Analiza populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych
23 lutego 2021
Prezentowana jest wygodna, szybka i opłacalna metoda pomiaru proporcji komórek populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych.
Analiza komórek populacji bocznej jest jedną z powszechnie stosowanych metod izolowania i identyfikacji nowotworowych komórek macierzystych z tkanek nowotworowych i linii komórek nowotworowych. Ten test jest wygodny, szybki i opłacalny. Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia wpływu genów lub innych sygnałów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych na właściwości macierzyste komórek nowotworowych.
Wiele czynników może wpływać na procentową zawartość komórek SP w tej analizie, dlatego ważne jest, aby zbadać odpowiednie warunki przed formalnym eksperymentem. Wysiewaj komórki nowotworowe na sześciodołkowej płytce i inkubuj je w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza zasilanym 5% dwutlenkiem węgla. Gdy gęstość komórek osiągnie około 90%, odessać pożywkę hodowlaną i umyć komórki dwukrotnie trzema mililitrami PBS.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów 0,25% trypsyny-EDTA do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do trzech minut. Delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki, dodaj trzy mililitry PBS uzupełnionego 2% FBS do każdej studzienki i pipetuj komórki w górę iw dół trzy do pięciu razy, aby rozproszyć grudki komórek. Zbadaj zawiesinę komórek pod mikroskopem.
Jeśli obecne są grudki komórek, przepuść zawiesinę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj je w ilości 200 razy g przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w trzech mililitrach PBS uzupełnionych 2% FBS, pipetując komórki w górę iw dół trzy do pięciu razy w celu wymieszania.
Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i rozcieńcz je w PBS uzupełnionym 2% FPS do końcowego stężenia jeden razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Przygotuj dwie pięciomililitrowe, polistyrenowe, okrągłodenne probówki i dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek do każdej probówki. Oznacz jedną probówkę jako probówkę, a drugą jako probówkę kontrolną blokującą.
Przygotuj roztwór blokera, rozcieńczając go do odpowiedniego stężenia. Dodaj go do probówki kontrolnej blokera i dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wstrząsaj probówką co 10 minut.
Przygotować roztwór Hoechst 33342, rozcieńczając go do odpowiedniego stężenia. Dodaj go oddzielnie do probówki i probówki kontrolnej blokera i dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Potrząsaj probówkami co 10 minut.
Po inkubacji odwirować komórki przez pięć minut w temperaturze 200 razy g i czterech stopniach Celsjusza, a następnie ostrożnie zassać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w każdej probówce z jednym mililitrem lodowatego PBS uzupełnionego 2% FBS, a następnie pipetować komórki w górę iw dół, aby wymieszać. Dodaj jeden mikrolitr jednego miligrama na mililitr jodku propydu lub PI do każdej probówki i wymieszaj.
Kliknij kartę Parameters (Parametry) w oprogramowaniu cytometru przepływowego. Najpierw wybierz parametry odpowiednio FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red i PI. Po drugie, wybierz skalę logarytmiczną dla parametru PI.
Na koniec wybierz skale obszaru i szerokości odpowiednio dla parametrów FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red i PI. Najpierw uruchom ogniwa z probówki, a następnie uruchom ogniwa z probówki kontrolnej blokera przy użyciu tych samych napięć i bramek. Zbierz od 20 do 100 000 zdarzeń z każdej próbki, aby przeanalizować procent komórek SP.
Metodę tę zastosowano do wykrycia proporcji komórek SP w linii komórkowej ludzkiego raka piersi MDA-MB-231. Wykres punktowy FSC-A w porównaniu z PI-A wykazał populację martwych komórek, szczątków komórkowych i główną populację komórek PI ujemnych, która została poddana dalszej analizie. Do analizy proporcji komórek SP wykorzystano pojedynczą populację komórek bramkowaną na podstawie wykresu kropkowego FSC-A w porównaniu z FSC-W oraz wykresu kropkowego SSC-A w porównaniu z SSC-W, która wynosiła około 0,9% w komórkach nieleczonych i około 0,09% w komórkach leczonych rezerpiną.
Na komórkach MDA-MB-435 testowano różne stężenia barwienia Hoechst 33342 i stwierdzono, że dwa mikrogramy na mililitr są optymalne do analizy SP. Niskie stężenia utrudniały odróżnienie komórek SP od innych populacji, podczas gdy wysokie stężenia powodowały zanik komórek SP. Werapamil i rezerpina zostały przetestowane w celu określenia właściwego blokera dla komórek MDA-MB-435.
Około 0,4% komórek wydaliło barwnik po leczeniu werapamilem, ale stosunek ten spadł do około 0,1% po leczeniu rezerpiną, co pokazuje, że rezerpina jest bardziej odpowiednim blokerem dla tej linii komórkowej. Protokół ten wykorzystano również do określenia proporcji komórek SP w ludzkich komórkach gruczolakoraka płuc A549 leczonych koliveliną aktywatora STAT3 oraz w ludzkich komórkach raka piersi T47D leczonych inhibitorem FRA1 SKLB816. Test ten dostarcza wskazówek na temat regulacyjnego wpływu szlaków sygnałowych na cechy nowotworowych komórek macierzystych i ułatwia odkrycie nowych mechanizmów, które mogą ostatecznie ukierunkować celowaną terapię nowotworów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia wygodną, szybką i kosztowo efektywną metodę pomiaru proporcji komórek populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych. Analiza komórek populacji bocznej jest kluczowa dla izolacji i identyfikacji nowotworowych komórek macierzystych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Komórki populacji bocznej (SP) są istotne dla badania nowotworowych komórek macierzystych.
