Name: PeptiQuick, jednoetapowa inkorporacja białek błonowych do biotynylowanych peptydysków w celu usprawnienia testów wiązania białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Poznaj metodę PeptiQuick do jednoczesnej oczyszczania i rekonstytucji białek błonowych z E. coli bez detergentów. Technologia Peptidisc umożliwia stabilizację białek FhuA i analizę ich interakcji z ligandami za pomocą interferometrii biowarstwowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii. JS jest stypendystą CGS-M CIHR. LT był wspierany przez finansowane przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych South West Biosciences Doctoral Training Partnership [numer grantu szkoleniowego BB/M009122/1]. FD jest Tier II Canada Research Chair.

1. Przygotowanie i solubilizacja receptora błonowego FhuA
<ol>
	<li>Wyraź jego6-znakowany FhuA w szczepie Escherichia coli AW740. Hodować komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w pożywce M9 (tabela 1). Zobacz Mills et al.16, aby uzyskać szczegółowy protokół wyrażeń.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie (5 000 x g, 10 min, 4 °C) i ponownie zawiesić je w 50 ml buforu tris-sol-glicerol (TSG) (Tabela 1). Odbić zawieszone komórki i dodać fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF) do końcowego stężenia 1 mM tuż przed lizą. 
	UWAGA: PMSF jest toksyczny i.</li>
	<li>Lizuj komórki za pomocą mikrofluidyzatora (trzy przejścia) przy 15 000 psi lub prasy francuskiej (trzy pasaże) przy 8 000 psi. Niezlizowane komórki i inny nierozpuszczalny materiał osadzać przez wirowanie na niskiej prędkości (5 000 x g, 10 min, 4 °C).</li>
	<li>Ultraodwirować supernatant (200 000 x g, 40 min, 4 °C) w celu wyizolowania surowej frakcji membranowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad membranowy w minimalnej ilości buforu GTS i odbić za pomocą szklanego lub metalowego aparatu do wybijania w celu zapewnienia jednorodności.</li>
	<li>Wykonać test Bradforda, aby sprawdzić stężenie białka w zawieszonej surowej błonie. Rozcieńczyć surową błonę do końcowego stężenia 3 mg/ml przy użyciu buforu TSG przed rozpuszczeniem.</li>
	<li>Dodać detergent Triton X-100 do końcowego stężenia 1% (v/v), aby selektywnie rozpuszczać wewnętrzną błonę bakteryjną przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z delikatnym kołysaniem. Osadzać nierozpuszczalny materiał (frakcję membrany zewnętrznej) przez ultrawirowanie (200 000 x g, 40 min, 4 °C).</li>
	<li>Odrzucić sklarowany sklarat zawierający rozpuszczoną membranę i ponownie zawiesić osad w TSG do końcowego stężenia 3 mg/ml. Dodać tlenek laurylodimetyloaminy (LDAO) w stężeniu 1% (v/v) do zawieszonej frakcji błony zewnętrznej i rozpuszczać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.</li>
	<li>Wykonaj końcowy etap wirowania, aby ogranulować cały nierozpuszczalny materiał (200 000 x g, 40 min, 4 °C). 
	UWAGA: Otrzymany supernatant zawiera rozpuszczone białka błony zewnętrznej, w tym docelowe FhuA znakowane przez niego.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie i rekonstytucja FhuA za pomocą przepływu pracy PeptiQuick
<ol>
	<li>Wstępnie zrównoważyć wstępnie napakowaną kolumnę Ni-NTA (objętość żywicy 5 ml) z dwiema objętościami kolumny buforu do płukania metodą chromatografii powinowactwa do metali (IMAC) (tabela 1).</li>
	<li>Rozcieńczyć rozpuszczoną błonę zewnętrzną od 1% LDAO do 0,04% LDAO za pomocą TSG. Następnie dodać imidazol do końcowego stężenia 5 mM. 
	UWAGA: Imidazol jest toksyczny i.</li>
	<li>Załaduj rozpuszczone białka błony zewnętrznej na żywicę Ni-NTA i zbierz przepływ. Ponownie załaduj przepływ na żywicę, aby zwiększyć wiązanie żywicy FhuA i zebrać przepływ wtórny. 
	UWAGA: Zachowaj 20 μl podwielokrotności rozpuszczonego materiału jako odniesienie do późniejszej analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).</li>
	<li>Przemyć żywicę 250 ml buforu płuczącego IMAC i zebrać pierwsze 50 ml eluatu. Opróżnić bufor płuczący do wysokości objętości złoża żywicy i zamknąć kran na kolumnie.</li>
	<li>Dodać 1 ml stężonego roztworu peptydu Bio-Peptidisc o stężeniu 10 mg/ml (Tabela 1) do kolumny. Dodać 50 ml rozcieńczonego 1 mg/ml roztworu peptydu Bio-Peptidisc w TSG i wymieszać żywicę ze szklaną pałeczką w celu ponownego zawieszenia kulek w TSG.</li>
	<li>Po wychwytywaniu peptydysku pozwól żywicy osiąść i odsącz nadmiar 1 mg/ml roztworu Bio-Peptidisc przez żywicę.</li>
	<li>Umyj cząstki peptydysku dołączone do Ni-NTA 50 ml TSG. Eluować cząstki peptydysku za pomocą 15 ml buforu elucyjnego IMAC (Tabela 1) zawierającego 600 mM imidazolu w TSG. Zebrać 1 ml frakcji i natychmiast dodać 10 μl 0,5 M EDTA, aby chelatować wypłukane jony niklu. 
	UWAGA: EDTA jest substancją drażniącą.</li>
</ol>
3. Ocena rekonstytucji PeptiQuick
<ol>
	<li>Analiza SDS-PAGE
	<ol>
		<li>Załadować 10 μl podwielokrotności materiału wyjściowego, frakcji przepływowej, przemywającej(-ych) i eluowanej z rozpuszczonego PeptiQuick na 12% żel denaturujący SDS i elektroforezę przez 30 minut przy stałym prądzie 60 mA.</li>
		<li>Zabarwić żel niebieskim barwnikiem Coomassie, odbarwić żel i wyświetlić na skanerze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia wykluczania wielkości (SEC)
	<ol>
		<li>Na podstawie 12% analizy SDS-PAGE podczas rozpuszczania PeptiQuick, wyizolować i połączyć odpowiednie frakcje, a następnie zagęścić je za pomocą odśrodkowego koncentratora o sile 30 kDa. 
		UWAGA: Na załączonym filmie frakcje F3–F7 są łączone razem i skoncentrowane poniżej 1 ml (objętość pętli iniekcyjnej na instrumencie SEC).</li>
		<li>Wstrzyknąć ~ 1 ml zbiorczych frakcji elucyjnych IMAC do kolumny S200 (300/10) do filtracji żelowej przy natężeniu przepływu 0,25 ml/min w buforze TSG. Zbierz frakcje o pojemności 1 ml i uruchom je na 12% żelu SDS, aby określić, które frakcje SEC należy zebrać i skoncentrować. 
		UWAGA: Wymywane frakcje PeptiQuick mogą być łączone bez stężenia, a podwielokrotność może być wstrzykiwana do SEC w celu sprawdzenia jakości rekonstytucji. Jest to ważna kontrola białek błonowych, które są potencjalnie wrażliwe na agregację podczas zagęszczania odśrodkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Interferometria biowarstw
<ol>
	<li>Konfiguracja eksperymentalna BLI
	<ol>
		<li>Ustaw płytkę 96-dołkową ręcznie. 
		UWAGA: Wszystkie studzienki są napełniane do końcowej objętości 200 μl.</li>
		<li>W kolumnie 1, wiersze A−E, załadować 200 μl bufora kinetycznego, aby umożliwić zrównoważenie końcówek i utworzenie sygnału linii podstawowej.</li>
		<li>Rozcieńczyć ligand (FhuA w Bio-Peptidisc) do stężenia 2,5 μg/ml w buforze kinetycznym (Tabela 1). Załadować 200 μl tego rozcieńczenia do rzędów A−D w kolumnie 2.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu kinetycznego tylko do E2 (czujnik odniesienia).</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu kinetycznego do kolumny 3, rzędy A−E, aby zmyć nadmiar FhuA z końcówki.</li>
		<li>W kolumnie 4 przeprowadzić dwukrotne seryjne rozcieńczenia analitu (ColM) w dół płytki od A4 do D4. Zacznij od 28 nM (8*Kd) w A4 do 3,5 nM (1*Kd) w D4.</li>
		<li>Dodaj 28 nM ColM do E4, aby zmierzyć niespecyficzne wiązanie (najwyższe stosowane stężenie ColM).</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu kinetycznego do kolumny 5, rzędy A−E. 
		UWAGA: Tutaj ColM oddzieli się od końcówki i mierzona jest dysocjacja.</li>
		<li>Umieść płytkę nastawczą w instrumencie BLI.</li>
		<li>Umieść tackę na końcówkę czujnika w przyrządzie BLI.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych BLI i wybierz Nowy eksperyment kinetyczny w kreatorze oprogramowania.</li>
		<li>Użyj zakładki definicji płytki, aby wprowadzić układ płytki 96-dołkowej do oprogramowania. 
		UWAGA: Studzienki zawierające ligand, FhuA są wprowadzane jako "Obciążenie". Studnie zawierające tylko bufor są wprowadzane jako "Bufor". Studzienki zawierające analit, ColM, są wprowadzane jako "próbka".</li>
		<li>Użyj zakładki definicji testu, aby zdefiniować czas i prędkość obrotową płytki dla każdego kroku w eksperymencie. 
