Name: Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metody oceny gojenia ran u myszy za pomocą modelu gąbki PVA i wycięcia skóry ogona. Te techniki umożliwiają analizę leukocytów rany oraz kinetyki cytokin w badaniach biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Kevinowi Carlsonowi z Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility za konsultacje i pomoc w eksperymentach z cytometrią przepływową. Obrazy na rysunkach 1B i C zostały utworzone za pomocą BioRender. Kayla Lee i Gregory Serpa otrzymują podziękowania za pomoc fotograficzną. Prace te były wspierane przez granty z: Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Nagrody Dziekana ds. Obszarów Powstających Nowych Nauk (Brown University), Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Narodowego Instytutu Nauk o Środowisku (NIES) T32-ES7272 (Szkolenie w Patologii Środowiskowej) oraz Brown University Research Seed Award.

Wszystkie opisane tutaj badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Browna i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dla Opieki i Użytkowania Zwierząt National Institutes of Health. UWAGA: w filmie serweta chirurgiczna została pominięta w celach demonstracyjnych. 
1. Podskórna implantacja gąbek PVA
<ol>
	<li>Za pomocą nożyczek pokrój arkusze gąbki PVA na kawałki o wymiarach 8 mm x 8 mm x 4 mm. Ponownie nawodnij kawałki gąbki PVA, zanurzając je w sterylnym 1x PBS w zlewce.</li>
	<li>Autoklaw gąbek w 1x PBS do sterylizacji i całkowitego ostygnięcia. Przechowywać autoklawizowane gąbki w sterylnym 1x PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przed wykonaniem implantacji chirurgicznej należy umieścić niezbędną liczbę gąbek w sterylnym naczyniu hodowlanym w sterylnych warunkach w kapturze z przepływem laminarnym. Przechowuj dodatkowe gąbki w sterylnym 1x PBS w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Upewnij się, że gąbki pęcznieją do 1 cm x 1 cm x 0,5 cm po ponownym nawodnieniu. Obraz odwodnionych gąbek PVA jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. 
	UWAGA: Aby zachować sterylność miejsca operowanego, procedura implantacji gąbką PVA wymaga, aby jedna osoba obsługiwała mysz i przygotowywała miejsce operowane, a druga osoba wykonywała implantację.</li>
	<li>Znieczulić 8-12-tygodniowego samca myszy C57BL/6J przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 80 mg/kg ketaminy. Podawać 40 mg/kg ksylazyny dootrzewnowo w celu znieczulenia. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez utratę odruchu pedałowania. Przygotuj miejsce operacji, usuwając włosy wzdłuż grzbietu za pomocą maszynki do strzyżenia. Za pomocą sterylnej gazy nałóż roztwór jodu powidonu na obszar golenia 2x, a następnie 70% etanolu.</li>
	<li>Umieść mysz na sterylnych serwetach chirurgicznych. Umieść podgrzewaną podkładkę pod obłożeniami chirurgicznymi, aby utrzymać temperaturę wnętrza myszy.</li>
	<li>Do wykonywania zabiegu należy nosić sterylne rękawice chirurgiczne. Odciągnij skórę grzbietową od leżącej pod nią tkanki za pomocą kleszczy i za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych wykonaj 2 cm nacięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej około 2 cm przed podstawą ogona. Trzymając nacięcie otwarte sterylnymi kleszczami, użyj sterylnych, zakrzywionych nożyczek chirurgicznych z końcówką, aby utworzyć podskórną kieszeń wzdłuż grzbietu w jednej z pozycji wskazanych w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B.</li>
	<li>Kontynuuj używanie kleszczy, aby odciągnąć skórę od leżącej pod nią tkanki. Używając sterylnych nożyczek chirurgicznych, delikatnie ściśnij jedną gąbkę PVA w naczyniu hodowlanym, aby usunąć nadmiar PBS. Podnieś gąbkę PVA za jeden róg za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i prowadząc róg trzymany przez nożyczki, umieść gąbkę w kieszeni podskórnej utworzonej w kroku 1.4.</li>
	<li>Powtórz ten proces 5 razy, umieszczając w sumie sześć gąbek w kieszeniach podskórnych, jak pokazano na Rysunek 1B.</li>
	<li>Ściśnij naciętą skórę grzbietową sterylnymi kleszczami i zamknij nacięcie dwoma klipsami ze stali nierdzewnej.</li>
	<li>Używaj nowego zestawu sterylnych narzędzi chirurgicznych dla każdej myszy. Alternatywnie użyj sterylizatora koralików do sterylizacji narzędzi między myszami.</li>
</ol>
2. Izolacja płynów z gąbek PVA
<ol>
	<li>Aby ocenić środowisko cytokin w przypadku rany ostrej, należy wyizolować gąbki w okresie od 1 do 14 dni po implantacji.</li>
	<li>Przygotować probówkę do pobierania płynów, umieszczając cylinder strzykawki o pojemności 5 ml w probówce hodowlanej o pojemności 16 ml.</li>
	<li>Poddaj eutanazji mysz z wszczepionymi gąbkami PVA przez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Usuń zszywki chirurgiczne i otwórz nacięcie kleszczami zębatymi. Użyj nożyczek, aby przedłużyć nacięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy wyjmij jedną gąbkę z kieszonki podskórnej i przenieś ją do przygotowanego cylindra strzykawki, uważając, aby zminimalizować nacisk na gąbkę. Odłącz tkankę łączną, która pozostaje przyklejona do powierzchni gąbki. W razie potrzeby użyj nożyczek, aby wyciąć gąbkę z otaczającej tkanki. Powtórz proces usuwania gąbki z pozostałymi gąbkami. Umieść probówkę zawierającą gąbki na lodzie.</li>
	<li>W celu wyizolowania płynu z rany należy odwirować probówkę hodowlaną zawierającą strzykawkę o pojemności 5 ml z gąbkami o sile 700 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Po odwirowaniu wyrzucić strzykawkę i gąbki. Płyn z rany zostanie zebrany w probówce hodowlanej o pojemności 16 ml. Reprezentatywny obraz płynu pobranego z rany z 7 dnia jest pokazany na Rysunek 1D. Przenieść płyn z rany do czystej probówki w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek z gąbek PVA
