Name: Kwantyfikacja cytotoksyczności Staphylococcus aureus w stosunku do ludzkich leukocytów wielojądrzastych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj metodę izolacji leukocytów wielojądrzastych z krwi ludzkiej oraz dwa testy ilościowej oceny cytotoksyczności Staphylococcus aureus wobec tych komórek odpornościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez U.S. National Institutes of Health Grants NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371, a także fundusze z Rolniczej Stacji Doświadczalnej Uniwersytetu Stanowego Montana oraz dotację na sprzęt od Murdock Charitable Trust.

Heparynizowana krew żylna od zdrowych dawców została pobrana zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board for Human Subjects na Uniwersytecie Stanowym Montany. Wszyscy dawcy wyrazili pisemną zgodę na udział w tym badaniu.
1. Oczyszczanie ludzkich leukocytów wielojądrzastych i izolacja ludzkiej surowicy
UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem obecności endotoksyn za pomocą dostępnego na rynku zestawu do wykrywania endotoksyn i powinny zawierać <25,0 pg/ml endotoksyny, aby zapobiec niepożądanemu zalewaniu PMN.
<ol>
	<li>Przynieś 50 ml 3% dekstranu-0,9% NaCl (w/v), 35 ml 0,9% NaCl (w/v), 20 ml 1,8% NaCl (w/v), 12 ml 1,077 g/ml roztworu gradientu gęstości i 20 ml wody do wstrzykiwań lub nawadniania do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Aby wyizolować surowicę ludzką, należy inkubować 4 ml świeżo pobranej krwi ludzkiej bez antykoagulantu w temperaturze 37 °C w szklanej probówce o pojemności 15 ml przez 30 minut. Po inkubacji odwirować próbkę o masie 2 000–3 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę surowicy do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i umieść na lodzie.</li>
	<li>Połączyć 25 ml świeżo pobranej heparynizowanej (1000 jednostek/ml) pełnej krwi ludzkiej z 25 ml 3% dekstronu-0,9% NaCl o temperaturze pokojowej (stosunek 1:1) w dwóch powtórzonych stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (całkowita objętość 50 ml na probówkę). Wymieszaj, delikatnie kołysząc każdą stożkową probówkę o pojemności 50 ml, a następnie odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji w temperaturze pokojowej pojawią się dwie oddzielne warstwy. Przenieść wierzchnią warstwę każdej mieszaniny dekstranu i krwi do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z niskimi hamulcami lub bez hamulców.</li>
	<li>Ostrożnie odessać oba supernatanty i wyrzucić, nie naruszając osadów komórkowych. Delikatnie ponownie zawiesić każdą komórkę w 2 ml 0,9% NaCl o temperaturze pokojowej, połączyć zawieszone granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a następnie dodać pozostałe 0,9% NaCl (końcowa objętość 35 ml).</li>
	<li>Ostrożnie umieścić 10 ml roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej 1,077 g/ml pod zawiesiną komórek za pomocą pipety ręcznej. Wirować z prędkością 450 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z niskimi hamulcami lub bez hamulców. Delikatnie zassać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Supernatant będzie zawierał jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, które można pobrać zgodnie z wcześniejszym opisem14.</li>
	<li>Lizować czerwone krwinki, ponownie zawieszając osad komórkowy w 20 ml wody o temperaturze pokojowej. Mieszaj delikatnie, kołysząc rurką przez 30 sekund. Lizie czerwonych krwinek będzie towarzyszyć wyraźne zmniejszenie zmętnienia.</li>
	<li>Natychmiast dodać 20 ml 1,8% NaCl (w temperaturze pokojowej [RT]) i odwirować próbkę o sile 450 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym PMN pozostają w samej wodzie po lizie czerwonych krwinek, aby zmaksymalizować wydajność PMN i zapobiec lizie i/lub aktywacji PMN.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki RT RPMI 1640 i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić oczyszczone PMN w stężeniu 1 x 107 komórek/ml za pomocą lodowatego RPMI i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Połączyć 100 μl oczyszczonych PMN (1 x 106 komórek) z 300 μl lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS) zawierającej 1 μl barwnika jodkiem propidyny w dwóch probówkach do cytometrii przepływowej. W celu uzyskania pozytywnej kontroli uszkodzenia błony plazmatycznej należy dodać 40 μl 0,5% roztworu Triton X-100 do jednej z probówek cytometrii przepływowej i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Użyj cytometrii przepływowej, aby zmierzyć rozproszenie do przodu, rozproszenie boczne i barwienie jodkiem propidyny (maksima wzbudzenia/emisji przy 535/617 nm) oczyszczonych komórek (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: Analiza rozproszenia do przodu i z boku pozwoli zidentyfikować niepożądane populacje limfocytów i monocytów. Jodek propidyny barwi tylko komórki z naruszoną błoną plazmatyczną i nie należy stosować oczyszczonych PMN, które mają wyraźne populacje komórek dodatnich jodku propidyny. W tych badaniach oczyszczone PMN stosowano tylko wtedy, gdy zawierały >98% oczyszczonych komórek i <5% barwionych na obecność jodku propidyny.</li>
	<li>Przygotować 96-dołkową płytkę do oznaczania cytotoksyczności PMN, pokrywając poszczególne studzienki, które zostaną użyte w tym teście, 100 μl 20% izolowanej ludzkiej surowicy, która została rozcieńczona DPBS. 