		UWAGA: Etapy eksperymentalne są ustawione jako: 1) linia wyjściowa: 60 s; 2) Ładowanie: 250 s; 3) linia bazowa 2: 300 s; 4) Stowarzyszenie: 450 s; oraz 5) dysocjacja: 900 s. Pozostaw domyślną prędkość potrząsania (1,000 obr./min). Powyższe kroki są indywidualnie przypisywane do każdej kolumny w płytce 96-dołkowej, wybierając żądany krok i klikając prawym przyciskiem myszy Dodaj krok testu na każdej kolumnie.</li>
		<li>Przypisz pierwszy krok, klikając prawym przyciskiem myszy pierwszą kolumnę i wybierz polecenie Rozpocznij nowy test. Upewnij się, że krok planu bazowego jest poprawnie przypisany przy użyciu prawego dolnego okna i zmień go za pomocą menu rozwijanego zgodnie z potrzebami.</li>
		<li>Przypisz kolejne kroki do każdej kolumny, klikając prawym przyciskiem myszy wzdłuż płytki i wybierając opcję Dodaj krok testu. Przypisz je do odpowiedniej kolumny, zgodnie z ustawieniami w kroku 4.1.13.</li>
		<li>Użyj zakładki Przypisanie czujnika, aby upewnić się, że instrument oktetowy pobiera piny BLI z właściwego miejsca w zasobniku czujnika. 
		UWAGA: Na karcie przypisania czujnika tylko A1−E1 powinny być podświetlone na niebiesko. Upewnij się, że w tych miejscach na tacy czujnika znajduje się końcówka czujnika i upewnij się, że F1−H1 są puste.</li>
		<li>Podświetl F1−H1 na ekranie, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Usuń, aby oznaczyć je jako puste. Zaznacz pole wyboru Wymień czujniki w zasobniku po użyciu, aby zachować używane czujniki.</li>
		<li>Na karcie przeglądania eksperymentu, która zawiera ostateczne omówienie eksperymentu przed jego wykonaniem, zapoznaj się z krokami eksperymentalnymi, aby upewnić się, że cała konfiguracja jest poprawna.</li>
		<li>Na karcie uruchamiania eksperymentu wybierz lokalizację pliku, aby zapisać pliki metody.</li>
		<li>Zmień temperaturę płyty na temperaturę pokojową.</li>
		<li>Wybierz pozycję Przejdź, aby uruchomić eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych BLI
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych Octet BLI.</li>
		<li>Użyj karty wyboru danych, aby zlokalizować eksperyment i sprawdzić podsumowanie eksperymentu. Zaimportuj plik projektu z jego lokalizacji zapisu zdefiniowanej w kroku 4.1.19.</li>
		<li>Wprowadź stężenia analitu (tutaj ColM), wybierając informacje z czujnika dla każdego eksperymentu.</li>
		<li>Przypisz końcówkę w komponencie E1 jako wskazówkę referencyjną.</li>
		<li>Użyj zakładki przetwarzania, aby odjąć sygnał odniesienia (E1) od danych eksperymentalnych. Sprawdź nieprzetworzone dane z końcówki referencyjnej pod kątem niespecyficznego wiązania analitu. Jeśli nie zostanie zaobserwowany, kontynuuj. 
		UWAGA: Jest to ważna kontrola ujemna. Jeśli zaobserwowane zostanie niespecyficzne wiązanie, zostanie to uwzględnione w kroku 4.2.7.</li>
		<li>Wyrównaj oś y do drugiego kroku linii bazowej. Nie zaznaczaj połączenia międzykrokowego. Wybierz filtrowanie Savitzky-Golay. Wybierz opcję Process Data!.</li>
		<li>Na karcie analizy wybierz dane eksperymentalne w tabeli poniżej wykresu, aby zobaczyć krzywe asocjacji i dysocjacji z odjętym sygnałem z czujnika referencyjnego.</li>
		<li>Wybierz model wiązania 1:1 i wybierz częściowe dopasowanie łuku. Wybierz opcję Dopasuj krzywe!.</li>
		<li>Przeanalizuj wykres widoku resztkowego, aby sprawdzić dopasowanie krzywej.</li>
		<li>Przewiń tabelę, aby zobaczyć obliczone Kd.</li>
		<li>Wybierz opcję Zapisz raport..., aby zapisać dokument arkusza kalkulacyjnego z wyszczególnieniem konfiguracji, wykresów danych pierwotnych i analizowanych oraz obliczonych stałych dysocjacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rawlings, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+always+an+insoluble+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: always an insoluble problem.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).</li>
<li>Popot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipols%2C+Nanodiscs%2C+and+Fluorinated+Surfactants%3A+Three+Non+Conventional+Approaches+to+Studying+Membrane+Proteins+in+Aqueous+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).</li>
<li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Detergent-Free+Isolation+of+Membrane+Proteins+in+their+Local+Lipid+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment.</a> Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).</li>
<li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Saposin-Lipoprotein+Nanoparticle+System+for+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins.</a> Nature Methods. 13, 345-351 (2016).</li>
<li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Single+Bacteriorhodopsin+Trimers+in+Bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).</li>
<li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+for+Structural+and+Functional+Studies+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural%2C+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).</li>
<li>Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+Facilitate+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).</li>
<li>Carlson, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Peptidisc%2C+A+Simple+Method+for+Stabilizing+Membrane+Proteins+in+Detergent-Free+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution.</a> eLife. 7, 34085(2018).</li>
<li>Carlson, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+E.+coli+Membrane+Interactome+Captured+in+Peptidisc+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries.</a> eLife. 8, 46615(2019).</li>
<li>Serdakowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+residual+detergent+in+biological+samples+post+endotoxin+reduction+treatment+and+evaluation+of+strategies+for+subsequent+detergent+removal%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal.</a> International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).</li>
<li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+Purification+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Strategies for the Purification of Membrane Proteins.</a> Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).</li>
<li>Lin, S. H., Guidotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of Membrane Proteins.</a> Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).</li>
<li>Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Membrane+Protein-Detergent+Interactions+Depend+on+Protein+Electrostatics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).</li>
<li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Phospholipid+Exchange+between+a+Detergent-Solubilized+Membrane+Protein+and+Lipid-Detergent+Mixed+Micelles%3A+Brominated+Phospholipids+as+Tools+to+Follow+Its+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170481(2017).</li>
<li>Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FhuA+Interactions+in+a+Detergent-Free+Nanodisc+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).</li>
<li>Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Exclusion+Chromatography+for+the+Analysis+of+Protein+Biotherapeutics+and+their+Aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates.</a> Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).</li>
<li>Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation%3A+Pathways%2C+induction+factors+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).</li>
<li>FortéBio. Octet System Data Acquisition User Guide, Release 7.1. . , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2014/01/Data-Acquisition-Octet.pdf">http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2014/01/Data-Acquisition-Octet.pdf</a> (2014).</li>
<li>FortéBio. Octet System Data Analysis User Guide, Release 7.1. . , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Data-Analysis-Octet.pdf">http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Data-Analysis-Octet.pdf</a> (2011).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+proximity-based+labeling+methods+for+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping.</a> F1000Research. 8, 135(2019).</li>
</ol>

