Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy
January 7th, 2020
Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.
Sekwencjonowanie mRNA pojedynczej komórki jest szeroko stosowane w celu zrozumienia procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki. Pojawienie się strategii multipleksowania jeszcze bardziej rozszerzyło jego amplifikacje, umożliwiając profilowanie wielu próbek w jednym eksperymencie, radykalnie obniżając koszty i unikając efektów wsadowych. Procedurę zademonstrują Wei Feng, doktor habilitowany, i Andrew Przysinda, technik z mojego laboratorium.
Po zliczeniu podziel komórki wyizolowane z komór serca w dniu embrionalnym 18,5 na pięć razy od 10 do piątej porcji i umyj komórki dwa razy świeżym PBS na przemycie. Ponownie zawiesić granulki w 180 mikrolitrach PBS na próbkę i dodać 20 mikrolitrów roztworu podstawowego z kodem kreskowym do każdej probówki, delikatnie mieszając. Po pięciominutowej inkubacji na lodzie dodać 20 mikrolitrów roztworu podstawowego z kodami kreskowymi do każdej probówki, delikatnie mieszając, aby uzyskać dodatkową pięciominutową inkubację na lodzie, a następnie trzykrotnie umyć komórki jednym mililitrem zimnego PBS uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej na pranie, a następnie przefiltrować próbki do nowych probówek przez jedno sitko do komórek o długości 40 mikrometrów na probówkę.
Po zliczeniu złóż chip B w uchwycie na wióry, a następnie dodaj 75 mikrolitrów 50% roztworu glicerolu do niewykorzystanych studzienek w rzędzie pierwszym, 40 mikrolitrów do nieużywanych studzienek w rzędzie drugim i 280 mikrolitrów do niewykorzystanych studzienek w rzędzie trzecim. Zwróć uwagę, że w tym miejscu używany jest chip treningowy, aby zademonstrować procedurę. Delikatnie pipetując, dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej i wody wolnej od nukleaz do mieszanki wzorcowej.
Dodaj 75 mikrolitrów powstałego roztworu komórkowego do dolnej środkowej części dołka próbki w pierwszym rzędzie bez pęcherzyków. Wiruj kulki żelu przez 30 sekund, a następnie powoli dodaj 40 mikrolitrów kulek do dolnej środkowej części kulki żelowej w drugim rzędzie bez pęcherzyków. Dodaj 280 mikrolitrów oleju do rozdzielania wzdłuż ściany bocznej studzienki olejowej w rzędzie trzecim.
Przymocuj uszczelkę do chipa bez naciskania uszczelki i utrzymywania uszczelki poziomo, aby uniknąć zmoczenia uszczelki. Załaduj zmontowany chip z uszczelką w kontrolerze chromu i uruchom program B z pojedynczą komórką chromu. Zwróć uwagę, że ekran pokazuje trening chromu dla chipa treningowego, ale w przypadku prawdziwych eksperymentów ekran wyświetli pojedynczą komórkę chromu B. Po zakończeniu programu natychmiast wyjmij chip i wyrzuć uszczelkę.
Odchyl pokrywę do tyłu, aby odsłonić studzienki pod kątem 45 stopni i sprawdź poziom cieczy, aby upewnić się, że nie ma zatorów. Powoli odessać 100 mikrolitrów kulek żelowych w emulsji z najniższych punktów studni regeneracyjnej i sprawdzić jednorodność kulek. Dozuj zemulgowane kulki po ściance nowej probówki do PCR na lodzie i umieść probówkę w termocyklerze w celu odwrotnej transkrypcji.
Aby przygotować cDNA do amplifikacji, dodaj 125 mikrolitrów środka odzysku do próbki w temperaturze pokojowej. Nie należy obserwować nieprzezroczystej cieczy i unikać pipetowania lub wirowania. Odczekaj 60 sekund przed powolnym usunięciem środka odzysku z dna probówki i dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny do czyszczenia kulek wirowych do próbki.
Odpipetować mieszaninę 10 razy przed inkubacją przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieść próbki na magnesie w wysokiej pozycji. Gdy roztwór się klaruje, usuń supernatant i dodaj 200 mikrolitrów 80% etanolu do osadu.
Po 30 sekundach usuń etanol i powtórz pranie jeszcze dwa razy. Po ostatnim myciu należy na krótko odwirować próbkę i umieścić probówkę na magnesie w niskim położeniu, aby próbka mogła wyschnąć na powietrzu przez mniej niż dwie minuty. Gdy próbka wyschnie, wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 35,5 mikrolitra świeżo przygotowanego roztworu elucyjnego.
Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieścić próbkę na magnesie w pozycji wysokiej, aż roztwór się klaruje, a następnie przenieść 35 mikrolitrów próbki do nowego paska probówki. W przypadku amplifikacji cDNA przy użyciu strategii kodowania kreskowego na bazie lipidów, dodaj mieszaninę reakcji amplifikacji do 35-mikrolitrowych próbek cDNA z dokładnym wymieszaniem przed krótkim odwirowaniem. Pod koniec wirowania inkubować próbkę w termocyklerze, postępując zgodnie z odpowiednią procedurą amplifikacji cDNA.
Dodaj 120 mikrolitrów wybranego odczynnika i 100 mikrolitrów ultraczystej wody do 100 mikrolitrów próbki i odpipetuj otrzymany 0,6x wybrany odczynnik 15 razy. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieść próbkę na magnesie, aż roztwór stanie się klarowny. Przenieś supernatant do 1,5-mililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania w celu multipleksowania konstrukcji biblioteki cDNA z kodami kreskowymi.
