Name: Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj multipleksowaną metodę sekwencjonowania mRNA pojedynczych komórek w tkankach embrionalnych myszy. Technika ta zmniejsza koszty i eliminuje efekty partii w analizie ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Davidowi M. Pattersonowi i Christopherowi S. McGinnisowi z laboratorium Dr. Zev J. Gartnera za uprzejme dostarczenie odczynników do kodów kreskowych na bazie lipidów oraz sugestie dotyczące etapów eksperymentu i analizy danych. Praca ta została założona przez National Institutes of Health (HL13347202).

<ol><li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877(2008).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377(2009).</li>
<li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li>
<li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476(2019).</li>
<li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100(2017).</li>
<li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li>
<li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175(2016).</li>
<li>Grün, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77(2016).</li>
<li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).</li>
<li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MULTI-seq%3A+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224(2018).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).</li>
<li>SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).</li>
<li>Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).</li>
<li>Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411(2018).</li>
<li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li>
<li>Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym badaniu zademonstrowaliśmy protokół analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek. Udostępniliśmy również dwie opcjonalne metody multipleksowania próbek w przepływie pracy scRNA-Seq. Obie metody okazały się wykonalne w różnych laboratoriach i dostarczyły rozwiązań do przeprowadzenia opłacalnego i wolnego od efektów wsadowych eksperymentu z pojedynczą komórką18,26.
Jest kilka kroków, które należy dokładnie wykonać podczas ...

Profil transkrypcyjny każdej pojedynczej komórki różni się między populacjami komórek podczas rozwoju embrionalnego. Chociaż jednocząsteczkowa hybrydyzacja in situ może być wykorzystana do wizualizacji ekspresji niewielkiej liczby genów1, sekwencjonowanie mRNA pojedynczej komórki (scRNA-Seq) zapewnia bezstronne podejście do zilustrowania wzorców ekspresji genów w całym genomie w pojedynczych komórkach. Po pierwszej publikacji w 2009 roku2, scRNA-Seq został zastosowany do badania wielu tkanek na różnych etapach rozwoju w ostatnich latach3,4,5. Ponadto, w związku z tym, że atlas komórek ludzkich rozpoczął niedawno swoje projekty ukierunkowane na rozwój, oczekuje się, że w najbliższej przyszłości zostanie wygenerowanych więcej danych dotyczących pojedynczych komórek z ludzkich tkanek embrionalnych.
Serce, jako pierwszy organ, który się rozwija, odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym. Serce składa się z wielu typów komórek, a rozwój każdego typu komórek jest ściśle regulowany czasowo i przestrzennie. W ciągu ostatnich kilku lat scharakteryzowano pochodzenie i linię komórkową komórek serca we wczesnych stadiach rozwoju6, które stanowią niezwykle użyteczne narzędzie nawigacyjne do zrozumienia patogenezy wrodzonych wad serca, a także do opracowania bardziej zaawansowanych technologicznie metod stymulowania regeneracji kardiomiocytów7.
W ostatnich latach scRNA-Seq przeszedł gwałtowny rozwój8,9,10. Dzięki nowo opracowanym metodom, projektowanie i analiza eksperymentów z pojedynczymi komórkami stały się bardziej osiągalne11,12,13,14. Przedstawiona tutaj metoda jest komercyjną procedurą opartą na roztworach kropelkowych (patrz Tabela materiałów)15,16. Metoda ta polega na wychwytywaniu komórek i zestawów unikalnie oznaczonych kodami kreskowymi kulek w kropelce emulsji olejowo-wodnej pod kontrolą systemu sterownika mikroprzepływowego. Szybkość ładowania komórek do kropelek jest bardzo niska, tak że większość emulsji kropelkowych zawiera tylko jedną komórkę17. Pomysłowa konstrukcja procedury polega na rozdzieleniu pojedynczych komórek na emulsje kropelkowe zachodzące jednocześnie z kodowaniem kreskowym, co umożliwia równoległą analizę pojedynczych komórek za pomocą RNA-Seq na niejednorodnej populacji.