FD jest założycielem firmy Peptidisc Biotech, której celem jest dystrybucja peptydów peptydowych wśród społeczności akademickiej. Peptidisc Biotech współpracuje również z firmami z branży biotechnologicznej i farmaceutycznej w celu wdrożenia peptidiscu w ich przepływach pracy związanych z odkrywaniem. Publikacja tego artykułu w otwartym dostępie była sponsorowana przez FortéBio.

Podczas gdy detergenty pozostają najprostszą metodą ekstrakcji i oczyszczania białek błonowych, te środki powierzchniowo czynne mogą mieć wiele niepożądanych skutków dla stabilności, funkcji i dalszych analizbiałek 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Trudności te zmotywowały do opracowania mimetyki membranowej, która dąży do zminimalizowania obecności detergentów i odtworzenia w jak największym stopniu natywnego środowiska membranowego 2,3,4,5,6. Większość metod rekonstytucji wymaga jednak znacznej optymalizacji warunków rekonstytucji i często wymaga dodatkowych etapów oczyszczania, co zmniejsza ostateczną wydajność 7,8. Peptydysk spontanicznie dostosowuje się do docelowego białka błonowego i stosunkowo wymaga niewielkiej optymalizacji i dalszego oczyszczania 9,10. W tym protokole PeptiQuick jest przedstawiony jako prosty sposób na usprawnienie protokołu rekonstytucji do dalszej analizy interakcji białko-białko.
Chociaż jest to proste, istnieje kilka zastrzeżeń eksperymentalnych, które mogą prowadzić do nieudanej rekonstytucji. Wśród nich najczęstszą jest agregacja białek. Dlatego tak ważne jest wykonanie chromatografii wykluczania wielkości w celu monitorowania procesu rekonstytucji. Na przykład pik wykluczenia wielkości eluujący w objętości pustki wskazuje na agregaty białkowe (Figura 3B)17,18. Agregaty białek błonowych zwykle tworzą się po długotrwałym wystawieniu na działanie nieoptymalnych warunków detergentu przed rozpuszczeniem. W szczególności stwierdzono, że białka błonowe w detergentach mają tendencję do tworzenia agregatów, gdy są skoncentrowane przez ultrafiltrację na urządzeniach odśrodkowych. W takim przypadku wrażliwe białka błonowe mogą być zagęszczane za pomocą ultrafiltracji próżniowej, która jest łagodniejszą i bardziej jednorodną metodą zagęszczania, ponieważ adsorpcja białek na filtrze jest zmniejszona.
Zasadniczo, aby uniknąć koncentracji białka, eluowane frakcje IMAC należy połączyć i wstrzyknąć podwielokrotność do kolumny wykluczającej wielkość w celu sprawdzenia jakości jej rekonstytucji. Należy zauważyć, że nieinkorporowany wolny peptyd eluuje się tuż po głównym piku peptydysku (ryc. 3B). Wolne rusztowanie niekoniecznie utrudnia dalsze eksperymenty. Jednakże, w razie potrzeby, nadmiar ten można usunąć za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar. Alternatywnie, zwiększenie objętości płukania podczas rozpuszczenia, a przed elucją, z żywicy IMAC, wystarczy, aby skutecznie usunąć większość wolnego peptydu peptydyskowego. Z tego powodu zaleca się chromatografię wykluczania wielkości jako szybki i prosty sposób sprawdzenia jakości rekonstytucji.
Eksperyment BLI wymaga starannej optymalizacji stężeń zarówno ligandów, jak i analitów. Wiązanie liganda musi być wystarczające do uzyskania wyraźnego sygnału, ale przeciążenie spowoduje nasycenie sygnału, co skutkuje artefaktami danych z powodu przepełnienia i przeszkody sterycznej na powierzchni końcówki. Dlatego zarówno stężenie liganda, jak i czas, jaki końcówka spędza w roztworze liganda, muszą być zoptymalizowane dla każdej próbki białka (rysunek uzupełniający 2). Należy również zoptymalizować stężenie analitu. Jeśli znana jest stała dysocjacji, ten krok staje się łatwiejszy, ponieważ zakres stężeń można przybliżyć. Dobrym punktem wyjścia do tej analizy jest zastosowanie stężeń białek od 0,1 do 20 razy większych niż oczekiwane Kd19.
Po pobraniu danych BLI należy przeprowadzić staranną analizę danych, aby uniknąć błędnej interpretacji. Obliczenie stałej dysocjacji zależy od dopasowania krzywej wiązania. O ile stechiometria wiązania nie jest już znana, do wstępnego dopasowania należy zastosować klasyczny model oddziaływania dwumolekularnego 1:1. Należy zauważyć, że niejednorodna krzywa wiązania jest często wynikiem artefaktów i nieidealnego zachowania spowodowanego wysokim stężeniem analitu, który może być błędnie interpretowany jako złożony model wiązania. W związku z tym obniżenie stężenia analitu do momentu, gdy profil sensorgramu będzie wykazywał stechiometrię wiązania 1:1, może pomóc w odróżnieniu wiązania heterogenicznego od bardziej złożonych interakcji. Wszelkie pozostałe heterogeniczne dane wiązania są następnie dyskontowane, jak pokazano na rysunku 420.
W tym raporcie mierzona jest stała dysocjacji wynosząca 2,28 ± 0,74 nM dla oddziaływania FhuA-ColM. Wartość ta jest zgodna ze stałą dysocjacji wcześniej wyznaczoną w naszej grupie z nanodyskiem lub peptydyskiem przy użyciu odpowiednio ITC lub MST (Figura 4E)16. Ta spójność daje pewność co do rekonstytucji peptydysku i analizy BLI jako sposobu na określenie kinetyki interakcji. Co ważne, należy zauważyć, że białka są zwykle unieruchamiane na biosensorach streptawidyny albo poprzez chemiczne sieciowanie biotyny, albo addycję specyficzną dla miejsca przy użyciu ligazy biotyny E. coli BirA21. Najwyraźniej biotynylacja rusztowania peptydysku, zamiast docelowego białka błonowego, ma wiele zalet. Biotynylacja rusztowania oszczędza czas i minimalizuje możliwość zakłócenia ważnych miejsc wiązania białek. Odkryliśmy również, że PeptiQuick ma zastosowanie do szerokiego zakresu docelowych klas białek, w tym receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), kanałów jonowych i białek błonowych β beczek. Ogólnie rzecz biorąc, należy zauważyć, że początkowy ekstrakt detergentowy białek błonowych do stanu wolnego od agregatów ma kluczowe znaczenie, a natychmiastowa rekonstytucja w peptydysku zmniejsza problemy z agregacją w dalszej części procesu. Biorąc pod uwagę prostotę, przewiduje się, że PeptiQuick zostanie rozszerzony na inne testy wiązania oparte na streptawidynie, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), testy ELISA i ściąganie powinowactwa przy użyciu kulek streptawidyny.

