Name: Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę mikromacierzowej analizy transkryptomu nasion zbóż, w tym izolację RNA i hybrydyzację. Technika ta umożliwia badanie zmian ekspresji genów w odpowiedzi na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana w ramach obszaru tematycznego CGIAR Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, oraz IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Niemcy. Dziękujemy Mandy Püffeld za doskonałą pomoc techniczną oraz dr Isabel Marii Mora-Ramirez za podzielenie się informacjami i doświadczeniami związanymi z chipsami pszennymi. Dziękujemy dr Rhondzie Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Niemcy) za komentarze i krytyczną lekturę manuskryptu.

<ol><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li>
<li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li>
<li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li>
<li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+seeds%3A+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage%2C+dormancy+and+onset+of+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li>
<li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-development+programs%3A+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li>
<li>Butardo, V. M. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li>
<li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854(2017).</li>
<li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li>
<li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li>
<li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4(2009).</li>
<li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+%26+Integrative+Genomics%22%5BJournal%5D)">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li>
<li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature%3A+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li>
<li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain%2C+sweet+and+bioenergy+sorghums%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35(2014).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Journal%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li>
<li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana metoda zapewnia wysoce powtarzalne wyniki dla wysokowydajnych i wysokiej jakości ekstraktów RNA (ryc. 1). Opierając się na naszym doświadczeniu, zalecamy do analizy trzy kontrpróby biologiczne dla jednego genotypu, etapu lub stanu. Aby móc wykryć statystycznie istotne różnice, należy wziąć pod uwagę ogólną obfitość mRNA. Należy jednak pamiętać, że wymagana jest początkowa ilość 200 mg próbek tkanek w trzech egzemplarzach na etapie ekstrakcji RNA. W związku z tym w przypadku eksperymentów, w których bierze udział ograniczona liczba próbek, takich jak genetycznie modyfikowane materiały roślinne, metoda ta może nie być odpowiednia.
Podczas hybrydyzacji mikromacierzy najważniejsze są następujące kroki: (1) ładowanie próbek do szkiełka uszczelki (krok 4.7) i (2) mycie matryc po hybrydyzacji (kroki 4.13 i 4.14). Ładowanie próbki należy wykonywać bardzo ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i rozlewania cieczy. Należy zachować ostrożność podczas umieszczania szkiełka do mikromacierzy na suwaku uszczelki zawierającym załadowane próbki: strona DNA (z nakrapianymi sondami) powinna być skierowana w dół, aby umożliwić hybrydyzację. W przypadku mycia mikromacierzy drugi etap mycia jest szczególnie krytyczny: w tym przypadku wyjmowanie szkiełek z bufora myjącego 2 musi odbywać się bardzo powoli (10 s), aby uniknąć artefaktów buforowych na szkiełkach, które mogą zakłócać gromadzenie i analizę danych.
Aby otrzymać wyniki eksperymentu hybrydyzacji, które kwalifikują się do dalszej analizy bioinformatycznej, należy przestrzegać kilku ważnych kryteriów. Raport kontroli jakości, który jest generowany po wykonaniu powyższego protokołu, daje dobre wyobrażenie o tym, co należy poprawić i które dane są w stanie użytecznym (rysunek 3). Pierwszą otrzymaną informacją jest wizualizowana siatka (rysunek 2). W tym miejscu można bezpośrednio sprawdzić, czy wszystkie obszary do odczytu fluorescencji są prawidłowo wyrównane. Jeśli nastąpi wizualnie wykrywalne przesunięcie, wpłynie to na wszystkie inne wartości (tło, intensywność sygnału itp.), a odczyt z tego układu nie będzie mógł być użyty. Na przeglądzie (Rozkład przestrzenny wszystkich wartości odstających) można łatwo dostrzec wszelkie zanieczyszczenia (np. kurz lub włosy), które miały wpływ na wynik. Brud można usunąć, delikatnie i ponownie skanując chip. Histogram wykresu sygnału, jak wspomniano powyżej, powinien dać szeroką krzywą w kształcie Gaussa, z niewielkimi wartościami odstającymi (rysunek 2). W zależności od analizowanej tkanki (ryc. 1), krzywa ta może wyglądać inaczej i może wydawać się mieć dwa piki lub jeden dominujący pik z ramieniem. Nie będzie to miało wpływu na jakość danych. Tylko silnie przesunięty pik lub wysokie sygnały na krawędziach wskazują na problemy, takie jak "zielone potwory" (zbyt wysokie natężenia fluorescencji), których nie można usunąć przez pranie i należy je zgłosić producentowi chipa. Ponadto "Wykres rozkładu przestrzennego dla mediany sygnałów" powinien różnić się wokół wspólnej wartości. Powinno to mieścić się w zakresie od 40 do 100, w zależności od ogólnego odczytu intensywności analizowanego chipa. Kolejną ważną kontrolą jakości jest ocena skoku danych: Wykres logarytmiczny dla skoku sygnałów powinien dawać liniową i regularną linię. Wreszcie, tabela "metryk oceny" daje dobry i wiarygodny obraz otrzymanych wyników. W tym miejscu producent podaje zakres wartości, które można sklasyfikować jako Doskonały, Dobry i Oceniający (Rysunek 3). Z naszego doświadczenia wynika, że niektóre wartości nie zawsze mogą być stosowane do wszystkich żetonów. W przypadku niestandardowych chipsów ryżowych "wartość niekontrolna" była często poza zakresem, ale nie wpływa znacząco na dalsze przetwarzanie danych. Ponadto zakres "NegControl" może zostać rozszerzony w zależności od tkanki, organizmu i ogólnej wydajności chipa do <80. Z naszego doświadczenia wynika, że zakres oceny dla wartości E1 med CV może zostać rozszerzony do <9, a nie <8. Dzięki temu możliwa jest właściwa ocena wszystkich danych odczytanych przez chip. Ogólnie rzecz biorąc, należy zawsze pamiętać, że niezależne repliki biologiczne zawsze dają najbardziej wiarygodny wynik.
Zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami jest fakt, że stanowi ona opłacalną, wysokoprzepustową metodę profilowania transkrypcji. Co więcej, dalsza analiza danych jest łatwiejsza i bardziej ugruntowana. Pomimo zalet, istnieją pewne ograniczenia tej techniki, takie jak liczba genów, które można przeanalizować. Mikromacierz może jedynie ułatwić analizę genów wcześniej wykrytych sond na tablicy. Dlatego technika ta ma zastosowanie tylko do gatunków roślin ze zsekwencjonowanymi genomami i w pełni opisanymi genami. Przewidujemy, że transkryptomika oparta na mikromacierzach będzie nadal bardzo przydatna i istotna nie tylko dla profilowania ekspresji genów, ale także dla innych dalszych procesów bioinformatycznych, takich jak analizy sieci regulacyjnych genów i badania asocjacyjne całego transkryptomu.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Transkryptom reprezentuje kompletny zestaw transkryptów kwasu rybonukleinowego (RNA) wyrażonych przez genom organizmu w danym czasie, a w szczególności w warunkach środowiskowych i wzrostu. Każda komórka ma swój indywidualny transkryptom, który odzwierciedla jej aktualny stan fizjologiczny i metaboliczny. Zbiór komórek pochodzących z podobnej tkanki lub narządu jest używany w typowym badaniu transkryptomu, ale transkryptomika jednokomórkowa i przestrzennie rozdzielczona staje się coraz bardziej popularna1. Analizy transkryptomiczne rozpoczynają się od ekstrakcji całkowitego RNA z wybranej tkanki w określonym punkcie czasowym i w określonych warunkach wzrostu. W tym celu zalecamy zastosowanie nowo opracowanej metody ekstrakcji całkowitego RNA z próbek o wysokiej zawartości skrobi lub cukru, takich jak nasiona zbóż2. Porównanie transkryptomów między różnymi próbkami skutkuje identyfikacją cząsteczek RNA o różnej liczebności. Te cząsteczki RNA są uważane za geny o zróżnicowanej ekspresji (DEC). Obfitość transkryptów pochodzących z określonych genów markerowych może być następnie wykorzystana do oszacowania stanu rozwoju lub określenia odpowiedzi organizmu na fluktuacje środowiskowe. Geny bez wykrywalnych zmian w obfitości transkryptów w badanych punktach rozwojowych są często używane jako geny referencyjne lub porządkowe.
RNA jest zazwyczaj wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą różnych metod, takich jak Northern blotting i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy odwrotnej transkryptazy (qRT-PCR), ale obecne metody transkryptomiki o wysokiej przepustowości opierają się głównie na hybrydyzacji kwasów nukleinowych przy użyciu technologii mikromacierzy, jak również sekwencjonowania RNA (RNA-Seq). RNA-Seq jest obecnie bardzo popularny, ponieważ zapewnia kilka korzyści dla aplikacji transkryptomicznych o wysokiej przepustowości, jak omówiono w innym miejscu3,4. Chociaż jest to starsza technologia, profilowanie ekspresji genów za pomocą chipów mikromacierzy jest nadal szeroko stosowane, ponieważ jest to bardziej ugruntowana technologia, która wymaga mniejszego zaplecza w dziedzinie bioinformatyki. W porównaniu z sekwencją RNA, zestawy danych generowane w eksperymentach z mikromacierzami są mniejsze i łatwiejsze do analizy. Ponadto jest bardziej opłacalny, zwłaszcza jeśli mamy do czynienia z dużą liczbą próbek. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy analizy transkryptomiczne z wykorzystaniem technologii mikromacierzy w celu określenia roli centralnych węzłów regulacyjnych, które zarządzają sieciami molekularnymi i szlakami zaangażowanymi we wzrost, rozwój i metabolizm ziaren zbóż5,6,7,8,9. Rutynowo używamy go również do prowadzenia badań profilowania ekspresji genów w całym genomie, aby uzyskać mechanistyczne zrozumienie reakcji ziaren zbóż na stresy abiotyczne10, a także w prowadzeniu badań asocjacji całego transkryptomu (TWAS) i mapowania sprzężeń w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za jakość ziarna zbóż i odżywianie11,12. Inne grupy również wykorzystały technologię mikromacierzy do stworzenia specyficznego dla rozwoju atlasu ekspresji genów w jęczmieniu13, rice14,15,16, sorhum17 i wheat18.
Celem tej publikacji jest dostarczenie krótkiego tekstowego podsumowania i szczegółowego wizualnego opisu metody, którą obecnie stosujemy w naszym laboratorium do transkryptomicznego profilowania ziaren zbóż za pomocą platformy mikromacierzy Agilent. Należy pamiętać, że dostępne są inne platformy mikromacierzy, ale nie zostaną one uwzględnione w tej metodzie. Protokół rozpoczynamy od przedstawienia szczegółowego opisu ekstrakcji RNA z rozwijających się lub kiełkujących nasion zbóż. Opierając się na naszym doświadczeniu, uzyskanie wysokiej jakości i dużej ilości transkryptomu nadającego się do dalszych analiz transkryptomicznych jest często wąskim gardłem przy użyciu tkanek nasion zbóż. Wypróbowaliśmy kilka dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji RNA, ale żaden z nich nie przyniósł zadowalających wyników. W związku z tym opracowaliśmy protokół ekstrakcji chemicznej w celu uzyskania surowego ekstraktu RNA, który jest następnie poddawany oczyszczaniu kolumnowemu przy użyciu dostępnego na rynku zestawu. Korzystając z tej metody, rutynowo i powtarzalnie uzyskujemy wysokiej jakości RNA2 (Rysunek 1), który może być używany w różnych dalszych aplikacjach do generowania profilu transkryptomu.

