Zastosowanie testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej w celu poszukiwania potencjalnych biomarkerów stwardnienia zanikowego bocznego w ludzkich płytkach krwi

Protokół ten może być stosowany do optymalizacji zarówno stężeń białek, jak i pierwszorzędowych przeciwciał na jednej płytce testowej oraz do wykonywania dwóch testów przy użyciu jednego preparatu próbki. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na 2 1/2 dnia pracy laboratoryjnej, w tym analizę danych, w ciągu 3 1/2 godziny. Technika ta zapewnia wysokoprzepustowy format testu do opracowania biomarkera ALS na bazie krwi i jest idealną metodą do przeprowadzania dużych badań klinicznych.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat docelowych profili białkowych podczas prognozowania choroby i może ułatwić monitorowanie działania leków w interesujących badaniach klinicznych. Po zebraniu 100 mikrolitrów ludzkich lizatów płytek krwi od pacjentów z ALS i osób zdrowych, wypełnij wygenerowane przez siebie szablony do układu kapilarnego i przygotowania próbki. Tabela przygotowania mieszaniny próbek jest dynamiczna i automatycznie oblicza, ile objętości należy usunąć ze źródła.

Umieść wszystkie odczynniki do oznaczania na lodzie. Z wyjątkiem standardowego opakowania, które powinno pozostać w temperaturze pokojowej. Aby przygotować wzorcową mieszankę fluorescencyjną, dodaj 40 mikrolitrów dejonizowanej wody do przezroczystej probówki naziemnej telewizji cyfrowej i dodaj 20 mikrolitrów 10-krotnego buforu do próbek.

I 20 mikrolitrów przygotowanego 400-milimolowego roztworu DTT do różowej probówki z zestawu testowego. Aby przygotować drabinę biotynylową, dodaj 16 mikrolitrów wody dejonizowanej, dwa mikrolitry buforu do próbki 10X i dwa mikrolitry przygotowanego 400-milimolowego roztworu DTT do białej probówki dołączonej do zestawu. Po delikatnym wymieszaniu przenieś roztwór drabinkowy do probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów przed denaturacją.

Dodaj 1,5 mikrolitra 10-krotnego buforu do próbek i 148,5 mikrolitra dejonizowanej wody do 600-mikrolitrowej probówki wirówki i wiruj do wymieszania przed umieszczeniem probówki na lodzie. Dodać interesujące nas przeciwciała bezpośrednio do rozcieńczalnika, jak wskazano w tabeli, i kilkakrotnie przepłukać końcówkę pipety w jednorodnym roztworze przeciwciał. Aby przygotować kapilarną mieszaninę próbek, otwórz wszystkie probówki do PCR i dodaj 1,6 mikrolitra porcji fluorescencyjnego buforu do próbki 5X do każdej probówki, jak wskazano w tabeli, stosując technikę odwróconego pipetowania.

Natychmiastowe zamknięcie każdej probówki w miarę dodawania buforu. Po dodaniu całego buforu otwórz wszystkie probówki i dodaj 0,1-krotny bufor próbki w objętościach wskazanych w tabeli, natychmiast zamykając każdą probówkę podczas dodawania buforu. Następnie otwórz wszystkie probówki i dodaj próbki białka, jak wskazano w tabeli, a następnie natychmiast zamknij każdą nakrętkę probówki.

Po dodaniu wszystkich próbek należy na krótko odwirować wszystkie probówki w wirówce stołowej. Wirować, aby ponownie wymieszać i odwirować próbki. Pod koniec drugiego wirowania umieść wszystkie probówki w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką.

