Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów
21 maja 2020
Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu zbóż. Profilowanie ekspresji genów w oparciu o mikromacierze rozpoczyna się od wyizolowania wysokiej jakości całkowitego RNA z ziaren zbóż i jest kontynuowane wraz z generowaniem cDNA. Po znakowaniu cRNA i hybrydyzacji mikromacierzy podawane są zalecenia dotyczące wykrywania sygnału i kontroli jakości.
Ta metoda hybrydyzacji mikromacierzy jest przydatna do porównywania dużej liczby próbek z organizmu o znanym genomie. W porównaniu z podejściem do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, ilość danych generowanych tą metodą jest znacznie łatwiejsza w obsłudze, a ponadto może być analizowana w bardziej opłacalny sposób. Procedurę zademonstruje dr Christiane Seiler, naukowiec ze stopniem doktora pracująca w grupie badawczej w Rosis w IPK w Gatersleben.
Przed wykonaniem hybrydyzacji mikromacierzy przy użyciu zestawu do hybrydyzacji ekspresji genów należy przygotować 10-krotny środek blokujący zgodnie ze specyfikacją producenta i poddzielić otrzymany środek blokujący w objętościach 200 mikrolitrów. Następnie przechowuj środek blokujący w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. W dniu hybrydyzacji mikromacierzy rozmrozić jedną 200 mikrolitrową porcję środka blokującego 10X na lodzie i podgrzać piec do hybrydyzacji do 65 stopni Celsjusza, a blok grzewczy do 60 stopni Celsjusza.
Przygotować mieszaninę do rozdrobnienia dla każdej próbki zgodnie z opisem producenta i delikatnie wymieszać próbki w wirze. Po wirowaniu należy krótko odwirować próbki w mikrowirówce, a następnie inkubować przez dokładnie 30 minut w bloku grzewczym o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji natychmiast schłodzić każdą probówkę na lodzie przez jedną minutę przed zatrzymaniem fragmentacji za pomocą 25 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego 2X do hybrydyzacji ekspresji genów, wysokie prędkości obrotowe na minutę na probówkę.
Wymieszać delikatnie pipetując, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza, a następnie odwirować probówki w temperaturze pokojowej. Pod koniec wirowania natychmiast umieść wszystkie probówki na lodzie i załaduj każdą próbkę do szkiełka tak szybko, jak to możliwe. Następnie powoli dozuj 44 mikrolitry każdej mieszanki hybrydyzacyjnej do środka każdej studzienki uszczelki, uważając, aby nie wprowadzać pęcherzyków, i dodaj 44 mikrolitry buforu hybrydyzacyjnego do niewykorzystanych studzienek.
Natychmiast umieść szkiełko mikromatrycy we właściwej orientacji na suwaku uszczelki, uważając, aby nie rozlać płynu, i szczelnie zamknij zespół hybrydyzacyjny. Obrócić zespół, aby potwierdzić brak stacjonarnych pęcherzyków powietrza i umieścić zespół komory hybrydyzacyjnej w rotatorze pieca do hybrydyzacji. Ustaw prędkość obrotową na 10 obrotów na minutę, a następnie rozpocznij hybrydyzację w temperaturze 65 stopni Celsjusza dokładnie przez 17 godzin.
Podczas hybrydyzacji próbek należy przygotować trzy zespoły naczyń do mycia w odpowiednich do mycia, jak opisano w tabelach. Dokładnie po 17 godzinach hybrydyzacji zdemontuj jedną komorę hybrydyzacyjną na stole laboratoryjnym wyłożonym niestrzępiącym się papierem i przenieś jedną kanapkę z mikromacierzą do naczynia zawierającego bufor do mycia z kodem kreskowym mikromacierzy skierowanym do góry w pozycji skośnej, bez zanurzania całego szkiełka w buforze. Za pomocą kleszczy oddziel dwa szklane szkiełka i pozwól, aby uszczelka delikatnie opadła na dno naczynia, jednocześnie mocno trzymając szkiełko do mikroukładu.
Powoli podnieś szkiełko mikromacierzy na boki w celu natychmiastowego przeniesienia do stojaka na mikromacierz w naczyniu drugim przy minimalnym naświetleniu powietrzem. Gdy wszystkie osiem szkiełek zostanie równomiernie rozmieszczonych wzdłuż stojaka, przymocuj uchwyt stojaka i przenieś cały zestaw naczyń do mieszadła magnetycznego. Delikatnie mieszaj zestaw dokładnie przez minutę.
