Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów
May 21st, 2020
Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu zbóż. Profilowanie ekspresji genów w oparciu o mikromacierze rozpoczyna się od wyizolowania wysokiej jakości całkowitego RNA z ziaren zbóż i jest kontynuowane wraz z generowaniem cDNA. Po znakowaniu cRNA i hybrydyzacji mikromacierzy podawane są zalecenia dotyczące wykrywania sygnału i kontroli jakości.
Ta metoda hybrydyzacji mikromacierzy jest przydatna do porównywania dużej liczby próbek z organizmu o znanym genomie. W porównaniu z podejściem do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, ilość danych generowanych tą metodą jest znacznie łatwiejsza w obsłudze, a ponadto może być analizowana w bardziej opłacalny sposób. Procedurę zademonstruje dr Christiane Seiler, naukowiec ze stopniem doktora pracująca w grupie badawczej w Rosis w IPK w Gatersleben.
Przed wykonaniem hybrydyzacji mikromacierzy przy użyciu zestawu do hybrydyzacji ekspresji genów należy przygotować 10-krotny środek blokujący zgodnie ze specyfikacją producenta i poddzielić otrzymany środek blokujący w objętościach 200 mikrolitrów. Następnie przechowuj środek blokujący w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. W dniu hybrydyzacji mikromacierzy rozmrozić jedną 200 mikrolitrową porcję środka blokującego 10X na lodzie i podgrzać piec do hybrydyzacji do 65 stopni Celsjusza, a blok grzewczy do 60 stopni Celsjusza.
Przygotować mieszaninę do rozdrobnienia dla każdej próbki zgodnie z opisem producenta i delikatnie wymieszać próbki w wirze. Po wirowaniu należy krótko odwirować próbki w mikrowirówce, a następnie inkubować przez dokładnie 30 minut w bloku grzewczym o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji natychmiast schłodzić każdą probówkę na lodzie przez jedną minutę przed zatrzymaniem fragmentacji za pomocą 25 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego 2X do hybrydyzacji ekspresji genów, wysokie prędkości obrotowe na minutę na probówkę.
Wymieszać delikatnie pipetując, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza, a następnie odwirować probówki w temperaturze pokojowej. Pod koniec wirowania natychmiast umieść wszystkie probówki na lodzie i załaduj każdą próbkę do szkiełka tak szybko, jak to możliwe. Następnie powoli dozuj 44 mikrolitry każdej mieszanki hybrydyzacyjnej do środka każdej studzienki uszczelki, uważając, aby nie wprowadzać pęcherzyków, i dodaj 44 mikrolitry buforu hybrydyzacyjnego do niewykorzystanych studzienek.
Natychmiast umieść szkiełko mikromatrycy we właściwej orientacji na suwaku uszczelki, uważając, aby nie rozlać płynu, i szczelnie zamknij zespół hybrydyzacyjny. Obrócić zespół, aby potwierdzić brak stacjonarnych pęcherzyków powietrza i umieścić zespół komory hybrydyzacyjnej w rotatorze pieca do hybrydyzacji. Ustaw prędkość obrotową na 10 obrotów na minutę, a następnie rozpocznij hybrydyzację w temperaturze 65 stopni Celsjusza dokładnie przez 17 godzin.
Podczas hybrydyzacji próbek należy przygotować trzy zespoły naczyń do mycia w odpowiednich do mycia, jak opisano w tabelach. Dokładnie po 17 godzinach hybrydyzacji zdemontuj jedną komorę hybrydyzacyjną na stole laboratoryjnym wyłożonym niestrzępiącym się papierem i przenieś jedną kanapkę z mikromacierzą do naczynia zawierającego bufor do mycia z kodem kreskowym mikromacierzy skierowanym do góry w pozycji skośnej, bez zanurzania całego szkiełka w buforze. Za pomocą kleszczy oddziel dwa szklane szkiełka i pozwól, aby uszczelka delikatnie opadła na dno naczynia, jednocześnie mocno trzymając szkiełko do mikroukładu.