	UWAGA: Powlekanie PMN bezpośrednio na plastiku lub szkle spowoduje aktywację ogniw. Należy pamiętać o dołączeniu co najmniej jednej studzienki kontroli ujemnej, która będzie otrzymywać tylko pożywkę, oraz co najmniej jednej studzienki kontroli pozytywnej, która otrzyma 0,05% Triton X-100.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji należy dwukrotnie przemyć pokryte studzienki lodowatym DPBS, aby usunąć nadmiar surowicy. Delikatnie postukaj w talerz do góry nogami, aby usunąć resztki DPBS i umieść na lodzie.</li>
	<li>Delikatnie dodać 100 μl oczyszczonych ludzkich PMN o stężeniu 1 x 107 komórek/ml do każdej powlekanej studzienki (1 x 106 PMN/studzienkę). Pozwól PMN osiąść w studzienkach, inkubując płytkę na lodzie przez co najmniej 5 minut. Utrzymuj płytkę poziomo, aby umożliwić równomierne rozmieszczenie komórek w każdym dołku i pozostaw na lodzie, aby uniknąć niepożądanej aktywacji PMN.</li>
</ol>
2. Test cytotoksyczności białek zewnątrzkomórkowych S. aureus przeciwko ludzkim leukocytom wielojądrzastym
<ol>
	<li>Hodowlę S. aureus przez noc w tryptycznym bulionie sojowym (TSB) w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C. W tych badaniach 20 ml TSB w oddzielnych 150 ml kolbach Erlenmeyera zaszczepiono zamrożonymi kulturami szczepów S. aureus USA300 lub USA300ΔsaeR/S i hodowano przez około 14 godzin z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
	<li>Subkultura S. aureus, wykonując rozcieńczenie 1:100 nocnej kultury bakteryjnej ze świeżą pożywką. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż bakterie osiągną wczesną fazę wzrostu stacjonarnego. 
	UWAGA: W tych eksperymentach 20 ml tryptycznego bulionu sojowego w 150 ml kolbach Erlenmeyera zaszczepiono 200 μl nocnej hodowli USA300 lub USA300ΔsaeR/S i inkubowano w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 5 godzin.</li>
	<li>Gdy bakterie osiągną wczesną fazę wzrostu stacjonarnego, przenieś 1 ml subkulturowanego S. aureus do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po odwirowaniu przenieść supernatant do strzykawki o pojemności 3 ml. Przepuść supernatanty przez filtr 0,22 μm i do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
	<li>Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia supernatantów lodowatymi pożywkami używanymi do hodowli S. aureus. 
	UWAGA: W pokazanych eksperymentach supernatanty z USA300 i USA300ΔsaeR/S poddano czterem kolejnym rozcieńczeniom 1/2 log lodowatym TSB.</li>
	<li>Delikatnie dodać próbki sklarowanego osadu lub same pożywki (do kontroli ujemnych i dodatnich) do poszczególnych studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej PMN na lodzie z kroku 1.15. W tych eksperymentach do każdej studzienki dodano 10 μl próbek supernatantu USA300 lub USA300ΔsaeR/S. Delikatnie kołysać płytkę, aby rozprowadzić supernatanty w studzienkach i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W pożądanym czasie wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją na lodzie. Dodać 40 μl 0,5% Triton X-100 do studzienki kontroli dodatniej.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować próbki w górę i w dół w każdej studzience, aby całkowicie usunąć wszystkie PMN przyklejone do płytki, a następnie przenieść próbki do probówek cytometrii przepływowej na lodzie, które zawierają 300 μl lodowatego DPBS z 1 μl jodku propidyny.</li>
	<li>Zmierz proporcję PMN dodatnich dla jodku propidyny za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Po związaniu z DNA jodek propidyny ulega wzbudzeniu/emisji przy długości fali 535/617 nm.</li>
</ol>
3. Test cytotoksyczności S. aureus przeciwko ludzkim leukocytom wielojądrzastym po fagocytozie
UWAGA: Krzywe wzrostu zdefiniowane przez gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) i stężenie bakterii muszą być wyznaczone empirycznie dla szczepów S. aureus do badania przed rozpoczęciem tego testu. Powodzenie tych eksperymentów wymaga konsekwentnego zbierania równych stężeń każdego szczepu S. aureus testowanego w połowie fazy wzrostu wykładniczego przy użyciu OD600 subkulturowanych bakterii.