<ol>
	<li>Aby ocenić środowisko komórkowe gojenia się ran ostrych, należy pobrać gąbki między 1–14 dniem po implantacji gąbki. Gąbki pobrane z rany 7 dni po implantacji pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1E.</li>
	<li>Przygotować pożywkę zbiorczą zawierającą 1x HBSS (+wapń/+magnez/–czerwień fenolową) uzupełnioną 1% FBS, 1% HEPS i 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Podaniec 5 ml pożywki zbiorczej HBSS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Ekstrahować gąbki PVA od myszy poddanych eutanazji, jak opisano w 2.2–2.4. Umieść gąbki w stożkowej probówce zawierającej 5 ml pożywki HBSS.</li>
	<li>Przenieś biszkopty i pożywkę HBSS do worka blendera o pojemności 80 ml, wlewając. Zawieś torbę blendera na włazie blendera łopatkowego, umieszczoną tak, aby łopatki uderzały o gąbki i media. Dostosuj ustawienia blendera łopatkowego, aby działał na wysokich obrotach przez 60 s. Naciśnij start.</li>
	<li>Przenieś pożywkę z torebki blendera z powrotem do stożkowej rurki o pojemności 15 ml za pomocą pipety, pozostawiając gąbki w torebce. Ściśnij gąbki, aby dokładnie uwolnić nośnik. Dostosuj ustawienia blendera łopatkowego, aby działał przez 30 sekund na wysokich obrotach. Dodaj 5 ml pożywki do torebki blendera i powtórz proces żołądkowania 2x, co daje w sumie trzy płukania biszkoptem.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o masie 250 x g przez 5 minut. Czerwona osadka komórek i czerwonych krwinek będzie widoczna na dnie stożkowej probówki po odwirowaniu.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i przeprowadzić lizę krwinek czerwonych: dodać 900 μl dH2O do osadu komórek i pipetę do wymieszania. Zneutralizować za pomocą 100 μL 10x PBS. Dodać 4 ml 1x PBS do probówki, aby całkowicie zneutralizować lizę, a następnie odwirować przy 250 x g przez 5 min. 
	UWAGA: Etap lizy powinien być krótki; Pozostawienie wody w kontakcie z komórkami przez dłużej niż 3-5 s może spowodować lizę krwinek innych niż czerwone.</li>
	<li>Po odwirowaniu na dnie stożkowej probówki będzie obecna osadka białych krwinek zawierająca komórki rany pozbawione czerwonych krwinek. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w żądanym podłożu w celu dalszych analiz.</li>
</ol>
4. Opcjonalna analiza metodą cytometrii przepływowej wrodzonych leukocytów wyizolowanych z ran po gąbce PVA
<ol>
	<li>Zawiesić 0,5–1 x 106 komórek rany w 25 μL 2x roztworu przeciwciała blokującego zawierającego 10 μg/ml przeciwciała anty-CD16/CD32 FcRγII/III rozcieńczonego w 1x PBS + 1% BSA. 
	UWAGA: Wszystkie przeciwciała należy miareczkować w celu określenia optymalnych stężeń do analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem blokującym przez 10 minut na lodzie.</li>
	<li>Przygotować 2x główną mieszankę przeciwciał zawierającą 2,5 mg/ml PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/ml FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F i 10 mg/ml eFluor660-F4-80 rozcieńczone w 1x PBS + 1% BSA. Bezpośrednio dodać 25 μl koktajlu przeciwciał do komórek inkubujących w przeciwciałie blokującym.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 20 minut na lodzie, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Umyj komórki 2x za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Zrób mistrzowską mieszankę reaktywnego z aminami, utrwalanego barwnika żywotności-eFluor506 rozcieńczonego 1:1,000 w 1x PBS. Zawiesić osad komórkowy w 50 μl roztworu barwnika żywotności. 
	UWAGA: Surowica musi być wyłączona z etapu utrwalającej się żywotności, ponieważ zapobiegnie to wiązaniu barwnika z białkami endogennymi. Inkubować komórki przez 20 minut na lodzie, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Umyj komórki 2x za pomocą 1x PBS. Zawiesić osad komórkowy w 50 μl 1% paraformaldehydu.</li>
	<li>Inkubować komórki z 1% paraformaldehydem przez 15 minut na lodzie, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Umyj komórki 1x za pomocą 1x PBS i ponownie zawieś osad w 1x PBS do analizy cytometrycznej przepływowej.</li>
</ol>
5. Wycięcie skóry ogona
<ol>
	<li>Znieczulić 8-12-tygodniowego samca myszy C57BL/6J przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 80 mg/kg ketaminy. Podawać 40 mg/kg ksylazyny dootrzewnowo w celu znieczulenia. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez utratę odruchu pedałowania.</li>
	<li>Przygotuj miejsce operacji na ogonie znieczulonej myszy, używając sterylnej gazy, aby nałożyć roztwór jodu powidonu 2x, a następnie jedną aplikację 70% etanolu.</li>
	<li>Zdefiniuj przekrój o wymiarach 10 mm x 3 mm na grzbietowej powierzchni ogona, 10 mm od podstawy ogona (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C) za pomocą trwałego markera, aby śledzić z gotowego szablonu.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na sterylnych serwetach chirurgicznych.</li>
	<li>Do wykonywania zabiegów chirurgicznych należy nosić sterylne rękawice chirurgiczne. Sterylnym ostrzem skalpela wykonaj nacięcie o pełnej grubości wzdłuż prawej, dolnej i lewej krawędzi obszaru rany.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy oderwij wyciętą skórę od ogona i użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć górną krawędź obszaru rany.</li>
	<li>Uciskaj sterylną gazą, aby zatrzymać krwawienie.</li>
	<li>Nałóż folię barierową w sprayu na łożysko rany.</li>
	<li>Fotografuj rany z ustalonej odległości w regularnych odstępach czasu. Analizuj zdjęcia za pomocą analizy planimetrycznej w celu określenia pomiarów obszaru rany. Alternatywnie użyj suwmiarki, aby uzyskać pomiary długości i szerokości nawinięcia.</li>
</ol>