Włączenie strategii multipleksowania jest jednym z ważnych dodatków do tradycyjnego przepływu pracy z pojedynczymi komórkami13,14. Ten dodatek jest bardzo przydatny w odrzucaniu dubletów komórkowych, zmniejszaniu kosztów eksperymentów i eliminowaniu efektów wsadowych18,19. Strategia kodów kreskowych opartych na lipidach i strategia kodów kreskowych opartych na przeciwciałach (patrz tabela materiałów) to dwie najczęściej stosowane metody multipleksowania. Określone kody kreskowe są używane do oznaczania każdej próbki w obu metodach, a oznaczone próbki są następnie mieszane w celu wychwycenia pojedynczych komórek, przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Następnie zbiorcze dane sekwencjonowania można rozdzielić, analizując sekwencje kodów kreskowych (Rysunek 1)19. Istnieją jednak znaczne różnice między tymi dwiema metodami. Strategia kodowania kreskowego oparta na lipidach opiera się na oligonukleotydach modyfikowanych lipidami, które nie stwierdzono, aby miały jakiekolwiek preferencje dotyczące typu komórki. Podczas gdy strategia kodowania kreskowego oparta na przeciwciałach może wykryć tylko komórki wyrażające białka antygenu19,20. Ponadto barwienie lipidów zajmuje około 10 minut, ale barwienie przeciwciał trwa 40 minut (ryc. 1). Co więcej, oligonukleotydy modyfikowane lipidami są tańsze niż oligonukleotydy sprzężone z przeciwciałami, ale nie są dostępne na rynku w momencie pisania tego artykułu. Wreszcie, strategia oparta na lipidach może multipleksować 96 próbek w jednym eksperymencie, ale strategia oparta na przeciwciałach może obecnie multipleksować tylko 12 próbek.
Zalecana liczba komórek do multipleksowania w pojedynczym eksperymencie powinna być mniejsza niż 2,5 x 104, w przeciwnym razie doprowadzi to do wysokiego procentu dubletów komórkowych i potencjalnego zanieczyszczenia mRNA w otoczeniu. Dzięki strategiom multipleksowania koszt wychwytywania pojedynczych komórek, generowania cDNA i przygotowania biblioteki dla wielu próbek zostanie zredukowany do kosztu jednej próbki, ale koszt sekwencjonowania pozostanie taki sam.

<table><tbody><tr><td>10% Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Uchwyt na chipy</td><td>10x Genomics</td><td>120252 330019</td><td></td></tr><tr><td>10x Kontroler chromu</td><td>10x Genomics</td><td>120223</td><td></td></tr><tr><td>10x Separator magnetyczny</td><td>10x Genomics</td><td>120250 230003</td><td></td></tr><tr><td>10x Adapter Vortex</td><td>10x Genomics</td><td>330002, 120251</td><td></td></tr><tr><td>10x Klips Vortex</td><td>10x Genomics</td><td>120253 230002</td><td></td></tr><tr><td>4200 System TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Uniwersytet w Pittsburghu Sekwencjonowanie Podstawowy</td></tr><tr><td>kod kreskowy Oligo</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Jednoniciowy DNA</td><td>25 nmol</td></tr><tr><td>Bufor EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Myszy CD1</td><td>Chales River</td><td>Strain Code 022</td><td>zamówione ciężarne myszy</td></tr><tr><td>Wirówka 5424R</td><td>Appendorf</td><td>2231000214</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Chip B Zestaw pojedynczych komórek, 48 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>1000073</td><td>Przechowywać w temperaturze otoczenia</td></tr><tr><td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>120262</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>1000094</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' Library Kit v3</td><td>10x Genomics</td><td>1000095</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' V3 Żelowe kulki</td><td>10x Genomics</td><td>2000059</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 & C</td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Sigma/Millipore</td><td>10103578001</td><td>Przechowywać proszek w temperaturze 4 stopni; C, przechowywać w temperaturze -20 &; C po rozpuszczeniu</td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Sigma/Millipore</td><td>11088807001</td><td>Przechowywać proszek w temperaturze 4 & stopni; C, przechowywać w temperaturze -20 &; C po rozpuszczeniu</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>Uniwersytet w Pittsburghu Sekwencjonowanie Sekwencjonowanie Core</td></tr><tr><td>DNA LoBind Probówka do mikrowirówek, 1,5 ml</td> Probówka do mikrowirówek <td>Eppendorf</td><td>022431021</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind, 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431048</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE</td><td>10x Genomics</td><td>2000048</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, stosowany w Beads Cleanup Mix (Tabela 1)</td></tr> <tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>Theromo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, czysty (200 proof, bezwodny)</td> <td>Sigma</td><td>E7023-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL High Clarity PP Probówka</td> wirówkowa <td>Corning Cellgro</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL High Clarity PP Probówka wirówkowa</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, Stany Zjednoczone</td><td>Fisher Scientific 26140079</td><td></td><td>Store w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Pipety wielokanałowe Finnpipette F1, 10-100&mu; l</td> Pipety wielokanałowe <td>Theromo Scientific</td><td>4661020N</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F1, 1-10&mu; l</td><td>Theromo Scientific</td><td>4661000N</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy Flowmi</td><td>Sigma</td><td>BAH136800040</td><td>Porowatość 40 &mu; m, na końcówki do pipet 1000 μL, opakowanie po 50 sztuk</td></tr><tr><td>Gliceryna (glicerol), 50% (v/v)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (roztwór blokujący receptor Fc)</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td>Dodaj 5 &mikro; l ludzkiego TruStain FcX na milion komórek w 100 i mikro; l objętość barwienia</td></tr><tr><td>Izopropanol (IPA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0295239</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, stosowany w mieszance bibliotek kodów kreskowych znakowanych lipidami (tabela 1)</td></tr><tr><td>Lipidowy podkład kodów kreskowych (Multi-seq Primer)</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Jednoniciowy bufor DNA</td><td>100 nmol</td></tr><tr><td>o niskiej zawartości TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>MasterCycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950W</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (Ambion)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR 0,2 ml 8 probówek</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1X bez wapnia i magnezu</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 10% albuminą bydlęcą (alternatywa dla produktu Thermo Fisher)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0036</td><td></td></tr><tr><td>Piper 4-pak (0,1&ndash; 2,5&mu; L, 0,5-10&mu; L, 10&ndash; 100&mu; L, 100&ndash; 1,000&mu; L Pipety o zmiennej objętości</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik selekcyjny (zestaw odczynników SPRIselect)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318 (60ml)</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik szablonu Oligo</td><td>10x Genomics</td><td>3000228</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C, używany w Master Mix (Tabela 1)</td></tr><tr><td>Strategia kodów kreskowych oparta na przeciwciałach jest również znana jako haszowanie</td><td></td><td></td><td></td>komórek</tr><tr><td>Przeglądarka komórek to Loup Cell Browser</td><td>10x Genomics</td><td></td><td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics. com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-lupe-cell-browser</a></td></tr><tr><td>Komercyjnie dostępna linia analityczna w kroku 8.1 to Cell Ranger</td><td>10x Genomics</td><td></td><td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/ najnowsze/co-jest-strażnikiem-komórki</a></td></tr><tr><td>Strategia kodowania kreskowego oparta na lipidach jest również znana jako MULTI-seq</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dobrze utrzymana platforma R to Seurat V3</td><td>satijalab</td><td></td><td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td></tr><tr><td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet</td><td>tip USA Scientific</td><td>1180-3710</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1000 ul XL końcówka do pipety z filtrem o ultra niskiej retencji</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1730</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 ul końcówka do pipety z filtrem o ultra niskiej retencji</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8710</td><td></td></tr><tr><td>TotalSeq-A0301 anty-mysie Hashtag 1 Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>155801</td><td>0,1 - 1,0 i mikro; g przeciwciała w 100 &mikro; l bufora barwiącego na każdy 1 milion komórek</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0302 anty-mysie Hashtag 2 Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>155803</td><td>0,1 - 1,0 &mikro; g przeciwciała w 100 &mikro; l bufora barwiącego na każdy 1 milion komórek</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0302 anty-mysie Hashtag 3 Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>155805</td><td>0,1 - 1,0 i mikro; g przeciwciała w 100 &mikro; l bufora barwiącego na każdy 1 milion komórek</td></tr><tr><td>Starter TrueSeq RPI</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Jednoniciowe DNA</td><td>100 nmol, stosowane w mieszance bibliotek kodów kreskowych znakowanych lipidami (Tabela 1)</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne</td><td>zintegrowane technologie DNA I5</td><td>Jednoniciowy DNA</td><td>100 nmol</td></tr></tbody></table>

multipleksowana analiza sekwencjonowania mrna pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Sekwencjonowanie mRNA pojedynczych komórek poczyniło znaczne postępy w ciągu ostatnich kilku lat i stało się ważnym narzędziem w dziedzinie biologii rozwojowej. Został z powodzeniem wykorzystany do identyfikacji rzadkich populacji komórek, odkrywania nowych genów markerowych oraz dekodowania przestrzennych i czasowych informacji rozwojowych. W ciągu ostatnich dwóch, trzech lat rozwinęła się również metoda jednokomórkowa od mikroprzepływowej technologii Fluidigm C1 do rozwiązań kropelkowych. Tutaj użyliśmy serca jako przykładu, aby zademonstrować, jak profilować komórki tkanki embrionalnej myszy za pomocą metody scRNA-Seq opartej na kropelkach. Ponadto zintegrowaliśmy dwie strategie z przepływem pracy, aby profilować wiele próbek w jednym eksperymencie. Korzystając z jednej ze zintegrowanych metod, jednocześnie sprofilowaliśmy ponad 9 000 komórek z ośmiu próbek serca. Metody te będą cenne dla dziedziny biologii rozwoju, zapewniając opłacalny sposób jednoczesnego profilowania pojedynczych komórek z różnych środowisk genetycznych, etapów rozwojowych lub lokalizacji anatomicznych.