Białka błonowe są często wykluczane z programów badawczych dotyczących leków lub przeciwciał ze względu na skłonność białek błonowych do agregacji poza środowiskiem dwuwarstwowym lipidów, zwłaszcza w obecności detergentów1. Dlatego w ostatnich latach opracowano kilka mimetyki błonowej (zwanych rusztowaniami) w celu ułatwienia izolacji i badania białek błonowych w środowisku całkowicie wolnym od detergentów (tj. nanodyski, SMALP, amfipole itp.)2,3,4,5,6. Jednak rekonstytucja białek błonowych w tych mimetykach często wymaga rozległej optymalizacji, która jest czasochłonna i zazwyczaj towarzyszy jej utrata odzysku białka7,8. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, nasze laboratorium opracowało niedawno "uniwersalną" formułę znaną jako peptidisc9. Peptydysk powstaje, gdy wiele kopii amfipatycznego dwuhelicznego peptydu o masie 4,5 kDa wiąże się z hydrofobową powierzchnią docelowego białka błonowego. Stabilna rekonstytucja w peptydysku następuje po usunięciu detergentu, zatrzymując zarówno endogenne lipidy, jak i rozpuszczone białka błonowe w rozpuszczalnych w wodzie cząsteczkach. Te ustabilizowane cząstki są teraz podatne na wiele dalszych zastosowań.
Metoda peptidisc oferuje kilka zalet; na przykład, rekonstytucja jest prosta, ponieważ wiązanie rusztowania peptidisc z celem jest kierowane przez samą matrycę białka9,10. Stechiometria peptydów jest również samodzielna, a dodawanie lipidów egzogennych nie jest konieczne. Powstawanie peptydysku następuje przez proste rozcieńczenie detergentem, co jest ważną zaletą w porównaniu z dializą lub adsorpcją na kulkach polistyrenu, co często skutkuje niską wydajnością białka z powodu niespecyficznego kojarzenia powierzchni i agregacji11,12,13. Końcowy zespół peptydysku jest wysoce termostabilny i niezmiennie rozpuszczalny w różnych lub w obecności kationów dwuwartościowych (np. Ni2+). Czystość i jednorodność strukturalna rusztowania jest również wysoka (np. nie zawiera endotoksyn), a peptyd można dostosować za pomocą grup funkcyjnych umieszczonych w różnych pozycjach.
Prezentujemy tutaj laboratoryjny przepływ pracy o nazwie PeptiQuick, znany również jako rekonstytucja na koralikach9. Protokół ten łączy oczyszczanie białek błonowych i rekonstytucję peptydysku w jednym kroku i na tym samym podłożu chromatograficznym. Jak sama nazwa wskazuje, PeptiQuick jest szybki w porównaniu z innymi metodami rekonstytucji, a także znacznie skraca czas ekspozycji na detergent. Negatywne skutki detergentów, takie jak rozwijanie i agregacja białek, często występują w sposób zależny od czasu; Dlatego minimalizacja narażenia na detergenty ma kluczowe znaczenie dla utrzymania natywnej konformacji białka<klasa SUP = "xref">14,<klasa SUP = "xref">15. Ma to kluczowe znaczenie dla dokładności metod, które informują o interakcjach białek i powinowactwie wiązania ligandów.
Podczas opracowywania tego protokołu, prezentujemy nową biotynylowaną wersję rusztowania peptidisc, zwaną Bio-Peptidisc. Grupy funkcyjne biotyny umożliwiają przyłączanie docelowego białka błonowego do powierzchni pokrytych streptawidyną. Ponieważ znakowanie biotyną jest ograniczone do rusztowania, miejsca wiązania na docelowym białku błonowym pozostają niezmienione. Za pomocą Bio-Peptidisc określa się kinetykę wiązania receptora błony bakteryjnej FhuA i peptydu przeciwdrobnoustrojowego kolicyny M (ColM) 16. To powinowactwo jest mierzone za pomocą interferometrii biowarstw (BLI), która analizuje interakcje w czasie rzeczywistym na podstawie wzorców interferencji światła białego odbitych od końcówki czujnika.
Korzystając z tego protokołu, wyeliminowano potrzebę stosowania detergentu podczas analizy BLI, co jest ważnym osiągnięciem, ponieważ detergenty mogą zakłócać interakcje. Za pomocą tej metody można szybko zmierzyć powinowactwo wiązań, a wyniki są porównywalne z tymi zgłoszonymi wcześniej przy użyciu nanodysków i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC)16. Pokazano i omówiono kluczowe etapy przepływu pracy PeptiQuick, takie jak przygotowanie białka, rozcieńczanie detergentu, dodawanie peptydów i rekonstytucję, wraz ze wskazówkami dotyczącymi rozwiązywania problemów z wiązaniem ligandów i analitów w teście BLI. Korzystając z przepływu pracy PeptiQuick, stwierdzono, że białka błonowe mogą być wychwytywane w peptydyskach, a ich interakcje mierzone w ciągu jednego dnia.

<table><tbody><tr><td>Koncentrator odśrodkowy 30 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7715-Ampicillin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BioShop</td><td>69-52-3</td><td>Sól sodowa</td></tr><tr><td>Bio-Peptidisc Peptidisc</td><td>Peptidisc Biotech</td> <td>https://peptidisc.com-Albumina</td><td></td></tr> <tr><td>surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td>Liofilizowany proszek</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Chemiczny</td><td>10035-04-8</td><td>Certyfikowany ACS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>6381-92-6</td><td>Klasa biotechnologiczna</td></tr><tr><td>Ettan LC (AKTA)</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td>18-1145-58-Glukoza</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BioShop</td><td>50-99-7</td><td>Bezwodny, odczynnik</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Chemical</td><td>56-81-5</td><td>Certyfikowany ACS</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>BioShop</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek laurylodimetyloaminy klasy biotechnologicznej (LDAO)</td><td>Sigma</td><td>101822204</td> <td>~ 30% w H2O</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>10034-99-8</td><td>Certyfikowany</td></tr><tr><td>mikrofluidyzator</td> ACS <td>Microfluidics</td><td>M-110L</td><td>Pasuje do komory F20Y 75 i mikro Żywica</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>H-320-50-Niewiążąca</td><td></td></tr> <tr><td>96-dołkowa płytka BLI</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655076</td><td>Microplate, PS, 96 dołk, F-Bottom (studzienka kominowa),, Fluotrac, Med. Binding</td></tr><tr><td>Octet Red96</td><td>Fort&eacute; Przyrząd Bio</td><td>OCTET RED96E-GxP</td><td>Octet RED96e, oprogramowanie Octet CFR, komputer stacjonarny, monitor LC, zestaw akcesoriów, zestaw IQ/OQ, zestawy PQ i roczna gwarancja</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P-7626-Barwnik</td><td></td></tr> do <tr><td>oznaczania białek - Koncentrat odczynnika</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Stosowany w teście Bradforda do oznaczania stężenia białka - 5x stężenie</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Biosensory streptawidyny (SA)</td> klasy biotechnologicznej <td>ForteBio</td><td>18-5019</td><td>Jedna taca zawierająca 96 biosensorów pokrytych streptawidyną do oznaczania ilościowego, badań przesiewowych lub zastosowań kinetycznych.</td></tr><tr><td>Superdex S200 (300/10)</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td>175175-01-Tiamina</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Merck</td><td>69271-Tris-HCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BioShop</td><td>77-86-1</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>klasy Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>900998-1</td><td>Biotechnology Grade</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Ultra wirówka</td><td>Beckman Redlica</td><td>365668</td><td>-</td></tr></tbody></table>

peptiquick, jednoetapowa inkorporacja białek błonowych do biotynylowanych peptydysków w celu usprawnienia testów wiązania białek

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Białka błonowe, w tym transportery, kanały i receptory, stanowią prawie jedną czwartą proteomu komórkowego i ponad połowę obecnych celów leków. Jednak główną przeszkodą w ich charakterystyce i wykorzystaniu w środowisku akademickim lub przemysłowym jest to, że większość strategii biochemicznych, biofizycznych i przesiewowych leków wymaga, aby białka te były w stanie rozpuszczalnym w wodzie. Nasze laboratorium opracowało niedawno peptydysk, mimetyk błonowy oferujący uniwersalne podejście do problemu rozpuszczalności białek błonowych. Przedstawiamy tutaj uproszczony protokół, który łączy oczyszczanie białka i rekonstytucję peptydysku w jednym kroku chromatograficznym. Ten przepływ pracy, określany jako PeptiQuick, pozwala na ominięcie dializy i inkubacji za pomocą kulek polistyrenowych, co znacznie zmniejsza narażenie na detergenty, denaturację białek i utratę próbki. Gdy PeptiQuick jest wykonywany z biotynylowanymi rusztowaniami, preparat może być bezpośrednio przymocowany do powierzchni pokrytych streptawidyną. Nie ma potrzeby biotynylowania ani modyfikowania docelowego białka błonowego. PeptiQuick jest tutaj prezentowany z receptorem błonowym FhuA i przeciwdrobnoustrojowym ligandem kolyną M, wykorzystując interferometrię biowarstw w celu określenia dokładnej kinetyki ich interakcji. Stwierdzono, że PeptiQuick jest wygodnym sposobem na przygotowanie i analizę interakcji białko-ligand błonowy w ciągu jednego dnia w środowisku wolnym od detergentów.

Receptor błonowy FhuA jest ekspresowany w laboratoryjnym szczepie E. coli. Frakcję błony zewnętrznej izoluje się poprzez wirowanie, a następnie białka solubilizuje za pomocą dwuetapowej ekstrakcji detergentowej. Solubilizowane białka błonowe nanosi się na kulki agarozy Ni-NTA upakowane w plastikowej kolumnie, a następnie stosuje procedurę PeptiQuick zgodnie z przedstawionym protokołem. Po kontroli jakości z wykorzystaniem chromatografii wykluczania cząsteczkowego, cząstki Bio-Peptidisc unieruchamia się na pinach pokrytych streptawidyną. Analizę BLI przeprowadza się w celu pomiaru kinetyki oddziaływań między FhuA a ColM. Schematyczny przegląd tego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1.
Przeprowadza się elektroforezę w żelu SDS, aby określić jakość rekonstytucji po elucji cząsteczek FhuA Bio-Peptidisc z kolumny IMAC (Rysunek 2). W celu oceny skuteczności metody PeptiQuick, na żel SDS nanosi się alikwoty frakcji odpowiadających początkowi, prześwitowi, przemywaniom oraz frakcjom elucyjnym. Wyczerpanie białka FhuA we frakcji prześwitu koreluje z jego wzbogaceniem we frakcjach elucyjnych, co wskazuje na efektywność oczyszczania białka. W elowanych frakcjach obserwuje się niewielkie prążki białek zanieczyszczających. Analiza żelu SDS służy do określenia, które frakcje należy połączyć przed analizą SEC. Przeprowadza się również elektroforezę w żelu natywnym dla elowanych cząsteczek FhuA Bio-Peptidisc, aby potwierdzić rozpuszczalność FhuA (Rysunek dodatkowy 1). Migracja rekonstytuowanego białka w żelu natywnym świadczy o rozpuszczalności białka w środowisku wolnym od detergentów.
Analizę SEC przeprowadza się w celu oceny rozpuszczalności cząsteczek peptidisc. Chromatogram przedstawiony na Rysunku 3A wykazuje pojedynczy, symetryczny pik eluujący przy objętości około 14 mL (6 mL poza objętością martwą wynoszącą 8,0 mL w kolumnie do filtracji żelowej S200 10/300). Położenie tego piku, poza objętością martwą, potwierdza rozpuszczalność cząsteczek FhuA Bio-Peptidisc. Dla odniesienia Rysunek 3B ilustruje teoretyczne, suboptymalne przygotowanie peptidisc. W tym przypadku chromatogram wykazuje większy pik białkowy eluujący przy objętości martwej, co wskazuje na obecność agregatów białkowych. Mniejszy pik eluujący tuż za głównym pikiem peptidisc odpowiada nadmiarowi peptydów peptidisc.
Oddziaływanie białka FhuA z analitym ColM jest określane po przytwierdzeniu peptidysków do sensorów powlekanych streptawidyną. Końcówki sensorów są najpierw równoważone w buforze kinetycznym, a następnie przenoszone do buforu zawierającego bio-peptidyski FhuA. Stężenie bio-peptidysków FhuA oraz czas ich inkubacji z końcówką są optymalizowane przed przeprowadzeniem tego eksperymentu (Rycina uzupełniająca 1). Po etapach obciążania i płukania, w kroku asocjacji mierzone są oddziaływania między obciążonymi końcówkami a czterema różnymi stężeniami kolicyny M. Następnie przeniesienie końcówek z powrotem do buforu powoduje dysocjację, która jest mierzona za pomocą przesunięcia długości fali światła białego odbitego od końcówki.
Rysunek 4A przedstawia surowe dane z sensogramu uzyskane w tym doświadczeniu. Wszystkie krzywe wydają się jednorodne w krokach ładowania i linii bazowej, z wyjątkiem referencyjnej krzywej zaznaczonej na żółto. Końcówka referencyjna nie ma załadowanego ligandu, ale jest wystawiona na działanie analitytu w celu oceny wiązania nieswoistego, co stanowi ważną kontrolę negatywną. Dla bardziej szczegółowej analizy wyników, sygnał z końcówki referencyjnej jest odejmowany od krzywych dla końcówek eksperymentalnych, aby uwzględnić wiązanie nieswoiste. Dane są wyrównane do początku etapu asocjacji w celu umożliwienia bezpośredniego porównania wizualnego, jak pokazano na Rysunku 4B. Porównanie to wykazuje wzrost przesunięcia długości fali wraz ze zwiększaniem stężeń kolicyny M. Krzywa dopasowana do danych wykazuje klasyczny model wiązania 1:1.
wykres reszt (Rysunek 4B, dół), która opisuje różnice między danymi dopasowanymi a eksperymentalnymi, pokazuje, że dopasowanie dla najwyższego stężenia ColM (28 nM) jest słabe w porównaniu z trzema niższymi stężeniami. Profil samej krzywej nie wykazuje plateau krzywej wiązania, które jest charakterystyczne dla nasycenia miejsc wiązania w typowym eksperymencie wiązania. Brak plateau sugeruje wiązanie heterogeniczne, co prawdopodobnie jest artefaktem wysokiego stężenia ColM. W związku z tym najwyższe stężenie ColM zostało wykluczone z analizy, a pozostałe trzy stężenia wykorzystano do wyznaczenia stałej dysocjacji (Rycina 4C,D). Dwustronny test t-Studenta ttest, przy 95% poziomie ufności, wykazał, że zaobserwowana stała dysocjacji w tym eksperymencie nie różni się istotnie od wartości uzyskanych przy użyciu różnych technik (Rysunek 4E)16.
<img alt="Schemat rekonstytucji PeptiQuick; obejmuje solubilizację błon oraz analizę metodą interferometrii warstwy biologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd schematu pracy PeptiQuick z wykorzystaniem Bio-Peptidisców i analizy BLI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej SDS-PAGE, oczyszczanie białek, frakcje elucji PeptiQuick, prążek 82 kDa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza żelowa SDS (12%) frakcji początkowej, przepływowej, płukania oraz elucji zebranych w ramach procedury PeptiQuick. Na każdą ścieżkę naniesiono około 10 µL próbki, a elektroforezę prowadzono przez 30 min przy stałym natężeniu prądu 60 mA. Żel zabarwiono błękitem Coomassie, odbarwiono i zobrazowano za pomocą skanera żeli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres chromatografii filtracyjnej; absorbancja przy 280 nm w funkcji objętości elucji dla analizy białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig3a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Eksperymentalne i teoretyczne profile SEC reprezentujące odpowiednio optymalną i suboptymalną rekonstytucję. (A) Eksperymentalny profil SEC białka FhuA (~82 kDa) rekonstytuowanego metodą PeptiQuick w Bio-Peptidiscach. Frakcje elucji IMAC F3−F7 zostały połączone i zagęszczone do objętości ~1 mL przy użyciu koncentratora odśrodkowego z granicą odcięcia 30 kDa. Tę zagęszczoną próbkę wstrzyknięto z przepływem 0,25 mL/min na kolumnę do filtracji żelowej S200 (10/300) w buforze TSG. (B) Teoretyczny profil SEC suboptymalnej rekonstytucji metodą PeptiQuick. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig3alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza sensorgramu z kinetyką asocjacji/dysocjacji; wykresy dopasowania, tabela Kd, wyniki na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig4d.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Badanie oddziaływań ColM z FhuA zrekonstytuowaną w Bio-Peptidiscach. (A) Surowe dane sensorgramu z referencyjnym śladem sensora zaznaczonym na żółto. (B,C) Góra: etapy asocjacji i dysocjacji z częściowym dopasowaniem krzywej wiązania 1:1. Dół: widoki residuów przedstawiające różnicę między danymi eksperymentalnymi a dopasowaniem obliczeniowym. (C) Ponowne wykreślenie danych z (B) z wyłączeniem najwyższego stężenia ColM. (D) Obserwowane stałe szybkości asocjacji i dysocjacji (odpowiednio kon i koff) oraz stałe dysocjacji (Kd). (E) Porównanie stałych dysocjacji FhuA-ColM uzyskanych za pomocą metod peptidisc i BLI (w tym eksperymencie), peptidisc i mikroskalowej termoforezy (Saville, nieopublikowane dane) oraz nanodisc i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej16. Słupki błędów reprezentują jedno SD niepewności, natomiast n.s. oznacza brak istotnej różnicy na poziomie ufności 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig4clarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Pożywka M9 (na litr)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >200 mL soli M9</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >800 mL dH2O</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10 mL 40% glukozy</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >80 µL 1 M CaCl2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2,5 mL 1 M MgSO4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >300 µL 15 mg/mL tiaminy</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor TSG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM NaCl</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10% glicerolu</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor do płukania IMAC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM NaCl</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10% glicerolu</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >0,04% LDAO</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >5 mM imidazolu</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór Bio-Peptidisc</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rozpuścić gotowy do użycia Bio-Peptidisc (&gt;95% czystości) w sterylnej dH2O. Stężenie i objętość roztworu peptydowego zależą od etapu procesu rekonstytucji.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM NaCl</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >UWAGA: Ten roztwór stokowy peptydu Bio-Peptidisc jest stabilny w temperaturze 4 °C przez ponad miesiąc.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor do elucji IMAC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM NaCl</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10% glicerolu</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >600 mM imidazolu</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor do badań kinetycznych</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM NaCl</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >0,002% Tween-20</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >0,1% BSA</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Składy pożywek i roztworów.
Rysunek uzupełniający 1: Analiza frakcji elucji zebranych w ramach procesu PeptiQuick za pomocą żelu natywnego 4%–16%. Na każdą ścieżkę naniesiono około 10 µL próbki, a elektroforezę prowadzono przez 40 min przy stałym natężeniu prądu 30 mA. Żel zabarwiono błękitem Coomassie, odbarwiono, a następnie wizualizowano za pomocą skanera. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Optymalizacja stężenia ligandu przy użyciu pojedynczego pinu. (A) Sześć różnych stężeń FhuA w Bio-Peptidiscu przetestowanych pod kątem wiązania do pojedynczego pinu powleczonego streptawidyną. Układ został przygotowany na płytce 96-dołkowej z buforem w dołkach pomiędzy stężeniami ligandu (protokół przygotowania znajduje się w Pliku uzupełniającym 1). (B) Surowe dane z sensorgramu dla eksperymentu optymalizacji ligandu. Pin wykazuje największą odpowiedź i dodatkowo osiąga nasycenie przy stężeniu nr 4 (lub 2,5 µg/mL). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661suppfig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>
Plik uzupełniający 1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/supplementalfile1.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Prezentujemy metodę, która łączy oczyszczanie białek błonowych i rekonstytucję w peptydyskach w jednym kroku chromatograficznym. Biotynylowane rusztowania są używane do bezpośredniego przylegania do powierzchni i pomiaru interakcji białko-ligand za pomocą interferometrii biowarstw.

PeptiQuick, jednoetapowa inkorporacja białek błonowych do biotynylowanych peptydysków w celu usprawnienia testów wiązania białek

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Klasyczna metoda, w której białka błonowe są ekstrahowane w celu ich badania, polega na prostej solubilizacji w detergencie. Chociaż jest to prosta i uniwersalna metoda, wykazano, że detergenty zmieniają natywną strukturę, funkcję i aktywność tych wrażliwych białek. Tutaj przedstawiamy Peptidisc jako roztwór do stabilizacji białek błonowych w roztworze wolnym od detergentów.System Peptidisc spontanicznie dostosowuje się do rozmiaru, kształtu i typologii niezliczonych białek błonowych. Kontrastuje to z innymi mimetykami membranowymi, które często wymagają żmudnej optymalizacji. FhuA, białko błony zewnętrznej E. coli, zostanie wykorzystane jako modelowe białko docelowe, które zostanie odtworzone w tym protokole.Pęcherzyki błony zewnętrznej zostaną odizolowane, a następnie dodany detergent w celu rozpuszczenia białek błonowych. Peptyd Peptidisc dodaje się do solubilizacji, a detergent rozcieńcza się, spontanicznie tworząc cząstki Peptidisc. Te ustabilizowane rozpuszczalne cząstki są obecnie podatne na wiele dalszych zastosowań.W ramach tego protokołu zbadana zostanie interferometria warstwy biologicznej jako zastosowanie technologii Peptidisc. Protokół ten skupi się na metodzie rekonstytucji PeptiQuick, użytecznej technice, która ułatwia jednoczesne oczyszczanie i odtwarzanie białek błonowych. Metoda rozpuszczania na kulkach PeptiQuick jest wykonywana w standardowej kolumnie grawitacyjnej Nickel-NTA IMAC wstępnie zbalansowanej w detergencie.Rozpuszczona błona jest ładowana na żywicę, a białka niebędące przedmiotem zwalczania są wypłukiwane. Następnie peptyd dodaje się do kolumny, a detergent szybko rozcieńcza. Hydrofobowa strona peptydu Peptidisc wiąże się z odsłoniętymi obszarami hydrofobowymi.Hydrofilowa strona peptydu utrzymuje białko rozpuszczalne w roztworze. Nadmiar peptydu jest wypłukiwany. Imidazol jest dodawany w celu wymycia odtworzonej furii.Rusztowanie Peptidisc może być funkcjonalizowane w celu pośredniego znakowania białek pamięci, a tym samym otwierania drzwi do szerszego zestawu dalszych analiz. W tym przypadku wykorzystujemy biotynylowany peptyd do przyłączenia do czujników pokrytych streptawidyną w celu analizy BLI. Interferometria biowarstwowa jest potężną, bezznacznikową techniką badania interakcji biomolekularnych w roztworze.Technika ta nie tylko po prostu demonstruje interakcje, ale także zapewnia odczyt kinetyczny w czasie rzeczywistym i umożliwia obliczenie stałej dysocjacji wiązania. Dzięki temu protokołowi eliminujemy potrzebę stosowania detergentu podczas analizy BLI, ponieważ może to zmienić aktywność. Interferometria biowarstwowa analizuje interferencję przechodzenia białego światła odbitego od czujnika lub końcówki i związanych makrocząsteczek podczas interakcji.Aby zmierzyć interakcje, końcówka czujnika jest przekazywana między roztworami, a sygnał jest rejestrowany na każdym kroku. Każda końcówka daje wtedy swój własny ślad na sensogramie. Po pierwsze, ustala się poziom bazowy tylko bufora.Po drugie, ligand jest związany. W tym przypadku FhuA i biotynylowane Peptidiscs wiążą końcówkę pokrytą streptawidyną. Następnie końcówka jest myta w buforze w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych FhuA.Teraz końcówkę przenosi się do roztworu o znanym stężeniu analitu, tutaj ColM. Jeśli dojdzie do interakcji, da to krzywą wiązania. Na koniec końcówka jest przenoszona do bufora i mierzona jest dysocjacja.Obserwowane szybkości asocjacji i dysocjacji przy każdym stężeniu kolumny można wykorzystać do obliczenia stałej dysocjacji. Heksahistydyna znakowana FhuA ulega ekspresji w szczepie E-coli AW740 przez 18 godzin w pożywkach aminowych. Bakterie zbiera się przez odwirowanie w temperaturze 5 000 g i 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Powstały osad komórkowy jest ponownie zawieszany w buforze TSG, a następnie odbijany w celu rozbicia grudek komórkowych i zapewnienia dokładnej lizy. TMSF jest dodawany do ponownie zawieszonych komórek do końcowego stężenia jednego milimola tuż przed lizą. Lizę komórek uzyskuje się przez trzy przejścia przez mikrofluidyzator o ciśnieniu 15 000 PSI lub prasę francuską o ciśnieniu 8 000 PSI.Zlizowane komórki są zbierane i przeprowadza się wirowanie z niską prędkością w temperaturze 5 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni. Supernatant z wolnoobrotowego wirowania jest ładowany do wirnika ultrawirówki TI70 i odwirowywany z prędkością 200 000 G przez 40 minut w temperaturze czterech stopni w celu osadzenia surowej membrany E. coli. Po ultraodwirowaniu supernatant jest odrzucany, a surowy granulat membranowy jest ponownie zawieszany w minimalnej ilości buforu TSG.Surowa membrana jest odrzucana, aby zapewnić jej jednorodność. Test Bradforda przeprowadza się w celu sprawdzenia stężenia białka w ponownie zawieszonej surowej błonie. Bufor TSG służy do rozcieńczania surowej membrany do około trzech miligramów na mililitr przed rozpuszczeniem.Triton X-100 dodaje się do ponownie zawieszonej surowej membrany w końcowym stężeniu 1% w celu selektywnego rozpuszczania wewnętrznej błony bakteryjnej. Solubilizacja odbywa się przez godzinę w czterech stopniach, z delikatnym kołysaniem. Nierozpuszczoną błonę zewnętrzną izoluje się przez ultrawirowanie w temperaturze 200 000 G przez 40 minut, w temperaturze czterech stopni.Otrzymany supernatant zawierający rozpuszczoną błonę wewnętrzną jest odrzucany. Podczas gdy osad, zawierający membranę zewnętrzną, jest ponownie zawieszany, jak poprzednio w GTS. LDAO dodaje się do końcowego stężenia 1% do ponownie zawieszonej błony zewnętrznej i rozpuszcza przez godzinę w temperaturze czterech stopni.Na koniec przeprowadza się ultrawirowanie, tak jak poprzednio, w celu osadzenia nierozpuszczalnego materiału. Powstały supernatant zawiera rozpuszczoną błonę zewnętrzną, w tym nasz cel, oznaczony przez niego FhuA, teraz gotowy do jednoczesnego oczyszczania IMAC i rekonstytucji Peptidisc. Kolumna grawitacyjna niklowo-NTA IMAC jest wstępnie zrównoważona z dwiema objętościami kolumny buforu płuczącego IMAC.Imidazol dodaje się w końcowym stężeniu pięciu milimolów do rozpuszczonej błony zewnętrznej, rozcieńczonej do 0,04% LDAO. Rozpuszczona membrana zewnętrzna jest ładowana na żywicę niklowo-NTA, a przepływ jest zbierany. Ten przepływ jest ponownie ładowany na żywicę, aby zwiększyć wiązanie żywicy FhuA.Po załadowaniu żywica jest przemywana 250 mililitrami buforu myjącego IMAC i zbierane jest pierwsze 50 mililitrów. Po umyciu bufor płuczący jest opróżniany do wysokości tuż powyżej wysokości złoża żywicy i zamykany jest kurek kolumny. Do kolumny dodaje się jeden mililitr skoncentrowanego, 10 miligramów na mililitr peptydu Peptidisc.Po dodaniu skoncentrowanego peptydu dodaje się 50 mililitrów rozcieńczenia, jeden miligram na mililitr, peptyd Peptidisc w TSG. Żywica jest mieszana w celu ponownego zawieszenia kulek w TSG, poniżej CMC LDAO, tworząc w ten sposób cząstki peptidisc. Po wychwytywaniu peptidisc żywicę pozostawia się do osiadania, a jeden miligram na mililitr roztworu peptydu jest odprowadzany przez żywicę.Żywicę przemywa się 50 mililitrami TSG w celu usunięcia nadmiaru peptydu Peptidisc. Na koniec cząsteczki Peptidisc rozcieńcza się 50 mililitrami 600-milimolowego imidazolu w TSG. Zbiera się jedną frakcję mililitrową i dodaje 10 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA, kluczowego światła wypłukiwanych jonów niklu.Frakcje początkowe, przepływowe, płuczące i wymykające się są ładowane do 12% żelu SDS i poddawane elektroforezie przez 30 minut przy natężeniu 60 miliamperów. Żel jest barwiony i wizualizowany na skanerze żelowym. Powstały żel wykazuje zubożenie FhuA w przepływie i wzbogacenie w elucję.W frakcjach wymykających się obserwuje się również niewielkie pasma zanieczyszczeń. Frakcje od trzeciej do siódmej są wybierane do chromatografii wykluczania wielkości w celu potwierdzenia rozpuszczalności peptydysku FhuA i zubożenia zanieczyszczeń. Odcięty koncentrator odśrodkowy o mocy 30 kilokopuły służy do koncentracji frakcji od trzech do siedmiu.Jeden mililitr połączonych frakcji elucji IMAC jest wstrzykiwany do kolumny S200 z natężeniem przepływu 0,25 mililitra na minutę w buforze TSG. Pobiera się jedną frakcję mililitrową i uruchamia się 12% żel SDS z frakcji. Odpowiednie frakcje są łączone w pule i mogą być teraz wykorzystywane w dalszych aplikacjach.BLI przeprowadzono w oktecie ForteBio RED96. Ten instrument przesuwa kołki BLI po 96-dołkowej płytce, która jest najpierw ustawiana ręcznie. Wszystkie studzienki są napełniane do końcowej objętości 200 mikrolitrów.Kolumna pierwsza jest załadowana buforem kinetycznym, aby umożliwić zrównoważenie końcówek i utworzenie sygnału bazowego. Kolumna druga jest obciążona z góry określonym stężeniem liganda i buforu kinetycznego. W tym przypadku FhuA jest ligandem i dodaje się go do stężenia 2,5 mikrograma na mililitr.Końcówka w wierszu E będzie używana jako odniesienie i jest ładowana tylko z buforem. Kolumna trzecia jest załadowana buforem kinetycznym, aby wypłukać nadmiar FhuA z końcówki. Dwukrotne seryjne rozcieńczenia analitu, w tym przypadku ColM, są ładowane od góry do dołu w kolumnie czwartej.Najwyższe z tych stężeń stosuje się w rzędzie referencyjnym do pomiaru niespecyficznego wiązania analitu z końcówką. Kolumna piąta jest załadowana buforem. Tutaj ColM dokona dysocjacji, a dysocjacja zostanie zmierzona.Po przygotowaniu płytki, tacka z końcówką czujnika i przygotowana płytka są ładowane do przyrządu BLI. Otwierane jest oprogramowanie do akwizycji danych BLI i rozpoczyna się nowy eksperyment kinetyczny. Zakładka Definicja płytki służy do wprowadzania układu płytki 96-dołkowej do oprogramowania.Tutaj ligand FhuA jest wprowadzany jako ładunek, podczas gdy analit ColM jest wprowadzany jako próbka. Zakładka Definicja testu służy do definiowania czasu i prędkości obrotowej płytki dla każdego kroku eksperymentu. W tym miejscu uwzględniamy krok linii bazowej trwający 60 sekund, po którym następuje krok obciążenia trwający 250 sekund, drugi krok linii bazowej trwający 300 sekund, etap asocjacji analitu trwający 450 sekund, a na końcu etap dysocjacji trwający 900 sekund.Kroki te są indywidualnie przypisywane do każdej kolumny w płytce 96-dołkowej poprzez wybranie żądanego kroku i kliknięcie prawym przyciskiem myszy Dodaj test na każdej kolumnie. Zakładka przypisania czujnika służy do upewnienia się, że instrument Octet pobiera piny BLI z ich prawidłowego miejsca w zasobniku czujnika. Karta Przeglądanie eksperymentu zawiera ostateczne omówienie eksperymentu przed jego wykonaniem.BLI będzie teraz realizowane przez Octet RED. W ten sposób utworzony zostanie nieprzetworzony sensogram danych do analizy. Analiza jest wykonywana poprzez pierwsze uruchomienie oprogramowania do analizy danych personalizacyjnych Octet.Karta Wybór danych służy do lokalizowania eksperymentu i sprawdzania podsumowania eksperymentu. Stężenia analitu ColM są tutaj wprowadzane. Następnie zakładka Przetwarzanie służy do odejmowania sygnału referencyjnego od danych eksperymentalnych.Linia bazowa jest zdefiniowana w taki sposób, aby wyrównać oś Y tak, jakby zastosowano jej szybkość usuwania stopu. Na koniec wybierana jest opcja Dane procesowe. Dane są izolowane na potrzeby tego eksperymentu i wybierana jest opcja Dopasuj krzywe.Wybierane jest częściowe dopasowanie krzywej asocjacji i dysocjacji. Kd jest obliczane na podstawie tego dopasowania. Chromatogram wykluczający wielkość służy do walidacji rekonstytucji ambute.Chromatogram pokazuje pojedynczy symetryczny pik, co sugeruje monodyspersyjny preparat białkowy. Pik wymywa kilka mililitrów po objętości pustki, co wskazuje na niezagregowane rozpuszczalne cząstki peptidisc. Agregaty białkowe będą wymywać się w pustej przestrzeni, podczas gdy nadmiar detergentów i peptydów będzie wymywał się po głównym piku.Zwiększone mycie utworzonych peptydysków, gdy są nadal przyczepione do kulek niklu-NTA, powinno zubożyć ten ostatni pik. Agregaty białkowe są często wynikiem wystawienia białek pamięci na działanie roztworu wolnego od detergentów przed rozpuszczeniem. Ten ostatni chromatogram wykluczający jest przydatną diagnostyką do rozwiązywania problemów z rekonstytucją.Po przetworzeniu danych doświadczalnych do sensogramu dopasowuje się krzywą. Dokładność tego dopasowania ma zasadnicze znaczenie dla obliczenia stałej dysocjacji. Wykres widoku resztkowego opisuje różnicę między danymi eksperymentalnymi a dopasowaniem obliczeniowym.Pokazuje to, że dla czterech różnych stężeń kolumn trzy krzywe dobrze do siebie pasują. Jednak w przypadku najwyższego stężenia krzywa nie zapewnia dobrego dopasowania. Sugeruje to, że przy tym wyższym stężeniu dochodzi do niejednorodnego wiązania kolumny z szpilką.Ten sygnał o najwyższym stężeniu nie jest zatem uwzględniany w analizie kinetycznej zgodnie z notami aplikacyjnymi ForteBio. Pozostałe trzy krzywe są używane do analizy kinetycznej. Stała dysocjacji między FhuA i ColM, wyznaczona metodą BLI i Peptidisc, jest zgodna ze stałymi wyznaczonymi innymi metodami.Kalorymetria izotermiczna i nanodyski oraz termoforeza w mikroskali i Peptidisc dały stałe dysocjacji nie różniące się istotnie od wyznaczonej przez nas wartości. Ta konsystencja potwierdza walidację metody Peptidisc BLI do pomiaru kinetyki oddziaływań. W porządku, więc po obejrzeniu tego filmu mamy nadzieję, że zdobyłeś praktyczne zrozumienie siły i zastrzeżeń metod PeptiQuick.Odkryliśmy, że ta metoda jest szczególnie przydatna do ilościowego określania interakcji FhuA ColM przy całkowitym braku detergentów. Podejrzewamy, że ten sam przepływ pracy można zastosować do scharakteryzowania każdej innej interakcji receptor-ligand. Powodzenia w eksperymentach.