<ol>
	<li>Rozpocznij nocne hodowle szczepów S. aureus i subkultur bakterii, jak opisano w krokach 2.1.1 i 2.1.2.</li>
	<li>Zbierz subkulturowany S. aureus, gdy osiągnie średni wykładniczy wzrost, przenosząc 1 ml hodowanych bakterii do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirowując przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W naszych warunkach wzrostu USA300 i USA300ΔsaeR/S osiągnęły średnią fazę wzrostu wykładniczego po około 135 minutach inkubacji6.</li>
	<li>Przemyć S. aureus po odwirowaniu przez zasysanie supernatantu, ponowne zawieszenie granulowanych bakterii w 1 ml DPBS, wirowanie próbki przez 30 s i odwirowanie przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opsonizować S. aureus przez ponowne zawieszenie osadu bakteryjnego w 1 ml 20% ludzkiej surowicy rozcieńczonej DPBS i inkubację w temperaturze 37 °C z mieszaniem przez 15 min.</li>
	<li>Odwirować opsonizowane bakterie w dawce 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć S. aureus po odwirowaniu przez zasysanie supernatantu, ponowne zawieszenie granulowanych bakterii w 1 ml DPBS, a następnie wirować próbkę, aż do całkowitego rozpadu osadu bakteryjnego plus dodatkowe 30 sekund. Odwirować bakterie w ilości 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić opsonizowane szczepy S. aureus w 1 ml RPMI, wirować próbkę, aż osad bakteryjny zostanie całkowicie rozbity, a następnie przez dodatkowe 30 s. Umieść bakterie na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć opsonizowane szczepy S. aureus do pożądanego stężenia za pomocą lodowatego RPMI. Wiruj przez 30 s i umieść na lodzie.</li>
	<li>Potwierdź stężenie opsonizowanego S. aureus przez posiew 1:10 seryjnych rozcieńczeń bakterii na tryptycznym agarze sojowym. 
	UWAGA: Ponieważ różnice w stężeniu bakterii użytych w tym teście mogą mieć duży wpływ na późniejszą przepuszczalność błony plazmatycznej PMN (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A), bardzo ważne jest, aby stężenie każdego badanego szczepu było określane dla każdego eksperymentu i było równoważne między szczepami.</li>
	<li>Delikatnie dodać 100 μl/basenik każdego szczepu S. aureus lub RPMI (dla kontroli dodatniej i ujemnej) do PMN na 96-dołkowej płytce na lodzie z kroku 1.14. Delikatnie kołysz płytę, aby rozprowadzić S. aureus w studzienkach.</li>
	<li>Zsynchronizuj fagocytozę, odwirowując płytkę w temperaturze 500 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C15. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C natychmiast po odwirowaniu (T = 0).</li>
	<li>W pożądanym czasie wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić na lodzie. Dodać 40 μl 0,5% Triton X-100 do studzienki kontroli dodatniej.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować próbki w górę i w dół w każdym dołku, aby całkowicie usunąć wszystkie PMN przyklejone do płytki, a następnie przenieść próbki do probówek cytometrii przepływowej na lodzie zawierającym 200 μl lodowatego DPBS z 1 μl jodku propidyny.</li>
	<li>Analizować próbki pod kątem barwienia jodkiem propidyny za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w kroku 2.9.</li>
</ol>

<ol><li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., Höök, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion%2C+invasion+and+evasion%3A+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li>
<li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li>
<li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li>
<li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epic+Immune+Battles+of+History%3A+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li>
<li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Management+of+Infections+in+the+Immunocompromised+Host%22%5BJournal%5D)">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li>
<li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SaeR%2FS+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li>
<li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR%2FS+Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li>
<li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+SaeR%2FS-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li>
<li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR%2FS-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li>
<li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, at https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2018.03085 3085(2018).</li>
<li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocidins%3A+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li>
<li>Bøyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SaeR%2FS+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje oczyszczanie PMN z ludzkiej krwi i dwa odrębne testy, które wykorzystują jodek propidyny do ilościowego określenia cytotoksyczności S. aureus wobec tych ważnych wrodzonych komórek odpornościowych. Powodzenie tych procedur będzie zależało od jakości oczyszczonych PMN oraz odpowiedniego przygotowania S. aureus i białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez ten patogen. W przypadku izolacji PMN ważne jest, aby zminimalizować aktywację PMN podczas i po oczyszczeniu poprzez stosowanie odczynników wolnych od zanieczyszczenia endotoksynami, delikatne traktowanie preparatów komórkowych i utrzymywanie komórek w odpowiedniej temperaturze. Oznaki wskazujące na aktywację PMN obejmują zlepianie się komórek podczas oczyszczania i gdy więcej niż 5% wyizolowanych komórek barwi się dodatnio na obecność jodku propidyny. Ze względu na stosunkowo krótką żywotność PMN, komórki te muszą zostać wyizolowane z ludzkiej krwi i przebadane tego samego dnia. PMN zaczną wykazywać oznaki spontanicznej apoptozy, jeśli zostaną pozostawione na lodzie na dłużej niż 3 godziny po oczyszczeniu. Jak wspomniano wcześniej, bardzo ważne jest, aby każdy preparat PMN był dokładnie oceniany przy użyciu analizy cytometrii przepływowej rozproszenia do przodu i bocznego, a także barwienia jodkiem propidyny, aby zapewnić czystość i integralność izolowanych komórek.