Pamiętaj, aby zapisać zarówno supernatanty, jak i zasadę, ponieważ zawartość supernatantu składa się z cDNA oznaczonego kodem kreskowym, a zawartość zasady z endogennego cDNA. Oczyść endogenne cDNA za pomocą 80% etanolu i wymyj DNA za pomocą 40 mikrolitrów buforu elucyjnego, a następnie przeprowadź kontrolę jakości endogennego cDNA przed przygotowaniem endogennej biblioteki transkryptów. Stężenie cDNA powinno być określone ilościowo i kwalifikowane przed budową biblioteki.
Skonstruowane biblioteki, w tym endogenne biblioteki cDNA i kodów kreskowych, powinny być również określone ilościowo i kwalifikowane przed sekwencjonowaniem. Po sekwencjonowaniu wyrażenie kodu kreskowego można przeanalizować w każdej pojedynczej komórce. Na przykład w tej analizie zaobserwowano osiem grup pojedynczych komórek, które jednoznacznie wyrażały jeden typ kodu kreskowego reprezentującego komórki z ośmiu różnych próbek.
Ponadto niektóre komórki nie wyrażały żadnego kodu kreskowego i dlatego zostały zdefiniowane jako komórki ujemne, podczas gdy inne komórki wyrażały dwa różne kody kreskowe reprezentujące dublety. Korzystając z komórek singletowych, heterogeniczność komórkową i regulacje molekularne można ocenić za pomocą adnotacji typu komórki, identyfikacji nowych i rzadkich typów komórek, analizy porównawczej stref anatomicznych oraz analizy szlaków ontologii genów, takich jak separacje faz cyklu komórkowego. Pomocne jest zobrazowanie kulek żelu w emulsji, jeśli możesz, ponieważ obraz powie Ci, czy procedura zakończyła się sukcesem do tego momentu.
Multipleksowanie próbek zapewnia dużą elastyczność w projektowaniu eksperymentów. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tej demonstracji będziesz bardziej pewny siebie w rozpoczynaniu własnych eksperymentów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia wielokrotnie wielokrotną metodę sekwencjonowania mRNA pojedynczych komórek w celu stworzenia profilu ekspresji genów w tkankach zarodkowych myszy. Metoda scRNA-Seq oparta na kroplach, w połączeniu ze strategiami wielokrotnego użycia, umożliwia jednoczesne profilowanie pojedynczych komórek z wielu próbek, zmniejszając koszty i minimalizując efekty wsadowe.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Genomika
- Biologia komórki
Tło
- Sekwencjoniowanie mRNA pojedynczych komórek jest kluczowe dla zrozumienia procesów biologicznych na poziomie komórkowym.
- Strategie wielokrotnego użycia poprawiają efektywność profilowania wielu próbek.
- Ta metoda radzi sobie z wyzwaniami związanymi z kosztami i efektami wsadów w analizie pojedynczych komórek.
- Tkanki zarodkowe myszy służą jako model do badań rozwojowych.
Cel badania
- Rozwój opłacalnej metody profilowania ekspresji genów w pojedynczych komórkach.
- Wykazanie zastosowania wielokrotnego scRNA-Seq w tkankach zarodkowych.
- Minimalizacja efektów wsadowym doświadczalnych poprzez jednoczesne przetwarzanie próbek.
Zastosowane metody
- Izolacja komórek z tkanek zarodkowych myszy.
- Sekwencjoniowanie mRNA pojedynczych komórek oparte na kroplkach.
- Strategie wielokrotnego użycia do jednoczesnej analizy próbek.
- Zmniejszenie kosztów reagentów poprzez efektywne przetwarzanie próbek.
Główne wyniki
- Sukces w profilowaniu ekspresji genów w wielu próbkach zarodkowych.
- Demonstracja obniżonych kosztów związanych z wielokrotnym użyciem.
- Minimalizacja efektów wsadowym w analizie ekspresji genów.
- Walidacja metody poprzez procedury doświadczalne.
Wnioski
- Metoda wielokrotnego scRNA-Seq jest skuteczna w badaniu ekspresji genów w tkankach zarodkowych.
- To podejście może znacząco obniżyć koszty i poprawić jakość danych.
- Przyszłe zastosowania mogą rozciągać się na inne systemy biologiczne i warunki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Multiplexed single cell mRNA sequencing enables high-resolution profiling of cellular heterogeneity across multiple samples, supporting early discovery and target validation in complex tissues. By minimizing batch effects and reducing per-sample costs, this approach enhances predictive confidence and accelerates portfolio triage in developmental and disease-relevant models. The method's scalability and quantitative outputs position it as a reusable capability for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular diversity and rare cell populations in developmental or disease models.
- Supports functional target validation by linking gene expression to specific cell types and states.
- Facilitates mechanistic de-risking through high-content, single-cell resolution data.
- Improves predictive confidence for target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single cell suspensions for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes sample processing and minimizes batch effects for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable multiplexing, allowing simultaneous evaluation of multiple genetic backgrounds or conditions.
- Provides robust data for reliable compound or perturbation assessment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular phenotypes with developmental or disease-relevant biomarkers when profiling multiple anatomical zones or stages.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling comparative analyses across models.
- De-risks translational advancement by revealing molecular regulations and cell type-specific responses.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed scRNA-Seq method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and comparative analytics across samples.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of cellular heterogeneity and pathway activity.
- Screening: Provides standardized, reproducible single cell data for assay development and screening readiness.
- Analytics: Delivers quantitative gene expression and barcode readouts for robust condition comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease model validation when profiling multiple developmental stages or anatomical regions.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform adaptable to diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling multiplexed analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single cell isolation, barcoding, and sequencing workflows.
- Needs access to droplet-based microfluidic instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to minimize batch effects and ensure data comparability.
- Adaptable to various genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations with appropriate optimization.
- Practical limitations include cell viability, barcode assignment accuracy, and doublet discrimination.
