Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków
18 marca 2020
Ogólnym celem tego protokołu jest instrukcja, jak wydobywać, utrzymywać i oddzielać mysie komórki astrocytów i mikrogleju od ośrodkowego układu nerwowego, a następnie infekować pasożytami pierwotniaków.
Protokół ten opisuje metodę, która koncentruje się na równoległym wyodrębnianiu dwóch najliczniejszych populacji komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju, od myszy po urodzeniu. Nasza metoda różni się od innych wcześniej opisanych protokołów izolacji astrocytów i mikrogleju, ponieważ koncentrujemy się na uzyskaniu i wyizolowaniu obu typów komórek w tej samej ekstrakcji w tym samym stanie, optymalizując w ten sposób wykorzystanie zwierząt doświadczalnych i poprawiając badanie względnych ról tych komórek w kontekstach immunologicznych. Protokół ten może być przydatny do lepszego badania roli mikrogleju i astrocytów w wielu kontekstach i chorobach ośrodkowego układu nerwowego, takich jak choroba Alzheimera, Parkinson i infekcje na przykład pierwotniakami, pasożytami lub wirusami.
Uzyskanie i wyizolowanie obu typów komórek z tej samej ekstrakcji jest pożądane w celu oceny porównawczej roli kontekstów immunologicznych każdego podzbioru komórek, takich jak infekcja lub stan zapalny. Ludzie powinni być ostrożni, zwłaszcza podczas usuwania mózgu i płukania tkanek nerwowych, ale wierzę, że dzięki temu protokołowi i nakręconemu filmowi ludzie nie będą walczyć. Protokół ten może być długi w zależności od liczby zwierząt do ekstrakcji kory, więc przygotuj się na spędzenie około czterech godzin lub więcej.
Pierwszego dnia przygotuj czysty HBSS i HBSS plus 10% inaktywowany termicznie FBS. Przygotuj uzupełniony DMEM F12 i przefiltruj go filtrem 0,22 mikrona. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie i użyj 70% etanolu podczas zabiegu.
Umieść nowonarodzone myszy w szczelnej komorze zawierającej bawełnę nasączoną izofluranem na pięć minut w celu uzyskania głębokiego znieczulenia. Spryskaj szczeniaka myszy 70% etanolem i odetnij zwierzę nożyczkami. Wykonaj strzałkowe cięcie nożyczkami wzdłuż czaszki, aby ją otworzyć i odsłonić mózg.
Usuń mózg za pomocą mikroszpatułki, aby zachować integralność mózgu. Umieść mózg na suchej szalce Petriego o średnicy sześciu centymetrów. Za pomocą mikroszpatułki usuń opuszkę węchową i móżdżek.
Przenieś korę na inną szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry HBSS plus 10% FBS. Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki sterylnymi nożyczkami i za pomocą mikropipety P1000 przenieś każdą tkankę mózgową za pomocą HBSS plus 10% FBS do różnych 15-mililitrowych stożkowych probówek. W razie potrzeby użyj HBSS plus 10% FBS, aby wypełnić końcową objętość do dwóch mililitrów.
Umyj przeciętą tkankę mózgową trzema mililitrami HBSS plus 10% FBS na każdą probówkę. Po dekantacji ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz pranie z HBSS plus 10%FBS jeszcze trzy razy.
Następnie umyj trzema mililitrami czystego HBSS trzy razy. Po dekantacji ostrożnie usunąć supernatant. Następnie dodaj trzy mililitry trypsyny i umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, delikatnie potrząsając probówkami co pięć minut.
To trawi pobraną tkankę. Unikaj bąbelków. Aby dezaktywować trypsynę, przemyj tkankę trzema mililitrami HBSS plus 10% FBS, a po dekantacji tkanki ostrożnie usuń supernatant.
Powtórz to pranie trzy razy. Następnie umyj chusteczkę trzema mililitrami czystego HBSS i powtórz jeszcze dwa razy. Po dekantacji tkanki ostrożnie usunąć supernatant.
Dodać siedem mililitrów czystego HBSS i homogenizować tkankę przez kolejne przejścia w pipetach, najpierw za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, następnie pięciomililitrowej pipety, a na końcu mikropipety P1000. Po homogenizacji odwirować probówki o ciśnieniu 450 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z czterema mililitrami HBSS plus 10% FBS na każdą probówkę.
Przenieś komórki do komercyjnie poddanej obróbce kolby T75 w celu uzyskania optymalnej przyczepności do hodowli komórkowych. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% dwutlenku węgla na 30 minut w celu przylegania. Następnie dodaj 10 mililitrów uzupełnionego DMEM F12 do kolby i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie noce.
Trzeciego dnia usuń siedem mililitrów pożywki hodowlanej z kolby T75 i dodaj siedem mililitrów świeżo uzupełnionego DMEM F12. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Piątego dnia, aby usunąć zanieczyszczenia i nieprzylegające komórki, wymień całą pożywkę z kolby T75 na 14 mililitrów świeżo uzupełnionego DMEM F12.
Następnie co 48 godzin usunąć sześć mililitrów supernatantu i dodać siedem mililitrów świeżo uzupełnionej pożywki DMEM F12 do 14 dnia hodowli. W dniu 14, po usunięciu sześciu mililitrów supernatantu i dodaniu siedmiu mililitrów świeżo uzupełnionej pożywki DMEM F12, szczelnie zamknąć kolby T75 foliowym opakowaniem. Umieść je w podłogowej wytrząsarce orbitalnej przy 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez noc, aby mechanicznie oddzielić mikroglej od astrocytów.
W dniu 15 należy wyjąć kolby z wytrząsarki i energicznie umyć je ich własnym podłożem, aby zoptymalizować dysocjację komórek i zebrać maksymalną liczbę mikrogleju. Następnie zebrać supernatant i przenieść go do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj cztery mililitry trypsyny do każdej kolby i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu odłączenia astrocytów.
Następnie dodaj pięć mililitrów uzupełnionego DMEM F12, aby dezaktywować trypsynę. Umyć kolby ich własnym podłożem i przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować wszystkie probówki zawierające zdysocjowany mikroglej lub astrocyty pod ciśnieniem 450 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad mikrogleju w jednym mililitrze uzupełnionego DMEM F12, a astrocyty w 10 mililitrach uzupełnionego DMEM F12. Przejdź do zliczania komórek w komorze Neubauera lub automatycznym liczniku komórek.
Pokryj komórki uzupełnionym DMEM F12 o pożądanej gęstości na wstępnie poddanej obróbce płytce do hodowli komórek z płaskim dnem. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny, aby umożliwić im przyczepienie się. W 14 dobie hodowla komórek glejowych została poddana mechanicznej dysocjacji.
Zaobserwowano go z czystością 89,5% dla populacji astrocytów i 96,6% dla populacji mikrogleju. Astrocyty i mikroglej myszy C57BL6 zostały zakażone T.cruzi Y. Po dwóch godzinach, 48 godzinach i 96 godzinach komory utrwalono metanolem i wybarwiono markerem nukleazy komórkowej DAPI i anty-GFAP. Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych pasożytów wykazujących ekspresję fluorescencyjnych reporterów lub pasożytów znakowanych specyficznymi przeciwciałami fluorescencyjnymi poprawiło mikroskopię immunofluorescencyjną, ponieważ można je lepiej odróżnić od jądra komórkowego.
Poniżej przedstawiono dwa przykłady. Szczep T.gondii RH konstytutywnie eksprymujący YFP i szczep T.cruzi Y barwiony niekomercyjnym białkiem anty-SSP4 przeciwciała monoklonalnego 2C2. Ważne jest, aby dokładnie umyć komórki, aby nie stracić żadnych agregatów komórkowych.
Po zakażeniu komórek glejowych można ocenić inne parametry, takie jak ELISA dla produkcji cytokin obecnych w supernatancie, Western blot dla ekspresji białka i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym dla oceny transkrypcji RNA. Wiele pytań związanych z funkcją komórek glejowych, na przykład ich metabolizmem, odpowiedzią immunologiczną i samą biologią komórki, można rozwiązać i odnieść korzyści dzięki tej technice. Wszystkie pasożyty pierwotniaków są w stanie infekować komórki ludzkie, a także hodować komórki myszy, dlatego ważne jest, aby zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tym pasożytem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół równoległej izolacji, hodowli i zakażania pierwotnych astrocytów i mikrogleju mysiego z kory mózgu noworodków myszy. Metoda ta umożliwia badaczom uzyskanie obu typów komórek glejowych z tej samej izolacji, co ułatwia badania porównawcze ich roli w infekcjach ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w szczególności w przypadku pasożytów pierwotniakowych, takich jak Trypanosoma cruzi i Toxoplasma gondii. Protokół obejmuje etapy izolacji komórek, prowadzenia hodowli, fenotypowania, zakażania oraz analizy stopnia zakażenia przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuroimmunologia
- Biologia komórki
- Parazytologia
Wstęp
- Astrocyty i mikroglej to najliczniejsze komórki glejowe w OUN, niezbędne dla wsparcia fizjologicznego i homeostazy.
- Oba typy komórek odgrywają istotną rolę w odpowiedzi immunologicznej na infekcje OUN.
- Konieczne jest opracowanie ulepszonych metod izolacji i badania tych komórek, aby lepiej zrozumieć ich reakcje na patogeny.
- Infekcje pierwotniakami, takie jak wywoływane przez T. cruzi i T. gondii, mogą znacząco wpływać na funkcje OUN.
Cel badania
- Aby dostarczyć powtarzalny i wydajny protokół jednoczesnej ekstrakcji i hodowli astrocytów oraz mikrogleju z kory mózgu myszy.
- Aby umożliwić badania porównawcze odpowiedzi komórek glejowych na infekcje pierwotniakami.
- Aby ułatwić dalsze analizy funkcji komórek glejowych podczas infekcji.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja kory mózgowej od noworodków myszy w warunkach sterylnych.
- Dysocjacja enzymatyczna i mechaniczna tkanki mózgowej w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek.
- Hodowla in vitro komórek glejowych z okresową wymianą pożywki przez 14 dni.
- Dysocjacja mechaniczna w celu oddzielenia mikrogleju od astrocytów.
- Fenotypowanie populacji komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej.
- Zakażanie hodowlanych komórek pasożytami T. cruzi i T. gondii.
- Ocena wskaźników zakażenia przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z zastosowaniem pasożytów modyfikowanych genetycznie lub znakowanych przeciwciałami.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na uzyskanie populacji o wysokiej czystości: około 89,5% astrocytów i 96,6% mikrogleju.
- Oba typy komórek mogą zostać efektywnie zainfekowane pierwotniakami in vitro.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wyraźną wizualizację i kwantyfikację wskaźników infekcji w wielu punktach czasowych.
- Metoda ta umożliwia dodatkowe analizy, takie jak ELISA, Western blotting i qPCR w badaniach funkcjonalnych.
Wnioski
- Niniejszy protokół zapewnia prostą, kosztowo efektywną i wydajną metodę izolacji oraz badania pierwotnych astrocytów i mikrogleju mysiego.
- Umożliwia on bezpośrednie porównanie odpowiedzi komórek glejowych na infekcje OUN.
- Technika ta otwiera nowe możliwości badań neuroimmunologicznych nad funkcją komórek glejowych podczas infekcji i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczym z obszaru biofarmacji jednoczesną izolację pierwotnych astrocytów i mikrogleju z kory mózgu myszy, co wspiera porównawczą analizę komórek glejowych w modelach infekcji OUN. Poprzez optymalizację wykorzystania zwierząt oraz zapewnienie standaryzowanego schematu postępowania w zakresie fenotypowania i zakażania, metoda ta usprawnia walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w badaniach nad neuroimmunologią i chorobami zakaźnymi. Podejście to wspiera wczesne etapy poszukiwań koncentrujące się na glejowej kontroli patogenów oraz oddziaływaniach gospodarz-patogen.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceuticals
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie odpowiedzi komórek glejowych na pierwotniaki, takie jak T. cruzi i T. gondii, w celu wyjaśnienia mechanizmów patogennych w infekcjach OUN.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez umożliwienie bezpośredniego porównania wskaźników infekcji oraz kontroli pasożytów w astrocytach i mikrogleju.
- Pewność predykcyjna: Ułatwia fenotypowy screening odpowiedzi immunologicznych pośredniczonych przez glej, co pozwala na zmniejszenie ryzyka w programach badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi i zakaźnymi.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie oczyszczonych populacji komórek glejowych z czystością astrocytów >89% i mikrogleju >96%, co umożliwia przeprowadzanie powtarzalnych testów infekcyjnych.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia ilościowe określenie wskaźnika infekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w wielu punktach czasowych w celu przeprowadzenia analizy zależnej od dawki i czasu.
- Skalowalność: Wykorzystuje standardowy sprzęt i odczynniki do hodowli komórkowych, co pozwala na adaptację do formatów wielodołkowych w celu przesiewania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: dostarcza mysi model komórek glejowych do badania infekcji pierwotniakami istotnych dla OUN, o znaczeniu translacyjnym dla ludzkich stanów zapalnych układu nerwowego.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: umożliwia ocenę udziału gleju w usuwaniu patogenów, wspierając odkrywanie biomarkerów i analizę szlaków sygnałowych.
- Ciągłość przedkliniczna: pozwala na podłużne monitorowanie infekcji od 2 do 96 godzin, co jest zgodne z oknami oceny przedklinicznej kandydatów na leki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych (discovery workflows), dostarczając zwalidowane komórki glejne do modelowania infekcji, opracowywania testów analitycznych oraz badań mechanistycznych przed etapem optymalizacji wiodących kandydatów na leki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących specyficznych ról komórek glejowych w inwazji i replikacji patogenów w obrębie OUN.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowane, sfenyotypowane komórki glejowe gotowe do testów infekcyjnych z użyciem pasożytów znakowanych fluorescencyjnie lub przeciwciałami.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar wskaźnika infekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz późniejszą analizę ekspresji cytokin, białek i RNA.
- Badania translacyjne: Łączy odpowiedzi infekcyjne gleju z szerszymi mechanizmami neuroimmunologicznymi istotnymi dla przedklinicznych modeli chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną platformę izolacji komórek glejowych, którą można zastosować w programach badawczych nad chorobami wirusowymi, pasożytniczymi i neurodegeneracyjnymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w funkcji komórek glejowych podczas infekcji, umożliwiając bezpośrednie porównanie astrocytów i mikrogleju z tego samego zwierzęcia.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki ujednoliconemu protokołowi ekstrakcji, który minimalizuje zmienność międzyosobniczą.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go), dostarczając wczesnych danych prognostycznych na temat kontroli patogenów pośredniczonej przez glej w modelach infekcji OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w oparciu o analizę ryzyka, bazując na odpowiedzi komórek glejowych na wyzwanie pierwotniakami.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie aseptycznej dyssekcji tkanek, trawienia enzymatycznego oraz technik mechanicznej dysocjacji.
- Zależne od dostępu do wirówek, inkubatorów, wytrząsarek orbitalnych oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny infekcji.
- Wymaga standaryzacji wymian pożywek, etapów płukania oraz czasu dysocjacji pomiędzy partiami w celu uzyskania powtarzalnej wydajności komórek glejowych.
- Wiąże się z koniecznością adaptacji protokołu przy rozszerzaniu go na inne podtypy gleju lub modele chorób poza infekcjami pierwotniakami.
- Ograniczone przez 14-dniowy cykl hodowli oraz etap mechanicznej dysocjacji, co może wpływać na skalowalność w zastosowaniach wysokoprzepustowych.