<ol><li>Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+use+in+wound+healing+research%3A+a+survey+focusing+on+in+vitro+and+in+vivo+adult+soft+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).</li>
<li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modeling+Conundrum%3A+Murine+for+Cutaneous+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li>
<li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%3A+Mechanisms%2C+signaling%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).</li>
<li>Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+to+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses to trauma.</a> Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).</li>
<li>Novak, M. L., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Transitions+of+Macrophages+Orchestrate+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair.</a> The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).</li>
<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+Their+Receptors+Are+Key+Players+in+the+Orchestra+That+Regulates+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing.</a> Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).</li>
<li>Guerrero-Juarez, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+fibroblast+heterogeneity+and+myeloid-derived+adipocyte+progenitors+in+murine+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds.</a> Nature Communications. 10 (1), 650(2019).</li>
<li>Shook, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+proliferation+and+heterogeneity+are+supported+by+macrophages+during+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair.</a> Science. 362 (6417), 2971(2018).</li>
<li>Davidson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+repair%2C+cell+proliferation%2C+and+collagen+accumulation+are+produced+by+a+cartilage-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor.</a> The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).</li>
<li>Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+of+epidermal+growth+factor+accelerates+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).</li>
<li>Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+T-lymphocytes+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Significance of T-lymphocytes in wound healing.</a> Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).</li>
<li>Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+T-lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Wound healing and T-lymphocytes.</a> Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).</li>
<li>Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+synthesis+in+wounds%3A+pharmacology+and+effect+on+accumulation+of+collagen+in+wounds+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Surgery+%3D+Acta+Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice.</a> The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).</li>
<li>Opalenik, S. R., Davidson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+differentiation+of+bone+marrow-derived+cells+during+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).</li>
<li>Järveläinen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+decorin+in+cutaneous+wound+healing+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).</li>
<li>Luckett, L. R., Gallucci, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+%28IL-6%29+modulates+migration+and+matrix+metalloproteinase+function+in+dermal+fibroblasts+from+IL-6KO+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice.</a> The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).</li>
<li>Daniel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+postburn+wound+inflammatory+response+by+gammadelta+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells.</a> Shock. 28 (3), 278-283 (2007).</li>
<li>MacLauchlan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+fusion%2C+giant+cell+formation%2C+and+the+foreign+body+response+require+matrix+metalloproteinase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9.</a> Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).</li>
<li>Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+thermal+injury+on+wound+infiltration+and+the+dermal+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response.</a> Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+Induces+Oncostatin+M+Expression+in+Human+Chronic+Wound+Macrophages+through+Axl+Receptor+Tyrosine+Kinase+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway.</a> The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).</li>
<li>Deskins, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stromal+cells%3A+identifying+assays+to+predict+potency+for+therapeutic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).</li>
<li>Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+of+murine+wound+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The phenotype of murine wound macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).</li>
<li>Thomay, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Interleukin-1+Signaling+Improves+the+Quality+of+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing.</a> The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).</li>
<li>Brancato, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+signaling+regulates+the+acute+local+inflammatory+response+to+injury+and+the+fibrosis%2Fneovascularization+of+sterile+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).</li>
<li>Daley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+macrophage+phenotype+by+soluble+product%28s%29+released+from+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils.</a> Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).</li>
<li>Crane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocyte+to+macrophage+transition+in+the+murine+sterile+wound%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound.</a> PloS One. 9 (1), 86660(2014).</li>
<li>Falanga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-thickness+wounding+of+the+mouse+tail+as+a+model+for+delayed+wound+healing%3A+accelerated+wound+closure+in+Smad3+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+skeletal+growth+arrest+by+cutaneous+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring.</a> Bone. 66, 223-231 (2014).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Model+for+Cutaneous+Wound+Healing+and+Scarring+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).</li>
<li>Crane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+influenza+A+virus+infection+leads+to+suppression+of+the+innate+immune+response+to+dermal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury.</a> PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212(2018).</li>
<li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Techniques+Made+Simple%3A+Animal+Models+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li>
<li>Rittié, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+skin+repair+in+humans+and+other+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).</li>
<li>Falanga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Bone+Marrow-Derived+Cultured+Mesenchymal+Stem+Cells+Delivered+in+a+Fibrin+Spray+Accelerate+Healing+in+Murine+and+Human+Cutaneous+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds.</a> Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).</li>
<li>Lucas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Roles+of+Macrophages+in+Diverse+Phases+of+Skin+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+function+and+fate+of+neutrophils+in+sterile+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair.</a> Science. 358 (6359), 111-116 (2017).</li>
<li>Mirza, R. E., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+cell+subsets+to+cytokine+production+during+normal+and+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing.</a> Cytokine. , 1-4 (2014).</li>
<li>Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+Specific+Macrophage+Ablation+Is+Detrimental+to+Wound+Healing+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).</li>
<li>DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIP-1alpha+as+a+critical+macrophage+chemoattractant+in+murine+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).</li>
<li>Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+Sustained+Induction+of+Chemokines+during+Impaired+Wound+Healing+in+the+Genetically+Diabetic+Mouse%3A+Prolonged+Persistence+of+Neutrophils+and+Macrophages+during+the+Late+Phase+of+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair.</a> Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).</li>
<li>Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+wound+healing+in+aging+small+mammals%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano dwa możliwe do wykonania modele ran mysich, które pozwalają na ocenę ostrej reakcji na gojenie się ran. Pierwsza metoda polega na chirurgicznym wszczepieniu gąbek PVA w grzbietową przestrzeń podskórną. Podejście to daje wyraźną przewagę nad modelami ran opartymi na biopsji w badaniu komórkowej reakcji na gojenie się ran ze względu na dużą liczbę komórek i ilość płynów z ran uzyskanych z izolowanych gąbek. Dla pomyślnego wykonania tej procedury konieczne jest utrzymanie sterylnego pola operacyjnego popr...

