Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Metoda ta może być wykorzystana do oceny, w jaki sposób nowe środki lub strategie terapeutyczne wpływają lub wzmacniają odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T podczas raka trzustki. Technika ta pozwala na szybkie trawienie i stymulację guzów in vitro, umożliwiając jednoczesną analizę wielu parametrów odpowiedzi limfocytów T, które można łatwo dostosować do innych zastosowań. Na początek użyj kleszczy, przenieś guz na szalkę Petriego.

Przechowuj pięć mililitrów pożywki wytrawiającej w 50-mililitrowej tubce na lodzie, aby zapobiec rozpoczęciu aktywności enzymów. Weź małą porcję tego roztworu, aby pokryć guz na szalce Petriego. Użyj sterylnego skalpela i kleszczy, aby pociąć guz na małe kawałki, o długości mniej niż trzy milimetry.

Zeskrob kawałki guza do probówki i delikatnie odwróć rurkę, aż wszystkie kawałki zostaną zanurzone w pożywce trawiącej. Przenieść probówkę na urządzenie wstrząsające na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza do strawienia. Upewnij się, że wszystkie kawałki guza są zanurzone i nie przyklejają się do krawędzi rurki.

Natychmiast po etapie trawienia umieść probówkę na lodzie, aby spowolnić aktywność enzymu. Dodaj EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 milimoli i krótko zwiruj próbkę do wymieszania w celu dalszego spowolnienia aktywności enzymu. Otwórz probówkę i spłucz wszelkie odpady trawione przez guz z pokrywki probówki świeżym medium RPMI.

Następnie przygotuj sitko o średnicy 70 mikronów, umieść je na 50-mililitrowej otwartej tubie na lodzie. Wstępnie zwilż filtr medium. Ponownie zawiesić strawione komórki i umyć boki probówki za pomocą 25-mililitrowego lub większego pasiaka.

Szerszy otwór pasiaka umożliwia łatwe przechodzenie gęstego trawienia. Przelej cały płyn na sitko za pomocą 25-mililitrowej paski. Rozcieraj guz w górę iw dół na górze filtra za pomocą jednomililitrowego tłoka strzykawki.

Ciągle myj komórki przez sitko za pomocą RPMI. Upewnij się, że myjesz z wystarczającą siłą, aby przepchnąć komórki. Kontynuuj mycie, aż wszystkie komórki przejdą przez sitko.

Wirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy i zakończyć RPMI, a następnie przejść bezpośrednio przez inny filtr, aby usunąć wszelką macierz zewnątrzkomórkową lub duże grudki komórek, których nie można odpowiednio zawiesić. Jeśli stymulacja nie jest wymagana, natychmiast wybarwić izolowane komórki do analizy cytometrii przepływowej lub ponownie zawiesić je w pożywce zamrażającej 10% DMSO i FBS i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby wykonać stymulację, najpierw policz komórki. Rozcieńczyć komórki w kompletnym pożywce, aby uzyskać stężenie dwa razy dziesięć do sześciu na 100 mikrolitrów. Umieść 100 mikrolitrów komórek w każdym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U.

Dodaj 100 mikrolitrów kompletnej pożywki, zawierającej 2X preparat PMA i jonomycyny. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ale 5% dwutlenku węgla na godzinę. Następnie, przy 20 mikrolitrach 10-krotnego preparatu Brefeldin A i Monensin oraz kompletnych pożywkach, aby osiągnąć końcowe stężenie odpowiednio 1,06 mikromola i 2,0 mikromola.

Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne cztery godziny. Po wstrzyknięciu 1000 TB32048 komórek do trzustki, guzy ortotopowe rozwijają się po około 30 dniach. Po trawieniu i stymulacji pobranych guzów ortotopowych wykonano fluorescencję minus jeden w celu określenia fluorescencji tła dla bramkowania.

Przeprowadzono kontrolę tylko z prefabrykacją Brefeldin A Monensin w celu określenia podstawowej produkcji cytokin. W przypadku inkubacji interferonu gamma z Brefeldyną A i Monenzyną nie stwierdzono wzrostu interferonu gamma w stosunku do kontroli FMO, zarówno w próbkach śledziony, jak i guza. Jednak dodanie PMA i jonomycyny zwiększyło odsetek wewnątrzkomórkowego interferonu gamma wykrywalnego zarówno w limfocytach T CD4-dodatnich i CD8-dodatnich pochodzących ze śledziony, jak i guza.

Limfocyty T CD4-dodatnie i CD8-dodatnie śledziony, stosowane jako kontrola pozytywna, mają stosunkowo wyższą produkcję interferonu gamma niż podzbiory limfocytów T naciekających nowotwór. Wskazanie, że immunosupresja występuje w obrębie guza. Stosując tę samą strategię dla TNF alfa, wysoki odsetek limfocytów T CD4 dodatnich dla śledziony był dodatni dla wewnątrzkomórkowego TNF alfa.

W porównaniu z naciekającymi nowotwór limfocytami T CD4-dodatnimi. Limfocyty T CD8-dodatnie naciekające śledzionę i nowotwór wytwarzały podobne poziomy TNF alfa. Upewnij się, że guz jest wystarczająco posiekany i że wszystkie kawałki są zanurzone w pożywce trawiącej.

Podczas rozgniatania guza należy zachować delikatność i dokładnie przemyć komórki. Protokół trawienia guza można połączyć z sortowaniem komórek wspomaganym przepływem, w celu oczyszczenia poszczególnych podzbiorów komórek odpornościowych w celu dodatkowej, funkcjonalnej lub analizy ekspresji genów. Zastosowaliśmy tę metodę, aby scharakteryzować, w jaki sposób limfocyty B kształtują odpowiedź immunologiczną podczas raka trzustki, generując guzy ortotopowe zarówno u myszy z nokautem komórek B, jak i z niedoborem komórek B.