Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid
10 lutego 2022
Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.
Znakowana termoforeza w mikroskali skutecznie uzyskuje stałe dysocjacji lub KD różnych interakcji biochemicznych. Protokół ten i towarzyszący mu film wskazują na przybliżone powinowactwo do kwasu fosfatydowego do Vam7, jedynego rozpuszczalnego białka SNARE w drożdżach. Jest to sposób, w jaki Vam7 wiąże się z dwiema błonami przed interakcją z innymi białkami.
Metoda ta pozwala szybko uzyskać KD dla różnych interakcji biochemicznych przy niskich kosztach, z wysoką odtwarzalnością i przy minimalnym koszcie białka. Technika ta jest odpowiednia dla pierwszego etapu rozwoju farmaceutycznego, pozwalając na łatwe do uzyskania KD w celu określenia potencjalnych związków wiodących. Przed rozpoczęciem analizy włącz wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia MST i otwórz oprogramowanie sterujące.
Upewnij się, że komputer jest podłączony do urządzenia i jest w stanie połączenia, a następnie ustaw MST Przed na 3 sekundy, MST na 30 sekund, a Odzyskiwanie fluorescencji na po 1 sekundzie. Dla każdej rurki kapilarnej wprowadź nazwę liganda docelowego, nazwę analitu liganda, stężenie celu i najwyższe stężenie miareczkowania przy użyciu współczynnika miareczkowania z autouzupełnianiem. Wybierz zakres mocy MST i wprowadź wartości dla każdej mocy, aby przetestować najsolidniejsze dopasowanie wiązania.
Aby przygotować znakowane próbki MST, należy rozcieńczyć roztwór Vam7-oktahistydyny do stężenia 200 nanomolowych i barwnika NTA-Atto 647 do stężenia 100 nanomolowych, oba w PBS. Wymieszaj Vam7-oktahistydynę i barwnik NTA-Atto 647 w stosunku objętościowym 1:1 i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez 30 minut. Pod koniec inkubacji odwirować mieszaninę barwnika i białka i przechowywać roztwór w temperaturze 4 stopni Celsjusza do kilku godzin przed użyciem.
Następnie przygotuj próbkę, weź barwiony ligand i naświetl analit. W celu termoforezy próbki w mikroskali należy otworzyć urządzenie i wysunąć stojak kapilarny. Załaduj kapilary na próbki do stojaka o najwyższym stężeniu w pozycji pierwszej i wybierz kanał czerwony w oprogramowaniu sterującym.
Następnie załaduj stojak do instrumentu. Następnie wybierz zakres mocy MST i rozpocznij pomiar MST Cap Scan i oceń reakcję na zmianę. Poniżej przedstawiono ślady termoforetyczne z jednej próby miareczkowania 1:1 DiC8 PA, zaczynając od 500 mikromoli w stosunku do 50 nanomolowych NTA-Atto 647 znakowanych domeną Vam7.
Można zaobserwować początkową fluorescencję, przeskok w czasie i termoforezę, co pozwala na obliczenie KD na podstawie dowolnego z tych pomiarów lub ich kombinacji. Na podstawie tych wyników można wykreślić krzywą nasycenia, na przykład dla termoforezy z wyjściem skoku w czasie, jak pokazano na wykresie. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki MST określa się za pomocą skali logarytmicznej, biorąc pod uwagę stężenie białka w celu określenia powinowactwa wiązania poprzez wybór modelu KD i wprowadzenie stężenia białka.
Wykonując ten protokół, upewnij się, że roztwór znajduje się w środku kapilary i że nie ma pęcherzyków powietrza oraz że w kapilarze nie ma kurzu ani roztworu na zewnątrz kapilary. Izotermiczna kalorymetria miareczkowa lub powierzchniowy rezonans plazmonowy mogą być wykorzystane do walidacji uzyskanego eksperymentalnego KD. Jeśli istnieje potencjalne powiązanie kooperacyjne, ITC będzie następną wykonaną metodą logiczną, biorąc pod uwagę zasoby.
Technika ta umożliwiła tradycyjnym naukowcom zajmującym się biologią włączenie biofizycznych technik przesiewowych do swoich badań w celu określenia zależności między szlakami. Jednym z przykładów tej techniki jest lizaza komórkowa z białkiem docelowym ulegającym endogennej ekspresji, przy czym znacznik GFP jest nowatorskim sposobem przeprowadzenia tradycyjnego testu pull-down.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Znakowana mikrotermoforeza jest wydajną metodą wyznaczania stałych dysocjacji (KD) dla różnych oddziaływań biochemicznych. Niniejszy protokół koncentruje się na pomiarze powinowactwa Vam7, rozpuszczalnego białka SNARE u drożdży, do kwasu fosfatydowego, podkreślając jego rolę w oddziaływaniach z błoną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biofizyka
- Rozwój farmaceutyków
Wstęp
- Mikroskalowa termoforeza jest techniką pomiaru oddziaływań molekularnych.
- Termoforeza z użyciem znaczników umożliwia prowadzenie bardziej zróżnicowanych pomiarów oddziaływań niż metody bez znaczników.
- Zrozumienie oddziaływań białko-lipid jest kluczowe dla procesów komórkowych.
