Name: Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj metodę generowania ortotopowych guzów trzustki i analizy cytotoksyczności limfocytów T ex vivo. Technika umożliwia szybkie trawienie nowotworów i stymulację komórek do badania odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Animal Technician Service oraz dr Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Wielka Brytania) za ich pomoc podczas operacji ortotopowej. Chcielibyśmy również podziękować dr Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Wielka Brytania) za jej wskazówki w zakresie techniki chirurgicznej, dr Cristinie Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londyn, Wielka Brytania) za porady dotyczące trawienia guza oraz dr Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londyn, Zjednoczone Królestwo) za porady dotyczące protokołów stymulacji limfocytów T ex vivo. Chcielibyśmy również podziękować Radzie Badań Medycznych (MRC), Funduszowi Badań nad Rakiem Trzustki (PCFR) i Ovarian Cancer Action, które sfinansowały te badania.

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li>
<li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+standards+and+new+innovative+approaches+for+treatment+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Current standards and new innovative approaches for treatment of pancreatic cancer.</a> European Journal of Cancer. 57, 10-22 (2016).</li>
<li>Lee, J. W., Komar, C. A., Bengsch, F., Graham, K., Beatty, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+of+pancreatic+cancer%3A+The+KPC+model+%28LSL-KrasG12D%2F%2B%3BLSL-Trp53R172H%2F%2B%3BPdx-1-Cre%29%2C+its+variants%2C+and+their+application+in+immuno-oncology+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer: The KPC model (LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), its variants, and their application in immuno-oncology drug discovery.</a> Current Protocols in Pharmacology. 2016, (2016).</li>
<li>Tseng, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Orthotopic+Model+of+Invasive+Pancreatic+Cancer+in+an+Immunocompetent+Murine+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of an Orthotopic Model of Invasive Pancreatic Cancer in an Immunocompetent Murine Host.</a> Clinical Cancer Research. 16 (14), 3684-3695 (2010).</li>
<li>Majumder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Pancreatic+Cancer+with+Robust+Stroma%3A+a+Valuable+Tool+for+Preclinical+Evaluation+of+New+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+Surgery%22%5BJournal%5D)">A Novel Immunocompetent Mouse Model of Pancreatic Cancer with Robust Stroma: a Valuable Tool for Preclinical Evaluation of New Therapies.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 20 (1), 53-65 (2016).</li>
<li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp53R172H+and+KrasG12D+cooperate+to+promote+chromosomal+instability+and+widely+metastatic+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.</a> Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).</li>
<li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Patient-Derived+Models+Delineate+Individualized+Therapeutic+Vulnerabilities+of+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated Patient-Derived Models Delineate Individualized Therapeutic Vulnerabilities of Pancreatic Cancer.</a> Cell Reports. , (2016).</li>
<li>Nicolle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Adenocarcinoma+Therapeutic+Targets+Revealed+by+Tumor-Stroma+Cross-Talk+Analyses+in+Patient-Derived+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Adenocarcinoma Therapeutic Targets Revealed by Tumor-Stroma Cross-Talk Analyses in Patient-Derived Xenografts.</a> Cell Reports. , (2017).</li>
<li>Spear, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrepancies+in+the+Tumor+Microenvironment+of+Spontaneous+and+Orthotopic+Murine+Models+of+Pancreatic+Cancer+Uncover+a+New+Immunostimulatory+Phenotype+for+B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Discrepancies in the Tumor Microenvironment of Spontaneous and Orthotopic Murine Models of Pancreatic Cancer Uncover a New Immunostimulatory Phenotype for B Cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 542(2019).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF1%2FCSF1R+blockade+reprograms+tumor-infiltrating+macrophages+and+improves+response+to+T-cell+checkpoint+immunotherapy+in+pancreatic+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CSF1/CSF1R blockade reprograms tumor-infiltrating macrophages and improves response to T-cell checkpoint immunotherapy in pancreatic cancer models.</a> Cancer Research. , (2014).</li>
<li>Lee, J. J., Huang, J., England, C. G., McNally, L. R., Frieboes, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+Modeling+of+In+vivo+Response+to+Gemcitabine+in+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Predictive Modeling of In vivo Response to Gemcitabine in Pancreatic Cancer.</a> PLoS Computational Biology. , (2013).</li>
<li>Clark, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Immune+Reaction+to+Pancreatic+Cancer+from+Inception+to+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Immune Reaction to Pancreatic Cancer from Inception to Invasion.</a> Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).</li>
<li>Fukunaga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+together+with+CD4%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+dendritic+cells+improve+the+prognosis+of+patients+with+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes together with CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma.</a> Pancreas. 28 (1), 26-31 (2004).</li>
<li>Tewari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+tumor-associated+lymphocytes+confers+a+good+prognosis+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+an+immunohistochemical+study+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays.</a> BMC Cancer. 13 (1), 436(2013).</li>
<li>Royal, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+2+Trial+of+Single+Agent+Ipilimumab+%28Anti-CTLA-4%29+for+Locally+Advanced+or+Metastatic+Pancreatic+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Phase 2 Trial of Single Agent Ipilimumab (Anti-CTLA-4) for Locally Advanced or Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 33 (8), 828-833 (2010).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+Activity+of+Anti%E2%80%93PD-L1+Antibody+in+Patients+with+Advanced+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and Activity of Anti–PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 366 (26), 2455-2465 (2012).</li>
<li>Winograd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+Immunity+Overcomes+Complete+Resistance+to+PD-1+and+CTLA-4+Blockade+and+Improves+Survival+in+Pancreatic+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma.</a> Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).</li>
<li>Beatty, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Agonists+Alter+Tumor+Stroma+and+Show+Efficacy+Against+Pancreatic+Carcinoma+in+Mice+and+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans.</a> Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).</li>
<li>Lutz, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+converts+nonimmunogenic+pancreatic+tumors+into+immunogenic+foci+of+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation.</a> Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).</li>
<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocytes%3A+all+roads+lead+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (6), 401-409 (2002).</li>
<li>Mojic, M., Takeda, K., Hayakawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dark+side+of+IFN-%CE%B3%3A+Its+role+in+promoting+cancer+immunoevasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The dark side of IFN-γ: Its role in promoting cancer immunoevasion.</a> International Journal of Molecular Sciences. , (2018).</li>
<li>Castro, F., Cardoso, A. P., Gonçalves, R. M., Serre, K., Oliveira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+at+the+crossroads+of+tumor+immune+surveillance+or+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion.</a> Frontiers in Immunology. , (2018).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nature Immunology. , (2011).</li>
<li>Betts, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+viable+identification+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+by+a+flow+cytometric+assay+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation.</a> Journal of Immunological Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).</li>
<li>Schuerwegh, A. J., De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intracellular+cytokine+production+with+extracellular+cytokine+levels+using+two+flow+cytometric+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of intracellular cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric techniques.</a> Cytometry. 55 (1), 52-58 (2003).</li>
<li>Partecke, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syngeneic+orthotopic+murine+model+of+pancreatic+adenocarcinoma+in+the+C57%2FBL6+mouse+using+the+panc02+and+6606PDA+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the panc02 and 6606PDA cell lines.</a> European Surgical Research. , (2011).</li>
<li>An, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+Orthotopic+Homograft+%28Syngeneic%29+of+Murine+Primary+KPC+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+orthotopic+pancreatic+cancer+mouse+model%3A+Cells+suspended+and+injected+in+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: Cells suspended and injected in Matrigel.</a> World Journal of Gastroenterology. , (2014).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Microbiology+%26+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