- Niniejsza metoda pomaga w zrozumieniu właściwości macierzystości komórek nowotworowych.
- Wiele czynników wpływa na odsetek komórek SP.
- Odpowiednie warunki eksperymentalne są kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody pomiaru komórek populacji bocznej.
- Pogłębienie zrozumienia biologii macierzystych komórek nowotworowych.
- Ułatwienie badań nad wpływem różnych sygnałów na komórki nowotworowe.
Zastosowane metody
- Wysiać komórki nowotworowe na płytce sześcio-dołkowej.
- Inkubować w temperaturze 37°C w atmosferze 5% dwutlenku węgla.
- Odssać pożywkę hodowlaną, gdy gęstość komórek osiągnie około 90%.
- Przemyć komórki PBS przed przeprowadzeniem analizy.
Główne wyniki
- Metoda jest wydajna i ekonomiczna.
- Umożliwia ona izolację komórek macierzystych nowotworu z tkanek guza.
- Odpowiednie warunki są niezbędne do dokładnego pomiaru komórek SP.
- Podejście to przyczynia się do zrozumienia biologii komórek nowotworowych.
Wnioski
- Przedstawiona metoda stanowi cenny instrument w badaniach nad rakiem.
- Pomaga ona w identyfikacji nowotworowych komórek macierzystych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu zgłębienia biologii guza.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja komórek macierzystych nowotworu za pomocą analizy populacji bocznej (side population) umożliwia mechanistyczną weryfikację szlaków odpowiedzialnych za macierzystość guza, co wspiera walidację celów w badaniach nad nowotworami. Metoda ta dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych na temat populacji komórek o charakterystyce macierzystej, co ułatwia identyfikację potencjalnych leków oraz wybór modeli przedklinicznych. Jej efektywność kosztowa oraz możliwość zastosowania w różnych liniach guzów litych zwiększają ciągłość translacyjną od wczesnych etapów odkrywania do przesiewowych badań nad konkretnymi szlakami sygnałowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie aktywności efleksu komórek o charakterze macierzystym, powiązanej z funkcją transporterów ABC.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez blokadę z użyciem inhibitorów (np. werapamilu, rezerpiny) w celu potwierdzenia specyficzności fenotypu SP.
- Wartość translacyjna: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez powiązanie modulacji genów lub szlaków (np. aktywatora STAT3, inhibitora FRA1) ze zmianami w częstotliwości występowania SP.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do dalszego screeningu związków poprzez izolację frakcji wzbogaconych w SP.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja testów odpływu barwnika poprzez optymalizację stężenia Hoechst 33342 (2 µg/mL) oraz miareczkowanie blokera w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość translacyjna: Umożliwienie skalowalnych i wielokrotnie wykorzystywalnych przepływów pracy do oceny wpływu związków na właściwości nowotworowych komórek macierzystych w różnych liniach komórkowych (MDA-MB-231, MDA-MB-435, A549, T47D).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pomiar właściwości macierzystości w systemie istotnym dla przebiegu choroby w celu modelowania mechanizmów inicjacji nowotworu, przerzutów i nawrotów.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez korelację modulacji SP z efektywnością inhibitorów szlaków sygnałowych.
- Wartość translacyjna: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez powiązanie fluktuacji SP z wpływem sygnałów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych na macierzystość komórek nowotworowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Zastosowana na wczesnym etapie odkrywania, metoda ta wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego przed identyfikacją wiodących związków, a uzyskane wyniki stanowią podstawę do kontynuacji badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne wpływają na stemness pochodzącą z frakcji SP.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość testową dzięki ustandaryzowanemu przygotowaniu komórek, barwieniu i bramkowaniu w cytometrii przepływowej (FSC-A vs. PI-A, FSC-W, SSC-W).
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennej zależnej (procent SP) w celu porównania warunków (np. grupa nietraktowana vs. traktowana rezerpiną).
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez ocenę modulacji stemness w modelach gruczolaka płuca i raka piersi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako modułowa metoda możliwa do zastosowania w różnych typach guzów litych, co ogranicza redundantny rozwój testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad komórkami macierzystymi nowotworu poprzez bezpośredni odczyt funkcjonalny odpływu barwnika.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji stężenia komórek (1×10⁶ cells/mL), inkubacji (37°C, 5% CO₂) oraz kontroli blokowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji badań (go/no-go) poprzez statystycznie jasną identyfikację regulatorów szlaków odpowiedzialnych za cechy macierzystości (np. STAT3, FRA1).
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie skuteczności modulacji SP w różnych modelach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu kompensacji i bramkowania w cytometrii przepływowej dla parametrów Hoechst Blue/Red oraz PI.
- Konieczny jest dostęp do cytometrów przepływowych umożliwiających logarytmiczne skalowanie sygnału PI oraz detekcję sygnału w obszarze i szerokości (area/width).
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów przygotowania, płukania i blokowania komórek pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania zmienności.
- Należy uwzględnić konieczność adaptacji metody dla różnych typów nowotworów, ponieważ optymalne stężenie Hoechst oraz skuteczność blokerów różnią się w zależności od linii komórkowej (np. MDA-MB-435 vs. A549).
- Ograniczenie praktyczne: czułość analizy SP zależy od prawidłowego wykluczenia martwych komórek i debris za pomocą bramkowania PI, co wykazano na wykresach kropkowych dla linii MDA-MB-231.