Ekspresja dwuskładnikowych leukocydyn przez S. aureus jest odpowiedzialna za większość upośledzonej integralności błony plazmatycznej PMN, którą obserwuje się za pomocą testów opisanych w niniejszym protokole. Różnice w ekspresji tych toksyn i innych peptydów tworzących pory, takich jak moduliny rozpuszczalne w fenolach, między szczepami S. aureus powodują różnice w cytotoksyczności wobec ludzkich PMN. Znaczne odchylenia podczas wzrostu in vitro między szczepami S. aureus będą również wpływać na ekspresję toksyn tworzących pory i późniejszą cytotoksyczność. Ponadto stosunek S. aureus do PMN w testach fagocytozy ma duży wpływ na późniejszą przepuszczalność błony plazmatycznej PMN (ryc. 3A), a eksperymenty te wymagają konsekwentnego zbierania równych stężeń każdego szczepu S. aureus testowanego w połowie fazy wzrostu wykładniczego przy użyciu OD600 subkulturowanych bakterii. Biorąc pod uwagę te rozważania, bardzo ważne jest zdefiniowanie krzywych wzrostu dla wszystkich szczepów, które będą badane przed rozpoczęciem testów cytotoksyczności. Nie zalecamy stosowania tych metod do analizy cytotoksyczności S. aureus ze szczepami, które wykazują znaczące różnice we wzroście in vitro.
USA300 jest zjadliwym izolatem MRSA, o którym wiadomo, że jest wysoce cytotoksyczny wobec ludzkich PMN15, a utrata SaeR / S w tym szczepie radykalnie zmniejsza transkrypcję wielu dwuskładnikowych leukocydyn, które są ukierunkowane na ludzkie PMN 6,12, co czyni te szczepy idealnymi modelami do porównywania cytotoksyczności przy użyciu opisanych testów. Istnieje jednak duża zmienność genetyczna między różnymi izolatami S. aureus, a parametry wyszczególnione w tych protokołach mogą nie powodować istotnych zmian w cytotoksyczności wobec ludzkich PMN podczas testowania innych szczepów S. aureus. Dostosowanie warunków wzrostu, ilości dodanych supernatantów lub stosunku bakterii do PMN może być wymagane do powodzenia tych metod przy użyciu innych szczepów S. aureus.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus to bakteria Gram-dodatnia, która powoduje szerokie spektrum chorób u ludzi. Ten wybitny patogen wytwarza liczne czynniki wirulencji, które przyczyniają się do różnych aspektów infekcji. Należą do nich cząsteczki powierzchniowe, które pozwalają S. aureus przylegać do różnych typów tkanek gospodarza1, białka zewnątrzkomórkowe, które zakłócają odpowiedź immunologiczną gospodarza2, oraz szereg wydzielanych toksyn, które celują w różne typy komórek gospodarza3. W tym raporcie opisujemy metodę, która określa ilościowo cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez S. aureus wobec ludzkich leukocytów wielojądrzastych (PMN lub neutrofili), pierwotnych komórek efektorowych wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza.
PMN są najliczniejszymi leukocytami u ssaków. Te krążące komórki odpornościowe są szybko rekrutowane do miejsca uszkodzenia tkanki gospodarza w odpowiedzi na sygnały niebezpieczeństwa wytwarzane przez komórki rezydentne lub przez związki unikalne dla atakujących drobnoustrojów. Zewnątrzkomórkowy wkład z tych cząsteczek oraz z bezpośrednich kontaktów z aktywowanymi rezydującymi komórkami gospodarza podczas wynaczynienia zwiększa stan aktywacji PMN w procesie znanym jako priming4,5. Przygotowane PMN, które dotarły do uszkodzonej tkanki, wykonują następnie ważne wrodzone odpowiedzi immunologiczne mające na celu zapobieganie powstaniu infekcji. Należą do nich wiązanie i internalizacja, czyli fagocytoza, inwazyjnych mikroorganizmów, która wyzwala kaskadę zdarzeń wewnątrzkomórkowych kumulujących się w niszczeniu drobnoustrojów przez baterię silnych związków przeciwdrobnoustrojowych5.