<table><tbody><tr><td>&szlig;-merkaptoetanol</td><td>Roth</td><td>4227.3</td><td>Dodać 300 ul do 20 ml Bufor do ekstrakcji RNA bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Aby określić jakość i ilość ekstraktu RNA</td></tr><tr><td>Kostkarka do lodu Różne</td><td>marki</td><td></td><td>Aby utrzymać próbki na lodzie podczas przetwarzania próbki</td></tr><tr><td>Kolba Dewara</td><td>Różne marki</td><td></td><td>Używany jako pojemnik na ciekły azot</td></tr><tr><td>Etanol, absolutny</td><td>Roth</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do hybrydyzacji ekspresji genów</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5242</td><td>Składniki zestawu: 2X bufor hybrydyzacyjny Hi-RPM 25X bufor fragmentacji 10X Środek blokujący ekspresję genów</td></tr><tr><td>Zestaw do mycia ekspresji genów</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5325</td><td>Elementy zestawu: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Różne marki</td><td></td><td>Zaleca się posiadanie co najmniej jednego bloku grzewczego na probówki 1,5 ml i drugiego na probówki 2,0 ml</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td>Piec ze stali nierdzewnej przeznaczony do hybrydyzacji mikromacierzy firmy Sheldon Manufacturing, używany do hybrydyzacji próbki w mikromacierzy przez noc.</td></tr><tr><td>Zestaw prowadnic do uszczelek hybrydyzacyjnych</td><td>Agilent</td><td>G2534-60014</td><td></td></tr><tr>Oczyszczacz <td></td><td></td><td>powietrza iQAir</td><td>Aby upewnić się, że eksperyment jest przeprowadzany w obszarze o niskiej zawartości ozonu</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>Niestrzępiący się papier, Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>KC34155</td><td></td></tr><tr><td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2305</td><td> Składniki zestawu: T7 Primer 5x bufor pierwszej nici 0,1 m DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x bufor transkrypcyjny NTP Mix Mieszanka polimerazy RNA T7 Woda wolna od nukleaz Cyjanina 3-CTP</td></tr><tr><td>Metalowa szpatułka, mały</td><td></td><td></td><td>Upewnij się, że mała metalowa szpatułka może zmieścić się w probówkach do mikrofuge, aby zapewnić łatwe nabieranie próbek.</td></tr><tr><td>Zalecany jest skaner mikromatrycowy</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Agilent SureScan lub Agilent C</td></tr><tr><td>Probówki do mikromatryc, wolne od nukleaz</td><td>Różne marki</td><td></td><td>Mikrowirówka o pojemności 2,0 ml i 1,5 ml</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Zaleca się posiadanie co najmniej jednej mikrorurki do mikrofug o temperaturze otoczenia i niskiej temperaturze z wirnikami, które mogą pomieścić po 24 probówki</td></tr> <tr><td>do mikrofug o pojemności 1,5 ml i 2,0 mlMini inkubator</td><td>Labnet</td><td>I5110-230V</td><td>Każdy mały inkubator się nada.</td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td></td><td></td><td>Każdy mały ceramiczny lub marmurowy moździerz i tłuczek, który może wytrzymać mielenie kriogeniczne przy użyciu ciekłego azotu.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Peqlab / Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>Biozym</td><td>351900302</td><td></td></tr><tr><td>Jednokolorowy zestaw kolców RNA</td><td>Agilent</td><td>5188-5282</td><td>Elementy zestawu: Jednokolorowy zestaw osłon ślizgowych RNA Spike-Mix Dilution Buffer</td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>G2505-60550</td><td>Opcjonalna, ale wysoce zalecana</td></tr><tr><td>probówka do PCR, 0,2 ml, bez RNaz</td><td>Stratagene</td><td>Z376426</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:mieszanina izoamylu (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, bez nukleazy, końcówki filtrujące</td><td>Różne marki</td><td></td><td>Aby pomieścić objętości 2, 20, 20, 100, 200 i 1000 ul</td></tr><tr><td>Zestaw pipet Różne</td><td>marki</td><td></td><td>Dla objętości 2, 20, 20, 100, 200 i 1000 ul</td></tr><tr><td>Bufor do ekstrakcji RNA</td><td>10 mM Tri-HCl pH 8,0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1,5% EDTA 15 ul/ml &beta;-merkaptoetanol</td><td></td><td>Rutynowo używamy chemikaliów Roth lub Sigma; Dodaj &beta;-merkaptoetanol świeży codzienny</td></tr><tr><td>zestaw DNazy bez RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Składniki zestawu: Mini kolumna wirująca RNeasy (różowa) 1,5 ml Probówki zbiorcze 2 ml Probówki zbiorcze Bufor RLT Bufor RW Bufor RPE Woda wolna od nukleaz</td></tr><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>Elementy zestawu Qiagen</td><td>74904</td><td>Accessories: RNeasy mini wirująca kolumna (różowa) QIAshredder wirująca (fioletowa) 1,5 ml probówki zbiorcze 2 ml Probówki zbiorcze Bufor RLT Bufor RLC Bufor RW1 Bufor RPE Woda wolna od nukleaz</td></tr><tr><td>Uchwyty do szkiełek do skanera mikromacierzy DNA</td><td>Agilent</td><td>G2505-60525</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko barwiące z wyjmowanym stojakiem</td><td>DWK Life Sciences 900200</td><td>Fisher Scientific 08-812</td><td>Polecamy DWK Life Sciences Wheaton&trade; Szklane 20-szkiełkowe naczynie do barwienia ze zdejmowanym stojakiem (w komplecie z naczyniem, pokrywą i szklanym stojakiem na prowadnice)</td></tr> <tr><td>Chlorek sodu</td><td>Roth</td><td>P029.1</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka ultraniskotemperaturowa</td><td>Różne marki</td><td></td><td>Możliwość przechowywania próbki w temperaturze -80 & stopni; C</td></tr><tr><td>Mikser wirowy</td><td>Różne marki</td><td></td><td>Co najmniej jeden do jednorurowego miksera wirowego, a drugi do tego może mieszać wirowo wiele rurek</td></tr></tbody></table>

uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Charakterystyka ekspresji genów zależy od jakości RNA. W kiełkujących, rozwijających się i dojrzałych nasionach zbóż ekstrakcja wysokiej jakości RNA jest często utrudniona ze względu na wysoką zawartość skrobi i cukru. Związki te mogą zmniejszać zarówno wydajność, jak i jakość wyekstrahowanego całkowitego RNA. Pogorszenie ilości i jakości całkowitego RNA może mieć następnie znaczący wpływ na dalsze analizy transkryptomiczne, które mogą nie odzwierciedlać dokładnie przestrzennej i/lub czasowej zmienności profilu ekspresji genów badanych próbek. W tym protokole opisujemy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji całkowitego RNA w ilości i jakości wystarczającej do zastosowania do analizy całego transkryptomu ziaren zbóż. Opisana metoda nadaje się do kilku dalszych zastosowań wykorzystywanych do profilowania transkryptomicznego rozwijających się, kiełkujących i dojrzałych nasion zbóż. Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu z wykorzystaniem platformy mikromacierzy. Metoda ta została specjalnie opracowana do profilowania ekspresji genów zbóż z opisanymi sekwencjami genomu. Opisano szczegółową procedurę od obsługi mikromacierzy do końcowej kontroli jakości. Obejmuje to syntezę cDNA, znakowanie cRNA, hybrydyzację mikromacierzy, skanowanie szkiełek, ekstrakcję cech i walidację jakości danych. Dane uzyskane tą metodą mogą być wykorzystane do scharakteryzowania transkryptomu zbóż podczas kiełkowania, na różnych etapach rozwoju ziarna lub w różnych warunkach stresu biotycznego lub abiotycznego. Zaprezentowane tutaj wyniki stanowią przykład wysokiej jakości danych transkryptomowych, które można poddać dalszym analizom bioinformatycznym, takim jak oznaczanie genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG), charakterystyka sieci regulacyjnych genów oraz prowadzenie badania asocjacyjnego całego transkryptomu (TWAS).