Dostępnych jest wiele systemów modeli mysich do badania procesów gojenia się ran, z których każdy ma określone zalety i ograniczenia1,2. Poniższe metody przedstawiają dwa mysie modele ran, z których każdy odnosi się do określonego aspektu reakcji na gojenie się ran i które można wykorzystać do identyfikacji przyczyny i skutku zaburzeń w reakcji na uraz. Proces gojenia się ran przebiega w odrębnych fazach. Pierwsza faza jest zapalna, charakteryzująca się szybkim napływem płytek krwi, neutrofili i monocytów/makrofagów, a także wytwarzaniem cytokin i chemokin prozapalnych. Po ustąpieniu stanu zapalnego środowisko przechodzi w stan bardziej naprawczy z indukcją cytokin profibrotycznych i proangiogennych oraz czynników wzrostu. Tkanka ziarninowa odkłada się, a nowośnie tworzą się naczynia wraz z migracją miofibroblastów, fibroblastów, komórek nabłonkowych i komórek śródbłonka. W końcowych etapach prowizoryczna macierz zewnątrzkomórkowa ulega przebudowie, a powstawanie blizn i zamykanie ran postępuje2,3,4,5,6,7,8.
Żaden pojedynczy model mysi nie dostarcza systemu do badania wszystkich etapów gojenia się ran2. Opisano tu dwa modele ran chirurgicznych: jeden wyjaśnia ostre odpowiedzi komórkowe i cytokinowe na gojenie się ran, a drugi pozwala na ocenę zamknięcia rany, a także analizy histologiczne. Te dwie metody mogą być stosowane w sposób komplementarny do oceny wpływu zaburzeń lub chorób współistniejących na różne aspekty reakcji na gojenie się ran. Grzbietowa podskórna implantacja gąbek z alkoholu poliwinylowego (PVA) to system, który od dziesięcioleci jest stosowany w modelach gryzoni w celu wyjaśnienia wielu aspektów odpowiedzi komórek i ziarnin tkankowych9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Takie podejście pozwala na pobranie bogatych w cytokiny płynów z ran i nacieków komórkowych. W tym modelu kawałki gąbki PVA o wymiarach 1 cm x 1 cm x 0,5 cm umieszcza się w kieszeniach podskórnych poprzez 2 cm nacięcie wykonane na tylnej grzbietowej linii środkowej. Nacięcie jest zamykane klipsami chirurgicznymi, a gąbki można pobrać w późniejszych punktach czasowych w celu izolacji komórek i płynów. Środowisko komórkowe i cytokinowe izolowanych gąbek odzwierciedla normalne etapy gojenia się ran do około 14 dni po implantacji. W późniejszych punktach czasowych model jest bardziej korzystny do badania tworzenia się ziarniny i reakcji ciała obcego1. Dzięki temu systemowi możliwe jest wyizolowanie >106 komórek, co daje wyraźną przewagę w testach fenotypowych i funkcjonalnych oraz izolacji RNA, nad izolacją komórek z innych metod opartych na biopsji1,22,23,25,26.
Szybkość zamykania ran jest określana za pomocą modelu wycinania skóry ogona. W tym modelu, jak początkowo opisali Falanga i wsp. i zgłosili inni27,28,29,30, w pobliżu podstawy ogona usuwany jest fragment skóry ogona o wymiarach 1 cm x 0,3 cm pełnej grubości. Obszar rany jest łatwy do uwidocznienia i może być mierzony w czasie. Alternatywnie można wyizolować tkankę ogona do analizy histologicznej. Podejście to może być stosowane jako alternatywa lub w połączeniu z dobrze znaną metodą biopsji dziurki grzbietowej. Podstawowe różnice między tymi dwoma modelami to szybkość zamykania się ran, obecność lub brak futra oraz struktura skóry2,31,32. Rany skóry ogona dają dłuższy czas na ocenę zamknięcia rany, ponieważ całkowite zamknięcie zajmuje około 21 dni. Jest to przeciwieństwo nieszynowanych biopsji dziurki grzbietowej, które goją się znacznie szybciej (~ 7–10 dni), głównie przez skurcz spowodowany działaniem panniculus carnosus. Szynowane biopsje stempla grzbietowego goją się wolniej i zmniejszają efekty gojenia skurczowego, ale polegają na obecności ciała obcego, aby ograniczyć mechanizmy oparte na skurczu1,2,27,30,31,33.
Opisane modele ran są przydatne do zrozumienia normalnych procesów gojenia się ran przy braku zakłóceń. Podczas gdy gojenie się skóry gryzoni różni się w bardzo znaczący sposób od skóry ludzkiej, w tym luźnej struktury, polegania na gojeniu skurczów i innych różnic anatomicznych, system mysi oferuje pewne korzyści w badaniach mechanistycznych i przesiewowych. Najważniejszym z nich jest dostępność szczepów wsobnych i mutantów genetycznych, podatność genetyczna i niższe koszty. Mechanistyczny wgląd uzyskany z badań na myszach można przełożyć na złożone modele zwierzęce, które bardziej naśladują gojenie się ludzkiej skóry, takie jak system świń2,31.
Oprócz badania reakcji na gojenie się ran w stanie stacjonarnym, modele te mogą być łączone z chorobami współistniejącymi, aby zrozumieć podstawy wad gojenia się ran na poziomie komórkowym, cytokinowym i tkankowym. To właśnie w tym konkretnym otoczeniu oba modele mogą być używane razem do oceny wpływu określonego stanu współistniejącego, takiego jak pooperacyjne zapalenie płuc, zarówno na ostrą odpowiedź na gojenie się ran komórkowych, jak i szybkość zamykania się ran30.