PMN odgrywają kluczową rolę w ochronie ludzi przed inwazją patogenów i są szczególnie ważne dla zapobiegania infekcji S. aureus4. Jednak bakteria ta wytwarza szeroki zakres genów wirulencji, które utrudniają różne funkcje PMN. Należą do nich białka zewnątrzkomórkowe, które blokują rozpoznawanie cząsteczek sygnałowych, zapobiegają przyleganiu do tkanki gospodarza, hamują produkcję związków przeciwdrobnoustrojowych i naruszają integralność błony plazmatycznej4. S. aureus koordynuje czasową ekspresję tych genów wirulencji poprzez zbiorowe dane wejściowe z wielu dwuskładnikowych systemów sensorycznych, które rozpoznają określone sygnały środowiskowe. Dwuskładnikowy system SaeR/S jest głównym regulatorem zwiększającym transkrypcję genu wirulencji S. aureus podczas infekcji6,7,8,9,10,11. W szczególności wykazano, że ten dwuskładnikowy system ma kluczowe znaczenie dla produkcji dwuskładnikowych leukocydyn, które są specyficznie ukierunkowane na ludzkie PMNs12.
Ten protokół jest podzielony na trzy różne sekcje. Pierwsza sekcja opisuje oczyszczanie PMN z ludzkiej krwi za pomocą wirowania w gradionym gradiencie gęstości przy użyciu protokołu, który został zaadaptowany z metod opracowanych przez Bøyum13 i Nauseef14. Druga i trzecia sekcja szczegółowo opisują dwie różne techniki badania cytotoksyczności S. aureus; jeden odurza PMN białkami zewnątrzkomórkowymi wytwarzanymi przez S. aureus, podczas gdy drugi bada zdolność żywych bakterii do uszkadzania PMN po fagocytozie. Procedury te wykorzystują jodek propidyny do pomiaru utraty integralności błony plazmatycznej PMN spowodowanej przez toksyny tworzące pory S. aureus. Jodek propidyny jest fluoroforem wiążącym DNA, który zwykle jest nieprzepuszczalny dla błony komórkowej, ale może przenikać przez błony plazmatyczne, które zostały naruszone przez toksyny S. aureus. Analiza cytometrii przepływowej pozwala na szybkie określenie ilościowe PMN dodatnich pod względem jodku propidyny w celu zmierzenia względnej cytotoksyczności szczepów S. aureus. Oporny na metycylinę S. aureus (MRSA), zidentyfikowany jako elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym typu USA300 i izogeniczny mutant delecji saeR/S w tym szczepie (USA300ΔsaeR/S) zostały wykorzystane jako modele do pokazania, w jaki sposób procedury te mogą określić ilościowo cytotoksyczność S. aureus wobec ludzkich PMN.

<table><tbody><tr><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, USP, 500 ml Plastikowy pojemnik VIAFLEX</td><td>Baxter</td><td>2B1323Q</td><td>Oczyszczanie PMN</td></tr><tr><td>Mikroprobówki wirówkowe 1,5 ml z zatrzaskami</td><td>VWR</td><td>89000-044</td><td>Stosowany w komórkach myjących</td></tr><tr><td>1,8% roztwór chlorku sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Oczyszczanie PMN</td></tr><tr><td>12x75mm Probówki hodowlane</td><td>VWR</td><td>60818-430</td><td>Stosowany jako cytometria przepływowa Probówki</td></tr><tr><td>20% (w/w) Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8802</td><td>Oczyszczanie PMN</td></tr><tr><td>3125 Ręczny licznik talikowy</td><td>Produkty identyfikowalne</td><td>3125CC</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td>Do dozowania pożywki</td></tr><tr><td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td><td>Fischer 211823 Naukowy</td><td></td><td>Do hodowli kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki BD z końcówkami Luer-Lok, 3 ml</td><td>FischerScientific</td><td>BD 309657</td><td>Do filtrowania supernatantów</td></tr><tr><td>Hemocytometr Bright-Line</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Aparat do liczenia komórek</td></tr><tr><td>DPBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco) z wapniem i magnezem</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>Stosowany w komórkach myjących</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Oczyszczanie PMN</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu</td><td>FischerScientific</td><td>13-678-11E</td><td>Do zasysania cieczy</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0687</td><td>Płytka do przechowywania próbek eksperymentalnych</td></tr><tr><td>OMICRON Filtry strzykawkowe</td><td>Omicron Scientific</td><td>SFPV13R</td><td>Do filtrowania supernatantów</td></tr><tr><td>Propidium jodek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td>Membrana nieprzepuszczalna barwienie DNA</td></tr><tr><td>PYREX Marka 4980 Kolby Erlenmeyera</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-34503-24</td><td>Do hodowli kultur komórkowych</td></tr><tr><td>RPMI 1640, 1X bez L-glutaminy, czerwieni fenolowej</td><td>Corning</td><td>17-105-CV</td><td>Stosowany w ponownym zawieszaniu komórek</td></tr><tr><td>Sterylna woda do nawadniania, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7113</td><td>Oczyszczanie</td></tr> <tr><td>PMNPompa do pipet</td><td>Bel-Art Products</td><td>F37898</td><td>Do zasysania cieczy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Integralność membrany kontrola pozytywna</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja cytotoksyczności staphylococcus aureus w stosunku do ludzkich leukocytów wielojądrzastych

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus jest zdolny do wydzielania szerokiej gamy leukocydyn, które atakują i zakłócają integralność błony leukocytów wielojądrzastych (PMN lub neutrofili). Protokół ten opisuje zarówno oczyszczanie ludzkich PMN, jak i ilościowe oznaczanie cytotoksyczności S. aureus wobec PMN w trzech różnych sekcjach. Sekcja 1 szczegółowo opisuje izolację PMN i surowicy z krwi ludzkiej za pomocą wirowania gęstości. W sekcji 2 bada się cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez S. aureus w stosunku do tych oczyszczonych ludzkich PMN. Sekcja 3 mierzy cytotoksyczność w stosunku do ludzkich PMN po fagocytozie żywych S. aureus. Procedury te mierzą przerwanie integralności błony plazmatycznej PMN przez leukocydyny S. aureus za pomocą analizy cytometrii przepływowej PMN traktowanych jodkiem propidyny, fluoroforem wiążącym DNA, który jest nieprzepuszczalny dla błony komórkowej. Łącznie metody te mają tę zaletę, że pozwalają na szybkie testowanie cytotoksyczności S. aureus w stosunku do pierwotnych ludzkich PMN i można je łatwo dostosować do badania innych aspektów interakcji gospodarz-patogen.