Ta metoda została zoptymalizowana pod kątem ekstrakcji próbek nasion zbóż zawierających znaczne ilości zanieczyszczeń w postaci skrobi lub cukrów. Została ona opracowana w celu wyizolowania całkowitego RNA z 24 próbek nasion dziennie. Procedurę należy przeprowadzić w sposób ciągły w ciągu jednego dnia, jednak w całym protokole wskazano opcjonalne punkty przerwania i wstrzymania prac. Alternatywnie, użytkownik może zastosować preferowane zestawy do ekstrakcji RNA lub manualną metodę ekstrakcji chemicznej. Jednakże, w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia, dostępne komercyjnie zestawy do ekstrakcji RNA z roślin nie są odpowiednie dla nasion ze względu na znaczne ilości zanieczyszczeń w postaci skrobi, białek, cukrów i/lub lipidów. W opisanym podejściu ekstrakcja chemiczna surowego RNA jest uzupełniona o oczyszczanie kolumnowe przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA. Zazwyczaj zapewnia to RNA o wyższej jakości i wydajności. Rysunek 1 przedstawia wynik analizy BioAnalyzer w celu sprawdzenia jakości ekstrakcji RNA z zastosowaniem opisanej tutaj metody. Wyniki zaprezentowano dla liścia jęczmienia (próbki 1 i 2 reprezentujące próbki o niskiej zawartości skrobi) oraz nasion jęczmienia (próbki 3 i 4 reprezentujące próbki o wysokiej zawartości skrobi). Wartość wskaźnika integralności RNA (RIN) dla wszystkich próbek wynosi 10.
Rycina 1 przedstawia reprezentatywny żel oczyszczonego ekstraktu RNA, którego jakość została sprawdzona za pomocą Bioanalizatora. Próbki 1 i 2 to typowe wyniki dla próbek o niskiej zawartości skrobi, takich jak liście jęczmienia, w których widoczne są dodatkowe prążki rRNA pochodzące z chloroplastów. Próbki 3 i 4 to reprezentatywne wyniki dla próbek o wysokiej zawartości skrobi, takich jak nasiona jęczmienia, wykazujące rRNA 18S i 28S. Należy pamiętać, że w przypadku zielonych tkanek roślinnych, takich jak próbki liści, nie można obliczyć zautomatyzowanej wartości RIN ze względu na rRNA chloroplastów. Jednakże integralność i wysoką jakość można stwierdzić wizualnie na podstawie braku produktów degradacji, które zazwyczaj pojawiają się jako rozmycie o niskiej masie cząsteczkowej. Wartość RIN dla próbek nasion o wysokiej zawartości skrobi, takich jak nasiona jęczmienia, wynosi zazwyczaj 10 przy zastosowaniu protokołu opisanego w niniejszej pracy.
Dodatkowo przedstawiamy tutaj reprezentatywne dane z eksperymentu w serii czasowej dla dwóch elitarnych linii inbrednych jęczmienia (Sofiara i Victoriana) wykorzystanych do analizy jakości słodowniczej19. Podczas procesu słodowania skrobia jest przekształcana w cukier. W związku z tym próbki reprezentują tkanki o zmiennych proporcjach zawartości skrobi i cukru. Ponieważ przemysłowy proces słodowania jest podobny do procesu kiełkowania, przeanalizowano transkryptomy dwóch linii jęczmienia różniących się jakością słodowniczą. RNA wyekstrahowano z kiełkujących nasion w 2, 24, 48, 72, 120, 144 i 196 h po imbibicji w trzech powtórzeniach biologicznych. Przygotowanie RNA oraz hybrydyzacja z dostosowaną macierzą mikroarray dla jęczmienia zostały przeprowadzone zgodnie z powyższym opisem. Rycina 2 przedstawia znormalizowany odczyt siatki z hybrydyzacji mikroarray zawarty w raporcie kontroli jakości (QC) (Rycina 3) oraz histogram wykrytych sygnałów. Siatka prezentuje przykład sygnałów pochodzących z każdego narożnika płytki, w tym kropki odczytu tła oraz spike-in używane do kalibracji. Histogram wskazuje odchylenie wykrywalnych kropek z odpowiednimi intensywnościami sygnału. Pomyślna hybrydyzacja daje szeroką krzywą o kształcie Gaussa z jedynie niewielkimi wartościami odstającymi, jak pokazano na rycinie. Nieudane hybrydyzacje mogą skutkować silnym przesunięciem w jedną stronę („green monsters”).
