Name: Monitorowanie przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T pochodzącymi z kropli krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do oceny przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T z kropli krwi obwodowej pacjentów onkologicznych. Ta technika umożliwia identyfikację podzbiorów komórek odpowiedzialnych za efekty przeciwnowotworowe i niepożądane zdarzenia immunologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty dla S.K. od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki KAKENHI (JP17K16045) oraz Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (JP18cm0106335 i 19cm0106310).

Pobieranie próbek zostało przeprowadzone podczas rutynowych procedur klinicznych. Wszystkie próbki ludzkie zostały pobrane po uzyskaniu świadomej zgody uczestników, zgodnie z Deklaracją Helsińską i za zgodą komisji etycznej Graduate School of Medicine, Osaka University, Japonia (15383 i 752).
1. Przygotowanie i barwienie próbki krwi pełnej
<ol>
	<li>Pobrać próbki krwi pełnej do probówek do pobierania krwi zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). 
	UWAGA: Pobieranie krwi można wykonać za pomocą zwykłej igły lub lancetu do krwi.</li>
	<li>Przenieść 20 μl próbek krwi pełnej do 5 ml okrągłodennych probówek do cytometrii przepływowej z polistyrenu. 
	UWAGA: Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie komórek z probówkami, 1 ml 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dodaje się do probówek i wiruje przez 10 s przed nałożeniem na próbki.</li>
	<li>Dodaj 20 μl 2% FBS do PBS.</li>
	<li>Dodać 10 μl specyficznego dla człowieka odczynnika blokującego FcR. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu do lizy czerwonych krwinek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 4 ml 2% FBS do PBS i odwirowywać komórki przy 400 x g (1 500 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant przez aspirację.</li>
	<li>Powtórz proces mycia i aspiracji opisany w kroku 1.6.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w 100 μl 2% FBS w PBS i podziel na dwie probówki po 50 μl każda.</li>
	<li>Dodać przeciwciała markerowe powierzchniowe (Tabela 1). Dobrze wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	UWAGA: Podczas profilowania statusu immunologicznego limfocytów T liczbę markerów można zwiększyć w oparciu o jakość cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Umyj próbki 2 razy, jak opisano w kroku 1.6.</li>
	<li>Zawieś komórki w 200 μl 2% FBS w PBS.</li>
</ol>
2. Analiza cytometryczna przepływowa
<ol>
	<li>Włóż probówki do cytometru przepływowego i pobierz komórki, zasadniczo postępując zgodnie z zalecanym protokołem9.</li>
	<li>Zarejestruj 10 000 zdarzeń jako bramkę limfocytów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i wyeksportuj dane przepływu jako pliki .fcs do analizy.</li>
	<li>Otwórz pliki w oprogramowaniu analitycznym. Wizualizuj komórki na wykresie limfocytów z rozproszeniem do przodu (FSC) (A) i rozrzuceniu bocznym (SSC) (A) oraz na wykresie bramki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Po wybraniu pojedynczych komórek za pomocą FSC (H) vs. FSC (W) i SSC (H) vs. SSC (W) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) i wyświetleniu ich na wykresie CD3 vs. CD8 lub CD3 vs. CD4, bramka odpowiednio komórek T CD8 i limfocytów T CD4 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Po wybraniu bramkowanych komórek i wyświetleniu ich na wykresie PD-1 w porównaniu z ludzką IgG4, zidentyfikuj komórki T CD8 i CD4 związane z przeciwciałem blokującym PD-1 na podstawie kontroli izotypu (<silna klasa = "xfig" >Figura 1D).</li>
</ol>

<ol><li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy%3A+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).</li>
<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy%3A+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li>
<li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities%3A+a+collaborative+position+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).</li>
<li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).</li>
<li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li>
<li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+CD8%28%2B%29+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li>
<li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiamy metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do wykrywania przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T pochodzącymi z kropli krwi obwodowej, którą pierwotnie opracowaliśmy do wykrywania niwolumabu10. Chociaż ta technika jest bardzo prosta i łatwa do wykonania, należy zwrócić uwagę na dwa ważne punkty, aby uzyskać dokładne wyniki. Jednym z nich jest to, że do wykrywania cząsteczek PD-1 należy zastosować odpowiednie przeciwciało, które konkuruje z niwolumabem i...

Przeciwciała blokujące PD-1 stały się standardowym wyborem w leczeniu różnych rodzajów raka, w tym niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC)1,2,3,4. Wykazują one niezwykły efekt terapeutyczny w podgrupie pacjentów z rakiem, którzy nie zareagowali na konwencjonalne chemioterapii cytotoksyczne. Jednak inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI), które zawierają przeciwciała blokujące PD-1, mogą powodować unikalne i odrębne spektrum zdarzeń niepożądanych, określanych jako zdarzenia niepożądane związane z odpornością (irAEs)5. Chociaż irAE mogą wpływać na prawie wszystkie tkanki, najczęściej obserwuje się je w przewodzie pokarmowym, gruczołach dokrewnych, skórze i wątrobie, a także mogą powodować świąd, wysypkę, nudności, biegunkę i zaburzenia tarczycy6,7. Ogólnie rzecz biorąc, większość irAE pojawia się w ciągu 1 do 2 miesięcy po rozpoczęciu ICI. Jednak w niektórych przypadkach mogą wystąpić później niż 1 rok po rozpoczęciu leczenia lub nawet po zaprzestaniu leczenia6,7. Powodują również różne objawy, które mogą być trudne do odróżnienia od innych patologii. W związku z tym szybkie zdiagnozowanie irAE i odpowiednie ich leczenie może być trudne. irAE mogą wpływać na wszystkie tkanki, a na ich wystąpienie duży wpływ mają krążące komórki odpornościowe, zwłaszcza limfocyty T związane z przeciwciałami blokującymi PD-1. Dlatego prosta i minimalnie inwazyjna metoda monitorowania limfocytów T ukierunkowanych na przeciwciała jest ważna w warunkach klinicznych.
Tutaj opracowaliśmy prostą metodę oceny wiązania przeciwciał blokujących PD-1 z limfocytami T za pomocą kropli pełnej krwi obwodowej od pacjentów z rakiem, którzy otrzymywali niwolumab lub pembrolizumab. Stosując to podejście, byliśmy w stanie monitorować każde z poniższych: 1) czas wiązania przeciwciał z limfocytami T, 2) zajmowanie cząsteczek PD-1 limfocytów T przez przeciwciała terapeutyczne oraz 3) stan aktywacji i cechy immunologiczne limfocytów T. Ta metoda jest modyfikacją wcześniej zgłoszonej techniki8. Wymagana ilość krwi jest prawie taka sama, jak ta potrzebna do badania glukozy, a podejście to nie wymaga wzbogacania komórek jednojądrzastych ani kohodowli przeciwciałami blokującymi PD-1. Potwierdziliśmy, że metodę tę można również przeprowadzić przy użyciu zamrożonych próbek, w tym komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) oraz komórek z wysięku opłucnowego, wysięku osierdziowego, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i płynu mózgowo-rdzeniowego, co sugeruje, że strategia ta może być przydatna w kontekście badania wieloośrodkowego. Metoda ta może ułatwić wczesną diagnostykę irAEs, a także pomóc w ustaleniu odpowiednich terapii immunosupresyjnych w celu opanowania ich objawów oraz określenia optymalnego czasu na rozpoczęcie kolejnych terapii po inhibitorach PD-1.

<table><tbody><tr><td>10X bufor do lizy RBC (wielogatunkowy)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4300-54</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD4 APC/Cyjaniny7</td><td>Klon BioLegend</td><td>300518</td><td>RPA-T4</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II Cytometr</td><td></td><td></td><td></td>przepływowy BD</tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anty-ludzkie przeciwciało CD8a</td><td>BioLegend</td><td>301048</td><td>Klon RPA-T8</td></tr><tr><td>Fosforan Dulbecco Buforowana sól fizjologiczna</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Falcon Probówki z polistyrenu okrągłodennego</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>352058</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>FLOWJO</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12676029</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna IgG1 - kontrola izotypu</td><td>abcam</td><td>ab81200</td><td></td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-ludzka IgG4 Fc</td><td>abcam</td><td>ab99825</td><td>Klon HP6025</td></tr><tr><td>Pacific Blue Mysz anty-ludzka CD3</td><td>BD 558117</td><td></td><td>Klon UCHT1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mysz anty-ludzka CD279 (PD-1)</td><td>BD</td><td>561272</td><td>Klon EH12.1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mysz IgG1 &kappa; Isotype Control</td><td>BD</td><td>557646</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie przeciwciał blokujących pd-1 związanych z limfocytami t pochodzącymi z kropli krwi obwodowej

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, w tym przeciwciała blokujące PD-1, znacznie poprawiły wyniki leczenia różnych rodzajów raka. Skuteczność farmakologiczna tych immunoterapii jest długotrwała, wykraczająca nawet poza przerwanie ich wstrzykiwań, ze względu na utrzymujące się stężenia we krwi. W tym miejscu opracowaliśmy prosty test cytometrii przepływowej w celu oceny statusu wiązania limfocytów T przeciwciał blokujących PD-1 niwolumabu i pembrolizumabu. Podobnie jak test glukozy, test ten wymaga tylko jednej kropli krwi obwodowej. Wizualizacja wiązania przeciwciał na limfocytach T jest bardziej wiarygodna niż pomiar stężenia przeciwciał we krwi. Ponadto, jeśli to konieczne, możemy potencjalnie przeanalizować wiele charakterystycznych markerów związanych z odpornością na limfocytach T związanych z przeciwciałami blokującymi PD-1. Jest to zatem prosta i minimalnie inwazyjna strategia analizy farmakologicznego efektu przeciwciał blokujących PD-1 u pacjentów z rakiem.

Strategia bramkowania i analiza cytometryczna (Rysunek 1) pozwalają na wykrycie wiązania przeciwciała blokującego PD-1 z limfocytami T uzyskanymi z jednej kropli krwi obwodowej pacjenta z NSCLC. Przed podaniem przeciwciała blokującego PD-1 nie stwierdza się obecności ludzkich limfocytów T CD8 lub CD4 wykazujących dodatni wynik dla IgG4, a ekspresję PD-1 można potwierdzić za pomocą przeciwciała wykrywającego PD-1 (EH12.1) (Rysunek 2A). Po podaniu...

Opracowaliśmy prosty test cytometrii przepływowej do oceny wiązania przeciwciał blokujących PD-1 z limfocytami T, wymagający jedynie kropli krwi obwodowej od pacjentów z rakiem.

Monitorowanie przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T pochodzącymi z kropli krwi obwodowej

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Ponieważ metoda ta określa komórki związane z przeciwciałami blokującymi PD-1 przy użyciu krwi obwodowej od pacjentów, można zidentyfikować specyficzny podzbiór odpowiedzialny za działanie przeciwnowotworowe i zdarzenia niepożądane związane z odpornością. Ta metoda wymaga tylko niewielkiej ilości próbki krwi, a proces analizy jest dość prosty i szybki. Potrzebuje tylko maszyny do cytometrii przepływowej.Na początek zbierz próbki krwi pełnej do probówek do pobierania krwi zawierających EDTA. Potraktuj każdą pięciomililitrową probówkę do cytometrii przepływowej z polistyrenu o okrągłym dnie jednym mililitrem 2% płodowej surowicy bydlęcej w PBS. Wiruj przez 10 sekund.Następnie przenieś 20 mikrolitrów próbek krwi pełnej do traktowanych pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem. Dodaj 20 mikrolitrów 2% FBS w PBS i 10 mikrolitrów specyficznego dla człowieka odczynnika blokującego receptor FC. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy czerwonych krwinek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj cztery mililitry 2% FBS do PBS i wiruj komórki 400 razy g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.Usunąć supernatant przez aspirację. Powtórz proces prania i aspiracji. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach 2% FBS w PBS i podzielić na dwie probówki po 50 mikrolitrów każda.Dodać przeciwciała markerowe powierzchniowe. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj próbki dwukrotnie w 2%FBS w PBS, jak poprzednio.Ponownie zawiesić ogniwa w 200 mikrolitrach 2% FBS w PBS. Włóż probówki do cytometru przepływowego i pobierz komórki zgodnie z zalecanym protokołem. Rejestruj 10 000 zdarzeń jako bramkę limfocytów i eksportuj dane przepływu jako pliki FCS do analizy.Otwórz pliki w oprogramowaniu analitycznym i kliknij plik kontroli izotypu, aby wyświetlić komórki na wykresie rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu rozproszenia bocznego i limfocytów bramkowych. Wybierz pojedyncze komórki za pomocą FSCH w porównaniu z FSCW i SSCH w porównaniu z SSCW i wyświetl je na wykresie CD3 w porównaniu z CD8 lub CD3 w porównaniu z CD4. Bramka odpowiednio limfocytów T CD8 i limfocytów T CD4.Wybierz bramkowane komórki i wyświetl je na wykresie PD-1 w porównaniu z ludzką IgG4. A następnie, w oparciu o kontrolę izotypu, wybierz Q3, aby zidentyfikować limfocyty T CD8 i CD4 związane z przeciwciałem blokującym PD-1. W tym badaniu strategia bramkowania i analiza cytometrii przepływowej wykryły wiązanie przeciwciała blokującego PD-1 z limfocytami T uzyskanymi z kropli krwi obwodowej pacjenta.Wykres PD-1 w porównaniu z ludzką IgG4 pokazuje status wiązania przeciwciał blokujących PD-1 na limfocytach T. Pomarańczowe kropki i czarne kropki wskazują odpowiednio barwienie przeciwciałem anty-IgG4 i kontrolą izotypu. Przed podaniem przeciwciała blokującego PD-1 nie było ludzkich limfocytów T IgG4 CD8 lub CD4, a ekspresja PD-1 została potwierdzona przez przeciwciało wykrywające PD-1.Po podaniu niwolumabu lub pembrolizumabu IgG4 można wykryć na limfocytach T za pomocą przeciwciała anty-IgG4, podczas gdy przeciwciało wykrywające PD-1 EH12.1 nie rozpoznaje żadnego PD-1 na limfocytach T. Czerwona, niebieska i zielona bramka oznaczają odpowiednio całkowite wiązanie, częściowe wiązanie i utratę wiązania. Po odstawieniu niwolumabu i pembrolizumabu zmniejszył się stan wiązania przeciwciał blokujących PD-1 z limfocytami T CD8.Nastąpiło częściowe wiązanie i ostatecznie całkowita utrata wiązania. Upewnij się, że próbka krwi została również zmieszana z lizą RBC. Również mieszanie lizy RBC przed barwieniem markerem powierzchniowym jest kluczowym krokiem w tej metodzie.Jeśli badacz ma dostęp do zaawansowanej maszyny do cytometrii przepływowej, limfocyty T związane z przeciwciałem blokującym PD-1 mogą być oceniane za pomocą coraz większej liczby markerów związanych z Ta strategia może być stosowana do profilowania fenotypów limfocytów T odpowiedzialnych za zdarzenia niepożądane wywołane przez przeciwciała blokujące PD-1. Pobieranie próbek od pacjentów z rozwiniętymi zdarzeniami niepożądanymi jest ważne dla oceny użyteczności tej strategii.