Wykazaliśmy, w jaki sposób opisane powyżej procedury mogą być wykorzystane do względnej kwantyfikacji cytotoksyczności S. aureus wobec ludzkich PMN, wykorzystując MRSA PFGE-typ USA300 oraz izogenny mutant z delecją saeR/S w tym szczepie (USA300ΔsaeR/S) wygenerowany w poprzednich badaniach6. PMN wyizolowane zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 1 niniejszego protokołu barwiono jodkiem propidyny i analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej. Wykresy rozproszenia w przód (FSC) i z boku (SSC) posłużyły do zilustrowania zanieczyszczenia oczyszczonych PMN monocytami lub limfocytami (Rysunek 1A,B), a integralność PMN określono za pomocą barwienia jodkiem propidyny (Rysunek 1C). Opisana metoda oczyszczania ludzkich PMN może konsekwentnie dostarczać od 0.5 x 107 do 1 x 108 PMN o czystości &gt;98%, z których &gt;95% jest negatywnych pod kątem barwienia jodkiem propidyny.
Cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych produkowanych przez USA300 oraz USA300ΔsaeR/S przetestowano na oczyszczonych PMN (Rycyna 2) zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 2 niniejszego protokołu. Eksperymenty te wykazały zależny od stężenia wzrost barwienia oczyszczonych PMN jodkiem propidium po 30 min ekspozycji na białka zewnątrzkomórkowe produkowane przez USA300 (Rycina 2B). Wcześniejsze badania wykazały, że dwuskładnikowy system SaeR/S jest istotny dla ekspresji licznych dwuskładnikowych leukocydyn celujących w ludzkie PMN6,10,11,16. Zgodnie z tymi wcześniejszymi wynikami, po ekspozycji na białka zewnątrzkomórkowe produkowane przez USA300ΔsaeR/S wykryto bardzo mało PMN dodatnich pod kątem barwienia jodkiem propidium (Rycina 2B). Dalsze eksperymenty wykazały stały wzrost proporcji lizowanych PMN po ekspozycji na białka zewnątrzkomórkowe USA300, który osiągnął plateau po około 30 min (Rycina 2C). Minimalna liza ludzkich PMN odnotowano we wszystkich punktach czasowych po ekspozycji na białka zewnątrzkomórkowe produkowane przez USA300ΔsaeR/S. Wyniki te ilustrują użyteczność niniejszego testu do względnej kwantyfikacji cytotoksyczności białek zewnątrzkomórkowych S. aureus wobec ludzkich PMN.
Przetestowano szczepy USA300 i USA300ΔsaeR/S za pomocą testu cytotoksyczności S. aureus wobec ludzkich PMN po fagocytozie, opisanego w sekcji 3 niniejszego protokołu (Rycina 3). Obserwowano zależny od stężenia wzrost proporcji PMN wykazujących pozytywny wynik barwienia jodkiem propidium 90 min po fagocytozie USA300 (Rycina 3A). Odnotowano istotny spadek proporcji PMN dodatnich pod względem barwienia jodkiem propidium po fagocytozie USA300ΔsaeR/S (Rycina 3A), co potwierdza inne wyniki wskazujące, że dwuskładnikowy system SaeR/S jest istotny dla cytotoksyczności S. aureus wobec ludzkich PMN (Rycina 2)7,11. Jak wspomniano wcześniej i wykazano na Rycina 3A, różnice w stężeniu S. aureus mają wyraźny wpływ na lizę PMN po fagocytozie. Wyznaczenie liczebności inokulum USA300 i USA300ΔsaeR/S użytego w każdym z tych eksperymentów wykazało, że kontrast w cytotoksyczności między tymi szczepami nie wynikał z różnic w stężeniu użytych bakterii (Rycina 3B). Wyniki te pokazują, w jaki sposób test cytotoksyczności S. aureus wobec ludzkich PMN po fagocytozie może być wykorzystany do oceny zdolności różnych szczepów S. aureus do naruszania integralności błony plazmatycznej ludzkich PMN.