<li>Trapecar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+and+Validated+Method+for+Isolation+and+Characterization+of+Lymphocytes+from+HIV%2B+Human+Gut+Biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2017).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+enzymatic+digestion%2C+cell+culture+and+preservation+conditions+on+surface+CD62L+expression+of+primary+murine+CD3%2BCD4%2BT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+%28India%29%22%5BJournal%5D)">Effects of enzymatic digestion, cell culture and preservation conditions on surface CD62L expression of primary murine CD3+CD4+T cells.</a> Biomedical Research (India). 29 (10), 2153-2159 (2018).</li>
<li>Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+processing+time+and+duration+of+collagenase+digestion+on+human+and+murine+fat+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. , (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO Journal. , (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. , (2015).</li>
<li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. , (2019).</li>
<li>Moran, A. E., Polesso, F., Weinberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+Expands+and+Maintains+the+Function+of+High-Affinity+Tumor-Infiltrating+CD8+T+Cells+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy Expands and Maintains the Function of High-Affinity Tumor-Infiltrating CD8 T Cells In Situ.</a> The Journal of Immunology. , (2016).</li>
<li>Stromnes, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+against+a+Native+Antigen+Can+Surmount+Immunologic+and+Physical+Barriers+to+Treat+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. , (2015).</li>
<li>Singh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+targeted+long-read+single+cell+sequencing+reveals+the+clonal+and+transcriptional+landscape+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes.</a> Nature Communications. 10 (1), 3120(2019).</li>
<li>Jiang, N., Schonnesen, A. A., Ma, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+Ushering+in+Integrated+T+Cell+Repertoire+Profiling+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Opinion Ushering in Integrated T Cell Repertoire Profiling in Cancer.</a> Trends in Cancer. 5, 85-94 (2019).</li>
<li>Schietinger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Specific+T+Cell+Dysfunction+Is+a+Dynamic+Antigen-Driven+Differentiation+Program+Initiated+Early+during+Tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis.</a> Immunity. 45 (2), 389-401 (2016).</li>
<li>Raghav, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhaustion+of+tumor-specific+CD8%2B+T+cells+in+metastases+from+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Exhaustion of tumor-specific CD8+ T cells in metastases from melanoma patients.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+in+filtrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific in filtrating human tumors.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2014).</li>
<li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+exhausted+CD8+%2B+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subsets of exhausted CD8 + T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modele in vivo raka trzustki dostarczają nieocenionych narzędzi do zrozumienia progresji choroby i oceny nowych celów terapeutycznych3. W szczególności model ortotopowy jest opłacalnym i powtarzalnym modelem, który może być stosowany jednocześnie w dużych kohortach myszy 4,27. Model ortotopowy zapewnia również pokrewne mikrośrodowisko i nienaruszony układ odpornościowy dla wzrostu guza, co czyni go bardziej odpowiednim niż modele podskórne i PDX. Odkryliśmy jednak, że niektóre elementy infiltracji immunologicznej mogą się różnić między modelem ortotopowym a myszami KPC, złotym standardem mysiego modelu10. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy może być przyspieszony wzrost guza obserwowany w modelu ortotopowym. Dalsze różnice w gęstości podzbiorów komórek odpornościowych opisano między modelem ortotopowym a podskórnym 3,28. Dlatego, chociaż transgeniczny model KPC jest bardziej kosztownyi zmienny6, kluczowe wyniki powinny być weryfikowane w małej kohorcie myszy KPC, jeśli to możliwe.
Przygotowanie komórek nowotworowych do operacji ortotopowej jest krytycznym krokiem w protokole. Komórki powinny zawsze znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu i być wolne od mykoplazmy i infekcji. Operację ortotopową należy odłożyć, jeśli istnieją jakiekolwiek obawy dotyczące wzrostu komórek nowotworowych. Zastosowanie błony podstawnej poprawia częstość występowania guza w porównaniu z wstrzykiwaniem komórek bez niej29 i zmniejsza przeciek komórek, a tym samym rozprzestrzenianie się otrzewnej27. Jednak po zawieszeniu w błonie podstawnej komórki nowotworowe należy szybko wstrzyknąć (w ciągu 2 godzin), aby uniknąć utraty komórek. Liczba komórek nowotworowych wymaganych do wytworzenia guzów jest prawdopodobnie zależna od linii komórkowej, a zakres liczby komórek powinien być badany (np. od 100 do 100 000), co może również określić czas do osiągnięcia punktu końcowego. Jest prawdopodobne, że będzie istniał margines błędu podczas przygotowywania 1000 komórek na mysz do wstrzyknięcia; Dlatego, jeśli wymagana jest wielodniowa operacja, leczenie grup powinno być równomiernie rozłożone na dni, aby kontrolować efekty partii. Większość kroków chirurgicznych można modyfikować w zależności od preferencji; Należy jednak zachować ostrożność, aby nie naruszyć błony podstawnej podczas wymiany trzustki w jamie brzusznej lub zamykania ściany otrzewnej. Nieszczelność błony podstawnej może powodować wzrost komórek nowotworowych na ścianie otrzewnej, które tworzą się szybko i mogą skutkować koniecznością wcześniejszego poświęcenia zwierzęcia.
Idealnie byłoby, gdyby guzy trzustki zostały szybko strawione po zbiorach i natychmiast przygotowane do stymulacji ex vivo. Jednak może to nie być możliwe, jeśli do zebrania jest duża partia guzów, w takim przypadku guzy powinny być trzymane na lodzie i trawione partiami. Wykazano, że rodzaj, stężenie i czas ekspozycji na enzymy trawienne wpływają na dużą liczbę cząsteczek powierzchniowych komórek odpornościowych 30,31,32. Czas trawienia jest również celowo krótki, aby ograniczyć śmierć komórki33. Strawione komórki można zamrozić w pożywce zamrażającej w celu długotrwałego przechowywania; Jednak podczas rozmrażania nastąpi pewna utrata komórek. Proces trawienia może być mniej niż optymalny, jeśli kawałki guza nie zostaną wystarczająco pokrojone w kostkę przed inkubacją kolagenazy, co będzie widoczne, ponieważ twarde kawałki guza pozostaną w filtrze po trawieniu. Stężenie kolagenazy można obniżyć, jeśli pracujesz ze zdrową trzustką lub guzami we wczesnym stadium; Doniesienia na temat ekstrakcji zdrowych komórek przewodowych trzustki wykorzystują znacznie niższe stężenia34. Podczas trawienia należy spodziewać się wysokiego stopnia obumarcia komórek nabłonkowych; Jednak komórki odpornościowe powinny dobrze tolerować ten proces. Istnieją alternatywne metody izolowania żywotnych komórek nabłonka w celu wzrostu organoidów35 lub zachowania architektury tkankowej36.
Modyfikacje protokołu stymulacji można łatwo wprowadzić, w zależności od pożądanego odczytu i analizowanych komórek odpornościowych (np. makrofagów lub limfocytów B). Stosowanie odczynników do panstymulacji PMA/jonomycyny nie dyskryminuje swoistości antygenu TCR, dzięki czemu jest przydatne, gdy antygen nie jest znany. Jednak produkcja IFNɣ jest ściśle związana z zaangażowaniem TCR37 i zarówno produkcja IFNɣ, jak i TNFα mają kluczowe znaczenie w odpowiedziach przeciwnowotworowych PDAC38. Stymulacja PMA/jonomycyny odzwierciedla maksymalną zdolność limfocytów T do wytwarzania cytokin, które mogą, ale nie muszą, być wytwarzane przez limfocyty T w mikrośrodowisku guza. Produkcję endogenną można zmierzyć bez potrzeby stymulacji; Jednak poziomy mogą być znacznie niższe lub niewykrywalne. Istnieją alternatywne metody stymulacji limfocytów T: kulki pokryte anty-CD3/28, które również nie wymagają antygenu ani innych populacji komórek odpornościowych. Zaletą tej metody jest umożliwienie ilościowego określenia produkcji cytokin przez określone podzbiory limfocytów T bez konieczności stosowania metod separacji. Można również dodać inne markery cytotoksyczności (granzym B i perforyna A), aktywności (IL-2) lub immunosupresji (IL-10)21. Jednak wysokiej jakości przeciwciała cytometrii przepływowej nie są dostępne do wykrycia wszystkich cytokin i czynników będących przedmiotem zainteresowania. W związku z tym, jeśli wymagane są inne zastosowania, takie jak ELISA, stymulację można przeprowadzić bez włączania brefeldyny A/monenzyny, co pozwala na uwalnianie cytokin do supernatantu. Należy jednak zauważyć, że pozwoli to na całkowite uwolnienie cytokin komórkowych i nie będzie możliwe określenie, które populacje komórek się do tego przyczyniły.
Produkcja IFNγ jest dominującą cechą odpowiedzi przeciwnowotworowej limfocytów T, często stosowaną jako substytut rozpoznawania antygenu TCR 37,38. Inne metody in vivo, które dokładniej definiują odpowiedzi specyficzne dla antygenu, wykorzystują komórki nowotworowe wyrażające znany antygen, taki jak albumina jaja kurzego lub SV40. Uniwersalny antygen może być następnie wykorzystany ex vivo do testowania rozpoznawania limfocytów T lub w połączeniu z myszą gospodarza z ograniczeniami TCR. Alternatywnie, gdy antygen jest nieznany, kwantyfikacja ekspansji klonalnej komórek T może być przeprowadzona przez sekwencjonowanie masowe TCR lub ostatnio sekwencjonowanie TCR pojedynczej komórki39,40. Aby w pełni zrozumieć stan wewnątrznowotworowej odpowiedzi limfocytów T, należy również zmierzyć markery wskazujące na wyczerpanie lub receptory hamujące, w tym: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Jak również markery efektorowych limfocytów T (CD44hi, CD62lo) i aktywności proliferacyjnej, rozcieńczenie Ki67 + lub CSFE 41,42,43,44. Ogólnie rzecz biorąc, model ortotopowy stanowi użyteczną platformę do szybkiego testowania strategii terapeutycznych, w szczególności takich, które mogą modulować odpowiedź przeciwnowotworową komórek T, które można następnie zwalidować na mniejszej kohorcie myszy transgenicznych (KPC).