Podczas mieszania próbek przenieś trzecie naczynie z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na drugie mieszadło magnetyczne. Następnie delikatnie dodaj bufor do mycia 37 stopni Celsjusza do dania trzeciego, nie tworząc bąbelków. Pod koniec inkubacji z mieszaniem delikatnie i powoli przenieś ruszt szkiełkowy na półkę trzecią i wyjmij uchwyt rusztu.
Po mieszaniu dokładnie przez minutę, powoli i delikatnie wyjmij ruszt do szkiełków z naczynia i użyj niestrzępiącego się papieru, aby ostrożnie wysuszyć obie strony każdego szkiełka, umieszczając każde szkiełko w pudełku na szkiełka podczas suszenia. Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez 15 minut, przenieś każdy szkiełko do uchwytu na szkiełka z kodem kreskowym skierowanym do góry i załaduj zmontowane uchwyty na szkiełka do karuzeli skanującej i ułóż zgodnie z numerem kodu kreskowego. Następnie natychmiast zeskanuj slajdy.
Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywny wynik serii testowej mającej na celu przetestowanie jakości ekstrakcji RNA. W typowych analizach próbek o niskiej zawartości skrobi, takich jak liście jęczmienia, widoczne są dodatkowe prążki rybosomalnego RNA z chloroplastów. Próbki o wysokiej zawartości skrobi, takie jak nasiona jęczmienia, wykazują 18 i 28S rybosomalne RNA.
Należy pamiętać, że nie można obliczyć automatycznej wartości liczbowej integralności RNA dla zielonych tkanek roślinnych, takich jak próbki liści, ze względu na rybosomalne RNA chloroplastowe. W tej reprezentatywnej analizie przeprowadzono przygotowanie RNA i hybrydyzację do dostosowanego chipa mikromacierzy jęczmiennej, jak pokazano. Siatka przedstawia przykład sygnałów pochodnych z każdego rogu chipa, w tym tła i skoku w kropkach odczytu używanych do kalibracji.
Histogram wskazuje odchylenie wykrywalnych kropek o odpowiedniej intensywności sygnału. Jak zaobserwowano, udana hybrydyzacja daje szeroką krzywą w kształcie Gaussa z niewielkimi wartościami odstającymi. Poniżej przedstawiono raport z kontroli jakości wykrytych sygnałów.
Wartości dla szkiełka hybrydowego są podane w kolumnie drugiej, a zakres dopuszczalnych wartości jest pokazany w kolumnie czwartej. Metoda ta może być stosowana do rozwiązywania problemów związanych z dowolnym organizmem, w przypadku gdy dostępne są istotne informacje o genomie. Zastosowanie tej techniki w naszym laboratorium umożliwiło nam porównanie i analizę zmian transkryptomicznych w ryżu i jęczmieniu, które zachodzą po indukcji stresu wzrostowego.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia opartą na mikromacierzach metodę profilowania transkryptomu zbóż, koncentrując się na izolacji wysokiej jakości RNA i późniejszej syntezie cDNA. Procedura zawiera szczegółowe zalecenia dotyczące detekcji sygnału oraz kontroli jakości podczas hybrydyzacji mikromacierzy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia roślin
- Analiza ekspresji genów
Wstęp
- Hybrydyzacja mikromacierzy umożliwia porównanie wielu próbek pochodzących z organizmów o znanych genomach.
- Metoda ta jest łatwiejsza w obsłudze i bardziej opłacalna w porównaniu do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
- Jest ona szczególnie użyteczna przy analizie zmian transkrypcyjnych w zbożach, takich jak ryż i jęczmień.
- Środki kontroli jakości są kluczowe dla zapewnienia wiarygodnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody profilowania transkryptomu w ziarnach zbóż.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu izolacji RNA i hybrydyzacji mikromacierzy.
- Ułatwienie analizy zmian w ekspresji genów w różnych warunkach wzrostu.
Zastosowane metody
- Izolacja całkowitego RNA z ziaren zbóż.
- Generowanie cDNA i znakowanie cRNA.
- Hybrydyzacja mikromacierzy z zastosowaniem specyficznych protokołów przygotowania próbek.
- Ocena kontroli jakości w trakcie i po hybrydyzacji.
Główne wyniki
- Pomyślna hybrydyzacja skutkuje uzyskaniem szerokiej krzywej o kształcie rozkładu Gaussa w zakresie intensywności sygnału.
- Raporty z kontroli jakości wskazują na dopuszczalne zakresy sygnału dla zhybrydyzowanych preparatów.
- Reprezentatywne wyniki potwierdzają jakość ekstrakcji RNA oraz efektywność hybrydyzacji.