<table><tbody><tr><td>10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>15 mL probówki wirówkowe, Olympus</td><td>Genesee</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (+Wapń, +Magnez, &ndash; Czerwień fenolowa)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>5ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw myszom CD45.2-APC Fire750</td><td>BioLegend</td><td>109852</td><td>Clone 104</td></tr><tr><td>Przeciw myszom F4/80-eFluor660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-4801-82</td><td>Klon BM8</td></tr><tr><td>Anty-mysz Ly6C-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553104</td><td>Klon AL-21</td></tr><tr><td>Anty-mysz Ly6G-PerCP-eFluor710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9668-82</td><td>Klon 1A8-Ly6g</td></tr><tr><td>Anty-mysz Siglec-F-APC-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>565183</td><td>Clone E50-2440</td></tr><tr><td>Autoclip Aplikator do nawijania ran ze stali nierdzewnej</td><td>Autoclip Braintree Scientific</td><td>NC9021392</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Klipsy do nawijania ran ze stali nierdzewnej, 9mm</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9334081</td><td></td></tr><tr><td>Torba blendera, 80 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14258201</td><td></td></tr><tr><td>probówka hodowlana, 16 ml, 17x100</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-130</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu - standard</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalany barwnik żywotności eFluor506</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Hepes, 1M</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-534</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (5000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka z polialkoholu winylowego - duży rozmiar porów</td><td>Ivalon/PVA Unlimited</td><td></td><td>www.sponge-pva.com</td></tr><tr><td>Roztwór jodu powidonu, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>3955-16</td><td></td></tr><tr><td>Folia barierowa w sprayu, Cavilon</td><td>3M</td><td>3346E</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster, 110V</td><td>Seward</td><td>0080/000/AJ</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Gojenie ran to złożony proces, który wymaga uporządkowanego postępu stanu zapalnego, tworzenia ziarniny, zwłóknienia i rozwiązania. Modele mysie dostarczają cennych mechanistycznych informacji na temat tych procesów; Jednak żaden pojedynczy model nie uwzględnia w pełni wszystkich aspektów reakcji na gojenie się ran. Zamiast tego idealnie jest używać wielu modeli, aby zająć się różnymi aspektami gojenia się ran. W tym miejscu opisano dwie różne metody, które dotyczą różnych aspektów reakcji na gojenie się ran. W pierwszym modelu gąbki z polialkoholu winylowego są wszczepiane podskórnie wzdłuż grzbietu myszy. Po pobraniu gąbki komórki można wyizolować przez mechaniczne rozerwanie, a płyny można wyekstrahować przez odwirowanie, co pozwala na szczegółową charakterystykę odpowiedzi komórkowych i cytokinowych w środowisku ostrej rany. Ograniczeniem tego modelu jest brak możliwości oceny szybkości zamykania się rany. W tym celu wykorzystuje się model wycinania skóry ogona. W tym modelu prostokątny kawałek skóry ogona o wymiarach 10 mm x 3 mm jest wycinany wzdłuż powierzchni grzbietowej, w pobliżu podstawy ogona. Model ten można łatwo sfotografować do analizy planimetrycznej w celu określenia szybkości gojenia i można go wyciąć do analizy histologicznej. Obie opisane metody mogą być stosowane w genetycznie zmienionych szczepach myszy lub w połączeniu z modelami chorób współistniejących, takich jak cukrzyca, starzenie się lub wtórna infekcja, w celu wyjaśnienia mechanizmów gojenia się ran.

Systemiczna odpowiedź zapalna po implantacji gąbki PVA 
Operacja implantacji gąbki PVA wywołała systemiczną odpowiedź zapalną, o czym świadczy indukcja IL-6 w osoczu 1 dzień po zranieniu (Rycina 2A). Inne cytokiny prozapalne, w tym TNF-α i IL-1β, a także szereg chemokin, w tym CCL2 i CXCL1, zostały indukowane systemicznie w ciągu pierwszych 7 dni po implantacji gąbki PVA, co zostało opisane w innych publikacjach26,30</s...

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Modele te można wdrożyć do oceny różnych aspektów reakcji na gojenie się ran, w tym kinetyki komórkowej i cytokin oraz zamykania ran. Model gąbki PVA umożliwia odzyskanie milionów leukocytów ran do analiz fenotypowych i funkcjonalnych, podczas gdy model wycięcia skóry ogona umożliwia łatwą wizualizację wolno gojących się ran. Gąbka PVA i modele ran ogonowych wycinających mogą być używane w połączeniu ze stanami współistniejącymi, takimi jak cukrzyca lub zapalenie płuc, aby zrozumieć ich wpływ na gojenie się ran.Procedury zademonstruje Bill Henry, asystent naukowy z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem eksperymentu użyj nożyczek, aby pociąć arkusze gąbki PVA na kawałki o wymiarach osiem na osiem na cztery milimetry. Ponownie nawodnić kawałki gąbki w sterylnym PBS w zlewce przez 10 minut przed sterylizacją w autoklawie gąbek w PBS.Gdy gąbki ostygną, przechowuj je zanurzone w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W dniu zabiegu umieść sześć gąbek na zwierzę doświadczalne w sterylnym naczyniu hodowlanym w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym i potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego, ośmio- do 12-tygodniowego samca, myszy C57-Black/6. Poproś asystenta, aby użył maszynki do strzyżenia, aby usunąć włosy wzdłuż grzbietu i sterylnej gazy, aby dwukrotnie nałożyć roztwór jodu powidonu na ogolony obszar, a następnie pojedynczą aplikację 70% etanolu.Asystent powinien następnie przenieść mysz na sterylne obłożenia chirurgiczne umieszczone na podgrzewanej podkładce. Nosząc sterylne rękawiczki, użyj kleszczy, aby odciągnąć skórę grzbietową od leżącej pod nią tkanki i użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać dwucentymetrowe nacięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej około dwóch centymetrów przed podstawą ogona. Trzymając nacięcie otwarte sterylnymi kleszczami, użyj sterylnych, zakrzywionych nożyczek chirurgicznych z końcówką, aby utworzyć podskórną kieszeń wzdłuż grzbietu w jednej z pozycji, jak pokazano na rysunku.Po włożeniu nożyczek otwórz i zamknij końcówki dwa razy, aby utworzyć kieszeń wystarczająco dużą, aby pomieścić włożoną gąbkę. Po utworzeniu kieszonki użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby delikatnie ścisnąć jedną gąbkę PVA w naczyniu hodowlanym, aby usunąć nadmiar PBS. Następnie podnieś gąbkę za jeden róg i prowadząc z rogiem przytrzymanym przez nożyczki, umieść gąbkę w kieszeni podskórnej.Gdy wszystkie sześć gąbek zostanie umieszczonych zgodnie z pokazaniem, użyj sterylnych kleszczy, aby ścisnąć naciętą skórę grzbietową i zamknij nacięcie dwoma klipsami ze stali nierdzewnej. W celu izolacji płynu gąbkowego PVA, od jednego do 14 dni po implantacji, usuń zszywki chirurgiczne i otwórz nacięcie za pomocą kleszczy zębatych. Użyj nożyczek, aby przedłużyć nacięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej i użyj kleszczy, aby wydobyć jedną gąbkę z kieszonki podskórnej.Umieść gąbkę w cylindrze pięciomililitrowej strzykawki umieszczonej w 16-mililitrowej probówce hodowlanej na lodzie i użyj nożyczek, aby odłączyć tkankę łączną, która pozostaje przylegająca do powierzchni gąbki, jeśli to konieczne. Gdy wszystkie gąbki zostaną wyekstrahowane i przeniesione, jak pokazano, odwirować probówkę hodowlaną w celu zebrania płynu z rany. Aby wyizolować komórki z gąbek PVA, po zebraniu gąbek, jak właśnie pokazano, umieść je w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej pięć mililitrów pożywki HBSS.Po zebraniu wszystkich gąbek przelej zawiesinę biszkoptu do 80-mililitrowej torby blendera i zawieś torbę na włazie blendera łopatkowego, tak aby łopatki uderzyły w gąbki i medium. Ustaw blender łopatkowy tak, aby działał na wysokich obrotach przez 60 sekund i naciśnij start. Gdy blender się zatrzyma, ściśnij gąbki w torebce, aby całkowicie uwolnić pożywkę, a następnie za pomocą pipety przenieś pożywkę z torebki blendera z powrotem do 15-mililitrowej rurki.Dostosuj ustawienia blendera łopatkowego, aby działał przez 30 sekund na wysokich obrotach i dodaj pięć mililitrów pożywki do torebki blendera. Powtórz proces żołądkowania jeszcze dwa razy przed odwirowaniem probówki z zebranym podłożem. Na dnie stożkowej rurki powinna być widoczna czerwona osadka komórek i czerwonych krwinek.Wymieszaj 900 mikrolitrów wody destylowanej z komórkami przez trzy do pięciu sekund przed zneutralizowaniem lizy za pomocą 100 mikrolitrów 10x PBS i czterech mililitrów 1x PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad krwinek białych w odpowiednim podłożu do dalszej analizy. Aby stworzyć ranę na skórze ogona, po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego, ośmio- do 12-tygodniowego samca myszy C57-Black/6, użyj sterylnej gazy, aby dwukrotnie nałożyć roztwór jodu powidonu na miejsce operowane, a następnie jedną aplikację 70% etanolu.Używając markera permanentnego i gotowego szablonu, odrysuj odcinek o wymiarach 10 na trzy milimetry na grzbietowej powierzchni ogona, 10 milimetrów od podstawy ogona, i umieść mysz na sterylnych serwetach chirurgicznych. Nosząc sterylne rękawice chirurgiczne, użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wykonać nacięcie na całej grubości wzdłuż prawej, dolnej i lewej krawędzi obszaru rany. Za pomocą sterylnych kleszczy oderwij wyciętą skórę od ogona i użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć górną krawędź obszaru rany.Użyj sterylnej gazy, aby wywrzeć nacisk na ranę, aby zatrzymać krwawienie, i nałóż folię barierową w sprayu na łożysko rany. Następnie sfotografuj rany z ustalonej odległości w regularnych odstępach czasu i przeanalizuj zdjęcia za pomocą analizy planimetrycznej w celu określenia pomiarów powierzchni rany. Operacja implantacji gąbki PVA generuje ogólnoustrojową odpowiedź zapalną, o czym świadczy indukcja IL-6 w osoczu następnego dnia po zranieniu.Liczba komórek, które można odzyskać z ran gąbek PVA, wzrasta z czasem, przy czym neutrofile, monocyty i makrofagi stanowią główne populacje naciekające komórki w gąbkach. Neutrofile są identyfikowane jako komórki Ly6G-dodatnie, Siglec-F-ujemne. Komórki siglec-F-dodatnie to przede wszystkim eozynofile.Bramkowanie na komórkach Ly6G-ujemnych, Siglec-F-ujemnych umożliwia identyfikację monocytów i makrofagów F4/80-dodatnich. Komórki F4 / 80-dodatnie mogą być dalej różnicowane przez ekspresję Ly6C w celu odróżnienia monocytów Ly6C o wysokim stanie zapalnym i makrofagów Ly6C o niskiej zawartości monocytów. Wycinający model skóry ogona stanowi alternatywę dla metody biopsji grzbietowej skóry w celu zbadania zamykania ran w twardej skórze pozbawionej gęstego futra.Zamknięcie rany można określić ilościowo, mierząc powierzchnię łożyska rany w czasie. Ranę skóry ogona można również zaobserwować w przekroju poprzecznym poprzez analizę histologiczną za pomocą H i E oraz barwienie trichromem Massona. Na tych zdjęciach boczne brzegi wyciętej skóry są oznaczone grotami strzałek na grzbietowej powierzchni ogona.Aby zrozumieć gojenie się ran w stanie ustalonym, związki lub interwencje terapeutyczne można również testować poprzez ich wstrzyknięcie bezpośrednio do gąbki PVA lub poprzez dostarczenie do łożyska rany ogonowej.