Ta metoda szczegółowo opisuje, od początku do końca, procedurę chirurgiczną generowania ortotopowych guzów trzustki przy użyciu minimalnej ilości materiału komórkowego i późniejszą szybką dysocjację powstałych guzów w celu kompleksowej analizy populacji komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej, w tym analizy ex vivo funkcji komórek T.
Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest agresywnym rakiem, który tylko 8% pacjentów przeżywa 5 lat1. Ponieważ mniej niż 20% pacjentów kwalifikuje się do resekcji chirurgicznej2, świeże próbki pacjentów nie są łatwo dostępne do badań, dlatego modele in vivo dostarczają niezbędnych narzędzi do badania tej choroby. Istnieje wiele mysich modeli PDAC: ortotopowy, podskórny, transgeniczny, dożylny i ksenoprzeszczep pobrany od pacjenta (PDX), szczegółowo opisany tutaj3. Opisany tutaj model ortotopowy pozwala na wstrzyknięcie syngenicznych komórek PDAC do trzustki myszy immunokompetentnych. Można to przeprowadzić w dużych kohortach myszy typu dzikiego lub zmutowanego, a tym samym zapewnia opłacalny i spójny model do porównywania środków terapeutycznych. Co ważne, model ortotopowy zapewnia pokrewne mikrośrodowisko dla wzrostu komórek nowotworowych i przerzutów w naszych rękach i innych4 do klinicznie istotnych miejsc (np. wątroby), co czyni go bardziej istotnym klinicznie niż modele podskórne lub indukowane chemicznie. Guzy ortotopowe wykazują kluczowe cechy PDAC, takie jak silna reakcja desmoplastyczna z dużą ilością fibroblastów i odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej5. Transgeniczne modele PDAC są złotym standardem modelu mysiego, a najczęściej stosowanym jest model KPC, który wyraża zmutowane KrasG12D/+ i Trp53R172H/+ w specyficznym dla trzustki promotorze Pdx-1-Cre6. Dodatkowe modele KPC i inne modele PDAC in vivo są przeglądane tutaj7. U myszy KPC spontanicznie rozwijają się guzy trzustki z postępem choroby, który wiernie odtwarza cechy ludzkiego PDAC6. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich modeli transgenicznych, program hodowlany jest kosztowny, progresja guza jest zmienna i dlatego często wymaga dużych kohort myszy. Modele PDX wykorzystują komórki nowotworowe lub fragmenty pochodzące od pacjenta, które są następnie hodowane ortotopowo lub, częściej, podskórnie u myszy z obniżoną odpornością. Modele ksenoprzeszczepów dostarczają użytecznych narzędzi do badań przesiewowych związków terapeutycznych i uwzględniają niejednorodność pacjentów. Nie zapewniają one jednak pełnego mikrośrodowiska odpornościowego, co ogranicza ich zastosowanie8,9.
Po ustaleniu, guzy ortotopowe zazwyczaj potrzebują około 1 miesiąca lub więcej na wzrost (w zależności od użytej linii komórkowej) i tworzą duże guzy, które można łatwo zobrazować za pomocą ultradźwięków lub rezonansu magnetycznego w celu śledzenia postępu i określenia skuteczności leczenia4,5,10. Jednak po wykładniczym wzroście ostatnia faza wzrostu guza może być szybka, więc większość schematów leczenia rozpoczyna się stosunkowo wcześnie (np. 14 dni)11,12. Układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w rozwoju nowotworu, w tym w PDAC, który charakteryzuje się immunosupresyjnym naciekiem guza ze względnym niedostatkiem limfocytów T i częstą obecnością komórek szpikowych13. Wysoka obecność limfocytów T w PDAC zapewnia lepsze rokowanie14,15. Jednak inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, które łagodzą immunosupresję limfocytów T, takie jak anty-CTLA-416 i anty-PD-L117, nie wykazały korzyści klinicznych u pacjentów z PDAC, najprawdopodobniej dlatego, że ogólna reaktywność limfocytów T jest bardzo niska. Jednak czynniki, które pobudzają odpowiedź limfocytów T, takie jak anty-CD40, mogą przezwyciężyć oporność na anty-PD-L1/CTLA-418,19 i szczepienie allogeniczną szczepionką PDAC wydzielającą GM-CSF (GVAX) mogą zwiększyć immunogenność guzów PDAC20, co wskazuje, że wzmocnienie odpowiedzi limfocytów T stanowi ważną drogę terapeutyczną.
Kluczowe dla odpowiedzi przeciwnowotworowej limfocytów T jest rozpoznawanie antygenów pochodzących z nowotworu przez receptor limfocytów T (TCR) i późniejsza produkcja cytotoksycznych cytokin i granulek. Chociaż rozpoznawanie antygenu limfocytów T można określić za pomocą sekwencjonowania TCR, podejście to jest kosztowne i czasochłonne. Jednak kwantyfikacja podzbiorów limfocytów T naciekających nowotwór stanowi dobry wskaźnik odpowiedzi przeciwnowotworowej. Dalsze badania aktywności limfocytów T ex vivo pod kątem degranulacji, produkcji cytokin i innych czynników cytotoksycznych zapewniają głębszą analizę funkcjonalną. Testy te można wykonywać na świeżych próbkach guza, a wiele parametrów funkcji limfocytów T można szybko zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej.
Limfocyty T CD8+ i CD4+ wytwarzają cytokiny, takie jak IFNγ i TNFα, aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną21. IFNɣ indukuje regulację MHCI w górę na komórkach docelowych, indukuje różnicowanie i rekrutację komórek odpornościowych oraz wspomaga śmierć komórki. Produkcja IFNγ przez limfocyty T CD8 + jest dobrze scharakteryzowana jako część odpowiedzi przeciwnowotworowej i koreluje z regresją guza22,23. TNFα to kolejna cytokina prozapalna wytwarzana zarówno przez limfocyty T CD8 +, jak i CD4 +. Zwiększa zależną od TCR aktywację i proliferację limfocytów T, wspomagając odpowiedź przeciwnowotworową. Po zaangażowaniu TCR, cytotoksyczne limfocyty T CD8 + mogą ulegać degranulacji, w której wstępnie uformowane lizosomy wydzielnicze zawierające cząsteczki cytotoksyczne są uwalniane do synapsy immunologicznej, powodując degradację komórek docelowych21. Cząsteczki te obejmują perforynę, białko, które wiąże się z błoną komórkową docelową, tworząc pory, które następnie zakłócają integralność błony i umożliwiają dyfuzję21 lub endocytosis24 innych cząsteczek cytotoksycznych, takich jak Granzyme B, bezpośrednio do cytoplazmy komórki docelowej. Granzyme B jest proteazą, która powoduje degradację wielu białek w komórce docelowej, prowadząc do śmierci komórki21. Uwolnienie takich cząsteczek wymaga egzocytozy endosomów na powierzchnię komórki, gdzie marker endosomalny CD107a (znany również jako LAMP-1) jest przejściowo włączony do błony komórkowej25.
Pomiar wydzielania cytokin przez limfocyty T wymaga ich izolacji za pomocą sortowania komórek wspomaganego przepływem lub testów separacji opartych na koralikach, które nie mogą być łatwo przeprowadzone na dużej liczbie próbek jednocześnie. Jednak pomiar cytokin wewnątrzkomórkowych nie wymaga żadnych etapów przed izolacją i może być łatwo wykonany na wielu próbkach jednocześnie, co pozwala na podejście o wyższej przepustowości. Ponieważ cytokiny są szybko wydzielane przez limfocyty T, poziomy wewnątrzkomórkowe mogą być niewykrywalne, a zatem limfocyty T wymagają stymulacji w celu zwiększenia podstawowej produkcji cytokin. Aby ocenić produkcję cytokin sterowanych antygenem, antygen rozpoznany przez TCR musi zostać przedstawiony limfocytowi T przez zaszczepiony APC in vitro. W przypadkach, gdy swoistość antygenu nie jest znana, wymagane jest szerokie podejście do stymulacji. Stymulację TCR można naśladować za pomocą kulek anty-CD3/28, które zapewniają zarówno aktywację TCR, jak i kostymulację, co indukuje produkcję i proliferację cytokin. Jednak bardziej opłacalną alternatywą jest zastosowanie PMA i jonomycyny, które razem szeroko aktywują szlaki sygnałowe, które prowadzą do syntezy i uwalniania cytokin wewnątrzkomórkowych. W szczególności PMA aktywuje kinazę białkową C (PKC), a jonomycyna podnosi wewnątrzkomórkowe jony Ca2+, co prowadzi do zwiększonej sygnalizacji komórkowej. W celu zachowania wewnątrzkomórkowej zawartości cytokin, stymulacja ta może być skutecznie połączona z inhibitorami transportu białek brefeldyną A i monenzyną, które blokują białka w Golgiego, a tym samym zapobiegają uwalnianiu zewnątrzkomórkowemu. Stosowanie PMA/jonomycyny jest dobrze znaną metodą stymulacji limfocytów T i istnieje silna korelacja między cytokinami uwalnianymi zewnątrzkomórkowo i wewnątrzkomórkowymi26. Stymulacja limfocytów T za pomocą PMA i jonomycyny zwiększa również transport lizosomów do błony komórkowej, a zatem CD107a zostaje przejściowo zintegrowany na powierzchni komórki, zanim zostanie ponownie wprowadzony do komórki. Poprzez włączenie przeciwciała anty-CD107a podczas stymulacji, możliwe jest wykorzystanie go jako markera aktywności degranulacji25.
Ta metoda szybko trawi guzy, aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową. Na tym etapie poszczególne populacje mogą być bezpośrednio barwione do cytometrii przepływowej lub oczyszczane metodami dalszymi: sortowaniem komórek wspomaganym przepływem lub separacją magnetyczną. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki do analizy metodą cytometrii przepływowej umożliwia wysokoprzepustową analizę wielu populacji komórek odpornościowych i ich markerów fenotypowych, zapewniając dokładną kwantyfikację liczby komórek odpornościowych i fenotypu.
Na koniec, opisany tutaj protokół trawienia zapobiega utracie markerów powierzchniowych komórek i utrzymuje żywotność komórek odpornościowych, umożliwiając komórkom odpornościowym przejście dalszych etapów oczyszczania komórek i hodowli zgodnie z wymaganiami. Jednak metoda ta nie została przetestowana pod kątem wyprowadzania komórek nabłonkowych z tego trawienia.