- Vam7 jest jedynym rozpuszczalnym białkiem SNARE u drożdży, niezbędnym dla procesu fuzji błon.
Cel badania
- Dostarczenie protokołu pomiaru KD przy użyciu znakowanej mikrotermeforezy.
- Wykazanie oddziaływania między Vam7 a kwasem fosfatydowym.
- Ułatwienie wczesnych etapów rozwoju farmaceutycznego poprzez zapewnienie szybkich pomiarów powinowactwa.
Zastosowane metody
- Przygotowanie znakowanego białka Vam7.
- Wykorzystanie urządzenia do mikrotermoforezy do pomiaru oddziaływań.
- Analiza powinowactwa wiązania z kwasem fosfatydowym.
- Sterowanie programowe akwizycją i analizą danych.
Główne wyniki
- Wydajne wyznaczanie wartości KD dla Vam7 i kwasu fosfatydowego.
- Wysoka powtarzalność i niskie koszty materiałowe związane z metodą.
- Wykazana przydatność dla wczesnych etapów opracowywania leków.
- Protokół umożliwia szybkie pozyskanie danych o wiązaniu.
Wnioski
- Znakowana mikroskalowa termoforeza jest cennym narzędziem do badania oddziaływań białkowych.
- Metoda ta pozwala na szybkie i kosztowo efektywne uzyskanie wyników.
- Zrozumienie oddziaływań Vam7 może wspomóc procesy poszukiwania nowych leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Mikroskalowa termoforeza (MST) umożliwia szybkie i niskokosztowe wyznaczanie powinowactwa wiązania białko-lipid przy użyciu minimalnych ilości próbek, co rozwiązuje kluczowe problemy na wczesnym etapie walidacji celu. Dostarczając ilościowe pomiary KD o wysokiej powtarzalności, MST wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniu szlaków zależnych od lipidów w transdukcji sygnału i transporcie błonowym. Możliwość ta przyspiesza identyfikację związków wiodących, pozwalając zespołom badawczo-rozwojowym na priorytetyzację związków w oparciu o dowody biofizyczne przed przejściem do zasobochłonnych analiz.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących oddziaływań białko-lipid w szlakach transportu błonowego i przebudowy cytoszkieletu.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zużycie białek i lipidów w porównaniu do metod ITC lub SPR, obniżając koszty analiz podczas wczesnego screeningu celów terapeutycznych.
- Wartość predykcyjna: Pozwala na wyznaczenie wartości KD, które określają pewność wyboru celu i wspierają decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w procesach identyfikacji wiodących związków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje standaryzowane krzywe nasycenia na podstawie przesunięć termoforetycznych, co umożliwia wiarygodną ocenę związków w przesiewach pierwotnych.
- Powtarzalność: Zapewnia spójne pomiary KD w powtórzeniach, wspierając transfer analizy między zespołami badawczymi a przedklinicznymi.
- Skalowalność: Kompatybilna z formatami miareczkowania, które pozwalają na przesiew wielu analitów lipidowych przeciwko stałemu białku docelowemu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane o powinowactwie z etapu odkryć z walidacją przedkliniczną, dostarczając wartości KD do modelowania szlaków sygnałowych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane fenotypy wynikają z bezpośredniego wiązania białko-lipid, czy z efektów pośrednich.
- Dopasowanie biomarkerów: Wspiera wybór związków modulujących lipidy o mierzalnym stopniu zaangażowania celu w ramach strategii biomarkerowych dla dalszych etapów badań.
Integracja potoku i przepływu pracy
MST wpisuje się w kontinuum procesów odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, oferując pomiary KD, które służą do opracowywania zależności struktura-aktywność (SAR) oraz wyboru kandydatów do badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oddziaływań białko-lipid w szlakach fuzji błon pośredniczonej przez białka SNARE.
- Przesiewanie: Umożliwia szybkie wyznaczanie KD dla bibliotek lipidowych, co ułatwia przejście z etapu identyfikacji hitów do optymalizacji leadów.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wyniki termoforezy i odzysku fluorescencji do modelowania KD oraz rankingów powinowactwa.
- Badania translacyjne: Łączy dane o wiązaniu in vitro z fenotypami komórkowymi w testach transportu błonowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę biofizyczną do przesiewania różnorodnych par białko-lipid w różnych obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w mechanizmach wiązania lipidów.
- Wartość operacyjna: Wymaga minimalnej ilości białka (zakres nM), co umożliwia badanie rzadkich lub trudnych do ekspresji celów.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza identyfikację wiodących związków (lead identification) poprzez dostarczanie danych KD w ciągu dni, a nie tygodni, co poprawia efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane oddziaływanie z celem.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie znakowania białek oraz metod detekcji opartych na fluorescencji.
- Zależne od dostępu do aparatury MST z konfigurowalną mocą lasera i kanałami fluorescencji.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności między ośrodkami.
- Wymagana jest optymalizacja dla analitów z wewnętrzną fluorescencją UV, aby uniknąć interferencji sygnału w trybach bezznakowych.
- Ograniczone do rozpuszczalnych białek docelowych; białka błonowe mogą wymagać solubilizacji lub inkorporacji do nanodysków.
