Name: Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Poznaj mikroskalową termoforezę do pomiaru stałych dysocjacji interakcji białko-lipid. Ta metoda pozwala szybko i tanio określić KD dla białka Vam7 i kwasu fosfatydowego, wspierając wczesny etap rozwoju farmaceutycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez grant z National Science Foundation (MCB 1818310) dla RAF. Ta praca była częściowo wspierana przez Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit w H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).

1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 i 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Przygotować barwnik NTA-Atto 647 N. Rozcieńczyć podstawowy barwnik NTA-Atto 647 N do 100 nM ze 100% roztworu DMSO do PBS bez Tween.</li>
	<li>Ekspresja Vam7-His8 – Białko jako białko fuzyjne w E. coli i oczyszczanie za pomocą Ni-NTA i chromatografii wykluczania wielkości8.</li>
	<li>Miareczkować analit w buforze PBS. Jeśli analit znajduje się w innym buforze, znakowany MST nie jest szczególnie wrażliwy na niewielkie różnice w buforze od cząsteczek takich jak DMSO, chyba że zawartość buforu analitu wchodzi w interakcję ze znakowanym białkiem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzenia MST
<ol>
	<li>Włącz wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie sterujące i upewnij się, że laptop jest włączony i ma stan połączenia na komputerze podłączonym do urządzenia.</li>
	<li>Wprowadź ustawienia fluorescencji i MST dla tego eksperymentu. Ustaw MST Przed na 3 s, MST na 30 s, a Odzyskiwanie fluorescencji (Fluo.) po 1 s. Przed pomiarem wstępnej fluorescencji i nie wymaga długich czasów; MST to rzeczywista ilość czasu, w którym należy osiągnąć równowagę po indukcji ciepła.</li>
	<li>Tabela kapilarek: Dla każdej rurki kapilarnej wprowadź nazwę celu (liganda), nazwę liganda (analitu), stężenie celu oraz najwyższe stężenie miareczkowania i użyj współczynnika miareczkowania autouzupełniania. Na przykład wprowadź 50 nM dla docelowego stężenia Vam7-His8, Vam7-His8 jako nazwę celu, (kwas 1,2-dioctanoylfosfatydowy) Di-C8 PA jako nazwę liganda i najwyższe stężenie liganda, wybierając 1:1 i przeciągając w dół do miejsc autouzupełniania 2-16.</li>
	<li>Uruchom skanowanie nasadki, aby wybrać odpowiednią diodę LED (20% diody LED (ustawienie wstępne)) w oparciu o sygnał białka docelowego i dostosuj od 200 do 2000 jednostek fluorescencji dla znakowanego MST. Skany czapek powinny pokazywać jednolite, zaokrąglone szczyty w kształcie dzwonu.</li>
	<li>Wybierz zakres mocy MST i wprowadź wartości dla każdej z nich, aby przetestować najbardziej niezawodne dopasowanie wiązania, a następnie naciśnij Start Cap Scan + Measurement, skanując różne wartości w celu określenia najlepszych warunków pracy dla danej testowanej interakcji.</li>
	<li>Określ moc MST z najlepszym dopasowaniem za pomocą oprogramowania analitycznego i ustawienia wstępnego dla termoforezy za pomocą Tjump. Analizuj pasowania zgodnie z większością separacji fluorescencji między najniższym i najwyższym stężeniem w porównaniu z mocą MST z najlepszym dopasowaniem i wybierz moc MST do prób powtórzonych.</li>
	<li>Określ, czy między pierwszym a drugim uruchomieniem nastąpiło fotowybielanie, przechodząc do oprogramowania do analizy i przełączając analizę w tryb ekspercki. Następnie do analizy wybierz fluorescencję zamiast termoforezy. Wybierz tryb eksperta, a następnie fotowybielanie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek do oznakowania MST
<ol>
	<li>Doprowadzić roztwór Vam7-His8 do stężenia 200 nM w PBS bez Tween.</li>
	<li>Doprowadź barwnik NTA-Atto 647 do 100 nM w PBS bez Tween.</li>
	<li>Wymieszać barwnik Vam7-His8 i NTA-Atto 647 w stosunku objętościowym 1:1 i pozostawić w temperaturze pokojowej pod przykryciem światła przez 30 minut. Oznaczyć odpowiednie stężenie białka docelowego, jak w sekcji 2.5 (patrz Suplement dotyczący wykorzystania KD barwnika Ni-NTA, jak pokazano na filmie).</li>
	<li>Odwirowywać mieszaninę barwnika NTA-Atto 647 N i białka przez 10 minut w ciemnym pomieszczeniu przy użyciu wirówki stołowej o sile około 8,161 g.</li>