I denaturować próbki we wskazanych warunkach. Pod koniec denaturacji odwirować, wymieszać i ponownie odwirować próbki, a następnie umieścić wszystkie probówki w stojaku na probówki na lodzie. Korzystając z rysunku jako wskazówki, dodać 10 mikrolitrów peroksydazy chrzanowej streptawidyny do studzienki D1, 10 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała wtórnego do studzienek od D2 do D5, 10 mikrolitrów rozcieńczalnika przeciwciał do każdej studzienki w rzędzie B i do studzienki C1, 10 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego do studzienek od C2 do C25, pięć mikrolitrów biotynylowanej drabinki z probówki PCR numer jeden do studzienki A1, trzy mikrolitry próbki do rzędów od A2 do A25 i 15 mikrolitrów świeżo przygotowanego nadtlenku luminolu do każdej studzienki rzędu E. Pipetowanie mieszanki próbki i odczynnika do maleńkiego dołka we właściwej kolejności ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu, dlatego należy to zrobić bardzo ostrożnie.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania do każdej wyznaczonej studzienki buforu do płukania. I odwirować zawartość płytki przez odwirowanie. Aby przeprowadzić analizę kapilarną na płytce testowej, podłącz analizator kapilarny do systemu online i kliknij przycisk Instrument and Connect (Przyrząd i połącz) w oprogramowaniu analizatora.

Wybierz numer seryjny instrumentu w menu kontekstowym i kliknij przycisk Połącz. Wybierz kartę Test i wybierz opcję Nowy test, wprowadź parametry testu i zapisz nazwę pliku oraz lokalizację. Następnie upewnij się, że niebieski wskaźnik w analizatorze świeci na niebiesko i wyjmij wkład kapilarny z opakowania.

Zdjąć plombę ochronną z płytki testowej i obserwować wzrokowo wstępnie napełnione studzienki pod kątem pęcherzyków powietrza. Umieść płytkę testową w uchwycie płytki i trzymając wkład kapilarny pod kątem, włóż wkład do szczeliny kapilarnej i zamknij drzwiczki analizatora. Następnie kliknij Start w oprogramowaniu analizatora.

Zastosowanie w teście całej mieszaniny lizatu płytkowego może zmniejszyć intensywność sygnału docelowych białek i przyczynić się do wysokiego sygnału tła. Dlatego w tym teście zastosowano klarowny supernatant po pęknięciu płytek krwi. Liniowy zakres dynamiki stężenia białka cytozolu płytkowego ustalono na poziomie od 0,2 do 0,8 miligrama na mililitr i przyjęto szablon eseju, aby można było przeprowadzić zarówno stężenie białka, jak i miareczkowanie przeciwciał pierwotnych w jednym teście.

Profil detekcji o wysokim zakresie dynamiki zapewnia znacznie szerszy zakres dynamiki ze względu na większą czułość testu kapilarnego, co skutkuje lepszym wykrywaniem i kwantyfikacją w większym zakresie stężeń próbki. Można również zdefiniować indywidualne czasy naświetlania. Wykorzystując zoptymalizowane warunki testu, analiza frakcji cytozolowych lizatu płytek krwi uzyskanych od pacjentów z ALS przy użyciu dwóch zestawów przeciwciał pozwala na identyfikację specyficznego dla choroby TDP-43 i jego fosforylowanej pochodnej w próbkach.

Całkowite TDP-43 można następnie określić ilościowo za pomocą krzywej kalibracyjnej. Zmienność testów wewnątrz- i międzybiegowych testowano w zbiorczych frakcjach cytozolowych płytek krwi u ludzi z ALS. Metoda ta pozwala na zastosowanie przeciwciał pierwotnych, ułatwiając identyfikację do pięciu różnych białek docelowych w tej samej próbce w jednym teście.

Technika ta nie tylko znacznie skraca czas analizy białek, ale także wymaga objętości próbek w mikrolitrach i generuje wyniki o wysokim stopniu odtwarzalności. Niektóre substancje chemiczne użyte w tym teście i wszystkie próbki pobrane od ludzi są uważane za niebezpieczne biologicznie, dlatego podczas wykonywania tych eksperymentów należy zawsze stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.