Na koniec, reprezentatywny wynik dopuszczalnych wartości przedstawiono w kolumnie 4 na Rysunku 3. Aby wykazać wiarygodność przeprowadzonych eksperymentów, wyniki poddano dalszej ocenie przy użyciu oprogramowania GeneSpring. Zebrane dane zaprezentowano w formie analizy głównych składowych (PCA). PCA integruje wartości wybranych punktów (genów) jako wektor. Liczba ewaluowanych punktów może wynosić od kilkuset do wszystkich punktów na płytce i zależy od użytego oprogramowania. Każda płytka (próbka) generuje jedną wartość (wektor), która wynika z zintegrowanych intensywności sygnałów dla analizowanych punktów. Zatem względna pozycja na wykresie (PCA) wskazuje na podobieństwo próbek względem siebie. Im bliżej siebie znajdują się próbki, tym są bardziej podobne. Powtórzenia techniczne powinny znajdować się bliżej siebie niż biologiczne, a powtórzenia biologiczne danej próbki powinny tworzyć ciaśniejszą grupę niż próbki z różnych punktów czasowych, tkanek lub warunków.
<img alt="Obraz elektroforezy żelowej przedstawiający wyniki rozdzielenia DNA, drabinka z markerami wielkości nukleotydów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Podsumowanie przebiegu elektroforezy uzyskane po sprawdzeniu jakości RNA za pomocą Bioanalyzera. Próbki 1 i 2 to tkanka liścia jęczmienia, na co wskazują dodatkowe prążki rybosomalne z chloroplastów. Próbki 3 i 4 to tkanka nasion jęczmienia z widocznymi prążkami 18S i 28S rRNA. Współczynnik RIN nie zawsze jest obliczany dla tkanek zielonych, takich jak liście, ale na podstawie żelu jakość RNA jest bardzo dobra. Wartość RIN dla próbek 3 i 4 wynosi 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu przedstawiający wzór fluorescencji; histogram analizujący rozkład sygnału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Raport QC z udanej hybrydyzacji mikromacierzy jęczmienia. Znak + wskazuje wykryte sygnały na siatce we wszystkich narożnikach płytki. Histogram przedstawia liczbę sygnałów sklasyfikowanych według intensywności sygnału (fluorescencji) jako logarytm po odjęciu tła. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tabela metryk oceny; wyniki analizy danych obejmują wartości sygnału, nachylenia i granicy wykrywalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Podsumowanie kontroli jakości (QC) po hybrydyzacji i skanowaniu. Wartości dla zhybrydyzowanego preparatu podano w kolumnie 2 (wartość), a zakres akceptowalnych wartości przedstawiono w kolumnie 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zespół komory płukania</td>
			<td>Treść i etykieta</td>
			<td>Cel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naczynie 1</td>
			<td>Opróżnić, pozostawić na blacie laboratoryjnym do następnego dnia</td>
			<td>Następnego dnia napełnić buforem płuczącym 1 (Wash Buffer 1), używanym do demontażu szkiełek z mikromacierzą</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szalka 2</td>
			<td>Dodaj jedną kasetę do szkiełek mikroarray oraz mały magnetyczny mieszadło; opisz jako „Bufor piorący 1”, pozostaw na blacie laboratoryjnym do następnego dnia</td>
			<td>Służy do mycia płytek z mikroarrays buforem do mycia 1 (Wash Buffer 1) następnego dnia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szalka 3</td>
			<td>Dodaj jeden mały pasek magnetyczny, oznacz go etykietą „Wash Buffer 2” i umieść w 37 °C mini inkubator</td>
			<td>Służy do przemywania szkiełek z macierzą mikroarray buforem do przemywania 2 (Wash Buffer 2) następnego dnia wewnątrz 37 °C mini inkubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przygotowanie zestawów komór płuczących.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kroki</td>
			<td>Szalka</td>
			<td>Bufor piorący</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demontaż</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Otoczenia</td>
			<td rowspan="2">Tak szybko, jak to możliwe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Krok 4.13)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierwsze przemycie</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Otoczenia</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Krok 4.14)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugie przemywanie</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 °C</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Krok 4.15)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Temperatura i czas inkubacji dla zestawów komory płuczącej.

Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu zbóż. Profilowanie ekspresji genów w oparciu o mikromacierze rozpoczyna się od wyizolowania wysokiej jakości całkowitego RNA z ziaren zbóż i jest kontynuowane wraz z generowaniem cDNA. Po znakowaniu cRNA i hybrydyzacji mikromacierzy podawane są zalecenia dotyczące wykrywania sygnału i kontroli jakości.

Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Ta metoda hybrydyzacji mikromacierzy jest przydatna do porównywania dużej liczby próbek z organizmu o znanym genomie. W porównaniu z podejściem do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, ilość danych generowanych tą metodą jest znacznie łatwiejsza w obsłudze, a ponadto może być analizowana w bardziej opłacalny sposób. Procedurę zademonstruje dr Christiane Seiler, naukowiec ze stopniem doktora pracująca w grupie badawczej w Rosis w IPK w Gatersleben.Przed wykonaniem hybrydyzacji mikromacierzy przy użyciu zestawu do hybrydyzacji ekspresji genów należy przygotować 10-krotny środek blokujący zgodnie ze specyfikacją producenta i poddzielić otrzymany środek blokujący w objętościach 200 mikrolitrów. Następnie przechowuj środek blokujący w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. W dniu hybrydyzacji mikromacierzy rozmrozić jedną 200 mikrolitrową porcję środka blokującego 10X na lodzie i podgrzać piec do hybrydyzacji do 65 stopni Celsjusza, a blok grzewczy do 60 stopni Celsjusza.Przygotować mieszaninę do rozdrobnienia dla każdej próbki zgodnie z opisem producenta i delikatnie wymieszać próbki w wirze. Po wirowaniu należy krótko odwirować próbki w mikrowirówce, a następnie inkubować przez dokładnie 30 minut w bloku grzewczym o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji natychmiast schłodzić każdą probówkę na lodzie przez jedną minutę przed zatrzymaniem fragmentacji za pomocą 25 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego 2X do hybrydyzacji ekspresji genów, wysokie prędkości obrotowe na minutę na probówkę.Wymieszać delikatnie pipetując, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza, a następnie odwirować probówki w temperaturze pokojowej. Pod koniec wirowania natychmiast umieść wszystkie probówki na lodzie i załaduj każdą próbkę do szkiełka tak szybko, jak to możliwe. Następnie powoli dozuj 44 mikrolitry każdej mieszanki hybrydyzacyjnej do środka każdej studzienki uszczelki, uważając, aby nie wprowadzać pęcherzyków, i dodaj 44 mikrolitry buforu hybrydyzacyjnego do niewykorzystanych studzienek.Natychmiast umieść szkiełko mikromatrycy we właściwej orientacji na suwaku uszczelki, uważając, aby nie rozlać płynu, i szczelnie zamknij zespół hybrydyzacyjny. Obrócić zespół, aby potwierdzić brak stacjonarnych pęcherzyków powietrza i umieścić zespół komory hybrydyzacyjnej w rotatorze pieca do hybrydyzacji. Ustaw prędkość obrotową na 10 obrotów na minutę, a następnie rozpocznij hybrydyzację w temperaturze 65 stopni Celsjusza dokładnie przez 17 godzin.Podczas hybrydyzacji próbek należy przygotować trzy zespoły naczyń do mycia w odpowiednich do mycia, jak opisano w tabelach. Dokładnie po 17 godzinach hybrydyzacji zdemontuj jedną komorę hybrydyzacyjną na stole laboratoryjnym wyłożonym niestrzępiącym się papierem i przenieś jedną kanapkę z mikromacierzą do naczynia zawierającego bufor do mycia z kodem kreskowym mikromacierzy skierowanym do góry w pozycji skośnej, bez zanurzania całego szkiełka w buforze. Za pomocą kleszczy oddziel dwa szklane szkiełka i pozwól, aby uszczelka delikatnie opadła na dno naczynia, jednocześnie mocno trzymając szkiełko do mikroukładu.Powoli podnieś szkiełko mikromacierzy na boki w celu natychmiastowego przeniesienia do stojaka na mikromacierz w naczyniu drugim przy minimalnym naświetleniu powietrzem. Gdy wszystkie osiem szkiełek zostanie równomiernie rozmieszczonych wzdłuż stojaka, przymocuj uchwyt stojaka i przenieś cały zestaw naczyń do mieszadła magnetycznego. Delikatnie mieszaj zestaw dokładnie przez minutę.Podczas mieszania próbek przenieś trzecie naczynie z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na drugie mieszadło magnetyczne. Następnie delikatnie dodaj bufor do mycia 37 stopni Celsjusza do dania trzeciego, nie tworząc bąbelków. Pod koniec inkubacji z mieszaniem delikatnie i powoli przenieś ruszt szkiełkowy na półkę trzecią i wyjmij uchwyt rusztu.Po mieszaniu dokładnie przez minutę, powoli i delikatnie wyjmij ruszt do szkiełków z naczynia i użyj niestrzępiącego się papieru, aby ostrożnie wysuszyć obie strony każdego szkiełka, umieszczając każde szkiełko w pudełku na szkiełka podczas suszenia. Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez 15 minut, przenieś każdy szkiełko do uchwytu na szkiełka z kodem kreskowym skierowanym do góry i załaduj zmontowane uchwyty na szkiełka do karuzeli skanującej i ułóż zgodnie z numerem kodu kreskowego. Następnie natychmiast zeskanuj slajdy.Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywny wynik serii testowej mającej na celu przetestowanie jakości ekstrakcji RNA. W typowych analizach próbek o niskiej zawartości skrobi, takich jak liście jęczmienia, widoczne są dodatkowe prążki rybosomalnego RNA z chloroplastów. Próbki o wysokiej zawartości skrobi, takie jak nasiona jęczmienia, wykazują 18 i 28S rybosomalne RNA.Należy pamiętać, że nie można obliczyć automatycznej wartości liczbowej integralności RNA dla zielonych tkanek roślinnych, takich jak próbki liści, ze względu na rybosomalne RNA chloroplastowe. W tej reprezentatywnej analizie przeprowadzono przygotowanie RNA i hybrydyzację do dostosowanego chipa mikromacierzy jęczmiennej, jak pokazano. Siatka przedstawia przykład sygnałów pochodnych z każdego rogu chipa, w tym tła i skoku w kropkach odczytu używanych do kalibracji.Histogram wskazuje odchylenie wykrywalnych kropek o odpowiedniej intensywności sygnału. Jak zaobserwowano, udana hybrydyzacja daje szeroką krzywą w kształcie Gaussa z niewielkimi wartościami odstającymi. Poniżej przedstawiono raport z kontroli jakości wykrytych sygnałów.Wartości dla szkiełka hybrydowego są podane w kolumnie drugiej, a zakres dopuszczalnych wartości jest pokazany w kolumnie czwartej. Metoda ta może być stosowana do rozwiązywania problemów związanych z dowolnym organizmem, w przypadku gdy dostępne są istotne informacje o genomie. Zastosowanie tej techniki w naszym laboratorium umożliwiło nam porównanie i analizę zmian transkryptomicznych w ryżu i jęczmieniu, które zachodzą po indukcji stresu wzrostowego.

obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę wprowadzania, śledzenia i ilościowej analizy ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyczny do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również zastosowanie programów ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Pokazujemy metodę analizy aflatoksyn i ekspresji transgenów w nasionach orzeszków ziemnych, które zawierają sygnały interferencji RNA do wyciszania genów syntezy aflatoksyn u grzyba Aspergillus flavus. Kontrola mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi nie została wcześniej zgłoszona.

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

Udało nam się ustalić metodę izolacji RNA z nasion roślin zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda jest odpowiednia do monitorowania ekspresji genów z transkryptami niskiego poziomu w nasionach.

Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

Przedstawiono ulepszony protokół pomiaru przejściowej ekspresji genów z konstruktów reporterowych w komórkach aleuronowych jęczmienia po bombardowaniu cząsteczkami. Połączenie zautomatyzowanego mielenia ziarna z 96-dołkowymi testami enzymatycznymi na płytkach zapewnia wysoką wydajność zabiegu.

Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Celem tego protokołu jest zbadanie ewolucji i ekspresji genów kandydujących przy użyciu danych sekwencjonowania RNA.

Potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji RNA

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Protokół opisuje hodowlę odpornych odmian ryżu skrobiowego za pomocą technologii edycji genomu w precyzyjny, wydajny i technicznie prosty sposób.

Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

Prezentujemy protokół oparty na filtracji do izolowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych myszy, w którym usunęliśmy potrzebę ultrawirowania, dzięki czemu jest to łatwe do zastosowania. Pokazujemy, że chromatyna przygotowana z jąder nadaje się do badań immunoprecypitacji chromatyny i prawdopodobnego sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny.

Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny

Poznaj metodę mikromacierzowej analizy transkryptomu nasion zbóż, w tym izolację RNA i hybrydyzację. Technika ta umożliwia badanie zmian ekspresji genów w odpowiedzi na stres.

Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal

Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów