Monitorowanie przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T pochodzącymi z kropli krwi obwodowej

Ponieważ metoda ta określa komórki związane z przeciwciałami blokującymi PD-1 przy użyciu krwi obwodowej od pacjentów, można zidentyfikować specyficzny podzbiór odpowiedzialny za działanie przeciwnowotworowe i zdarzenia niepożądane związane z odpornością. Ta metoda wymaga tylko niewielkiej ilości próbki krwi, a proces analizy jest dość prosty i szybki. Potrzebuje tylko maszyny do cytometrii przepływowej.

Na początek zbierz próbki krwi pełnej do probówek do pobierania krwi zawierających EDTA. Potraktuj każdą pięciomililitrową probówkę do cytometrii przepływowej z polistyrenu o okrągłym dnie jednym mililitrem 2% płodowej surowicy bydlęcej w PBS. Wiruj przez 10 sekund.

Następnie przenieś 20 mikrolitrów próbek krwi pełnej do traktowanych pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem. Dodaj 20 mikrolitrów 2% FBS w PBS i 10 mikrolitrów specyficznego dla człowieka odczynnika blokującego receptor FC. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy czerwonych krwinek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj cztery mililitry 2% FBS do PBS i wiruj komórki 400 razy g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Usunąć supernatant przez aspirację. Powtórz proces prania i aspiracji. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach 2% FBS w PBS i podzielić na dwie probówki po 50 mikrolitrów każda.

Dodać przeciwciała markerowe powierzchniowe. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj próbki dwukrotnie w 2%FBS w PBS, jak poprzednio.

Ponownie zawiesić ogniwa w 200 mikrolitrach 2% FBS w PBS. Włóż probówki do cytometru przepływowego i pobierz komórki zgodnie z zalecanym protokołem. Rejestruj 10 000 zdarzeń jako bramkę limfocytów i eksportuj dane przepływu jako pliki FCS do analizy.

Otwórz pliki w oprogramowaniu analitycznym i kliknij plik kontroli izotypu, aby wyświetlić komórki na wykresie rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu rozproszenia bocznego i limfocytów bramkowych. Wybierz pojedyncze komórki za pomocą FSCH w porównaniu z FSCW i SSCH w porównaniu z SSCW i wyświetl je na wykresie CD3 w porównaniu z CD8 lub CD3 w porównaniu z CD4. Bramka odpowiednio limfocytów T CD8 i limfocytów T CD4.

Wybierz bramkowane komórki i wyświetl je na wykresie PD-1 w porównaniu z ludzką IgG4. A następnie, w oparciu o kontrolę izotypu, wybierz Q3, aby zidentyfikować limfocyty T CD8 i CD4 związane z przeciwciałem blokującym PD-1. W tym badaniu strategia bramkowania i analiza cytometrii przepływowej wykryły wiązanie przeciwciała blokującego PD-1 z limfocytami T uzyskanymi z kropli krwi obwodowej pacjenta.

Wykres PD-1 w porównaniu z ludzką IgG4 pokazuje status wiązania przeciwciał blokujących PD-1 na limfocytach T. Pomarańczowe kropki i czarne kropki wskazują odpowiednio barwienie przeciwciałem anty-IgG4 i kontrolą izotypu. Przed podaniem przeciwciała blokującego PD-1 nie było ludzkich limfocytów T IgG4 CD8 lub CD4, a ekspresja PD-1 została potwierdzona przez przeciwciało wykrywające PD-1.

Po podaniu niwolumabu lub pembrolizumabu IgG4 można wykryć na limfocytach T za pomocą przeciwciała anty-IgG4, podczas gdy przeciwciało wykrywające PD-1 EH12.1 nie rozpoznaje żadnego PD-1 na limfocytach T. Czerwona, niebieska i zielona bramka oznaczają odpowiednio całkowite wiązanie, częściowe wiązanie i utratę wiązania. Po odstawieniu niwolumabu i pembrolizumabu zmniejszył się stan wiązania przeciwciał blokujących PD-1 z limfocytami T CD8.

Nastąpiło częściowe wiązanie i ostatecznie całkowita utrata wiązania. Upewnij się, że próbka krwi została również zmieszana z lizą RBC. Również mieszanie lizy RBC przed barwieniem markerem powierzchniowym jest kluczowym krokiem w tej metodzie.

Jeśli badacz ma dostęp do zaawansowanej maszyny do cytometrii przepływowej, limfocyty T związane z przeciwciałem blokującym PD-1 mogą być oceniane za pomocą coraz większej liczby markerów związanych z Ta strategia może być stosowana do profilowania fenotypów limfocytów T odpowiedzialnych za zdarzenia niepożądane wywołane przez przeciwciała blokujące PD-1. Pobieranie próbek od pacjentów z rozwiniętymi zdarzeniami niepożądanymi jest ważne dla oceny użyteczności tej strategii.