W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy zarodkowe serca myszy jako przykład, aby zademonstrować, w jaki sposób przeprowadzono multipleksowe sekwencjonowanie mRNA pojedynczych komórek w celu jednoczesnego przetworzenia różnych próbek z oddzielnych części organu. Serca myszy CD1 w stadium E18.5 zostały wyizolowane i podzielone na lewy przedsionek (LA), prawy przedsionek (RA), lewą komorę (LV) oraz prawą komorę (RV). Komórki przedsionków i komór zostały następnie niezależnie okodowane za pomocą...

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Sekwencjonowanie mRNA pojedynczej komórki jest szeroko stosowane w celu zrozumienia procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki. Pojawienie się strategii multipleksowania jeszcze bardziej rozszerzyło jego amplifikacje, umożliwiając profilowanie wielu próbek w jednym eksperymencie, radykalnie obniżając koszty i unikając efektów wsadowych. Procedurę zademonstrują Wei Feng, doktor habilitowany, i Andrew Przysinda, technik z mojego laboratorium.Po zliczeniu podziel komórki wyizolowane z komór serca w dniu embrionalnym 18,5 na pięć razy od 10 do piątej porcji i umyj komórki dwa razy świeżym PBS na przemycie. Ponownie zawiesić granulki w 180 mikrolitrach PBS na próbkę i dodać 20 mikrolitrów roztworu podstawowego z kodem kreskowym do każdej probówki, delikatnie mieszając. Po pięciominutowej inkubacji na lodzie dodać 20 mikrolitrów roztworu podstawowego z kodami kreskowymi do każdej probówki, delikatnie mieszając, aby uzyskać dodatkową pięciominutową inkubację na lodzie, a następnie trzykrotnie umyć komórki jednym mililitrem zimnego PBS uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej na pranie, a następnie przefiltrować próbki do nowych probówek przez jedno sitko do komórek o długości 40 mikrometrów na probówkę.Po zliczeniu złóż chip B w uchwycie na wióry, a następnie dodaj 75 mikrolitrów 50% roztworu glicerolu do niewykorzystanych studzienek w rzędzie pierwszym, 40 mikrolitrów do nieużywanych studzienek w rzędzie drugim i 280 mikrolitrów do niewykorzystanych studzienek w rzędzie trzecim. Zwróć uwagę, że w tym miejscu używany jest chip treningowy, aby zademonstrować procedurę. Delikatnie pipetując, dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej i wody wolnej od nukleaz do mieszanki wzorcowej.Dodaj 75 mikrolitrów powstałego roztworu komórkowego do dolnej środkowej części dołka próbki w pierwszym rzędzie bez pęcherzyków. Wiruj kulki żelu przez 30 sekund, a następnie powoli dodaj 40 mikrolitrów kulek do dolnej środkowej części kulki żelowej w drugim rzędzie bez pęcherzyków. Dodaj 280 mikrolitrów oleju do rozdzielania wzdłuż ściany bocznej studzienki olejowej w rzędzie trzecim.Przymocuj uszczelkę do chipa bez naciskania uszczelki i utrzymywania uszczelki poziomo, aby uniknąć zmoczenia uszczelki. Załaduj zmontowany chip z uszczelką w kontrolerze chromu i uruchom program B z pojedynczą komórką chromu. Zwróć uwagę, że ekran pokazuje trening chromu dla chipa treningowego, ale w przypadku prawdziwych eksperymentów ekran wyświetli pojedynczą komórkę chromu B. Po zakończeniu programu natychmiast wyjmij chip i wyrzuć uszczelkę.Odchyl pokrywę do tyłu, aby odsłonić studzienki pod kątem 45 stopni i sprawdź poziom cieczy, aby upewnić się, że nie ma zatorów. Powoli odessać 100 mikrolitrów kulek żelowych w emulsji z najniższych punktów studni regeneracyjnej i sprawdzić jednorodność kulek. Dozuj zemulgowane kulki po ściance nowej probówki do PCR na lodzie i umieść probówkę w termocyklerze w celu odwrotnej transkrypcji.Aby przygotować cDNA do amplifikacji, dodaj 125 mikrolitrów środka odzysku do próbki w temperaturze pokojowej. Nie należy obserwować nieprzezroczystej cieczy i unikać pipetowania lub wirowania. Odczekaj 60 sekund przed powolnym usunięciem środka odzysku