- Metoda ta umożliwia analizę porównawczą zmian transkrypcyjnych w odpowiedzi na stres.
Wnioski
- Ta metoda mikromacierzy jest skuteczna w profilowaniu transkryptomu zbóż.
- Zapewnia ona niezawodne podejście do analizy ekspresji genów w różnych warunkach.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone na inne organizmy z dostępnymi informacjami genomicznymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Uzyskanie wysokiej jakości danych transkrypcyjnych z nasion zbóż ma kluczowe znaczenie dla walidacji celów w biotechnologii rolniczej, gdzie zawartość skrobi i cukrów często obniża integralność RNA. Metoda ta umożliwia wiarygodne profilowanie ekspresji genów w różnych warunkach rozwojowych i stresowych, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów związanych z konkretnymi cechami. Dzięki dostarczaniu ilościowych, powtarzalnych pomiarów transkrypcyjnych, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w wczesnych etapach procesów odkrywania w ramach programów ulepszania upraw.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez transkrypcyjnych w modelach zbóż o znanych genomach, wyjaśniając udział konkretnych szlaków w odpowiedzi na stres.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane procedury ekstrakcji RNA i hybrydyzacji, co redukuje zmienność w badaniach nad zaangażowaniem celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację genów różnicowo wyrażonych (DEG) oraz sieci regulacyjnych genów, zwiększając pewność w priorytetyzacji celów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje dane z całego transkrypтому, odpowiednie do wykrywania biomarkerów i przesiewu fenotypowego w modelach rozwoju ziarna.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójne profile intensywności sygnału wraz z metrykami kontroli jakości, co umożliwia powtarzalność testów w różnych laboratoriach.
- Skalowalność: Kompatybilna z platformami mikromacierzy, co pozwala na równoległe przetwarzanie wielu genotypów nasion lub warunków traktowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy fenotypy molekularne w rozwijających się nasionach z cechami istotnymi w warunkach polowych poprzez przygotowanie do badania asocjacji w całym transkryptomie (TWAS).
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Wyjaśnia dynamikę ekspresji genów podczas kiełkowania i stresu abiotycznego, zmniejszając niepewność co do mechanizmu docelowego.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia porównanie zmian transkryptomicznych w różnych warunkach, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w procesach walidacji cech.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację wiodących związków, szczególnie w przypadku walidacji cech roślin uprawnych, dla których dostępne są zasoby genomiczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez analizę DEG oraz charakterystykę sieci genów w modelach zbóż poddanych stresowi lub bodźcom rozwojowym.
- Przesiewanie: Umożliwia profilowanie transkryptomu gotowe do analizy dzięki kontroli jakości znakowania cRNA i wynikom hybrydyzacji odpowiednim do przesiewania porównawczego.
- Analityka: Generuje dane o intensywności sygnału z rozkładem Gaussa i kontrolami spike-in, co pozwala na statystyczne porównanie poziomów ekspresji w różnych próbkach.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i zastosowania TWAS poprzez dostarczanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z kiełkujących, rozwijających się i dojrzałych nasion.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do profilowania transkryptomu dla gatunków zbóż z dostępnymi sekwencjami genomu, co ogranicza redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję szumu pochodzącego z RNA niskiej jakości w tkankach bogatych w skrobię.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanemu zastosowaniu czynnika blokującego, czasu fragmentacji oraz protokołów buforów płuczących.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając kosztowo efektywną analizę transkryptomu w porównaniu z sekwencjonowaniem, zwłaszcza w przypadku dużych zestawów próbek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera postęp dostosowany do ryzyka, dostarczając wiarygodnych danych o ekspresji w celu priorytetyzacji celów w programach tolerancji na stres abiotyczny lub poprawy plonowania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z RNA oraz w technikach mikroarray, aby zapobiec degradacji i zapewnić prawidłową fragmentację.
- Zależność od dostępu do pieców do hybrydyzacji, mieszadeł magnetycznych, skanerów do szkiełek oraz materiałów eksploatacyjnych kompatybilnych z mikroarray.
- Konieczność standaryzacji metryk jakości RNA i czasu hybrydyzacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności wyników w wielu ośrodkach.
- Adaptacja do modeli pozazbożowych może wymagać walidacji skuteczności ekstrakcji RNA ze względu na zróżnicowaną zawartość skrobi, cukrów lub wtórnych metabolitów.
- Ograniczenie praktyczne: Ręczne operowanie szkiełkami zwiększa ryzyko powstania pęcherzyków powietrza lub kontaminacji krzyżowej podczas przygotowania do hybrydyzacji.
