Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Jest to bardzo dokładna i opłacalna metoda zrozumienia ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że w jednej partii możemy zmieścić 96 próbek. Ta duża liczba próbek pozwala nam zidentyfikować subfenotypy komórkowe o specyficzności anatomicznej.

Metoda ta może być zastosowana do każdego problemu biologicznego, dowolnego systemu, dowolnej tkanki, w celu zbadania indywidualnej odpowiedzi komórkowej poszczególnych neuronów lub innych typów komórek na chorobę lub inne zaburzenie, dowolną funkcję. A potem idź dalej i zapytaj, czy te reakcje komórek mają architekturę anatomiczną. Wyjmij mózg z pudełka na tkanki i umieść na uchwycie kriostatu.

Zbierz 10-mikronowe skrawki zawierające centralne jądro ciała migdałowatego lub innego preferowanego obszaru mózgu, rozmrażając 10-mikronowe odcinki na zwykłych szklanych szkiełkach. Natychmiast umieść szkiełka podstawowe na metalowej patelni spoczywającej na suchym lodzie. Włóż szkiełka z sekcjami mózgu do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza tak szybko, jak to możliwe.

Aby wykonać serię odwadniania etanolu i ksylenu, najpierw zanurz szkiełka w 75% etanolu na 30 sekund. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w 95% etanolu na 30 sekund. Następnie zanurz szkiełka w 100% etanolu na 30 sekund.

Na koniec zanurz szkiełka bezpośrednio w drugim pojemniku ze 100% etanolem na 30 sekund. Po serii odwadniania etanolu zanurz szkiełka w świeżo nalanym ksylenie na jedną minutę. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w drugim pojemniku z ksylenem na cztery minuty przed wysuszeniem, jak opisano w protokole tekstowym.

Użyj fluorescencji, aby zidentyfikować wybarwiony typ komórki i jej jądro w obszarze zainteresowania. Wybierz jedną komórkę lub wiele komórek, jeśli wykonujesz próbki z puli pojedynczej komórki. Oznacz interesujące komórki za pomocą mikrodysekcji wychwytu laserowego lub oprogramowania LCM.

Umieść nasadkę LCM na wierzchu plasterka w obszarze zainteresowania i rozpuść klej nasadki LCM na obszarze wybranej pojedynczej komórki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wybierz poszczególne komórki, które mają zostać pobrane do analizy, za pomocą narzędzi programowych LCM. Wybrane komórki muszą znajdować się w obszarze anatomicznym centralnego jądra ciała migdałowatego na podstawie atlasu mózgu szczura i bregmy.

Komórki powinny znajdować się w odległości co najmniej trzech mikronów od sąsiednich barwionych jąder. Następnie uruchom laser na podczerwień, aby zebrać zidentyfikowane pojedyncze komórki. Umieść nasadkę w stacji kontroli jakości i view ją, aby upewnić się, że wybrano tylko żądane komórki.

Jeśli inne komórki zostały błędnie wybrane, laser ultrafioletowy może być użyty do zniszczenia niechcianych komórek, podczas gdy nasadka pozostaje w stacji kontroli jakości. Zrób zdjęcie wycinka tkanki, z którego pobrano komórkę, aby udokumentować jej anatomiczną specyficzność. W razie potrzeby należy zapisać odległość wycinka od bregmy, korzystając z atlasu mózgu szczura jako punktu odniesienia.

Zdejmij nasadkę LCM ze stacji kontroli jakości i zamocuj urządzenie do ekstrakcji próbki. Następnie odpipetować 5,5 mikrolitra buforu do lizy na próbkę. Zamontuj urządzenie ekstrakcyjne na 0,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej i umieść je na płycie grzejnej w temperaturze 75 stopni Celsjusza na 15 minut.

Obracać próbkę i bufor do lizy przez 30 sekund z niską prędkością i umieścić pobraną próbkę w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić wstępną amplifikację mRNA pojedynczej komórki dla układu dynamicznego, najpierw dodaj pięć mikrolitrów 5X VILO do każdej studzienki nowej płytki PCR o wymiarach 96 na 96. Usuń próbki pojedynczych komórek LCM z minus 80 stopni Celsjusza i pozwól im na chwilę się rozmrozić.

Po odwirowaniu z niską prędkością dodaj 5,5 mikrolitra zlizowanych próbek jednokomórkowych do płytki PCR, dodając każdą próbkę do własnego dołka. Umieścić płytkę PCR z próbkami i VILO w termocyklerze i podgrzewać w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez półtorej minuty. Następnie obracaj talerz przez minutę w temperaturze 1 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza i umieść talerz na lodzie.