z dna probówki i dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny do czyszczenia kulek wirowych do próbki.Odpipetować mieszaninę 10 razy przed inkubacją przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieść próbki na magnesie w wysokiej pozycji. Gdy roztwór się klaruje, usuń supernatant i dodaj 200 mikrolitrów 80% etanolu do osadu.Po 30 sekundach usuń etanol i powtórz pranie jeszcze dwa razy. Po ostatnim myciu należy na krótko odwirować próbkę i umieścić probówkę na magnesie w niskim położeniu, aby próbka mogła wyschnąć na powietrzu przez mniej niż dwie minuty. Gdy próbka wyschnie, wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 35,5 mikrolitra świeżo przygotowanego roztworu elucyjnego.Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieścić próbkę na magnesie w pozycji wysokiej, aż roztwór się klaruje, a następnie przenieść 35 mikrolitrów próbki do nowego paska probówki. W przypadku amplifikacji cDNA przy użyciu strategii kodowania kreskowego na bazie lipidów, dodaj mieszaninę reakcji amplifikacji do 35-mikrolitrowych próbek cDNA z dokładnym wymieszaniem przed krótkim odwirowaniem. Pod koniec wirowania inkubować próbkę w termocyklerze, postępując zgodnie z odpowiednią procedurą amplifikacji cDNA.Dodaj 120 mikrolitrów wybranego odczynnika i 100 mikrolitrów ultraczystej wody do 100 mikrolitrów próbki i odpipetuj otrzymany 0,6x wybrany odczynnik 15 razy. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieść próbkę na magnesie, aż roztwór stanie się klarowny. Przenieś supernatant do 1,5-mililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania w celu multipleksowania konstrukcji biblioteki cDNA z kodami kreskowymi.Pamiętaj, aby zapisać zarówno supernatanty, jak i zasadę, ponieważ zawartość supernatantu składa się z cDNA oznaczonego kodem kreskowym, a zawartość zasady z endogennego cDNA. Oczyść endogenne cDNA za pomocą 80% etanolu i wymyj DNA za pomocą 40 mikrolitrów buforu elucyjnego, a następnie przeprowadź kontrolę jakości endogennego cDNA przed przygotowaniem endogennej biblioteki transkryptów. Stężenie cDNA powinno być określone ilościowo i kwalifikowane przed budową biblioteki.Skonstruowane biblioteki, w tym endogenne biblioteki cDNA i kodów kreskowych, powinny być również określone ilościowo i kwalifikowane przed sekwencjonowaniem. Po sekwencjonowaniu wyrażenie kodu kreskowego można przeanalizować w każdej pojedynczej komórce. Na przykład w tej analizie zaobserwowano osiem grup pojedynczych komórek, które jednoznacznie wyrażały jeden typ kodu kreskowego reprezentującego komórki z ośmiu różnych próbek.Ponadto niektóre komórki nie wyrażały żadnego kodu kreskowego i dlatego zostały zdefiniowane jako komórki ujemne, podczas gdy inne komórki wyrażały dwa różne kody kreskowe reprezentujące dublety. Korzystając z komórek singletowych, heterogeniczność komórkową i regulacje molekularne można ocenić za pomocą adnotacji typu komórki, identyfikacji nowych i rzadkich typów komórek, analizy porównawczej stref anatomicznych oraz analizy szlaków ontologii genów, takich jak separacje faz cyklu komórkowego. Pomocne jest zobrazowanie kulek żelu w emulsji, jeśli możesz, ponieważ obraz powie Ci, czy procedura zakończyła się sukcesem do tego momentu.Multipleksowanie próbek zapewnia dużą elastyczność w projektowaniu eksperymentów. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tej demonstracji będziesz bardziej pewny siebie w rozpoczynaniu własnych eksperymentów.

multiplexed-single-cell-mrna-sequencing-analysis-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj multipleksowaną metodę sekwencjonowania mRNA pojedynczych komórek w tkankach embrionalnych myszy. Technika ta zmniejsza koszty i eliminuje efekty partii w analizie ekspresji genów.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Przeglądaj więcej filmów