<table><tbody><tr><td>Nici wchłanialne vicryl powlekane o rozmiarze 6/0</td><td>Ethicon</td><td>W9500T</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Sitko do komórek o porach</td><td>Fisher Scientific 11597522</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 mm Klipsy Clay Adams</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015A</td> anty-CD107a <td></td></tr><tr><td>PE (klon 1D4B)</td><td>Biolegend</td><td>121612</td><td>1:100 do pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej anty-CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:200</td></tr><tr><td>anty-CD3 PerCP eFluor710 (klon 17A2)</td> <td>Biolegend</td><td>46-0032</td><td>Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:50</td></tr><tr><td>anty-CD4 FITC (klon GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td>Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>anty-CD45 Brilliant Violet 605 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103140</td><td>Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:200</td></tr><tr><td>anty-CD8 Brilliant Violet 421 (klon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100738</td><td>Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>anty-IFN-gamma PE/Cy7 (klon XMG1.2)</td><td>Biolegend</td><td>505826</td><td>Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:50</td></tr><tr><td>anty-TNF-alfa Alexa Fluor 647 (klon MP6-X)</td><td>Biolegend</td><td>506314</td><td>Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:50</td></tr><tr><td>BD Matrigel Podłoże z membraną podstawną o wysokim stężeniu</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td>Podwielokrotność na lodzie i przechowywać w temperaturze -20 ° Deg; C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl stymulacji komórek (500x) (12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) i jonomycyna)</td><td>eBioscience</td><td>00-4970-03</td><td>1x Stężenie końcowe PMA 0,081 i mu; M, jonomycyna 1,34 i mu; M</td></tr><tr><td>Clay Adams Autoclip Applier</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Clay Adams Autoclip remover</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu V z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9263</td><td>2 mg / ml w pożywce</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoka zawartość glukozy (4,5 g / L) z L-glutamina</td><td>PAA</td><td>E15-810</td><td></td></tr><tr><td>DNaza (dezoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej typu II-S) zapas 10 mg / ml w 0,15 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td>Końcowe stężenie w pożywce wytrawiającej 0,025 mg / ml</td></tr><tr><td>Możliwy do ustalenia barwnik żywotności 506 (FVD506)</td> <td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>Stosować w 1:200 w PBS</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-104</td><td>10% w RPMI</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton seria 700, 25 &mu; L objętość, końcówka skośna igły o rozmiarze 22s</td><td>Fisher Scientific</td><td>10100332</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do utrwalania wewnątrzkomórkowego i bufor do permeabilizacji wewnątrzkomórkowej</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td>Rozcieńczyć bufor permeabilizacyjny do 1x w H2O</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>PAA</td><td>15140122</td><td>100 jednostek/ml Penicyliny, 100 &mu; g/ml Streptomycyna</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów transportu białek (500x) (brefeldyna A i monesyna)</td><td>eBioscience</td><td>00-4980-03</td><td>1x Stężenie końcowe Brefeldin A 10,6 &mu; M, monenzyna 2 & mu; M</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (zawiera 0,3 g/l glutaminy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczne ostrze skalpela nr 10</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>594-18C</td><td>Trypsyna (0,1%) EDTA (0,4%) stężenie końcowe</td></tr><tr><td>U-bottomed 96 płytka mikrodołkowa</td><td>VWR</td><td>734-2080</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne aplikatory z bawełnianą końcówką - 6 cal x 100</td><td>Medisave</td><td>UN982</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka mikrodołkowa z dnem w kształcie litery V</td><td>VWR</td><td>735-0184</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów t naciekających nowotwór

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Modele in vivo raka trzustki dostarczają nieocenionych narzędzi do badania dynamiki choroby, infiltracji immunologicznej i nowych strategii terapeutycznych. Ortotopowy model mysi może być wykonywany jednocześnie na dużych kohortach myszy immunokompetentnych, jest stosunkowo niedrogi i zachowuje pokrewne mikrośrodowisko tkankowe. Kwantyfikacja naciekania limfocytów T i aktywności cytotoksycznej w guzach ortotopowych stanowi użyteczny wskaźnik odpowiedzi przeciwnowotworowej.
Ten protokół opisuje metodologię chirurgicznego generowania ortotopowych guzów trzustki poprzez wstrzyknięcie niewielkiej liczby syngenicznych komórek nowotworowych zawieszonych w błonie podstawnej o pojemności 5 μl bezpośrednio do trzustki. Myszy z guzami ortotopowymi potrzebują około 30 dni, aby osiągnąć punkt końcowy, w którym to momencie guzy można pobrać i przetworzyć w celu scharakteryzowania aktywności komórek T naciekających nowotwór. Szybkie trawienie enzymatyczne przy użyciu kolagenazy i DNazy umożliwia ekstrakcję zawiesiny jednokomórkowej z guzów. Żywotność i markery powierzchni komórek odpornościowych wyekstrahowanych z guza są zachowane; w związku z tym nadaje się do wielu dalszych zastosowań, w tym do wspomaganego przepływem sortowania komórek odpornościowych do hodowli lub ekstrakcji RNA, analizy cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych. W tym miejscu opisujemy stymulację ex vivo populacji limfocytów T do wewnątrzkomórkowej kwantyfikacji cytokin (IFNγ i TNFα) i aktywności degranulacyjnej (CD107a) jako miary ogólnej cytotoksyczności. Trawiny całego guza stymulowano octanem mirystynianu forbolu i jonomycyną przez 5 godzin, w obecności przeciwciała anty-CD107a w celu zwiększenia produkcji cytokin i degranulacji. Dodanie brefeldyny A i monenzyny przez ostatnie 4 godziny przeprowadzono w celu zablokowania transportu zewnątrzkomórkowego i maksymalizacji wykrywania cytokin. Następnie przeprowadzono barwienie zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe komórek do analizy cytometrii przepływowej, w której określono ilościowo proporcję limfocytów T IFNγ+, TNFα+ i CD107a+ i CD4+ i CD8+.
Ta metoda stanowi bazę wyjściową do przeprowadzenia kompleksowej analizy mikrośrodowiska guza.

Po wstrzyknięciu 10 komórek TB32048 do trzustki, guzy ortotopowe rozwijają się w ciągu około 30 dni (Rycina 1A,B). Przeciekanie błony podstawowej podczas operacji może spowodować powstanie dużych guzów bezpośrednio na ścianie otrzewnej, które są wyraźnie widoczne przez skórę (Rycina 1C). Takie myszy zostaną wykluczone z badania. Jednak przy zachowaniu odpowiedniej techniki chirurgicznej częstotliwość przecieków jest zminimalizowana. Guzy ortotopowe pobrane w punkcie końcowym mogą osiągnąć znaczny rozmiar u myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego (Rycina 1D). Pobrane guzy ortotopowe wymagają trawienia kolagenazą/DNazą przez 20 min w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek (Rycina 2). Na tym etapie komórki pochodzące z guza można wysiać na płytkę z półkulistym dnem w zagęszczeniu 2 x 106 komórek/studzienkę. Liczbę wysianych komórek można dostosować w zależności od liczebności limfocytów T w próbce; liczbę komórek można zmniejszyć, jeśli gęstość limfocytów T jest wysoka. W tym momencie można również wysiać kontrolne próbki śledziony lub węzłów chłonnych w celu stymulacji. Każda studzienka jest stymulowana PMA i jonomycyną przez 5 h, a po 1 h inkubacji dodaje się brefeldynę A i monensynę w celu zablokowania pozakomórkowego uwalniania cytokin (Rycina 2). Po inkubacji próbki poddaje się barwieniu na epitopy zewnątrzkomórkowe oraz wewnątrzkomórkowe cytokiny w celu analizy metodą cytometrii przepływowej (Rycina 2).
Próbki śledziony i guzów pobrane od myszy z guzami ortotopowymi poddano analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania zastosowana w analizie cytometrycznej śledziony i guzów ortotopowych wyklucza debris przy użyciu FSC-A, SSC-A, dublety poprzez FSC-A/FSC-H oraz SSC-A/SSC-W, a następnie martwe lub apoptotyczne komórki jako pozytywne pod kątem barwnika żywotności (fixable viability dye) (Ryc. 3A). Następnie wyodrębniono komórki odpornościowe jako CD45+, a następnie limfocyty T jako CD3+, z których zdefiniowano subpopulacje CD4+ i CD8+ (Ryc. 3A). Wykonano kontrolę FMO (fluorescence minus one) w celu określenia fluorescencji tła dla bramkowania oraz kontrolę z zastosowaniem wyłącznie brefeldyny A/monensyny w celu określenia podstawowej produkcji cytokin (Ryc. 3B-D).
W przypadku IFNγ inkubacja z brefeldyną A/monensyną nie spowodowała wzrostu poziomu IFNγ względem kontroli FMO zarówno w próbkach śledziony, jak i guza. Jednak dodanie PMA i jonomycyny zwiększyło % wewnątrzkomórkowego IFNɣ wykrywalnego w komórkach T CD4+ i CD8+ pochodzących zarówno ze śledziony, jak i z guza.
Limfocyty T CD4+ i CD8+ z śledziony, użyte jako kontrola dodatnia, wykazują relatywnie wyższą produkcję IFNγ niż podgrupy limfocytów T naciekających guz, średnio odpowiednio 6,60 ± 1,5% i 12,97 ± 3,4% w porównaniu do 4,81 ± 1,0% i 4,13 ± 1,3%, co wskazuje na występowanie immunosupresji w obrębie guza (Rycina 3B oraz 4A). Stosując tę samą strategię dla TNFα, zaobserwowano, że wysoki odsetek limfocytów T CD4+ z śledziony jest dodatni pod kątem wewnątrzkomórkowego TNFα (65,93 ± 2,3%) w porównaniu do limfocytów T CD4+ naciekających guz (2,45 ± 5,4%). Limfocyty T CD8+ z śledziony oraz naciekające guz produkują podobne poziomy TNFα (odpowiednio 25,15 ± 3,7% i 19,91 ± 5,1%) (Rycina 3C, Rycina 4B).
Wreszcie, CD107a jest markerem endosomalnym, który jest przejściowo ekspresowany na powierzchni komórki podczas egzocytozy granul cytotoksycznych i cytokin, w związku z czym jest on stosowany jako marker zastępczy dla cytotoksyczności. Korzyścią z barwienia CD107a podczas stymulacji jest to, że całe przejściowo ekspresowane na powierzchni komórek CD107a zostanie wychwycone przez przeciwciało fluorescencyjne. Bazowe poziomy CD107a pokazano w komórkach traktowanych wyłącznie brefeldyną A/monensyną. W przypadku śledzionowych limfocytów T CD8+ stymulacja PMA/ionomycyną zwiększa wykrywany poziom CD107a, przy czym najsilniejszą upregulację zaobserwowano w komórkach CD8+, w których poziom CD107a+ wynosił 23,95 ± 3,5%, w porównaniu do 5,8 ± 1,9% w naciekających guz komórkach CD8+, co wskazuje na większy stopień degranulacji w przypadku śledzionowych CD8+. Z drugiej strony, śledzionowe i naciekające guz komórki CD4+ wykazywały porównywalne poziomy CD107a, odpowiednio 9,37 ± 1,5% i 1,50 ± 1,8% (Rysunek 3D i 4C).
Podsumowując, wyniki te wskazują, że guzy ortotopowe mogą być generowane poprzez wstrzyknięcie bardzo niskiej liczby (1 0) komórek nowotworowych do trzustki. Guzy te można szybko przetrawić w celu izolacji limfocytów T do stymulacji ex vivo. Wykrywanie cytokin wewnątrzkomórkowych jest możliwe i podkreśla podstawowy poziom immunosupresji naciekających limfocytów T w porównaniu z limfocytami T w wtórnych narządach limfatycznych.
<img alt="Badanie wzrostu guza ortotopijnego; oś czasu, zabieg chirurgiczny, wyciek Matrigelu i wykres wagi guza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Generowanie ortotopowych guzów trzustki. (A) Harmonogram in vivo eksperymenty. (B) Wygląd makroskopowy guzów ortotopowych w jamie brzusznej (lewo) oraz po wycięciu (prawo), gdzie przedstawiony guz został przecięty na pół. (C) Dowody na nieszczelność błony podstawnej podczas operacji mogą prowadzić do rozwoju guzów widocznych przez skórę (górne zdjęcie) oraz formujących się na ścianie otrzewnej (dolne zdjęcie). (D) Masa ortotopowych guzów trzustki pobranych od myszy, które osiągnęły punkt końcowy (n=2). Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczą mysz; wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. Dane na tej rycinie zostały zmodyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanej pracy.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Harmonogram przetwarzania komórek; rozdrabnianie guza, wysiew, inkubacja, etapy barwienia; przygotowanie do cytometrii przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat przetwarzania guzów ortotopowych do ex vivo Stymulacja limfocytów T. Po pobraniu guzy trzustki są szybko trawione w kolagenazie (2 mg/ml) i DNazie (0,025 mg/ml) przez 20 min w temperaturze 37 °CNastępnie komórki resuspenduje się w stężeniu 2 x 106/ml w pełnej pożywce RPMI i wysiano na płytkę z wypukłym dnem (U-bottom). Dodano koktajl stymulujący z PMA i jonomycyną na 5 h, po czym do hodowli można również dodać przeciwciało anty-mysie CD107a. Po 1 h inkubacji dodano blokery transportu wewnątrzkomórkowego: brefeldynę A i monensynę. Po ex vivo po stymulacji komórki przenosi się do płytki z dnem w kształcie litery V w celu barwienia barwnikiem żywotności do utrwalania (w PBS) przez 20 min 4 °CKomórki przemywa się buforem FACS, a następnie inkubuje z przeciwciałami anty-CD16/32 (blokada FcR) przez 15 min (w buforze FACS), po czym inkubuje się je z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami zewnątrzkomórkowymi przez kolejne 30 min (w buforze FACS). Komórki ponownie przemywa się buforem FACS i resuspenderuje w buforze do fiksacji wewnątrzkomórkowej na 20 min. Następnie komórki przemywa się raz buforem FACS i raz 1x buforem do permeabilizacji. Komórki resuspenderuje się w fluorescencyjnie znakowanych przeciwciałach wewnątrzkomórkowych w temperaturze pokojowej przez 1 h (w 1x buforze do permeabilizacji). Komórki przemywa się raz 1x buforem do permeabilizacji i raz buforem FACS, a następnie resuspenderuje w buforze FACS w celu przeprowadzenia analizy na cytometrze przepływowym w ciągu 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna komórek śledziony/guza; aktywacja limfocytów T; wykresy SSC-A, IFNγ, TNFα, CD107a." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Analiza cytometryczna przepływowa ex vivo stymulowane limfocyty T pochodzące ze śledziony oraz z guza. (A) Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej zastosowana dla próbek śledziony (kontroli pozytywnej) oraz guzów ortotopowych. Komórki oddzielono od debris przy użyciu parametrów FSC-A/SSC-A, a następnie wyizolowano pojedyncze komórki za pomocą parametrów FSC-A/FSC-H oraz SSC-A/SSC-W. Komórki martwe lub apoptotyczne wykluczono przy użyciu utrwalanego barwnika żywotności FVD506, natomiast komórki odpornościowe wyselekcjonowano za pomocą markera CD45.+Następnie CD3+ Limfocyty T i CD4+ oraz CD8+ zdefiniowano podgrupy. Dane uzyskano za pomocą cytometru BD Fortessa. (BStrategia bramowania zastosowana do ilościowego oznaczenia IFNγ+ CD4+ oraz CD8+ Limfocyty T. Próbki w pełni stymulowane (PMA/ionomycyna/brefeldyna A/monensyna) poddaje się kontroli FMO (fluorescent minus one), aby określić fluorescencję tła. Kontrolę z samą brefeldyną A i monensyną (tylko B+M) stosuje się do wyznaczenia podstawowego poziomu produkcji cytokin. Następnie próbkę w pełni stymulowaną wykorzystuje się do obliczenia procentowej zawartości IFNγ.+ Limfocyty T. (C) Strategia bramkowania zastosowana do ilościowego oznaczenia TNFα+ CD4+ oraz CD8+ Limfocyty T. Próbki w pełni stymulowane (PMA/ionomycyna/brefeldyna A/monensyna) poddaje się kontroli FMO w celu określenia fluorescencji tła. Kontrolę z użyciem wyłącznie brefeldyny A/monensyny (tylko B+M) stosuje się do określenia podstawowego poziomu produkcji cytokin. Następnie wykorzystuje się próbkę w pełni stymulowaną do obliczenia procentowego udziału TNFα.+ Limfocyty T.DStrategia bramowania zastosowana do zdefiniowania CD107a+ CD4+ oraz CD8+ Limfocyty T. W próbkach w pełni stymulowanych (PMA/ionomycyna/brefeldyna A/monensyna) stosuje się kontrolę FMO w celu określenia fluorescencji tła. Kontrolę z samą brefeldyną A/monensyną (tylko B+M) stosuje się do określenia podstawowego poziomu degranulacji. Następnie próbka w pełni stymulowana służy do obliczenia wartości % CD107a.+ Limfocyty T. Wszystkie dane z cytometrii przepływowej przeanalizowano w programie FlowJo w wersji 10.6.1. Dane na tej rycinie zostały zmodyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanej pracy.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ekspresja cytokin w limfocytach T CD4/CD8 w śledzionie i guzie; %IFNγ, %TNFα, %CD107a; wykresy słupkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie ex vivo aktywność limfocytów T pochodzących ze śledziony i guza. Odsetek CD4+ oraz CD8+ limfocyty T wykazujące ekspresję (A) IFNγ+ (B) TNFα+ oraz (C) CD107a+ ilość określono w śledzionie (n=4) i guzie (n=7) myszy z ortotopowym guzem. Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczą mysz, a słupki błędów przedstawiają średnią ± SEM. Istotność statystyczną sprawdzono za pomocą nieparzystego testu t, gdzie * = p&lt;0,05 oraz *** = p&lt;0,01. Wszystkie dane przeanalizowano przy użyciu programu Prism 8. Dane przedstawione na tej rycinie zostały zmodyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanej pracy10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Metoda ta może być wykorzystana do oceny, w jaki sposób nowe środki lub strategie terapeutyczne wpływają lub wzmacniają odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T podczas raka trzustki. Technika ta pozwala na szybkie trawienie i stymulację guzów in vitro, umożliwiając jednoczesną analizę wielu parametrów odpowiedzi limfocytów T, które można łatwo dostosować do innych zastosowań. Na początek użyj kleszczy, przenieś guz na szalkę Petriego.Przechowuj pięć mililitrów pożywki wytrawiającej w 50-mililitrowej tubce na lodzie, aby zapobiec rozpoczęciu aktywności enzymów. Weź małą porcję tego roztworu, aby pokryć guz na szalce Petriego. Użyj sterylnego skalpela i kleszczy, aby pociąć guz na małe kawałki, o długości mniej niż trzy milimetry.Zeskrob kawałki guza do probówki i delikatnie odwróć rurkę, aż wszystkie kawałki zostaną zanurzone w pożywce trawiącej. Przenieść probówkę na urządzenie wstrząsające na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza do strawienia. Upewnij się, że wszystkie kawałki guza są zanurzone i nie przyklejają się do krawędzi rurki.Natychmiast po etapie trawienia umieść probówkę na lodzie, aby spowolnić aktywność enzymu. Dodaj EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 milimoli i krótko zwiruj próbkę do wymieszania w celu dalszego spowolnienia aktywności enzymu. Otwórz probówkę i spłucz wszelkie odpady trawione przez guz z pokrywki probówki świeżym medium RPMI.Następnie przygotuj sitko o średnicy 70 mikronów, umieść je na 50-mililitrowej otwartej tubie na lodzie. Wstępnie zwilż filtr medium. Ponownie zawiesić strawione komórki i umyć boki probówki za pomocą 25-mililitrowego lub większego pasiaka.Szerszy otwór pasiaka umożliwia łatwe przechodzenie gęstego trawienia. Przelej cały płyn na sitko za pomocą 25-mililitrowej paski. Rozcieraj guz w górę iw dół na górze filtra za pomocą jednomililitrowego tłoka strzykawki.Ciągle myj komórki przez sitko za pomocą RPMI. Upewnij się, że myjesz z wystarczającą siłą, aby przepchnąć komórki. Kontynuuj mycie, aż wszystkie komórki przejdą przez sitko.Wirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy i zakończyć RPMI, a następnie przejść bezpośrednio przez inny filtr, aby usunąć wszelką macierz zewnątrzkomórkową lub duże grudki komórek, których nie można odpowiednio zawiesić. Jeśli stymulacja nie jest wymagana, natychmiast wybarwić izolowane komórki do analizy cytometrii przepływowej lub ponownie zawiesić je w pożywce zamrażającej 10% DMSO i FBS i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby wykonać stymulację, najpierw policz komórki. Rozcieńczyć komórki w kompletnym pożywce, aby uzyskać stężenie dwa razy dziesięć do sześciu na 100 mikrolitrów. Umieść 100 mikrolitrów komórek w każdym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U.Dodaj 100 mikrolitrów kompletnej pożywki, zawierającej 2X preparat PMA i jonomycyny. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ale 5% dwutlenku węgla na godzinę. Następnie, przy 20 mikrolitrach 10-krotnego preparatu Brefeldin A i Monensin oraz kompletnych pożywkach, aby osiągnąć końcowe stężenie odpowiednio 1,06 mikromola i 2,0 mikromola.Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne cztery godziny. Po wstrzyknięciu 1000 TB32048 komórek do trzustki, guzy ortotopowe rozwijają się po około 30 dniach. Po trawieniu i stymulacji pobranych guzów ortotopowych wykonano fluorescencję minus jeden w celu określenia fluorescencji tła dla bramkowania.Przeprowadzono kontrolę tylko z prefabrykacją Brefeldin A Monensin w celu określenia podstawowej produkcji cytokin. W przypadku inkubacji interferonu gamma z Brefeldyną A i Monenzyną nie stwierdzono wzrostu interferonu gamma w stosunku do kontroli FMO, zarówno w próbkach śledziony, jak i guza. Jednak dodanie PMA i jonomycyny zwiększyło odsetek wewnątrzkomórkowego interferonu gamma wykrywalnego zarówno w limfocytach T CD4-dodatnich i CD8-dodatnich pochodzących ze śledziony, jak i guza.Limfocyty T CD4-dodatnie i CD8-dodatnie śledziony, stosowane jako kontrola pozytywna, mają stosunkowo wyższą produkcję interferonu gamma niż podzbiory limfocytów T naciekających nowotwór. Wskazanie, że immunosupresja występuje w obrębie guza. Stosując tę samą strategię dla TNF alfa, wysoki odsetek limfocytów T CD4 dodatnich dla śledziony był dodatni dla wewnątrzkomórkowego TNF alfa.W porównaniu z naciekającymi nowotwór limfocytami T CD4-dodatnimi. Limfocyty T CD8-dodatnie naciekające śledzionę i nowotwór wytwarzały podobne poziomy TNF alfa. Upewnij się, że guz jest wystarczająco posiekany i że wszystkie kawałki są zanurzone w pożywce trawiącej.Podczas rozgniatania guza należy zachować delikatność i dokładnie przemyć komórki. Protokół trawienia guza można połączyć z sortowaniem komórek wspomaganym przepływem, w celu oczyszczenia poszczególnych podzbiorów komórek odpornościowych w celu dodatkowej, funkcjonalnej lub analizy ekspresji genów. Zastosowaliśmy tę metodę, aby scharakteryzować, w jaki sposób limfocyty B kształtują odpowiedź immunologiczną podczas raka trzustki, generując guzy ortotopowe zarówno u myszy z nokautem komórek B, jak i z niedoborem komórek B.

generation-orthotopic-pancreatic-tumors-ex-vivo-characterization

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten artykuł opisuje technikę stymulacji limfocytów T ex vivo w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowego stężenia cytokin, takich jak interferon-gamma lub IFN-gamma i czynnika martwicy nowotworu-alfa lub TNF-alfa w limfocytach T. Cytokiny te pośredniczą w skutecznej odpowiedzi przeciwnowotworowej i mogą pełnić rolę terapeutyczną w guzie.

Stymulacja limfocytów T ex vivo w guzie trzustki: metoda zwiększania produkcji cytokin w komórkach T

Film wyjaśnia krokową metodę chirurgiczną do ortotopowego wszczepienia fragmentu guza od dawcy nowotworowego do trzustki myszy z nienowotworowym biorcą w celu rozwoju raka trzustki. Ortotopowo wszczepiony PDAC może dokładniej uchwycić mikrośrodowisko tkanek ludzkiego raka trzustki niż konwencjonalne modele podskórne (SC).

Ortotopowy przeszczep guza homograftu: technika generowania mysich modeli guza trzustki

Lepsze zrozumienie biologii raka trzustki jest niezwykle potrzebne, aby umożliwić opracowanie lepszych opcji terapeutycznych w leczeniu raka trzustki. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, demonstrujemy ortotopowy model raka trzustki, który umożliwia nieinwazyjne monitorowanie progresji raka za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.

Bioluminescencyjny ortotopowy model progresji raka trzustki

Eksperymentalna procedura immunofenotypowania mysich ortotopowych homograftów PDAC ma na celu profilowanie immuno-mikrośrodowiska guza. Guzy są wszczepiane ortotopowo za pomocą operacji. Guzy o wielkości 200–600 mm3 pobrano i zdysocjowano w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych, a następnie przeprowadzono analizę FACS pod kątem wielu markerów immunologicznych przy użyciu różnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.

Immunofenotypowanie homograftu ortotopowego (syngenecznego) mysiego pierwotnego gruczolakoraka przewodowego trzustki KPC za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy protokół implantacji pod kontrolą ultrasonograficzną linii komórkowych rdzeniakoraka przewodowego trzustki pochodzących od myszy bezpośrednio do natywnego miejsca guza. Takie podejście spowodowało guzy trzustki wykrywalne za pomocą skanowania ultrasonograficznego w ciągu 2-4 tygodni od wstrzyknięcia i znacznie zmniejszyło odsetek wysiewu komórek nowotworowych na ścianie otrzewnej w porównaniu z chirurgiczną implantacją ortotopową.

Ortotopowa implantacja mysiego gruczolakoraka przewodowego trzustki pod kontrolą USG

W kontekście klinicznym, pacjenci z zlokalizowanym rakiem trzustki zostaną poddani pankreatektomii, a następnie leczeniu uzupełniającemu. Przedstawiony tutaj protokół ma na celu ustanowienie bezpiecznej i skutecznej metody modelowania tego scenariusza klinicznego u nagich myszy, poprzez ortotopową implantację raka trzustki, a następnie dystalną pankreatektomię i splenektomię.

Ortotopowy resekcyjny mysi model raka trzustki

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Przedstawiamy protokół generowania minimalnie inwazyjnego modelu ortotopowego raka trzustki poprzez wstrzykiwanie ludzkich komórek raka trzustki pod kontrolą ultradźwięków i późniejsze monitorowanie wzrostu guza in vivo za pomocą obrazowania ultradźwiękowego.

Wytwarzanie ortotopowego ksenoprzeszczepu komórek raka trzustki za pomocą iniekcji pod kontrolą ultradźwięków

Syngeneic mysie ortotopowe alloprzeszczepy gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) podsumowują biologię, fenotypy i reakcje terapeutyczne podtypów choroby. Ze względu na szybką, powtarzalną progresję nowotworu są szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych. Tutaj pokazujemy powszechne praktyki generowania tych modeli, wstrzykiwania syngenicznych mysich kultur PDAC do trzustki.

Syngeniczne ortotopowe alloprzeszczepy myszy do modelowania raka trzustki

Opisujemy metodę wykorzystania limfocytów naciekających nowotwór (TIL) od myszy za pomocą cytometrii przepływowej do adoptywnego transferu komórek. Protokół ten ma na celu weryfikację specyficznej cytotoksyczności TIL wobec nowotworów w mysim modelu syngenicznego raka trzustki, dostarczając informacji na temat rozwoju adoptywnych terapii komórkowych w raku trzustki.

Izolacja oparta na cytometrii przepływowej i ocena terapeutyczna limfocytów naciekających nowotwór w mysim modelu raka trzustki

Poznaj metodę generowania ortotopowych guzów trzustki i analizy cytotoksyczności limfocytów T ex vivo. Technika umożliwia szybkie trawienie nowotworów i stymulację komórek do badania odpowiedzi immunologicznej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Przeglądaj więcej filmów