Dodaj 10-krotną mieszankę główną syntezy cDNA, białko genu T4 32 i bufor zawiesiny DNA do każdej studzienki. Umieść płytkę PCR, która jest płytką próbną numer jeden, w termocyklerze i uruchom zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zakończeniu cyklu dodaj dziewięć mikrolitrów roztworu polimerazy Taq do każdego dołka w 96-dołkowej płytce do PCR.

Dziewięć mikrolitrów składa się z 7,5 mikrolitra głównej mieszanki polimerazy Taq i 1,5 mikrolitra puli starterów. Teraz umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom program pre-amplifikacji szczegółowo opisany w protokole tekstowym. Postępując zgodnie z protokołem wstępnej amplifikacji, dodaj sześć mikrolitrów roztworu egzonukleazy do każdej studzienki w 96-dołkowej płytce PCR.

Roztwór egzonukleazy składa się z 0,6 mikrolitra 10-krotnego buforu reakcyjnego egzonukleazy-onu, 1,2 mikrolitra egzonukleazy i 4,2 mikrolitra buforu zawiesiny DNA. Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom program wymieniony w protokole tekstowym. Na koniec dodaj 54 mikrolitry buforu TE do każdej studzienki pierwszej płytki próbki.

Obracać płytkę PCR 1 300 razy g przez pięć minut. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli natychmiast przejdziesz do następnego kroku. Na nowej 96-dołkowej płytce do PCR, która jest drugą płytką próbki, dodaj pięć mikrolitrów barwnika wiążącego DNA i roztworu mieszanki głównej.

Dodać trzy mikrolitry wstępnie amplifikowanych próbek z pierwszej płytki próbki do odpowiednich studzienek w drugiej płytce próbnej. Zakręć płytką PCR z prędkością 1 300 g, a następnie połóż płytkę na lodzie. Na nowej 96-dołkowej płytce do PCR, która jest drugą płytką testową, dodaj pięć mikrolitrów roztworu ładującego test do każdej studzienki.

Roztwór ładujący test składa się z 3,75 mikrolitra odczynnika ładującego 2X GE i 1,25 mikrolitra buforu zawiesiny DNA na studzienkę. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra 10-mikromolowego startera qPCR z pierwszej płytki testowej do odpowiedniego dołka na drugiej płytce testowej. Obracać płytkę PCR 1 300 razy g przez pięć minut.

Aby załadować i uruchomić układ dynamicznej matrycy, najpierw zalej go płynem do przewodów sterujących. Następnie umieść chip w kontrolerze IFC HX i uruchom skrypt prime 136X. Dodaj sześć mikrolitrów z płytki próbki numer dwa do odpowiednich dołków na próbki w układzie dynamicznej matrycy 96 na 96

Teraz dodaj sześć mikrolitrów z drugiej płytki testowej do odpowiednich dołków testowych w chipie dynamicznej matrycy 96 na 96. Użyj igieł, aby przebić wszelkie pęcherzyki powietrza w studzienkach układu dynamicznej 96 na 96. Następnie umieść chip w kontrolerze IFC HX i uruchom skrypt load mix 136X.

Następnie wyjmij chip z kontrolera IFC HX. Umieść układ dynamicznej macierzy 96 na 96 w mikroprzepływowej platformie RT-qPCR i uruchom szybki protokół GE 96 na 96 PCR. Wybór pojedynczych komórek został zweryfikowany zarówno wizualnie, jak i molekularnie. Wizualnie morfologia komórek była oglądana przed pobraniem komórek.

Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy szkiełka z półwyciętym przodomózgowiem szczura, zawierającym centralne jądro ciała migdałowatego. Kolejne obrazy pokazują selekcję pojedynczych komórek i ich usuwanie z tkanki w celu analizy transkryptomicznej. Molekularnie markery specyficzne dla typu komórki wykazały zwiększoną ekspresję w odpowiednim typie komórki.

W szczególności zaobserwowano zwiększoną ekspresję NeuN w neuronach, Maf w mikrogleju i Gfap w astrocytach. Mapa cieplna pokazuje ekspresję wszystkich próbek w 40 testowanych genach. Wiersze to próbki połączone na rozciąganie, liczby oznaczają klastry próbek, a kolumny to geny.

Metody analizy wieloczynnikowej pokazują, że astrocyty w grupie wycofania były najbardziej dotkniętym typem komórek. Opierając się na tych danych w kontekście innych badań, astrocyty prawdopodobnie odgrywają kluczową rolę w zapaleniu w centralnym jądrze ciała migdałowatego podczas odstawienia opioidów. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w przypadku tej techniki, jest stosowanie odpowiedniego pipetowania, aby ograniczyć liczbę pęcherzyków powietrza.

Wyniki transkrypcji z tych eksperymentów można zwalidować za pomocą metod pomiaru białka, takich jak immunofluorescencja lub Western blot na tej samej tkance.