Name: Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR do analizy ekspresji genów w pojedynczych neuronach, mikroglejach i astrocytach z jądra środkowego migdałka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca tutaj prezentowana została sfinansowana przez NIH HLB U01 HL133360 przyznany JS i RV, NIDA R21 DA036372 przyznany JS i EVB, oraz T32 AA-007463 przyznany Janowi Hoekowi na rzecz SJO'S.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Thomasa Jeffersona oraz Drexel University College of Medicine. Protokół został zatwierdzony przez Uniwersytet Thomasa Jeffersona i Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Model zwierzęcy
<ol>
	<li>Wprowadzić podskórnie dwa granulki siarczanu morfiny o powolnym uwalnianiu po 75 mg lub dwie granulki placebo dorosłym samcom szczurów Sprague-Dawley.
	<ol>
		<li>Używaj fartucha i rękawiczek odpowiednio do drobnych sterylnych operacji. W razie potrzeby ogol grzbiet szczura maszynką do strzyżenia.</li>
		<li>Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia. Znieczulić szczura około 20 s inhalacji izofluranu. Znieczulenie potwierdza utrata przytomności.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej grzbietu szczura nożyczkami wysterylizowanymi koralikami i oddziel skórę właściwą od ściany ciała za pomocą sondy wysterylizowanej koralikami. Włóż granulki pod skórę właściwą za pomocą kleszczy wysterylizowanych koralikami. Zszyć nacięcie zamknięte sterylną igłą. 
		UWAGA: Cała procedura trwa około 5 minut na szczura. Dla każdego szczura używane są świeże sterylne rękawiczki.</li>
		<li>Umieść szczura w klatce izolacyjnej w celu rekonwalescencji pooperacyjnej. Sprawdź bicie serca i regularny rytm oddechowy. Obserwuj szczura, aż odzyskasz przytomność. Oceń ból pooperacyjny.</li>
		<li>Oceń szczury 8 godzin po operacji i co 12 godzin po niej pod kątem rekonwalescencji i infekcji. Umieść szczury w klatce z resztą kohorty, gdy w pełni wyzdrowieją po operacji, około 24 godziny po operacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie naltreksonu (75 mg/kg) kohortom G i Withdrawal po 6 dniach ekspozycji na morfinę. 
	UWAGA: W tym reprezentatywnym eksperymencie wzięły udział cztery kohorty szczurów (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Mózg należy pobrać 6 dni po wprowadzeniu osadu lub 24 godziny po wstrzyknięciu naltreksonu.
	<ol>
		<li>Umieścić zwierzę w komorze izofluranu na około 30 s lub do momentu wystąpienia utraty przytomności, co wskazuje na brak ruchu i zmniejszoną częstość oddechów.</li>
		<li>Użyj ostrej gilotyny, aby szybko odciąć głowę zwierzęciu.</li>
		<li>Wypreparuj mózg z czaszki zwierzęcia.</li>
		<li>Użyj ostrej ręcznej brzytwy, aby wykonać następujące poważne nacięcia w usuniętym mózgu: Najpierw odetnij móżdżek i wyrzuć. Po drugie, oddziel pień mózgu od przodomózgowia za pomocą poprzecznego nacięcia. Po trzecie, wyciąć przodomózgowie i/lub pień mózgu z nacięciem strzałkowym w linii środkowej.</li>
		<li>Umieść przodomózgowie i pień mózgu w plastikowej formie do zatapiania tkanek z 3-4 cm środka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na dnie formy. Pozostałą część próbki pokryć OCT.</li>
		<li>Natychmiast umieścić plastikową formę do zatapiania tkanek z próbką pokrytą OCT w kąpieli zawierającej suchy lód i metanol. Nie pozwól, aby metanol rozlał się do formy do zatapiania tkanek. Formę do zatapiania wraz z próbką mózgu należy przechowywać w kąpieli metanolowo-lodowej do momentu zakończenia pobierania tkanek (maksymalnie ~10-15 minut).</li>
		<li>Umieść próbkę mózgu w zamrażarce o temperaturze -80 °C tak szybko, jak to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieraj próbki jelit jednocześnie.
	<ol>
		<li>Po szybkim ścięciu głowy wykonaj nacięcie w linii środkowej brzucha zwierzęcia za pomocą skalpela.</li>
		<li>Znajdź jelito ślepe i przerwij jego połączenie z okrężnicą wstępującą.</li>
		<li>Wyciśnij zawartość jelita ślepego do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Natychmiast umieść stożkową rurkę na suchym lodzie i jak najszybciej włóż do zamrażarki o temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Treść z jelita cienkiego można również pobrać tymi samymi metodami, co w przypadku kontroli ujemnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Krojenie
<ol>
	<li>Pokrój półmózgowie szczura z półkulsekcją za pomocą kriostatu.
	<ol>
		<li>Wyjmij plastikową formę do zatapiania z przodomózgowiem z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieść w kriostacie o temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Usuń próbkę półwyciętego przodomózgowia z osadzonym w OCT z formy do zatapiania. W razie potrzeby użyj brzytwy, aby pokroić rogi plastikowej formy do osadzania w pionie. Zamontuj przodomózgowie w celu rostralnego i ogonowego cięcia koronalnego na uchwycie kriostatowym za pomocą OCT. 
		UWAGA: Anatomiczne punkty orientacyjne identyfikujące CeA obejmują drogę wzrokową i prążek końcowy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). Przewód wzrokowy rozgałęzia się od skrzyżowania wzrokowego i biegnie grzbietowo-bocznie, gdy mózg jest cięty rostralnie do ogonowego. Gdy przewód wzrokowy ma morfologię podobną do tej, którą można zaobserwować w atlasie mózgu szczura bregma -2,12 mm10, próbki testowe można oglądać pod mikroskopem. Morfologię drogi wzrokowej i końcówki prążka można sprawdzić w atlas10, aby zidentyfikować bregmę i czy CeA otacza zakończenia prążkowia.</li>
		<li>Pokrój skrawki koronalne o grubości 10 μm od półprzodomózgowia rostralnego do ogonowego, aż do uzyskania sekcji zawierających CeA. 
		UWAGA: Szerokość i wysokość sekcji wynoszą około 200 mm.</li>
		<li>Zbierz skrawki 10 μm zawierające CeA lub preferowany obszar mózgu, rozmrażając skrawki 10 μm na zwykłych szkiełkach podstawowych. Natychmiast umieść szkiełka podstawowe na metalowej patelni spoczywającej na suchym lodzie. Szkiełka z sekcjami mózgu należy jak najszybciej umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Na tym samym slajdzie można umieścić wiele plasterków. Jeśli używasz barwnika innego typu komórek do plasterków na tym samym szkiełku, pozostaw około 100 mm między plasterkami, aby można było użyć hydrofobowego pisaka do oddzielenia roztworów przeciwciał specyficznych dla typu komórki na szkiełku. Pozostaw około 20 mm od krawędzi szkiełka z każdej strony plastra.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Zabarwić sekcje przodomózgowia pod kątem wybranej komórki mózgowej (np. neuronu, mikrogleju, astrocytu itp.) za pomocą immunofluorescencji.
	<ol>
		<li>Wyjąć jedno lub więcej szkiełek z sekcjami CeA o grubości 10 μm z zamrażarki w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Zamocuj szkiełka 75% etanolem przez 30 s. Usuń nadmiar płynu.</li>
		<li>Zablokuj plastry na 30 s z 2% bydlęcym antygenem surowicy (BSA) w 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS). Umyć 1x PBS.</li>
		<li>Dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego do szkiełka na 2 minuty. Przemyć 1x 2% roztworem BSA. 
		UWAGA: Roztwór przeciwciała pierwszorzędowego składa się z 2% przeciwciała pierwszorzędowego, 1% RNazy Out i 96% tego samego roztworu PBS BSA dla powyższego kroku blokowania (krok 4.1.3). W reprezentatywnym eksperymencie wykorzystano przeciwciało anty-NeuN, przeciwciało anty-Cd11β i przeciwciało anty-GFAP w następujących ilościach: 3 μl pierwszorzędowego, 1,88 μl inhibitora RNA i 145,12 μl roztworu BSA.</li>
		<li>Dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała do szkiełka na 3 minuty. Przemyć 1x PBS. 
		UWAGA: Roztwór przeciwciała drugorzędowego składa się z 1 μl koziego znacznika fluorescencyjnego anty-mysiego 488 nm (1:500), 2,5 μl inhibitora RNA, 1,3 μl DAPI (1:10 000) i 196,5 μl 2% BSA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Seria odwadniania etanolu i ksylenu
<ol>
	<li>Zanurz szkiełka w 75% etanolu na 30 s. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w 95% etanolu na 30 s. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w 100% etanolu na 30 s. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w drugim pojemniku zawierającym 100% etanolu na 30 s.</li>
	<li>Po serii odwadniania etanolu zanurz szkiełka w świeżo nalanym ksylenie na 1 minutę. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w drugim pojemniku z ksylenem na 4 minuty.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z kąpieli ksylenowej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w ciemności przez 5 minut.</li>
	<li>Umieść szkiełka w eksykatorze na 5 minut, aby dalej wyschły.</li>
</ol>
6. Mikrodysekcja laserowa
<ol>
	<li>W przypadku zabarwienia umieść szkiełko w mikroskopie i znajdź obszar zainteresowania (CeA) za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych (tj. skrzyżowania wzrokowego i prążka końcowego).</li>
	<li>Użyj fluorescencji, aby zidentyfikować wybarwiony typ komórki i jej jądro w obszarze zainteresowania. Wybierz jedną komórkę lub wiele komórek, jeśli wykonujesz próbki z puli pojedynczej komórki. Zaznacz interesujące Cię komórki za pomocą oprogramowania LCM.</li>
	<li>Umieść nasadkę LCM na wierzchu plasterka w obszarze zainteresowania.</li>
	<li>Użyj próbnych strzałów lasera na podczerwień (IR), aby dostosować siłę, rozmiar i czas trwania lasera IR tak, aby klej do nasadki LCM topił się tylko na obszarze wybranej pojedynczej komórki. Gwarantuje to, że nie zostaną zebrane żadne inne komórki poza wybranymi. 
	UWAGA: W tym reprezentatywnym eksperymencie 10 pul komórek tego samego typu komórek użyto jako pojedynczej próbki, aby ograniczyć zmienność ekspresji genów między komórkami między próbkami poddanymi temu samemu traktowaniu. Jednak ta metoda może być używana do prawdziwych eksperymentów z pojedynczymi komórkami1,3.</li>
	<li>Wybierz poszczególne komórki, które mają zostać zebrane do analizy za pomocą narzędzi programowych LCM (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Wybrane komórki muszą znajdować się w anatomicznym obszarze CeA (lub wybranym regionie mózgu) na podstawie atlasu mózgu szczura i bregma10. Komórki powinny znajdować się w odległości co najmniej 3 μm od sąsiednich barwionych jąder.</li>
	<li>Uruchom laser na podczerwień, aby zebrać zidentyfikowane pojedyncze komórki.</li>
	<li>Umieść nasadkę w stacji kontroli jakości (QC) i view ją, aby upewnić się, że wybrano tylko żądane komórki. Jeśli inne komórki zostały błędnie wybrane, laser ultrafioletowy może być użyty do zniszczenia niechcianych komórek, podczas gdy nasadka pozostaje w stacji kontroli jakości.</li>
	<li>Zrób zdjęcie wycinka tkanki, z którego pobrano komórkę, aby udokumentować jej anatomiczną specyficzność. W razie potrzeby zapisz odległość wycinka od bregmy, korzystając z atlasu mózgu szczura jako odniesienia10.</li>
	<li>Zdejmij nasadkę LCM ze stacji kontroli jakości, podłącz urządzenie do ekstrakcji próbki i odpipetuj 5,5 μl buforu do lizy na próbkę. 
	UWAGA: Roztwór buforowy do lizy składa się z 0,5 μl wzmacniacza lizy i 5 μl buforu do ponownego zawieszenia.</li>
	<li>Zamontuj urządzenie ExtracSure na probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i umieść na płycie grzejnej w temperaturze 75 °C na 15 minut.</li>
	<li>Odwirować próbkę i bufor do lizy przez 30 s z niską prędkością (0,01-0,02 x g) i umieścić pobraną próbkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
7. Jednokomórkowy mikroprzepływowy RT-qPCR
<ol>
	<li>Wstępna amplifikacja mRNA pojedynczej komórki dla 96.96 Dynamic Array Chip
	<ol>
		<li>Połącz startery genów qPCR mRNA do przodu i do tyłu dla wszystkich genów poddawanych testom w puli starterów do wstępnej amplifikacji (stężenie 500 nM dla każdego startera). Na przykład 1 μl starterów 100 μM w 80 μL plus 120 μl buforu zawiesiny DNA. 
		UWAGA: Sekwencje starterów użyte w reprezentatywnym eksperymencie można znaleźć w O'Sullivan et al.4.</li>
		<li>Na nowej płytce PCR o wymiarach 96 x 96 dodaj 1 μl 5x VILO do każdej studzienki.</li>
		<li>Pobrać próbki jednokomórkowe LCM z próbek przechowywanych w temperaturze -80 °C, pozostawić do krótkiego rozmrożenia, krótko odwirować z małą prędkością (0,01-0,02 x g) i dodać 5,5 μl lizowanej próbki jednokomórkowej do płytki PCR. Każda próbka jest dodawana do osobnej studzienki.</li>
		<li>Umieścić płytkę PCR z próbkami i VILO w termocyklerze i podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 1,5 minuty. Obracać płytkę przez 1 minutę w temperaturze 1 300 x g w temperaturze 4 °C i umieścić płytkę na lodzie.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 0,15 μl 10-krotnej mieszanki głównej syntezy cDNA, 0,12 μl białka T4 Gene 32 i 0,73 μl buforu zawiesiny DNA.</li>
		<li>Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom następujący protokół: 25 °C przez 5 min, 50 °C przez 30 min, 55 °C przez 25 min, 60 °C przez 5 min, 70 °C przez 10 min, 4 °C do końca.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 7,5 μl głównej mieszanki polimerazy Taq.</li>
		<li>Dodaj 1,5 μl puli starterów (patrz wyżej) do każdej studzienki.</li>
		<li>Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom następujący protokół preamplifikacji: 95 °C przez 10 minut, a następnie 22 cykle po 96 °C przez 5 sekund, 60 °C przez 4 minuty.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 0,6 μl buforu reakcyjnego egzonukleazy I, 1,2 μl egzonukleazy I i 4,2 μl buforu zawiesiny DNA.</li>
		<li>Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom następujący protokół: 37 °C przez 30 min, 80 °C przez 15 min.</li>
		<li>Dodać 54 μl buforu TE do każdej studzienki. Odwirować płytkę PCR w temperaturze 1 300 x g przez 5 min. Przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli natychmiast przejdziesz do następnego etapu. Przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli na następny krok czeka się dłużej niż 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj płytkę próbną dla układu 96.96 Dynamic Array.
	<ol>
		<li>W nowej 96-dołkowej płytce do PCR dodaj 0,45 μl 20x barwnika wiążącego DNA i 4,55 μl mastermixu o niskiej ROX do każdej studzienki.</li>
		<li>Dodać 3 μl wstępnie amplifikowanej próbki do każdego dołka, obrócić płytkę PCR przy 1 300 x g, a następnie umieścić płytkę na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj płytkę testową dla układu 96.96 Dynamic Array.
	<ol>
		<li>W nowej 96-dołkowej płytce PCR dodaj 3,75 μl 2x odczynnika ładującego test GE i 1,25 μl buforu zawiesiny DNA do każdego dołka.</li>
		<li>Dodać 2,5 μl 10 μM startera qPCR do każdego odpowiedniego dołka. Obracać płytkę PCR o masie 1 300 x g przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj i uruchom układ 96.96 Dynamic Array.
	<ol>
		<li>Zalać chip płynem do przewodów kontrolnych.</li>
		<li>Umieść chip w kontrolerze IFC HX i uruchom skrypt Prime (136X).</li>
		<li>Dodać 6 μl próbki z płytki do PCR do odpowiednich dołków na próbki w układzie 96.96 Dynamic Array.</li>
		<li>Dodać 6 μl próbki z płytki testowej PCR do odpowiednich dołków testowych w układzie 96.96 Dynamic Array.</li>
		<li>Użyj igieł, aby przebić wszelkie pęcherzyki powietrza w studzienkach układu 96.96 Dynamic Array.</li>
		<li>Umieść układ 96.96 Dynamic Array Chip w kontrolerze IFC HX i uruchom skrypt Load Mix (136x).</li>
		<li>Wyjmij chip z kontrolera IFC HX, odklej naklejkę ochronną i umieść chip 96.96 Dynamic Array w mikroprzepływowej platformie RT-qPCR. Uruchom protokół GE Fast 96 x 96 PCR (30 cykli). 
		UWAGA: Jakość RNA i ważność wyników ocenia się za pomocą wielu metod, w tym walidacji testu za pomocą elektroforezy żelowej, krzywych temperatury topnienia, kontrprób próbek i testów oraz wykresów serii rozcieńczeń wzorcowych. Ponadto wyniki transkrypcji można zweryfikować za pomocą niezależnych metod hemisekcji mózgu, w tym testów Western blot i immunofluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Pomiar liczebności bakterii za pomocą mikroprzepływowego RT-qPCR
<ol>
	<li>Wyodrębnij DNA bakterii zgodnie ze wskazówkami zestawu do ekstrakcji DNA kału.</li>
	<li>Oszacuj stężenie DNA bakterii za pomocą qPCR.</li>
	<li>Dodaj wyekstrahowane bakteryjne DNA do nowej płytki PCR. Dodać 1 μl wyekstrahowanego bakteryjnego DNA i 9 μl buforu zawiesiny DNA.</li>
	<li>Przygotuj płytkę testową dla układu 48.48 Dynamic Array (patrz kroki 7.2.1-7.2.2)</li>
	<li>Przygotuj próbkę płytki dla układu 48.48 Dynamic Array Chip (patrz kroki 7.3.1-7.3.2)
	<ol>
		<li>W nowej 96-dołkowej płytce do PCR dodaj 0,45 μl 20-krotnego barwnika wiążącego DNA i 4,55 μl mieszanki głównej o niskiej ROX do 48 dołków.</li>
		<li>Dodać 3 μl próbki z płytki PCR zawierającej bakteryjne DNA do 48 dołków i wirować płytkę PCR przy 1 300 x g przez 5 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj i uruchom układ 48.48 Dynamic Array Chip (patrz kroki 7.4.1-7.4.7).</li>
</ol>

<ol><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+drive+cell+phenotype+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Inputs drive cell phenotype variability.</a> Genome Research. 24, 930-941 (2014).</li>
<li>Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+gene+regulatory+network+phenotypes+underlying+single+cell+transcriptional+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptional+Analysis+Reveals+Novel+Neuronal+Phenotypes+and+Interaction+Networks+Involved+in+the+Central+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Glia+and+Neuron+Gene+Expression+in+the+Central+Amygdala+in+Opioid+Withdrawal+Suggests+Inflammation+With+Correlated+Gut+Dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).</li>
<li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single+cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).</li>
<li>SEQC/MAQC-III Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+accuracy%2C+reproducibility+and+information+content+by+the+Sequencing+Quality+Control+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium.</a> Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).</li>
<li>Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+inflammation+and+dysbiosis+in+human+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li>
<li>Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiosis+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Dysbiosis in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 53, 1-4 (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%3A+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition</a>. , (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Biologia pojedynczej komórki wykazała niejednorodność fenotypów komórkowych i solidność funkcji tkanek. Odkrycia te dostarczyły informacji na temat organizacji systemów biologicznych zarówno w skali makro, jak i mikro. W tym miejscu opisujemy połączenie dwóch metod, LCM i mikroprzepływowego qPCR, w celu uzyskania pomiarów transkryptomu pojedynczej komórki, które zapewniają swoistość anatomiczną i dokładność transkrypcji przy stosunkowo niskich kosztach (ryc. 1). Nasza grupa przyjmuje podejśc...

Pomiar profili ekspresji genów w pojedynczych komórkach wykazał dużą niejednorodność fenotypową w tkance. Ta złożoność skomplikowała nasze zrozumienie sieci biologicznych, które zarządzają funkcjonowaniem tkanek. Nasza grupa i inni badali to zjawisko w wielu tkankach i warunkach1,2,3,4,5,6. Eksperymenty te nie tylko sugerują, że regulacja sieci ekspresji genów leży u podstaw takiej heterogeniczności, ale także, że rozdzielczość pojedynczej komórki ujawnia złożoność funkcji tkanki, której rozdzielczość na poziomie tkanki nie jest w stanie docenić. Rzeczywiście, tylko niewielka mniejszość komórek może reagować na określony stan lub wyzwanie, ale wpływ tych komórek na ogólną fizjologię może być znaczny. Ponadto podejście oparte na biologii systemowej, które stosuje metody wielowymiarowe do wielowymiarowych zestawów danych z wielu typów komórek i tkanek, może wyjaśnić efekty leczenia w całym systemie.
Łączymy LCM i mikroprzepływowy RT-qPCR, aby uzyskać takie zestawy danych. Przyjmujemy tutaj to podejście, w przeciwieństwie do zbierania pojedynczych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) i używania sekwencjonowania RNA (RNA-seq) do pomiaru ich transkryptomu. Przewagą LCM nad FACS jest to, że dokładna specyficzność anatomiczna pojedynczych komórek może być udokumentowana za pomocą LCM, względnie i bezwzględnie. Co więcej, podczas gdy sekwencja RNA może mierzyć więcej cech niż RT-qPCR, mikroprzepływowy RT-qPCR jest tańszy i ma wyższą czułość i swoistość7.
W tym reprezentatywnym eksperymencie badaliśmy wpływ uzależnienia od opioidów i odstawienia opioidów wywołanego naltreksonem na ekspresję genów neuronalnych, mikrogleju i astrocytów szczurów w centralnym jądrze ciała migdałowatego (CeA) i obfitość mikroflory jelitowej4. Przeanalizowano cztery grupy leczenia: 1) placebo, 2) morfina, 3) naltrekson i 4) odstawienie (ryc. 1). Odkryliśmy, że uzależnienie od opioidów nie zmieniło znacząco ekspresji genów, ale odstawienie opioidów indukowało ekspresję genów zapalnych, w szczególności Tnf. Astrocyty były najbardziej dotkniętym typem komórek. Odstawienie opioidów miało głęboki wpływ na mikrobiom jelitowy, na co wskazuje spadek stosunku Firmicutes do Bacteroides, który jest uznanym markerem dysbiozy jelitowej8,9.

<table><tbody><tr><td>20X Barwnik wiążący DNA</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>NA</td></tr><tr><td>2x Test GE Ładowanie odczynnika</td><td>Fluidigm</td><td>85000802-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>48.48 Dynamiczna tablica IFC do płynu do ekspresji genów</td><td></td><td>BMK-M-48.48</td><td>NA</td></tr><tr><td>96.96 Dynamiczna tablica IFC do płynu do ekspresji genów</td><td></td><td>BMK-M-96.96</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anti-CD11&beta; Przeciwciało</td><td>Genway Biotech</td><td>CCEC48</td> Przeciwciało anty-NeuN <td>Microglea Stain</td></tr><tr><td>, klon A60</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>Barwienie neuronalne</td></tr><tr><td>ArcturusXT System mikrodysekcji</td> laserowego <td>przechwytywania Arcturus</td><td>NA</td><td>NA NA</td></tr><tr><td>Biomark HD</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td>Platforma RT-qPCR</td></tr><tr><td>Antygen surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0211</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11753500</td><td>Składniki roztworu buforowego do lizy</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Bufor zawiesinowy DNA do barwienia jądra</td></tr><tr><td></td><td>TEKnova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Egzonukleaza I</td><td>Nowość Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0293S</td><td>NA</td></tr><tr><td>Urządzenie do ekstrakcji próbek ExtracSure</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0208</td><td>NA</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>Szkiełka podstawowe</td></tr><tr><td>zwykłe Rurka reakcyjna cienkościenna GeneAmp</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne GFAP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21294</td><td>Astrocyty Barwiące</td></tr><tr><td>kozę anty-mysie IgG (H + L), Superklonalne i handel; Rekombinowane przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A28175</td><td>Seconadry Antibody</td></tr><tr><td>IFC</td><td>Controller Fluidigm</td><td>NA</td><td>NA NA</td></tr><tr><td>RNaseOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox</td><td>Bio-Rad</td><td>PN 172-5211</td><td>Rox master mix</td></tr><tr><td>SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11754250</td><td>zawiera białko VILO i SuperScript</td></tr><tr><td>T4 Gene 32</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0300S</td><td>NA</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4391128</td><td>NA</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>TEKnova</td><td>T0225</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qpcr w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence

Głęboka heterogeniczność transkrypcji w anatomicznie sąsiadujących pojedynczych komórkach sugeruje, że dzięki różnorodności fenotypów komórkowych można osiągnąć solidną funkcjonalność tkanki. Eksperymenty na pojedynczych komórkach badające dynamikę sieci systemów biologicznych pokazują odpowiedzi komórkowe i tkankowe na różne warunki w biologicznie znaczącej rozdzielczości. W tym miejscu wyjaśniamy nasze metody zbierania pojedynczych komórek z anatomicznie określonych lokalizacji i dokładnego pomiaru podzbioru ich profili ekspresji genów. Łączymy mikrodysekcję wychwytu laserowego (LCM) z ilościowymi reakcjami łańcuchowymi polimerazy z odwrotną transkrypcją mikroprzepływową (RT-qPCR). Używamy również tej mikroprzepływowej platformy RT-qPCR do pomiaru obfitości mikrobiologicznej treści jelitowej.

Wybór pojedynczych komórek został zweryfikowany zarówno wizualnie, jak i molekularnie. W analizie wizualnej morfologię komórkową oceniano przed pobraniem komórek. Zebrane komórki poddano następnie oględzinom na stacji kontroli jakości (QC), sprawdzając, czy barwienie jąder komórkowych (DAPI) pokrywa się z fluorescencją markera wyboru pojedynczych komórek. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywne obrazy preparatu z przekrojem przedmózgowia szczu...

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular ...

Jest to bardzo dokładna i opłacalna metoda zrozumienia ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że w jednej partii możemy zmieścić 96 próbek. Ta duża liczba próbek pozwala nam zidentyfikować subfenotypy komórkowe o specyficzności anatomicznej.Metoda ta może być zastosowana do każdego problemu biologicznego, dowolnego systemu, dowolnej tkanki, w celu zbadania indywidualnej odpowiedzi komórkowej poszczególnych neuronów lub innych typów komórek na chorobę lub inne zaburzenie, dowolną funkcję. A potem idź dalej i zapytaj, czy te reakcje komórek mają architekturę anatomiczną. Wyjmij mózg z pudełka na tkanki i umieść na uchwycie kriostatu.Zbierz 10-mikronowe skrawki zawierające centralne jądro ciała migdałowatego lub innego preferowanego obszaru mózgu, rozmrażając 10-mikronowe odcinki na zwykłych szklanych szkiełkach. Natychmiast umieść szkiełka podstawowe na metalowej patelni spoczywającej na suchym lodzie. Włóż szkiełka z sekcjami mózgu do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza tak szybko, jak to możliwe.Aby wykonać serię odwadniania etanolu i ksylenu, najpierw zanurz szkiełka w 75% etanolu na 30 sekund. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w 95% etanolu na 30 sekund. Następnie zanurz szkiełka w 100% etanolu na 30 sekund.Na koniec zanurz szkiełka bezpośrednio w drugim pojemniku ze 100% etanolem na 30 sekund. Po serii odwadniania etanolu zanurz szkiełka w świeżo nalanym ksylenie na jedną minutę. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w drugim pojemniku z ksylenem na cztery minuty przed wysuszeniem, jak opisano w protokole tekstowym.Użyj fluorescencji, aby zidentyfikować wybarwiony typ komórki i jej jądro w obszarze zainteresowania. Wybierz jedną komórkę lub wiele komórek, jeśli wykonujesz próbki z puli pojedynczej komórki. Oznacz interesujące komórki za pomocą mikrodysekcji wychwytu laserowego lub oprogramowania LCM.Umieść nasadkę LCM na wierzchu plasterka w obszarze zainteresowania i rozpuść klej nasadki LCM na obszarze wybranej pojedynczej komórki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wybierz poszczególne komórki, które mają zostać pobrane do analizy, za pomocą narzędzi programowych LCM. Wybrane komórki muszą znajdować się w obszarze anatomicznym centralnego jądra ciała migdałowatego na podstawie atlasu mózgu szczura i bregmy.Komórki powinny znajdować się w odległości co najmniej trzech mikronów od sąsiednich barwionych jąder. Następnie uruchom laser na podczerwień, aby zebrać zidentyfikowane pojedyncze komórki. Umieść nasadkę w stacji kontroli jakości i view ją, aby upewnić się, że wybrano tylko żądane komórki.Jeśli inne komórki zostały błędnie wybrane, laser ultrafioletowy może być użyty do zniszczenia niechcianych komórek, podczas gdy nasadka pozostaje w stacji kontroli jakości. Zrób zdjęcie wycinka tkanki, z którego pobrano komórkę, aby udokumentować jej anatomiczną specyficzność. W razie potrzeby należy zapisać odległość wycinka od bregmy, korzystając z atlasu mózgu szczura jako punktu odniesienia.Zdejmij nasadkę LCM ze stacji kontroli jakości i zamocuj urządzenie do ekstrakcji próbki. Następnie odpipetować 5,5 mikrolitra buforu do lizy na próbkę. Zamontuj urządzenie ekstrakcyjne na 0,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej i umieść je na płycie grzejnej w temperaturze 75 stopni Celsjusza na 15 minut.Obracać próbkę i bufor do lizy przez 30 sekund z niską prędkością i umieścić pobraną próbkę w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić wstępną amplifikację mRNA pojedynczej komórki dla układu dynamicznego, najpierw dodaj pięć mikrolitrów 5X VILO do każdej studzienki nowej płytki PCR o wymiarach 96 na 96. Usuń próbki pojedynczych komórek LCM z minus 80 stopni Celsjusza i pozwól im na chwilę się rozmrozić.Po odwirowaniu z niską prędkością dodaj 5,5 mikrolitra zlizowanych próbek jednokomórkowych do płytki PCR, dodając każdą próbkę do własnego dołka. Umieścić płytkę PCR z próbkami i VILO w termocyklerze i podgrzewać w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez półtorej minuty. Następnie obracaj talerz przez minutę w temperaturze 1 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza i umieść talerz na lodzie.Dodaj 10-krotną mieszankę główną syntezy cDNA, białko genu T4 32 i bufor zawiesiny DNA do każdej studzienki. Umieść płytkę PCR, która jest płytką próbną numer jeden, w termocyklerze i uruchom zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zakończeniu cyklu dodaj dziewięć mikrolitrów roztworu polimerazy Taq do każdego dołka w 96-dołkowej płytce do PCR.Dziewięć mikrolitrów składa się z 7,5 mikrolitra głównej mieszanki polimerazy Taq i 1,5 mikrolitra puli starterów. Teraz umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom program pre-amplifikacji szczegółowo opisany w protokole tekstowym. Postępując zgodnie z protokołem wstępnej amplifikacji, dodaj sześć mikrolitrów roztworu egzonukleazy do każdej studzienki w 96-dołkowej płytce PCR.Roztwór egzonukleazy składa się z 0,6 mikrolitra 10-krotnego buforu reakcyjnego egzonukleazy-onu, 1,2 mikrolitra egzonukleazy i 4,2 mikrolitra buforu zawiesiny DNA. Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom program wymieniony w protokole tekstowym. Na koniec dodaj 54 mikrolitry buforu TE do każdej studzienki pierwszej płytki próbki.Obracać płytkę PCR 1 300 razy g przez pięć minut. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli natychmiast przejdziesz do następnego kroku. Na nowej 96-dołkowej płytce do PCR, która jest drugą płytką próbki, dodaj pięć mikrolitrów barwnika wiążącego DNA i roztworu mieszanki głównej.Dodać trzy mikrolitry wstępnie amplifikowanych próbek z pierwszej płytki próbki do odpowiednich studzienek w drugiej płytce próbnej. Zakręć płytką PCR z prędkością 1 300 g, a następnie połóż płytkę na lodzie. Na nowej 96-dołkowej płytce do PCR, która jest drugą płytką testową, dodaj pięć mikrolitrów roztworu ładującego test do każdej studzienki.Roztwór ładujący test składa się z 3,75 mikrolitra odczynnika ładującego 2X GE i 1,25 mikrolitra buforu zawiesiny DNA na studzienkę. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra 10-mikromolowego startera qPCR z pierwszej płytki testowej do odpowiedniego dołka na drugiej płytce testowej. Obracać płytkę PCR 1 300 razy g przez pięć minut.Aby załadować i uruchomić układ dynamicznej matrycy, najpierw zalej go płynem do przewodów sterujących. Następnie umieść chip w kontrolerze IFC HX i uruchom skrypt prime 136X. Dodaj sześć mikrolitrów z płytki próbki numer dwa do odpowiednich dołków na próbki w układzie dynamicznej matrycy 96 na 96.Teraz dodaj sześć mikrolitrów z drugiej płytki testowej do odpowiednich dołków testowych w chipie dynamicznej matrycy 96 na 96. Użyj igieł, aby przebić wszelkie pęcherzyki powietrza w studzienkach układu dynamicznej 96 na 96. Następnie umieść chip w kontrolerze IFC HX i uruchom skrypt load mix 136X.Następnie wyjmij chip z kontrolera IFC HX. Umieść układ dynamicznej macierzy 96 na 96 w mikroprzepływowej platformie RT-qPCR i uruchom szybki protokół GE 96 na 96 PCR. Wybór pojedynczych komórek został zweryfikowany zarówno wizualnie, jak i molekularnie. Wizualnie morfologia komórek była oglądana przed pobraniem komórek.Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy szkiełka z półwyciętym przodomózgowiem szczura, zawierającym centralne jądro ciała migdałowatego. Kolejne obrazy pokazują selekcję pojedynczych komórek i ich usuwanie z tkanki w celu analizy transkryptomicznej. Molekularnie markery specyficzne dla typu komórki wykazały zwiększoną ekspresję w odpowiednim typie komórki.W szczególności zaobserwowano zwiększoną ekspresję NeuN w neuronach, Maf w mikrogleju i Gfap w astrocytach. Mapa cieplna pokazuje ekspresję wszystkich próbek w 40 testowanych genach. Wiersze to próbki połączone na rozciąganie, liczby oznaczają klastry próbek, a kolumny to geny.Metody analizy wieloczynnikowej pokazują, że astrocyty w grupie wycofania były najbardziej dotkniętym typem komórek. Opierając się na tych danych w kontekście innych badań, astrocyty prawdopodobnie odgrywają kluczową rolę w zapaleniu w centralnym jądrze ciała migdałowatego podczas odstawienia opioidów. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w przypadku tej techniki, jest stosowanie odpowiedniego pipetowania, aby ograniczyć liczbę pęcherzyków powietrza.Wyniki transkrypcji z tych eksperymentów można zwalidować za pomocą metod pomiaru białka, takich jak immunofluorescencja lub Western blot na tej samej tkance.

combining-laser-capture-microdissection-microfluidic-qpcr-to-analyze

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Połączenie mikrodysekcji laserowej i mikroprzepływowego RT-qPCR zapewnia anatomiczną i biotechniczną specyfikę pomiaru transkryptomu w pojedynczych neuronach i gleju. Zastosowanie kreatywnych metod z systemowym podejściem biologicznym do chorób psychicznych może prowadzić do przełomów w zrozumieniu i leczeniu, takich jak hipoteza neurozapalenia i nagrody w uzależnieniu.

Badanie czynników wpływających na antynagrodę w zachowaniach uzależniających za pomocą anatomicznie specyficznych metod ekspresji genów jednokomórkowych

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Poznaj metodę mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR do analizy ekspresji genów w pojedynczych neuronach, mikroglejach i astrocytach z jądra środkowego migdałka.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Przeglądaj więcej filmów