Powoli podnieś szkiełko mikromacierzy na boki w celu natychmiastowego przeniesienia do stojaka na mikromacierz w naczyniu drugim przy minimalnym naświetleniu powietrzem. Gdy wszystkie osiem szkiełek zostanie równomiernie rozmieszczonych wzdłuż stojaka, przymocuj uchwyt stojaka i przenieś cały zestaw naczyń do mieszadła magnetycznego. Delikatnie mieszaj zestaw dokładnie przez minutę.
Podczas mieszania próbek przenieś trzecie naczynie z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na drugie mieszadło magnetyczne. Następnie delikatnie dodaj bufor do mycia 37 stopni Celsjusza do dania trzeciego, nie tworząc bąbelków. Pod koniec inkubacji z mieszaniem delikatnie i powoli przenieś ruszt szkiełkowy na półkę trzecią i wyjmij uchwyt rusztu.
Po mieszaniu dokładnie przez minutę, powoli i delikatnie wyjmij ruszt do szkiełków z naczynia i użyj niestrzępiącego się papieru, aby ostrożnie wysuszyć obie strony każdego szkiełka, umieszczając każde szkiełko w pudełku na szkiełka podczas suszenia. Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez 15 minut, przenieś każdy szkiełko do uchwytu na szkiełka z kodem kreskowym skierowanym do góry i załaduj zmontowane uchwyty na szkiełka do karuzeli skanującej i ułóż zgodnie z numerem kodu kreskowego. Następnie natychmiast zeskanuj slajdy.
Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywny wynik serii testowej mającej na celu przetestowanie jakości ekstrakcji RNA. W typowych analizach próbek o niskiej zawartości skrobi, takich jak liście jęczmienia, widoczne są dodatkowe prążki rybosomalnego RNA z chloroplastów. Próbki o wysokiej zawartości skrobi, takie jak nasiona jęczmienia, wykazują 18 i 28S rybosomalne RNA.
Należy pamiętać, że nie można obliczyć automatycznej wartości liczbowej integralności RNA dla zielonych tkanek roślinnych, takich jak próbki liści, ze względu na rybosomalne RNA chloroplastowe. W tej reprezentatywnej analizie przeprowadzono przygotowanie RNA i hybrydyzację do dostosowanego chipa mikromacierzy jęczmiennej, jak pokazano. Siatka przedstawia przykład sygnałów pochodnych z każdego rogu chipa, w tym tła i skoku w kropkach odczytu używanych do kalibracji.
Histogram wskazuje odchylenie wykrywalnych kropek o odpowiedniej intensywności sygnału. Jak zaobserwowano, udana hybrydyzacja daje szeroką krzywą w kształcie Gaussa z niewielkimi wartościami odstającymi. Poniżej przedstawiono raport z kontroli jakości wykrytych sygnałów.
Wartości dla szkiełka hybrydowego są podane w kolumnie drugiej, a zakres dopuszczalnych wartości jest pokazany w kolumnie czwartej. Metoda ta może być stosowana do rozwiązywania problemów związanych z dowolnym organizmem, w przypadku gdy dostępne są istotne informacje o genomie. Zastosowanie tej techniki w naszym laboratorium umożliwiło nam porównanie i analizę zmian transkryptomicznych w ryżu i jęczmieniu, które zachodzą po indukcji stresu wzrostowego.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę opartą na mikroarray dla profilowania transkryptomu zbóż, koncentrując się na izolowaniu wysokiej jakości RNA i następczej generacji cDNA. Procedura obejmuje szczegółowe zalecenia dotyczące wykrywania sygnałów i kontroli jakości podczas hybrydyzacji mikroarray.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia roślin
- Analiza ekspresji genów
Tło
- Hybrydyzacja mikroarray pozwala na porównanie wielu próbek organizmów o znanych genomach.
- Ta metoda jest bardziej zarządzalna i opłacalna w porównaniu z sekwencjonowaniem wysokoprężnościowym.
- Jest szczególnie przydatna do analizowania zmian transkryptomu w zbożach takich jak ryż i jęczmień.
- Środki kontroli jakości są kluczowe dla zapewnienia wiarygodnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie solidnej metody profilowania transkryptomu w ziarnach zbóż.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu izolacji RNA i hybrydyzacji mikroarray.
- Ułatwienie analizy zmian ekspresji genów w różnych warunkach wzrostu.
Stosowane metody
- Izolacja całkowitego RNA z ziaren zbóż.
- Generacja cDNA i etykietowanie cRNA.
- Hybrydyzacja mikroarray ze specyficznymi protokołami przygotowania próbek.
- Oceny kontroli jakości podczas i po hybrydyzacji.
Główne wyniki
- Udana hybrydyzacja daje szeroką krzywą Gaussa w intensywności sygnału.
- Raporty kontroli jakości wskazują na dopuszczalne zakresy sygnałów dla hybrydyzowanych płytek.
- Reprezentatywne wyniki pokazują jakość ekstrakcji RNA i efektywność hybrydyzacji.
- Metoda pozwala na analizę porównawczą zmian transkryptomu w odpowiedzi na stres.
Wnioski
- Ta metoda mikroarray jest skuteczna dla profilowania transkryptomu w zbożach.
- Dostarcza wiarygodnego podejścia do analizy ekspresji genów w różnych warunkach.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć się na inne organizmy o dostępnej informacji genomowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds is critical for target validation in agricultural biotechnology, where starch and sugar content often compromise RNA integrity. This method enables reliable gene expression profiling under varying developmental and stress conditions, supporting mechanistic de-risking of trait-associated targets. By delivering quantitative, reproducible transcriptomic measurements, it strengthens predictive confidence in early discovery workflows for crop improvement programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses in cereal models with known genomes, clarifying pathway involvement in stress response.
- Operational Value: Provides standardized RNA extraction and hybridization workflows that reduce variability in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports identification of differentially expressed genes (DEGs) and gene regulatory networks, improving confidence in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates transcriptome-wide data suitable for biomarker discovery and phenotypic screening in grain development models.
- Operational Value: Delivers consistent signal intensity profiles with quality control metrics, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Compatible with microarray platforms allowing parallel processing of multiple seed genotypes or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular phenotypes in developing seeds to field-relevant traits through transcriptome-wide association study (TWAS) readiness.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene expression dynamics during germination and abiotic stress, reducing uncertainty in target mechanism.
- Predictive Confidence: Enables cross-condition comparison of transcriptomic changes, supporting go/no-go decisions in trait validation pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly in crop trait validation where genomic resources exist.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via DEG analysis and gene network characterization in cereal models under stress or developmental cues.
- Screening: Enables assay-ready transcriptome profiling with quality-controlled cRNA labeling and hybridization outputs suitable for comparative screening.
- Analytics: Produces signal intensity data with Gaussian distribution and spike-in controls, allowing statistical comparison of expression levels across samples.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and TWAS applications by providing high-quality transcriptome data from germinating, developing, and mature seeds.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across cereal species with available genome sequences, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from low-quality RNA in high-starch tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized blocking agent use, fragmentation timing, and wash buffer protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling cost-effective transcriptome analysis compared to sequencing, especially for large sample sets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing reliable expression data for prioritizing targets in abiotic stress tolerance or yield improvement programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and microarray techniques to prevent degradation and ensure proper fragmentation.
- Dependent on access to hybridization ovens, magnetic stirrers, slide scanners, and microarray-compatible consumables.
- Necessitates cross-team standardization of RNA quality metrics and hybridization timing for multi-site reproducibility.
- Adaptation to non-cereal models may require validation of RNA extraction efficacy due to varying starch, sugar, or secondary metabolite content.
- Practical limitation: Manual slide handling increases risk of bubble introduction or cross-contamination during hybridization assembly.