assessment-acute-wound-healing-using-dorsal-subcutaneous-polyvinyl

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano przydatne narzędzie do analizy wpływu leków, czynników wzrostu i/lub zmodyfikowanych komórek w modelu zwierzęcym gojenia ran. Technika ta wykorzystuje właściwości gąbki z alkoholu poliwinylowego (PVA) do dostarczania i utrzymywania pożądanego preparatu, a także stanowi platformę, którą można wyciąć i poddać analizie.

Implantacja modelu gąbki z alkoholu poliwinylowego

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Szczur, ze względu na swoje rozmiary, dostępność i raczej łagodne zachowanie, był wykorzystywany jako model badawczy przez wiele lat. Celem tego protokołu jest wykorzystanie szczura jako niedokrwiennego modelu gojenia się ran skóry, aby zapewnić cenny wgląd w patofizjologię ran przewlekłych.

Demonstracja modelu rany na skórze z niedokrwieniem skóry u szczura

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Rany stanowią globalne wyzwanie zdrowotne. W ramach tego badania opracowano standaryzowaną kabinę fotograficzną wykorzystującą planimetrię cyfrową w celu zminimalizowania zmienności pomiaru rany. Monitorowanie ran u myszy przez 14 dni wykazało początkowy wzrost powierzchni i obwodu rany, po którym następowało stopniowe zamykanie. Metodologia ta może pomóc w ocenie kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Planimetria cyfrowa do oceny kinetyki zamykania ran w modelu mysim

Opisano zostało szczurze modele rany skóry, które umożliwiają ocenę różnych środków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych lub patologicznych na różnych etapach procesu gojenia. Ponadto szczegółowo opisano protokół do wykonywania manualnej planimetrji w celu monitorowania szybkości kurczenia się rany w trakcie naprawy tkanki.

Model szczurzych ran chirurgicznych: podejście do badań nad gojeniem się ran i oceną biomateriałów

Poznaj metody oceny gojenia ran u myszy za pomocą modelu gąbki PVA i wycięcia skóry ogona. Te techniki umożliwiają analizę leukocytów rany oraz kinetyki cytokin w badaniach biologii komórkowej.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona. (Wideo) | JoVE Journal

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Przeglądaj więcej filmów