monitoring-pd-1-blocking-antibodies-bound-to-t-cells-derived-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej.  Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Protokół opisuje technikę badania zdolności pierwotnych poliklonalnych ludzkich limfocytów T do tworzenia interfejsów synaptycznych za pomocą płaskich dwuwarstw lipidowych. Używamy tej techniki, aby pokazać zróżnicowaną zdolność tworzenia synaps ludzkich pierwotnych limfocytów T pochodzących z węzłów chłonnych i krwi obwodowej.

Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej

Charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) jest popularnym tematem w badaniach translacyjnych. Protokół ten opisuje półautomatyczny test immunofluorescencyjny (IF) do charakterystyki PD-L1 i liczenia CTC w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC).

Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

Użycie referencyjnych odczynników do testów uwalniania cytokin pozwala na bardziej powtarzalne i standaryzowane profile bezpieczeństwa in vitro immunoterapeutycznych przeciwciał monoklonalnych. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób testy uwalniania cytokin mogą być stosowane wraz z referencyjnym panelem odczynników do przewidywania bezpieczeństwa niektórych terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych.

Stosowanie odczynników referencyjnych w celu potwierdzenia odporności testów uwalniania cytokin w celu przewidywania bezpieczeństwa przeciwciał monoklonalnych

Inhibitory punktów kontrolnych są ważnymi celami w opracowywaniu terapii do walki z rakiem. Raport ten przedstawia nową szczepionkę przeciwnowotworową opartą na peptydzie PDL1, PDL1-Vaxx, która indukuje neutralizującą produkcję przeciwciał poliklonalnych, które blokują tworzenie kompleksu PD-1 / PDL1. Praca ta szczegółowo opisuje również rozwój i testowanie testu opartego na koralikach fluorescencyjnych do analizy tej aktywności.

Magnetyczna analiza przepływu podwójnego reportera oparta na kulkach magnetycznych blokady przeciwciał wywołanych szczepionką peptydu PDL1-Vaxx w interakcji PD-1/PD-L1

Ten protokół opisuje test blokady dla inhibitorów PD-1/PD-L1 przy użyciu technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Wykorzystuje dwuetapową strategię unieruchomienia i dostosowany system buforowy do dokładnego pomiaru jednostek reakcji, ułatwiając ocenę wskaźników blokady dla związków lub leków biologicznych. Dodatkowo wspomaga wysokoprzepustową identyfikację inhibitorów PD-1/PD-L1.

Identyfikacja inhibitorów PD-1/PD-L1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do oceny przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T z kropli krwi obwodowej pacjentów onkologicznych. Ta technika umożliwia identyfikację podzbiorów komórek odpowiedzialnych za efekty przeciwnowotworowe i niepożądane zdarzenia immunologiczne.

Monitorowanie przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T pochodzącymi z kropli krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów