Name: Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnej izolacji pierwotnych astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej myszy noworodkowej. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi komórek glejowych na zakażenia pierwotniakami w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować profesorowi Dr. Renato A. Mortara z Uniwersytetu Federalnego w São Paulo (UNIFESP) za mAb 2C2 anty-Ssp-4. Prace te były wspierane przez granty z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, grant 2017/25942-0 dla K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, grant 402100/2016-6 dla K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior ( CAPES, kod finansowy 001). M.P.A. otrzymuje stypendium od CNPq, A.L.O.P. otrzymuje stypendium od CAPES, a I.S.F i L.Z.M.F.B. otrzymują stypendium od FAPESP.

Wszystkie procedury eksperymentalne na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z brazylijskim prawem krajowym (11.794/2008) i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Federalnego w São Paulo (UNIFESP).
1. Ekstrakcja, utrzymanie i dysocjacja komórek glejowych
UWAGA: Liczba myszy użytych do ekstrakcji komórek glejowych zależy od ilości komórek potrzebnych do przeprowadzenia pożądanych eksperymentów. W tym protokole uzyskano łącznie 2,7 x 107 astrocytów i 4 x 106 mikrogleju od sześciu nowonarodzonych myszy C57BL / 6. Wszystkie zabiegi zostały wykonane w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego II klasy.
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Przygotuj czysty zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) i HBSS + 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przygotować uzupełnioną pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM penicylina + 0,09 mM Streptomycyna + 12,5 mM HEPES + 30 mM wodorowęglan sodu, pH 7,2) i przefiltrować filtrem 0,22 μm (patrz Tabela Materiałów). 
		UWAGA: Wszystkie pożywki hodowlane powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C, ale konieczne jest ich wstępne podgrzanie w temperaturze 37 °C przez 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
		<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (nożyczki, szpatułkę i pęsetę) w autoklawie i użyj 70% etanolu podczas zabiegu.</li>
		<li>Umieść nowonarodzone (do 3 dni) myszy w szczelnej komorze zawierającej bawełnę nasączoną izofluranem na 5 minut w celu głębokiego znieczulenia.</li>
		<li>Spryskaj szczeniaka myszy 70% etanolem i odetnij zwierzę nożyczkami.</li>
		<li>Wykonaj cięcie strzałkowe (od tyłu do przodu) nożyczkami wzdłuż czaszki, aby ją otworzyć i odsłonić mózg. Oddziel czaszkę od mózgu za pomocą pęsety. Usuń mózg za pomocą mikroszpatułki, aby zachować integralność mózgu.</li>
		<li>Umieść mózg na suchej szalce Petriego (o średnicy 6 cm). Usuń opuszkę węchową i móżdżek za pomocą mikroszpatułki. Przenieś korę na inną szalkę Petriego (6 cm średnicy) zawierającą HBSS + 10% FBS (2 ml/szalkę Petriego).</li>
		<li>Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki sterylnymi nożyczkami i za pomocą mikropipety p1000 przenieś każdą tkankę mózgową za pomocą HBSS + 10% FBS do różnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Upewnij się, że ostateczna objętość wynosi 2 ml/probówkę. Jeśli nie, w komplecie z HBSS + 10% FBS. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Jeśli tak, stożkowe rurki z tkanką OUN należy umieścić na lodzie do 1 godziny.</li>
		<li>Przemyć przeciętą tkankę mózgową 3 ml HBSS + 10% FBS (na probówkę) i po dekantacji. Ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok 3 razy. 
		UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie zanieczyszczeń i odzyskanie pobranej tkanki.</li>
		<li>Przeciąć tkankę mózgową 3 ml czystego HBSS (na probówkę) i po dekantacji ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok 3 razy. 
		UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie pozostałej surowicy z poprzednich prań, ponieważ w następnym kroku komórki zostaną wytrypsynizowane.</li>
		<li>Dodać 3 ml trypsyny do probówki i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut, delikatnie potrząsając probówkami co 5 minut. Unikaj pęcherzyków, odwracając lub gwałtownie mieszając probówki. 
		UWAGA: Ten etap ma na celu strawienie pobranej tkanki.</li>
		<li>Aby dezaktywować trypsynę, przemyj tkankę 3 ml na probówkę HBSS + 10% FBS i po dekantacji tkanki ostrożnie usuń supernatant. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
		<li>Przemyć tkankę 3 ml na probówkę czystego HBSS i ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
		<li>Dodać 7 ml do probówki czystego HBSS i homogenizować tkankę przez kolejne przejścia w pipetach: najpierw za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, następnie pipety o pojemności 5 ml, a na końcu za pomocą mikropipety p1000.</li>
		<li>Po homogenizacji probówki wirować o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 4 ml HBSS + 10% FBS na probówkę.</li>
		<li>Przenieść komórki do wstępnie poddanej obróbce kolby T-75 w celu uzyskania optymalnej adhezji kultur komórkowych (patrz Tabela Materiałów). 
		UWAGA: Przetwarzaj tkankę z każdego zwierzęcia na kolbę.</li>
		<li>Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut w celu zachowania zaleceń lekarskich.</li>
		<li>Dodać 10 ml uzupełnionego DMEM/F12 na kolbę i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
		UWAGA: Ostateczna objętość wynosi 14 ml na kolbę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Usunąć 7 ml pożywki hodowlanej z kolby T-75 i dodać 7 ml świeżo uzupełnionego DMEM/F12. 
		UWAGA: Kolby będą zawierały dużo zanieczyszczeń komórkowych i będą miały mętny wygląd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5
	<ol>
		<li>Usunąć całą pożywkę z kolby T-75 i dodać 14 ml świeżego suplementu DMEM/F12. 
		UWAGA: Pożywka jest zastępowana z kolb w celu usunięcia zanieczyszczeń i nieprzylegających komórek.</li>
		<li>Po każdych 48 godzinach usunąć 6 ml supernatantu i dodać 7 ml świeżo uzupełnionej pożywki DMEM/F12 do 14 dnia hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 14
	<ol>
		<li>Po usunięciu 6 ml supernatantu i dodaniu 7 ml świeżo uzupełnionej pożywki DMEM/F12, szczelnie zamknąć kolby T-75.</li>
		<li>Umieść je w podłogowej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min i 37 °C na noc, aby mechanicznie oddzielić mikroglej od astrocytów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 15
	<ol>
		<li>Wyjmij kolby z wytrząsarki i energicznie umyj je ich własnym podłożem, aby zoptymalizować dysocjację komórek i zebrać maksymalną liczbę mikrogleju. Następnie zebrać supernatant (zawierający mikroglej) i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Następnie dodać 4 ml trypsyny do każdej kolby i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia astrocytów.</li>
		<li>Dodać 5 ml na kolbę uzupełnionego DMEM/F12, aby dezaktywować trypsynę. Umyć kolby ich własnym podłożem i przenieść ich zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odwirować wszystkie probówki zawierające zdysocjowany mikroglej i astrocyty w temperaturze 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant. Zawiesić osad mikrogleju w 1 ml, a astrocyty w 10 ml uzupełnionego DMEM/F12.</li>
		<li>Przejdź do zliczania komórek w komorze Neubauera lub automatycznym liczniku komórek. Pokryć komórki uzupełnionym DMEM/F12 o pożądanej gęstości na odpowiedniej płytce do hodowli komórek z płaskim dnem (wstępnie poddanej obróbce w celu optymalnego przyłączenia komórek; patrz Tabela materiałów). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny, aby umożliwić im przyłączenie. 
		UWAGA: Zarezerwuj 1,5 x 106 każdej populacji komórek, aby potwierdzić ich czystość za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Wykonaj analizę cytometrii przepływowej, aby zweryfikować czystość populacji komórek. 
		UWAGA: Bierzemy pod uwagę mikroglej CD11b+/CD45+/GFAP- i astrocyty CD11b-/CD45-/GFAP+. Barwienie Iba1 i TMEM119 może być brane pod uwagę w celu pełnego scharakteryzowania mikrogleju22.</li>
		<li>Dodaj FMO (Fluorescence Minus One)23 i niebarwioną próbkę dla każdej populacji komórek (astrocytów i mikrogleju) jako kontrole testu cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Dla każdej populacji komórek należy zarezerwować 5 x 105 komórek dla każdej barwionej i niebarwionej próbki. W przypadku FMO zarezerwuj dwie inne probówki mikrogleju zawierające 2,5 x 105 komórek każda, a także zarezerwuj kolejną probówkę z 5 x 105 astrocytów. 
		UWAGA: Ponieważ liczba mikrogleju może być czynnikiem ograniczającym, możliwe jest użycie mniejszej liczby komórek do kontroli niebarwionych i FMO.</li>
		<li>Odwirować wszystkie mikroprobówki o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 500 μl/mikroprobówkę buforu FACS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7,2).</li>
		<li>Odwirować wszystkie mikroprobówki o sile 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ze 100 μl/mikroprobówkę anty-CD16/CD32 (klon 93) (1:50) rozcieńczoną w buforze FACS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 500 μl/mikroprobówkę buforu FACS do wszystkich mikroprobówek i odwirować przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić probówki do barwienia astrocytów i mikrogleju, a także probówkę FMO astrocytów z mieszanką 50 μl / mikroprobówkę markerów powierzchniowych: anty-CD45 (PE, klon 30-F11) i anty-CD11b (eFluor 450, klon M1/70) (oba rozcieńczone w stosunku 1: 100 w buforze FACS).</li>
		<li>W przypadku komórek niebarwionych należy ponownie zawiesić z tą samą objętością bufora FACS. W przypadku FMO mikrogleju inkubuj każdą probówkę mikrogleju z anty-CD45 lub anty-CD11b. Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu FACS na mikroprobówkę. Wirować przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ze 100 μl/mikroprobówkę buforu utrwalającego (patrz tabela materiałów) przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Dodać 500 μl/mikroprobówkę buforu permeabilacyjnego 1x (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut w ciemności.</li>
		<li>Odwirować wszystkie mikroprobówki o sile 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić astrocyty i probówki do barwienia mikrogleju, a także probówki FMO mikrogleju z 50 μl / mikroprobówkę wewnątrzkomórkowego przeciwciała anty-GFAP (APC, klon GA5) w rozcieńczeniu 1:100 w 1x buforze permeabilizacji. W przypadku komórek niebarwionych i FMO astrocytów należy ponownie zawiesić komórki z tą samą objętością buforu FACS. Wszystkie próbki inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.</li>
		<li>Umyj wszystkie probówki, dodając 500 μl/mikroprobówkę 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować wszystkie mikroprobówki o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić każdą mikroprobówkę w 200 μl buforu FACS. Pobrać 1 x 105 zdarzeń/próbkę na cytometrze przepływowym.</li>
		<li>Do analizy komórki muszą być najpierw bramkowane na CD11b x CD45, a następnie na histogramie GFAP. 
		UWAGA: Kontrolki niebarwione i FMO są przydatne do określania bramek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zakażenie i ocena wskaźników infekcji
<ol>
	<li>Zakażenie komórek glejowych T. gondii
	<ol>
		<li>Płytka 3 x 104 mikroglej lub astrocyty z uzupełnionym DMEM/F12 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny na wstępnie poddanej 96-dołkowej płaskiej płytce (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Zakażon każdą populację komórek tachyzoitami ze szczepu T. gondii RH wykazującego ekspresję białka żółtej fluorescencji (YFP) przy wielokrotności infekcji (MOI) 1:1 (pasożyt: komórka) rozcieńczonej w 200 μl / studzienkę uzupełnionego RPMI (3% FBS + 0,16 mM penicylina + 0,18 mM Streptomycyna + 12,5 mM HEPES + 30 mM wodorowęglan sodu, pH 7,2) (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
		<li>Następnie odrzucić supernatant i utrwalić komórki, dodając 100 μl/basenik 1% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w PBS w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Zastąp PFA 100 μl/studzienkę PBS o pH 7,2.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i jądra komórek barwiących, pipetując 50 μl/studzienkę DAPI (5 mg/ml) rozcieńczonego w PBS pH 7,2 (1:1,000) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Zastąp roztwór barwiący DAPI 100 μl/studzienkę PBS (pH 7,2) i przeanalizuj go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie komórek glejowych T. cruzi
	<ol>
		<li>Płytka 3 x 104 mikroglej lub astrocyty z uzupełnionym DMEM/F12 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny na wstępnie poddanej 96-dołkowej płaskiej płytce (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Dla każdego punktu infekcji użyj innej płytki.</li>
		<li>Zakażone komórki glejowe trypomastigotami ze szczepu T. cruzi Y przy MOI 5:1 (pasożyty:komórka) rozcieńczone w 200 μl / studzienka uzupełnionego RPMI i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny 
		UWAGA: Ten krok jest ważny dla inwazji pasożyta na komórki.</li>
		<li>Usuń cały supernatant i umyj studzienki, dodając 200 μl / studzienkę uzupełnionego RPMI w celu usunięcia wszystkich pasożytów zewnątrzkomórkowych. Usunąć supernatant i dodać 200 μl/studzienkę świeżo uzupełnionego RPMI. 
		UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie wszystkich pasożytów, które nie zaatakowały przylegających komórek.</li>
		<li>Inkubuj zakażone komórki przez 2 godziny, 48 godzin i 96 godzin, aby ocenić replikację T. cruzi w komórkach glejowych11.</li>
		<li>Po każdym punkcie czasowym usunąć supernatant i utrwalić komórki za pomocą 100 μl/basenik metanolu przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zastąpić metanol 100 μl/basenik PBS (pH 7,2).</li>
		<li>Po utrwaleniu przygotuj komórki do testu immunofluorescencyjnego w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Aby uniknąć autofluorescencji, należy potraktować komórki 100 μl/basenik 50 mM NH4Cl rozcieńczonego w PBS (pH 8,0) przez 15 minut. Umyj komórki, dodając 100 μl / studzienkę PBS i natychmiast usuń (powtórz ten krok 3 razy).</li>
			<li>Następnie przepłucz komórki, dodając 100 μl/basenik 0,5% Tritona rozcieńczonego w PBS przez 15 minut. Umyj komórki, dodając 100 μL/studzienkę PBS i natychmiast go usuń (powtórz ten krok 3 razy).</li>
			<li>Następnie inkubować kulturę komórkową ze 100 μl/basenik roztworu blokującego (5% mleka beztłuszczowego + 2% BSA rozcieńczonego w PBS [pH 7,2]) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj komórki, dodając 100 μl/studzienkę PBS i natychmiast je usuń (powtórz ten krok 3 razy).</li>
			<li>W celu barwienia amastigotów inkubować z 30 μl/basenik niekomercyjnego przeciwciała monoklonalnego (mAb) białka anty-Ssp-4 2C2 (1:200) rozcieńczonego w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Umyj komórki, dodając 100 μl/studzienkę PBS i natychmiast je usuń (powtórz ten krok 3 razy). Inkubować płytkę z 30 μl/basenik drugorzędowego przeciwciała anty-mysiego (1:500) rozcieńczonego w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
			UWAGA: Niekomercyjne białko mAb 2C2 anty-Ssp-4 było miłym prezentem od prof. dr Renato A. Mortara z Wydziału Mikrobiologii, Immunologii i Parazytologii Uniwersytetu Federalnego w São Paulo.</li>
			<li>Ostrożnie usunąć supernatant i jądra barwienia, dodając 50 μl/studzienkę DAPI (5 mg/ml) rozcieńczonego w PBS pH 7,2 (1:1,000) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
			<li>Zastąp roztwór barwiący DAPI 100 μl/studzienkę PBS pH 7,2 i przeanalizuj go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia%2Fneuron+ratio%3A+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li>
<li>Jäkel, S., Dimou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Cells+and+Their+Function+in+the+Adult+Brain%3A+A+Journey+through+the+History+of+Their+Ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40 (2), 133-139 (2002).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVirchow%2C+R+%22Verlag+von+August+Hirschfeld%2C+Berlin%22">Verlag von August Hirschfeld, Berlin</a>. , (1858).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Samartino, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+abortus+induces+the+secretion+of+proinflammatory+mediators+from+glial+cells+leading+to+astrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).</li>
<li>Jamilloux, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome+activation+restricts+Legionella+pneumophila+replication+in+primary+microglial+cells+through+flagellin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection.</a> Glia. 61 (4), 539-549 (2013).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Pacheco, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impairment+in+the+NLRP3-induced+NO+secretion+renders+astrocytes+highly+permissive+to+T.+cruzi+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication.</a> Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).</li>
<li>Lian, H., Roy, E., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Primary+Microglial+Culture+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for Primary Microglial Culture Preparation.</a> Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).</li>
<li>Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+in+primary+rat+CNS+cells%3A+Differential+contribution+of+neurons%2C+astrocytes%2C+and+microglial+cells+for+the+intracerebral+development+and+stage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation.</a> Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Chagas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nova+tripanozomiaze+humana%3A+estudos+sobre+a+morfolojia+e+o+ciclo+evolutivo+do+Schizotrypanum+cruzi+n.+gen.%2C+n.+sp.%2C+ajente+etiolojico+de+nova+entidade+morbida+do+homem%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).</li>
<li>Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic+manifestations+of+the+neglected+tropical+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases.</a> Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).</li>
<li>Jones, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+encephalitis+in+HIV-infected+persons%3A+risk+factors+and+trends.+The+Adult%2FAdolescent+Spectrum+of+Disease+Group%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group.</a> AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).</li>
<li>Luft, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+Encephalitis+in+Patients+with+the+Acquired+Immunodeficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).</li>
<li>Madalosso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagasic+meningoencephalitis%3A+Case+report+of+a+recently+included+AIDS-defining+illness+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+do+Instituto+de+Medicina+Tropical+de+Sao+Paulo%22%5BJournal%5D)">Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil.</a> Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).</li>
<li>Rocha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+patients+with+Chagas%E2%80%99+disease+and+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).</li>
<li>Yasukawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+report%3A+Trypanosoma+cruzi+meningoencephalitis+in+a+patient+with+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Compensation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).</li>
<li>Silva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+astrocytes+with+TNF+enhances+their+susceptibility+to+Trypanosoma+cruzi+infection+and+creates+a+self-sustaining+inflammatory+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honeybee+retinal+glial+cells+transform+glucose+and+supply+the+neurons+with+metabolic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).</li>
<li>Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-site+energy+supply+at+synapses+through+monocarboxylate+transporters+maintains+excitatory+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).</li>
<li>Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+astrogliosis+in+the+mouse+hypothalamus+in+response+to+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).</li>
<li>Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+role+of+astrocytes+in+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The active role of astrocytes in synaptic transmission.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).</li>
<li>Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathophysiological+Role+of+Microglia+in+Dynamic+Surveillance%2C+Phagocytosis+and+Structural+Remodeling+of+the+Developing+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191(2017).</li>
<li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+refined+CD11b+magnetic+isolation+of+primary+microglia+with+enhanced+purity+and+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55364(2017).</li>
<li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3814(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie badania funkcji izolowanych komórek glejowych w różnych kontekstach biologicznych rośnie w ciągu ostatnich dwóch dekad. Zrozumienie OUN poza neuronami jest wciąż rozwijającą się dziedziną w biologii komórki, zwłaszcza w przypadku infekcji lub stanów zapalnych 8,9,24. Komórki glejowe mają kluczowe znaczenie nie tylko dla fizycznego wsparcia neuronów (jak to było wcześniej znane), ale także w wielu innych sytuacjach fizj...

OUN składa się głównie z neuronów i komórek glejowych1,2,3. Mikroglej i astrocyty są najliczniejszymi komórkami glejowymi w OUN. Mikroglej, makrofag rezydentny, jest immunokompetentną i fagocytarną komórką glejową w klasie CNS3,4, podczas gdy astrocyty są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy i pełnią funkcje wspomagające5.
Pomimo tego, że komórki glejowe są klasycznie znane jako odpowiedzialne za wsparcie i ochronę neuronów6,7, pojawiające się funkcje tych komórek zostały opisane w najnowszej literaturze, w tym ich reakcje na infekcje8,9,10,11. W związku z tym istnieje nacisk na opracowanie metod izolowania tych komórek glejowych, aby zrozumieć ich indywidualne funkcje.
Istnieją alternatywne modele do badania komórek glejowych zamiast pierwotnych hodowli, takie jak unieśmiertelnione linie komórkowe i modele in vivo. Jednak unieśmiertelnione komórki są bardziej podatne na dryfowanie genetyczne i zmiany morfologiczne, podczas gdy badania in vivo narzucają ograniczone warunki manipulacji. I odwrotnie, hodowle pierwotne są łatwe w obsłudze, lepiej przypominają komórki in vivo, a także pozwalają nam kontrolować czynniki eksperymentalne12,13. W tym miejscu opisujemy wytyczne dotyczące ekstrakcji, utrzymywania i dysocjacji mysich astrocytów i pierwotnych komórek mikrogleju w tym samym protokole. Ponadto podajemy również przykłady, jak pracować z zakażeniem pierwotniakami w tych kulturach.
Komórki OUN pobrane od noworodków myszy (do 3 dni) były hodowane przez 14 dni na pożywkach różnicowych, które pozwalają na preferencyjny wzrost astrocytów i komórek mikrogleju. Ponieważ mikroglej spoczywa nad przyłączonymi astrocytami, populacje komórek zostały mechanicznie zdysocjowane w inkubatorze orbitalnym. Następnie zebraliśmy cały supernatant zawierający mikroglej i dodaliśmy trypsynę, aby odłączyć astrocyty. Wyizolowane komórki glejowe oceniono fenotypowo za pomocą cytometrii przepływowej i posiano zgodnie z pożądanym eksperymentem.
Dostarczyliśmy również przykłady, jak zainfekować te izolowane mikroglej i astrocyty pasożytami pierwotniaków. T. gondii jest wysoce neurotropowym pierwotniakiem odpowiedzialnym za toksoplazmozę14, podczas gdy T. cruzi jest odpowiedzialny za chorobę Chagasa, która może prowadzić do rozwoju zaburzeń neurologicznych w klasie CNS<sup="xref">15,16. Ponadto donoszono również, że zakażenie T. gondii17,18 lub T. cruzi19,20,21 były przypuszczalną przyczyną zgonu pacjentów z obniżoną odpornością. Dlatego wyjaśnienie immunologicznej roli komórek glejowych z OUN w zwalczaniu zakażeń pierwotniakami ma ogromne znaczenie.

<table><tbody><tr><td>70% etanolu</td><td>Din&acirc; mika Qu&iacute; mika Współczesna&acirc; nea</td><td>Kot: 2231</td><td>Sterylizuj</td></tr><tr><td>75 cm2 Kolba</td><td>Corning</td><td>Nr kat.: 430720U</td><td>Tworzywo sztuczne</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Nr kat.: 655090</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Din&acirc; mika Qu&iacute; mika Współczesna&acirc; nea</td><td>Kot: C10337.01.AH</td><td>Usuń autofluorescencyjne</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GFAP</td><td>Abcam</td><td>Nr kat.: ab49874</td> Filtr butelkowy <td>przeciw immunofluorescencji</td></tr><tr><td>0,22 i mu; mm CA</td><td>Corning</td><td>Cat: 430513</td><td>Filtr pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich Kot</td><td>: A7906</td><td>FACS Przygotowanie buforu</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Kat.: 553310</td><td>Przeciwciało cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Kat.: 12-0451-83</td><td>Wirówka z przeciwciałami cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf Nr</td><td>kat.: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Wirówka</td></tr><tr><td>Klasa II Komora bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego do procedur sterylnych</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 3110</td><td>Konserwacja komórek pierwotnych</td></tr><tr><td>Rurki stożkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>Kot: 430766</td><td>Tworzywo sztuczne</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Corning</td><td>Kat: 352070</td><td>Tworzywo sztuczne</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>Nr kat.: C10281</td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Kat.: D1306</td><td>Antidoby immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Aparat do mikroskopu cyfrowego</td><td>Nikon</td><td>Nr kat.: DS-RI1</td><td>Rejestruj obrazy pod mikroskopem</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Kot: 12800-058</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Kot: E9884</td><td>FACS Przygotowanie buforu</td></tr><tr><td>F12 Mieszanka składników odżywczych</td><td>Kot Gibco</td><td>: 21700-026</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>Niedostępny</td><td>cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>LGC Biotechnology</td><td>Kot: 10-bio500-1</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Flow Jo (oprogramowanie)</td><td>Flow Jo</td><td>Wersja: Flow Jo_9.9.4</td><td>Analiza danych</td></tr><tr><td>Intensywne światło fluorescencyjne</td><td>Nikon</td><td>Kat: C-HGFI</td><td>Źródło fluorescencji</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Kat.: 50-9892-82</td><td>Przeciwciało cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Koza - anty-mysie IgG (FITC)</td><td>Kirkeegood& Perry Lab (KPL)</td><td>Kat.: 172-1806</td><td>Antydoby immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>HBSS - Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Kot</td><td>Kot: 14175079</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Kot: H4034</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Bufor utrwalający IC</td><td>Invitrogen</td><td>Nr kat.: 00-8222-49</td><td>Utrwalanie komórek do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Model: Mikroskop ECLIPSE TS100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Crist&aaacute; lia</td><td>Kot: 21.2665</td><td>Wziewny środek znieczulający</td></tr><tr><td>Syntezator</td><td>metanolu</td><td>Kot: 01A1085.01.BJ</td><td>Utrwalenie do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>ABC nierdzewna</td><td>Niedostępny</td><td>Materiał chirurgiczny</td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>Kot: MCT-150-C</td><td>Tworzywo sztuczne</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne (mAb) 2C2 anty-Ssp-4</td><td>Niekomercyjne</td><td>Niekomercyjne</td><td>Antydoby immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (p200)</td><td>Corning</td><td>Cat: 751630124</td><td>Odczynniki do pipet</td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>Version 4.0</td><td>Pozyskiwanie i analizowanie obrazów</td></tr><tr><td>Mleko beztłuszczowe</td><td>Nestl&eacute;</td><td>Kategoria: 9442405</td><td>Roztwór blokujący do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką orbitalną</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 481 Kategoria: 11</td><td>Dysocjacja mikrogleju od astrocytów</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Kot: P6148</td><td>Utrwalenie do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Niekomercyjne</td><td>Niekomercyjne</td><td>neutralne buforowanie</td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Kot: P-7794</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Suplement Bufor przepuszczalny (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Kot: 00-8333-56</td><td>Przepuszczalność komórek do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>szalka Petriego 60 mm x 15 mm (jednorazowa, sterylna)</td><td>Prolab</td><td>Nr kat.: 0303-8</td><td>Miernik pH z tworzywa</td></tr><tr><td></td><td>sztucznego Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>Kalibruj roztwór pH</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni</td><td>Gibco</td><td>Nr kat.: 31800-014</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>ABC nierdzewne</td><td>Nr kat.: LO9-W4</td><td>Materiał chirurgiczny</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Corning</td><td>Nr kat.: 4101</td><td>Tworzywo sztuczne</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 5 ml</td><td>Corning</td><td>Nr kat.: 4051</td><td>Tworzywo sztuczne</td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Kot: F123602</td><td>Odczynniki do pipet</td></tr><tr><td>Pojedynczy Pipeta kanałowa (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Kat: F123601</td><td>Odczynniki do pipet</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Kot: S6297</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>Aldrich Kot: S9137</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Kot: T9284</td><td>Przepuszczalność do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>Kot: 27250-018</td><td>Pęseta enzymów trawiennych</td></tr><tr><td></td><td>ABC nierdzewna</td><td>Kat: L28-P4-172</td><td>Materiał chirurgiczny</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Novatecnica</td><td>Model: 09020095</td><td>Trawić tkankę w temperaturze 37 & stopni; C z trypsyną</td></tr></tbody></table>

jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocyty i mikroglej to najliczniejsze komórki glejowe. Odpowiadają za wsparcie fizjologiczne i utrzymanie homeostazy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Coraz więcej dowodów na ich udział w zwalczaniu chorób zakaźnych uzasadnia rosnące zainteresowanie udoskonaleniem metodologii izolacji pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu oceny ich odpowiedzi na infekcje wpływające na OUN. Biorąc pod uwagę wpływ zakażenia Trypanosoma cruzi (T. cruzi) i Toxoplasma gondii (T. gondii) na OUN, przedstawiamy tutaj metodę ekstrakcji, utrzymania, dysocjacji i zakażenia mysich astrocytów i komórek mikrogleju pasożytami pierwotniaków. Wyekstrahowane komórki z kory noworodków są utrzymywane in vitro przez 14 dni z okresową wymianą pożywki różnicowej. Astrocyty i mikroglej uzyskuje się z tego samego protokołu ekstrakcji przez dysocjację mechaniczną. Po fenotypowaniu za pomocą cytometrii przepływowej komórki są zakażone pasożytniczymi pierwotniakami. Szybkość infekcji określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w różnych punktach czasowych, umożliwiając w ten sposób ocenę zróżnicowanej zdolności komórek glejowych do kontrolowania inwazji i replikacji pierwotniaków. Techniki te reprezentują proste, tanie i skuteczne metody badania odpowiedzi astrocytów i mikrogleju na infekcje, otwierając pole do dalszej analizy neuroimmunologicznej.

W 14tym dniu hodowla komórek glejowych (Rysunek 1A) została poddana dysocjacji mechanicznej. Izolowane populacje komórek przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej pod kątem markerów CD11b, CD45 oraz GFAP. Odnotowano czystość na poziomie 89,5% dla populacji astrocytów i 96,6% dla populacji mikrogleju (Rysunek 1B). Po izolacji komórki wysiano na płaską płytkę 96-dołkową, a po 24 h były one gotowe do zakażenia T...

Ogólnym celem tego protokołu jest instrukcja, jak wydobywać, utrzymywać i oddzielać mysie komórki astrocytów i mikrogleju od ośrodkowego układu nerwowego, a następnie infekować pasożytami pierwotniaków.

Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Protokół ten opisuje metodę, która koncentruje się na równoległym wyodrębnianiu dwóch najliczniejszych populacji komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju, od myszy po urodzeniu. Nasza metoda różni się od innych wcześniej opisanych protokołów izolacji astrocytów i mikrogleju, ponieważ koncentrujemy się na uzyskaniu i wyizolowaniu obu typów komórek w tej samej ekstrakcji w tym samym stanie, optymalizując w ten sposób wykorzystanie zwierząt doświadczalnych i poprawiając badanie względnych ról tych komórek w kontekstach immunologicznych. Protokół ten może być przydatny do lepszego badania roli mikrogleju i astrocytów w wielu kontekstach i chorobach ośrodkowego układu nerwowego, takich jak choroba Alzheimera, Parkinson i infekcje na przykład pierwotniakami, pasożytami lub wirusami.Uzyskanie i wyizolowanie obu typów komórek z tej samej ekstrakcji jest pożądane w celu oceny porównawczej roli kontekstów immunologicznych każdego podzbioru komórek, takich jak infekcja lub stan zapalny. Ludzie powinni być ostrożni, zwłaszcza podczas usuwania mózgu i płukania tkanek nerwowych, ale wierzę, że dzięki temu protokołowi i nakręconemu filmowi ludzie nie będą walczyć. Protokół ten może być długi w zależności od liczby zwierząt do ekstrakcji kory, więc przygotuj się na spędzenie około czterech godzin lub więcej.Pierwszego dnia przygotuj czysty HBSS i HBSS plus 10% inaktywowany termicznie FBS. Przygotuj uzupełniony DMEM F12 i przefiltruj go filtrem 0,22 mikrona. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie i użyj 70% etanolu podczas zabiegu.Umieść nowonarodzone myszy w szczelnej komorze zawierającej bawełnę nasączoną izofluranem na pięć minut w celu uzyskania głębokiego znieczulenia. Spryskaj szczeniaka myszy 70% etanolem i odetnij zwierzę nożyczkami. Wykonaj strzałkowe cięcie nożyczkami wzdłuż czaszki, aby ją otworzyć i odsłonić mózg.Usuń mózg za pomocą mikroszpatułki, aby zachować integralność mózgu. Umieść mózg na suchej szalce Petriego o średnicy sześciu centymetrów. Za pomocą mikroszpatułki usuń opuszkę węchową i móżdżek.Przenieś korę na inną szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry HBSS plus 10% FBS. Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki sterylnymi nożyczkami i za pomocą mikropipety P1000 przenieś każdą tkankę mózgową za pomocą HBSS plus 10% FBS do różnych 15-mililitrowych stożkowych probówek. W razie potrzeby użyj HBSS plus 10% FBS, aby wypełnić końcową objętość do dwóch mililitrów.Umyj przeciętą tkankę mózgową trzema mililitrami HBSS plus 10% FBS na każdą probówkę. Po dekantacji ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz pranie z HBSS plus 10%FBS jeszcze trzy razy.Następnie umyj trzema mililitrami czystego HBSS trzy razy. Po dekantacji ostrożnie usunąć supernatant. Następnie dodaj trzy mililitry trypsyny i umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, delikatnie potrząsając probówkami co pięć minut.To trawi pobraną tkankę. Unikaj bąbelków. Aby dezaktywować trypsynę, przemyj tkankę trzema mililitrami HBSS plus 10% FBS, a po dekantacji tkanki ostrożnie usuń supernatant.Powtórz to pranie trzy razy. Następnie umyj chusteczkę trzema mililitrami czystego HBSS i powtórz jeszcze dwa razy. Po dekantacji tkanki ostrożnie usunąć supernatant.Dodać siedem mililitrów czystego HBSS i homogenizować tkankę przez kolejne przejścia w pipetach, najpierw za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, następnie pięciomililitrowej pipety, a na końcu mikropipety P1000. Po homogenizacji odwirować probówki o ciśnieniu 450 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z czterema mililitrami HBSS plus 10% FBS na każdą probówkę.Przenieś komórki do komercyjnie poddanej obróbce kolby T75 w celu uzyskania optymalnej przyczepności do hodowli komórkowych. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% dwutlenku węgla na 30 minut w celu przylegania. Następnie dodaj 10 mililitrów uzupełnionego DMEM F12 do kolby i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie noce.Trzeciego dnia usuń siedem mililitrów pożywki hodowlanej z kolby T75 i dodaj siedem mililitrów świeżo uzupełnionego DMEM F12. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Piątego dnia, aby usunąć zanieczyszczenia i nieprzylegające komórki, wymień całą pożywkę z kolby T75 na 14 mililitrów świeżo uzupełnionego DMEM F12.Następnie co 48 godzin usunąć sześć mililitrów supernatantu i dodać siedem mililitrów świeżo uzupełnionej pożywki DMEM F12 do 14 dnia hodowli. W dniu 14, po usunięciu sześciu mililitrów supernatantu i dodaniu siedmiu mililitrów świeżo uzupełnionej pożywki DMEM F12, szczelnie zamknąć kolby T75 foliowym opakowaniem. Umieść je w podłogowej wytrząsarce orbitalnej przy 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez noc, aby mechanicznie oddzielić mikroglej od astrocytów.W dniu 15 należy wyjąć kolby z wytrząsarki i energicznie umyć je ich własnym podłożem, aby zoptymalizować dysocjację komórek i zebrać maksymalną liczbę mikrogleju. Następnie zebrać supernatant i przenieść go do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj cztery mililitry trypsyny do każdej kolby i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu odłączenia astrocytów.Następnie dodaj pięć mililitrów uzupełnionego DMEM F12, aby dezaktywować trypsynę. Umyć kolby ich własnym podłożem i przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować wszystkie probówki zawierające zdysocjowany mikroglej lub astrocyty pod ciśnieniem 450 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad mikrogleju w jednym mililitrze uzupełnionego DMEM F12, a astrocyty w 10 mililitrach uzupełnionego DMEM F12. Przejdź do zliczania komórek w komorze Neubauera lub automatycznym liczniku komórek.Pokryj komórki uzupełnionym DMEM F12 o pożądanej gęstości na wstępnie poddanej obróbce płytce do hodowli komórek z płaskim dnem. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny, aby umożliwić im przyczepienie się. W 14 dobie hodowla komórek glejowych została poddana mechanicznej dysocjacji.Zaobserwowano go z czystością 89,5% dla populacji astrocytów i 96,6% dla populacji mikrogleju. Astrocyty i mikroglej myszy C57BL6 zostały zakażone T.cruzi Y. Po dwóch godzinach, 48 godzinach i 96 godzinach komory utrwalono metanolem i wybarwiono markerem nukleazy komórkowej DAPI i anty-GFAP. Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych pasożytów wykazujących ekspresję fluorescencyjnych reporterów lub pasożytów znakowanych specyficznymi przeciwciałami fluorescencyjnymi poprawiło mikroskopię immunofluorescencyjną, ponieważ można je lepiej odróżnić od jądra komórkowego.Poniżej przedstawiono dwa przykłady. Szczep T.gondii RH konstytutywnie eksprymujący YFP i szczep T.cruzi Y barwiony niekomercyjnym białkiem anty-SSP4 przeciwciała monoklonalnego 2C2. Ważne jest, aby dokładnie umyć komórki, aby nie stracić żadnych agregatów komórkowych.Po zakażeniu komórek glejowych można ocenić inne parametry, takie jak ELISA dla produkcji cytokin obecnych w supernatancie, Western blot dla ekspresji białka i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym dla oceny transkrypcji RNA. Wiele pytań związanych z funkcją komórek glejowych, na przykład ich metabolizmem, odpowiedzią immunologiczną i samą biologią komórki, można rozwiązać i odnieść korzyści dzięki tej technice. Wszystkie pasożyty pierwotniaków są w stanie infekować komórki ludzkie, a także hodować komórki myszy, dlatego ważne jest, aby zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tym pasożytem.

concomitant-isolation-primary-astrocytes-microglia-for-protozoa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej (AdMSC) mają silne właściwości immunomodulacyjne, przydatne w leczeniu chorób związanych ze stanem zapalnym. Pokazujemy, jak izolować i hodować mysie AdMSC i pierwotny mieszany glej, stymulować AdMSC do zwiększania poziomu genów przeciwzapalnych i czynników wzrostu, oceniać migrację AdMSC i kohodować AdMSC z pierwotnym mieszanym glejem zakażonym prionami.

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Poznaj metodę jednoczesnej izolacji pierwotnych astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej myszy noworodkowej. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi komórek glejowych na zakażenia pierwotniakami w układzie nerwowym.

Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków

Przeglądaj więcej filmów