	<li>Po doświadczeniu mieszaninę należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub w czasie eksperymentu na lodzie w celu ponownego użycia w ciągu kilku godzin, jeśli jest to konieczne, aby zapobiec denaturacji białka.</li>
	<li>Użyj wyszukiwarki stężeń NT, aby określić zakres stężeń potrzebny do miareczkowania.</li>
	<li>Doprowadzić Di-C8 PA do odpowiedniego maksymalnego stężenia w wodzie.</li>
	<li>Miareczkować analit, stosując seryjne rozcieńczanie w stosunku 1:1 w buforze PBS dla 16 stężeń w oparciu o poprzedni krok. W przeciwieństwie do SPR, termoforeza nie jest tak wrażliwa na różnice.</li>
</ol>
4. MST próbek
<ol>
	<li>Włącz urządzenie i podłączony laptop.</li>
	<li>Naciśnij strzałkę w górę z przodu maszyny i wysuń stojak na kapilary.</li>
	<li>Załaduj kapilary do stojaka o najwyższym stężeniu w pozycji 1.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym wybierz czerwony kanał odpowiadający NTA-Atto 647 N.</li>
	<li>Wprowadź informacje o stężeniu, położeniu i nazwie dla każdej kapilary w tabeli naczyń włosowatych.</li>
	<li>Uruchom skanowanie kapilarne, naciskając Start Cap Scan przy 20% diodzie LED (ustawienie wstępne) i dostosuj zgodnie z 200 do 2000 jednostek fluorescencji za pomocą ustawień intensywności diody LED lub stężenia liganda (znakowanego białka).</li>
	<li>Wybierz zakres mocy MST.</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie nasadki + pomiar MST.</li>
	<li>Analizuj za pomocą oprogramowania analitycznego.</li>
</ol>
5. Analiza danych MST
UWAGA: Oprogramowanie do analizy dostarczone przez Nanotemper jest zastrzeżone i jest wykonywane przy użyciu analizy powinowactwa M.O. Istnieją różne sposoby pomiaru powinowactwa wiązania w oparciu o fluorescencję lub termoforezę. Nowsze wersje tego oprogramowania są wstępnie ustawione na automatyczną ocenę danych za pomocą termoforezy i są zaprogramowane na korzystanie z termoforezy z Tjump wykorzystującym oba pomiary. Alternatywnie można wybrać sam Tjump lub samą termoforezę. Dodatkowo oprogramowanie analityczne umożliwia oszacowanie powinowactwa za pomocą wstępnej fluorescencji. Dostęp do tych ustawień można uzyskać tylko w trybie eksperta.
<ol>
	<li>Ustaw strategię oceny w oprogramowaniu analitycznym na ekspert, klikając pole błyskawicy obok zestawu danych na ekranie Wybór danych. Oprogramowanie analityczne jest wstępnie ustawione na analizę MST; jednak badacz może wybrać opcję Utwórz nową analizę i wybrać opcję Wstępna analiza fluorescencji, aby oszacować powinowactwo wiązania na podstawie początkowej fluorescencji. Dostępny jest również tryb Expert dla wstępnej fluorescencji. W opisanej poniżej analizie zastosowano termoforezę i Tjump w celu oznaczenia KD prezentowanego Vam7-His8 z jego naturalnym substratem, kwasem lipidowym fosfatydowym.</li>
</ol>

<ol><li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScale+Thermophoresis%3A+Interaction+analysis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
<li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues%3A+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li>
<li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li>
<li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li>
<li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+%28Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor%29+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+%28Phox+Homology%29+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li>
<li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li>
<li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+proteins%3A+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunitat+und+Infektion%22%5BJournal%5D)">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li>
<li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li>
<li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li>
<li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening%3A+A+European+Lead+Factory+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li>
<li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA%2B+protein+NSF%2FSec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak potencjalnego konfliktu interesów.

Określenie wiązania Vam7-His8 z DiC8-PA zapewniło solidnie dopasowany KD dla danej interakcji, który ma nieco niższe powinowactwo niż zmierzone KD liposomów Vam7-His8 do PA (nieopublikowane). Różnica ta jest najprawdopodobniej spowodowana brakiem błony, co na ogół skutkuje niższym powinowactwem do specyficznych dla błony interakcji wiązania lipidów, a zatem pokazuje rolę rusztowania błony liposomowej w tej interakcji11.
<p class="jove_c...

Termoforeza w mikroskali jest stosunkowo nową techniką w określaniu stałych dysocjacji (KD) oraz stałych inhibicji (IC50) pomiędzy biochemicznie istotnymi ligandami. Wiodący komercyjny sprzedawca MST (np. NanoTemper) oferuje dwie popularne technologie MST: 1) Bezznacznikowy MST wymagający znacznika fluorescencyjnego oraz 2) znakowana termoforeza wykorzystująca naturalną fluorescencję białek zależną od liczby reszt aromatycznych obecnych w każdym białku1. Wadą termoforezy bezznacznikowej jest to, że w większości przypadków nie pozwala ona na pomiar oddziaływań białko-białko. Możliwe jest jednak zmodyfikowanie białek bez aminokwasów aromatycznych, takich jak tryptofan, do stosowania w termoforezie bez etykiety2.
MST mierzy ruch cząstek w odpowiedzi na indukcję mikroskopijnych pól temperatury zainicjowanych przez laser podczerwony w obecnie dostępnych technologiach1. MST może być używany do pomiaru interakcji białko-białko, interakcji białko-lipid, białka-mała cząsteczka, eksperymentów konkurencyjnych, a nawet interakcji między małymi cząsteczkami, o ile można wytworzyć wystarczającą separację sygnału. Dodatkowo, MST pozwala na pomiar interakcji opartych na błonie-białku osadzonych w liposomach lub nanodyskach. Znakowana termoforeza wykorzystuje zastosowanie znaczników znakowanych fluorescencyjnie, co pozwala na chemicznie kontrolowaną separację sygnału między ligandem a analitem. WartościK D można uzyskać za pomocą termoforezy dla interakcji obejmujących wiązanie białek przy niskich stężeniach nanomolowych, co w większości przypadków jest znacznie niższym stężeniem białka niż to, co jest wymagane dla kalorymetrii izotermicznej (ITC)3. Dodatkowo, MST nie ma ścisłych wymagań dotyczących buforowania, jak jest to wymagane dla powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)4, a znakowana termoforeza może być nawet używana do pomiaru stałych wiązania białek będących przedmiotem zainteresowania z nie w pełni oczyszczonych roztworów białkowych5 z genetycznie wstawionymi znacznikami fluorescencyjnymi6. Wadą MST jest to, że parametrów kinetycznych nie można łatwo uzyskać dla MST, jak w SPR2.
Pomiary termoforezy zależą od lokalnej różnicy temperatur roztworu. Ciepło to może być generowane przez laser na podczerwień. Urządzenie MST posiada detektor fluorescencji sprzężony z wiązką podczerwieni (IR) i może wychwytywać zmiany fluorescencji na podstawie lokalnych zmian stężenia cząsteczek fluorescencji w punkcie, w którym celowany jest laser IR. Urządzenie MST wykorzystuje laser ukierunkowany na podczerwień sprzężony bezpośrednio z detektorem fluorescencji skupionym w tym samym punkcie, w którym wytwarzane jest ciepło w roztworze. Pozwala to na solidne wykrywanie zmian temperatury odpowiadających zubożeniu cząsteczek w punkcie ciepła generowanego przez laser IR. Zmierzona fluorescencja na ogół zmniejsza się bliżej lasera IR w odpowiedzi na wzrost temperatury. Różnice mierzone w wyniku mogą wynikać z wielu czynników, w tym ładunku, wielkości lub entropii solwatacji. Różnice te są mierzone jako zmiany fluorescencji w odpowiedzi na indukcję ciepła lub ruch cząsteczek z gorących do chłodniejszych części naczynia włosowatego.
Podczas ładowania kapilary danym roztworem, ważne jest, aby pozostawić powietrze na obu końcach kapilary i nie obciążać kapilary całkowicie pełnej. W komercyjnej kapilarze mieści się około 10 μl roztworu. Można osiągnąć dokładne pomiary przy użyciu 5 μl roztworu, o ile roztwór jest manipulowany do środka kapilary, nie ma pęcherzyków powietrza (potencjalnie odgazowuje się przed załadowaniem kapilary) i należy zachować ostrożność przy ładowaniu stojaka, aby nie przepychać roztworu ze środka kapilary, gdzie celowany jest laser na podczerwień. Jeśli laser nie wejdzie w pełny kontakt z roztworem, wynikiem najprawdopodobniej będzie jeden z trzech bezużytecznych wyników dla tego stężenia: 1) brak lub niska detekcja fluorescencji, 2) wyższa detekcja fluorescencji (potencjalnie z postrzępionym pikiem) lub 3) detekcja fluorescencji w innych wartościach z danego miareczkowania, ale z postrzępionym i niezaokrąglonym pikiem.
Dla termoforezy znakowanej optymalne jest posiadanie sygnału fluorescencji powyżej 200 i poniżej 2000 jednostek fluorescencji7. Urządzenie MST wykorzystuje zakres intensywności diod LED od 0 do 100, które można wybrać tak, aby uzyskać sygnał powyżej 200 lub poniżej 2000. Alternatywnie można użyć różnych stężeń znakowanego liganda, aby zmodyfikować sygnał fluorescencji do optymalnego poziomu. Ważne jest, aby przeprowadzić skanowanie nasadki z danym pomiarem MST jako odniesieniem podczas analizy danych, ponieważ słabe skanowanie nasadki może często skutkować punktem, który można później określić jako wartość odstającą. Każdy przebieg powinien zająć około 30 minut, jeśli mierzy się pojedynczą moc MST za pomocą skanowania nasadki. Komercyjne urządzenia pozwalają na zmiany mocy MST. W starszych wersjach oprogramowania można to ustawić w zakresie od 0 do 100; a w nowszych wersjach można wybrać niski, średni lub wysoki MST. Aby uzyskać wiarygodne ślady, badacz może być zmuszony do wypróbowania każdego z nich i zdecydowania, które ustawienie MST daje najbardziej wiarygodne dane dla danej interakcji.

<table><tbody><tr><td>Cy5 Maleimid Mono-Reactive Dye</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>Do etykietowania białek</td></tr><tr><td>Graphpad Prsim</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td>Graphpad</tr><tr><td>Monolith NT.115 Kapilary (1000 sztuk)</td><td>Nanotemper</td><td>MO-K022</td><td>Kapilary do MST</td></tr><tr><td>Monolith NT.115</td><td>maszyna Nanotemper</td><td></td><td>Sprzęt uniwersytecki</td></tr><tr><td>NTA-Atto 647 N</td><td>Sigma</td><td>Etykieta 2175</td><td>dla Jego tagów</td></tr><tr><td>Fosfatydyloinozytol 3-fosforan diC8 (PI(3)P diC8)</td><td>Echelon</td><td>P-3008</td><td>Lipid do eksperymentów wiążących</td></tr></tbody></table>

zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Zdolność do określania powinowactwa wiązania lipidów z białkami jest istotną częścią zrozumienia interakcji białko-lipid w transporcie błonowym, transdukcji sygnału i przebudowie cytoszkieletu. Klasycznymi narzędziami do pomiaru takich oddziaływań są powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC). Chociaż są to potężne narzędzia, podejścia te mają wady. ITC wymaga dużych ilości oczyszczonego białka, a także lipidów, które mogą być kosztowne i trudne do wyprodukowania. Co więcej, zarówno ITC, jak i SPR są bardzo czasochłonne, co może znacznie zwiększyć koszty przeprowadzania tych eksperymentów. Jednym ze sposobów na ominięcie tych ograniczeń jest zastosowanie stosunkowo nowej techniki termoforezy w mikroskali (MST). MST jest szybki i opłacalny przy użyciu niewielkich ilości próbki w celu uzyskania krzywej nasycenia dla danego zdarzenia wiązania. Obecnie dostępne są dwa rodzaje systemów MST. Jeden rodzaj MST wymaga znakowania fluoroforem w widmie niebieskim lub czerwonym. Drugi system opiera się na wewnętrznej fluorescencji aminokwasów aromatycznych w zakresie UV. Oba systemy wykrywają ruch cząsteczek w odpowiedzi na miejscową indukcję ciepła z lasera na podczerwień. Każde podejście ma swoje zalety i wady. Bezznacznikowy MST może wykorzystywać nieoznakowane białka natywne; jednak wiele analitów, w tym farmaceutyków, fluoryzuje w zakresie UV, co może zakłócać określenie dokładnych wartości KD. Dla porównania, znakowany MST pozwala na większą różnorodność mierzalnych oddziaływań parami przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie sond przymocowanych do ligandów o mierzalnych absorbancjach w zakresie widzialnym w przeciwieństwie do UV, ograniczając potencjał zakłóceń sygnałów z analitów.

Jest to przykładowy wynik analizy powinowactwa. Oznakowany MST został wykorzystany do oznaczenia stałej wiązania Vam7-His8&#160;do rozpuszczalnego dioctanoilowego (DiC8) PA jednego z jego naturalnych substratów9. Rysunek 1 przedstawia ślady termoforetyczne z jednej próby miareczkowania DiC8 PA w stosunku 1:1, rozpoczynając od 500 μM przeciwko 50 nM Vam7-His8. Przedstawiono fluorescencję początkową (czas przed włączeniem lasera podczerwonego), Tjump (czas bezpośrednio ...

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Znakowana termoforeza w mikroskali skutecznie uzyskuje stałe dysocjacji lub KD różnych interakcji biochemicznych. Protokół ten i towarzyszący mu film wskazują na przybliżone powinowactwo do kwasu fosfatydowego do Vam7, jedynego rozpuszczalnego białka SNARE w drożdżach. Jest to sposób, w jaki Vam7 wiąże się z dwiema błonami przed interakcją z innymi białkami.Metoda ta pozwala szybko uzyskać KD dla różnych interakcji biochemicznych przy niskich kosztach, z wysoką odtwarzalnością i przy minimalnym koszcie białka. Technika ta jest odpowiednia dla pierwszego etapu rozwoju farmaceutycznego, pozwalając na łatwe do uzyskania KD w celu określenia potencjalnych związków wiodących. Przed rozpoczęciem analizy włącz wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia MST i otwórz oprogramowanie sterujące.Upewnij się, że komputer jest podłączony do urządzenia i jest w stanie połączenia, a następnie ustaw MST Przed na 3 sekundy, MST na 30 sekund, a Odzyskiwanie fluorescencji na po 1 sekundzie. Dla każdej rurki kapilarnej wprowadź nazwę liganda docelowego, nazwę analitu liganda, stężenie celu i najwyższe stężenie miareczkowania przy użyciu współczynnika miareczkowania z autouzupełnianiem. Wybierz zakres mocy MST i wprowadź wartości dla każdej mocy, aby przetestować najsolidniejsze dopasowanie wiązania.Aby przygotować znakowane próbki MST, należy rozcieńczyć roztwór Vam7-oktahistydyny do stężenia 200 nanomolowych i barwnika NTA-Atto 647 do stężenia 100 nanomolowych, oba w PBS. Wymieszaj Vam7-oktahistydynę i barwnik NTA-Atto 647 w stosunku objętościowym 1:1 i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez 30 minut. Pod koniec inkubacji odwirować mieszaninę barwnika i białka i przechowywać roztwór w temperaturze 4 stopni Celsjusza do kilku godzin przed użyciem.Następnie przygotuj próbkę, weź barwiony ligand i naświetl analit. W celu termoforezy próbki w mikroskali należy otworzyć urządzenie i wysunąć stojak kapilarny. Załaduj kapilary na próbki do stojaka o najwyższym stężeniu w pozycji pierwszej i wybierz kanał czerwony w oprogramowaniu sterującym.Następnie załaduj stojak do instrumentu. Następnie wybierz zakres mocy MST i rozpocznij pomiar MST Cap Scan i oceń reakcję na zmianę. Poniżej przedstawiono ślady termoforetyczne z jednej próby miareczkowania 1:1 DiC8 PA, zaczynając od 500 mikromoli w stosunku do 50 nanomolowych NTA-Atto 647 znakowanych domeną Vam7.Można zaobserwować początkową fluorescencję, przeskok w czasie i termoforezę, co pozwala na obliczenie KD na podstawie dowolnego z tych pomiarów lub ich kombinacji. Na podstawie tych wyników można wykreślić krzywą nasycenia, na przykład dla termoforezy z wyjściem skoku w czasie, jak pokazano na wykresie. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki MST określa się za pomocą skali logarytmicznej, biorąc pod uwagę stężenie białka w celu określenia powinowactwa wiązania poprzez wybór modelu KD i wprowadzenie stężenia białka.Wykonując ten protokół, upewnij się, że roztwór znajduje się w środku kapilary i że nie ma pęcherzyków powietrza oraz że w kapilarze nie ma kurzu ani roztworu na zewnątrz kapilary. Izotermiczna kalorymetria miareczkowa lub powierzchniowy rezonans plazmonowy mogą być wykorzystane do walidacji uzyskanego eksperymentalnego KD. Jeśli istnieje potencjalne powiązanie kooperacyjne, ITC będzie następną wykonaną metodą logiczną, biorąc pod uwagę zasoby.Technika ta umożliwiła tradycyjnym naukowcom zajmującym się biologią włączenie biofizycznych technik przesiewowych do swoich badań w celu określenia zależności między szlakami. Jednym z przykładów tej techniki jest lizaza komórkowa z białkiem docelowym ulegającym endogennej ekspresji, przy czym znacznik GFP jest nowatorskim sposobem przeprowadzenia tradycyjnego testu pull-down.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje termoforezę w mikroskali do badania interakcji białko-lipid. Test wykrywa interakcję między cząsteczkami poprzez ilościowe określenie ruchu termoforetycznego białek znakowanych fluorescencyjnie w odpowiedzi na gradient temperatury. Cząsteczka fluorescencyjna jest mieszana z różnymi stężeniami niefluorescencyjnych cząsteczek lipidów, a mieszanina cząsteczek w roztworze jest ładowana do naczyń włosowatych. Do próbek w kapilarach stosuje się gradient temperatury, a ruch...

Termoforeza w mikroskali do badania interakcji białko-lipid w roztworze

Ten film demonstruje technikę dyssypatywnej mikrograwimetrii do badania wiązania białek z dwuwarstwami lipidów. Małe pęcherzyki jednowarstwowe są dodawane w celu pokrycia powierzchni czujnika kwarcowego mikrowagi. Wykorzystując zależne od jonów wapnia wiązanie docelowego białka wiążącego fosfolipidy z dwuwarstwą, monitorowane są zmiany częstotliwości oscylacji czujnika i rozproszenie oscylacji w celu określenia charakteru wiązania dwuwarstwy białkowo-lipidowej.

Technika mikrograwimetrii dyssypatywnej do badania interakcji białkowo-lipidowej dwuwarstwowej

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Poznaj mikroskalową termoforezę do pomiaru stałych dysocjacji interakcji białko-lipid. Ta metoda pozwala szybko i tanio określić KD dla białka Vam7 i kwasu fosfatydowego, wspierając wczesny etap rozwoju farmaceutycznego.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Przeglądaj więcej filmów