peptiquick-one-step-incorporation-membrane-proteins-into-biotinylated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje biotynylowane peptydy penetrujące komórki do wykrywania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. Peptydy penetrujące komórki ułatwiają sprzężonemu peptydowi wnikanie do komórki i specyficzne wiązanie się z oddziałującymi z nią białkami. Biotyna, po związaniu się z awidyną, umożliwia oczyszczenie kompleksu białek oddziałujących z lizatu komórkowego.

Biotynylowana sonda peptydowa penetrująca komórki do wykrywania interakcji białko-białko

Ten film demonstruje metodę oceny internalizacji docelowego białka w astrocytach korowych myszy za pomocą biotynylacji, a następnie lizy komórek, ekstrakcji białka na bazie streptawidyny, denaturacji i analizy Western blot w celu potwierdzenia udanej internalizacji.

Ocena internalizacji docelowych białek powierzchniowych za pomocą pochodnej biotyny

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

To jest protokół do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko oparty na systemie pull-down biotyna-awidyna z nowością łączenia sekwencji penetrujących komórki. Główną zaletą jest to, że sekwencja docelowa jest inkubowana z żywymi komórkami, a nie z lizatami komórkowymi, a zatem interakcje będą zachodzić w kontekście komórkowym.

Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

System do automatycznej i szybkiej analizy glikanów na białkach został wcześniej opracowany. W artykule przedstawiono protokół "analizy glikojakościowej", zoptymalizowany dla szerokiego spektrum użytkowników, takich jak osoby zajmujące się analizą struktur glikanów w biofarmaceutykach i innych materiałach glikokoniugatowych.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metodę PeptiQuick do jednoczesnej oczyszczania i rekonstytucji białek błonowych z E. coli bez detergentów. Technologia Peptidisc umożliwia stabilizację białek FhuA i analizę ich interakcji z ligandami za pomocą interferometrii biowarstwowej w czasie rzeczywistym.

PeptiQuick, jednoetapowa inkorporacja białek błonowych do biotynylowanych peptydysków w celu usprawnienia testów wiązania białek (Wideo) | JoVE Journal

PeptiQuick, jednoetapowa inkorporacja białek błonowych do biotynylowanych peptydysków w celu usprawnienia testów wiązania białek

Przeglądaj więcej filmów