<img alt="Wykresy kropkowe i histogram cytometrii przepływowej do analizy populacji komórek; granulocyty, monocyty, debris." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Analiza cytometrii przepływowej oczyszczonych PMN. Reprezentatywne wykresy kropkowe cytometrii przepływowej dla (A) oczyszczonych ludzkich PMN oraz (B) PMN celowo zanieczyszczonych mononuklearnymi komórkami krwi obwodowej. (C) Reprezentatywny histogram cytometrii przepływowej wykazujący minimalne barwienie jodeczkiem propidyny (&lt;1%) oczyszczonych PMN (kolor szary) w porównaniu do PMN traktowanych 0,05% Triton X-100 (kolor czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej z jodkiem propidyny; ocena integralności błony bakteryjnej USA300." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza cytometrii przepływowej PMN poddanych działaniu białek zewnątrzkomórkowych produkowanych przez S. aureus. (A) Reprezentatywny histogram cytometrii przepływowej PMN barwionych jodkiem propidyny po 30 min inkubacji z kontrolą medium (kolor niebieski), filtrowanym naddatkiem USA300 w stężeniu końcowym 1:110 (kolor szary) lub 0,05% Triton X-100 (kolor czerwony). (B) Odsetek PMN dodatnich pod kątem jodku propidyny po 30 min inkubacji z różnymi stężeniami naddatków USA300 lub USA300∆saeR/S. (C) Odsetek PMN dodatnich pod kątem jodku propidyny w czasie po inkubacji z naddatkiem USA300 lub USA300∆saeR/S w stężeniu końcowym 1:110. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM z co najmniej 3 oddzielnych eksperymentów, gdzie * p ≤ 0,05 i ** p ≤ 0,005 określono za pomocą dwustronnego testu t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interakcja bakterii z PMN; wykres słupkowy; %jodek propidyny+; stężenie CFU/mL; USA300, ΔsaeR/S." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza cytometrii przepływowej PMN po fagocytozie S. aureus. (A) Procent PMN wykazujących dodatni wynik z jodekiem propidyny 90 min po fagocytozie różnych stężeń USA300 lub USA300∆saeR/S. (B) Stężenie opsonizowanych szczepów S. aureus wykorzystanych w eksperymentach przedstawionych w panelu A. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM z 4 oddzielnych eksperymentów, gdzie * p ≤ 0,01 określone za pomocą dwustronnego testu t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania leukocytów wielojądrzastych z pełnej krwi ludzkiej oraz dwa odrębne testy, które określają cytotoksyczność Staphylococcus aureus przeciwko tym ważnym wrodzonym komórkom odpornościowym.

Kwantyfikacja cytotoksyczności Staphylococcus aureus w stosunku do ludzkich leukocytów wielojądrzastych

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Staphylococcus aureus to bakteria Gram-dodatnia, która wytwarza szeroką gamę czynników wirulencji, które promują patogenezę. Należą do nich dwuskładnikowe leukotoksyny, które zaburzają integralność błony leukocytów wielojądrzastych, zwanych również PMN lub neutrofilami. Ten film ilustruje izolację PMN z ludzkiej krwi pełnej i dwa odrębne testy do ilościowego określania cytotoksyczności S.aureus wobec tych ważnych wrodzonych komórek odpornościowych.Wszystkie te testy można wykonać za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego i można je łatwo dostosować do badania innych aspektów interakcji patogenów gospodarza. Eksperymenty te będą wykorzystywać pełną krew pobraną od ludzkich dawców i będą wymagały zgody odpowiedniego komitetu instytucjonalnego lub komisji rewizyjnej, a także oświadczenia, że uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników. Pierwszym etapem tej procedury jest izolacja neutrofili poprzez zastosowanie wirowania i gradientów gęstości.Najpierw przynieś 50 mililitrów 3% dekstranu 0,9% chlorku sodu, 35 mililitrów 0,9% chlorku sodu, 20 mililitrów 1,8% chlorku sodu, 12 mililitrów 1,077 grama na mililitr roztworu figolu i 20 mililitrów wody do temperatury pokojowej. Przenieś 25 mililitrów świeżo pobranej heparynizowanej pełnej krwi ludzkiej do dwóch stożkowych probówek wirówkowych. Połącz 25 mililitrów świeżo pobranej heparynizowanej krwi pełnej z 25 mililitrami równoważnej objętości w temperaturze pokojowej, 3% dekstranu, 0,9% chlorku sodu w stosunku jeden do jednego.Wymieszaj, delikatnie kołysząc każdą 50-mililitrową stożkową rurkę, a następnie odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po inkubacji w temperaturze pokojowej pojawią się dwie oddzielne warstwy. Przenieś górną warstwę każdej mieszaniny krwi dekstranu do nowych 50-mililitrowych stożkowych probówek.Wirować przy 450 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z małymi przerwami lub bez nich. Ostrożnie odessać oba supernatanty i wyrzucić, nie naruszając osadów komórkowych. Delikatnie zawieś każdą komórkę w dwóch mililitrach 0,9% chlorku sodu.Połącz zawieszone granulki w pojedynczym, stożkowym o pojemności 50 mililitrów, a następnie dodaj pozostałe 0,9% chlorku sodu do końcowej objętości 35 mililitrów. Ostrożnie umieść 10 mililitrów 1,077 grama na mililitr roztworu fikolu pod zawiesiną komórek za pomocą pipety ręcznej. Po wirowaniu z masą 450 g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, z małymi przerwami lub bez nich, delikatnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego, jak pokazano wcześniej.Liza czerwonych krwinek poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 20 mililitrach wody o temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszaj, kołysząc przez 30 sekund. Natychmiast dodać 20 mililitrów 1,8% chlorku sodu i odwirować próbkę o masie 450 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie odessać supernatant, jak pokazano wcześniej. Delikatnie zawieś ponownie osad ogniwa w dwóch mililitrach RPMI w temperaturze pokojowej i umieść na lodzie. Policz komórki za pomocą hemekytometru.Ponownie zawiesić oczyszczone PMN w stężeniu od jednego razy 10 do 7 komórek na mililitr z lodowatym RPMI i trzymać na lodzie. Połącz 100 mikrolitrów oczyszczonych PMN z 300 mikrolitrami DPBS, zawierającymi jeden mikrolitr barwienia jodkiem propidyny w dwóch probówkach do cytometrii przepływowej z replikami. W celu uzyskania kontroli dodatniej dodaj 40 mikrolitrów 0,5% roztworu Triton X-100 do jednej z probówek cytometrii przepływowej i dokładnie wymieszaj.Użyj cytometrii przepływowej do pomiaru rozproszenia do przodu, rozproszenia bocznego i barwienia jodkiem propidyny, aby określić czystość i integralność izolowanych PMN. Należy stosować wyłącznie preparaty PMN o czystości powyżej 98% i ujemnej zawartości jodku propidu powyżej 95%. Aby zapoznać się z protokołem opisującym izolację normalnej ludzkiej surowicy, należy zapoznać się z pełnym rękopisem.Przygotuj 96-dołkową płytkę do testów cytotoksyczności PMN, dodając 100 mikrolitrów 20% izolowanej ludzkiej surowicy rozcieńczonej DPBS do poszczególnych studzienek, które zostaną użyte w tym teście. Należy pamiętać o dołączeniu co najmniej jednej studzienki kontroli ujemnej, która będzie otrzymywać tylko pożywkę i co najmniej jednej studzienki kontroli pozytywnej, która otrzyma 0,05% Triton X. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji umyj zakodowane studzienki dwukrotnie 100 mikrolitrami lodowatego DPBS i umieść płytkę na lodzie.Usuń wszelkie pozostałości DPBS z dołków płytkowych i delikatnie dodaj 100 mikrolitrów oczyszczonych ludzkich PMN jednorazowo od 10 do 7 komórek na mililitr do każdej zakodowanej studzienki. Pozostawić posiane neutrofile do ustabilizowania się, pozostawiając je na lodzie na co najmniej pięć minut przed użyciem w następujących testach cytotoksyczności. W tej sekcji opisano test, który określa ilościowo cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez gronkowca złocistego w stosunku do ludzkich PMN.Hodowlę S.aureus przez noc w odpowiednich pożywkach za pomocą inkubatora wstrząsającego ustawionego na 37 stopni Celsjusza dzień przed eksperymentem. Subkultura S.aureus, wykonując rozcieńczenie od 1 do 100 nocnych kultur bakterii ze świeżą pożywką. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem, aż bakterie osiągną wczesną fazę wzrostu stacjonarnego.Po pięciu godzinach wzrostu przenieś jeden mililitr subkultury S.aureus do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i odwiruj przy 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odessać supernatanty. Przepuścić zassane supernatanty przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i umieścić na lodzie.Wykonać seryjne rozcieńczenia supernatantów lodowatymi pożywkami używanymi do hodowli gronkowca złocistego. Delikatnie dodać próbki supernatantu lub pożywkę wypożyczoną do kontroli ujemnej i pozytywnej do poszczególnych studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej PMN na lodzie, jak opisano wcześniej. Delikatnie kołysz płytę, aby rozprowadzić supernatanty w studzienkach i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza.W pożądanym czasie wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić na lodzie. Dodaj 300 mikrolitrów lodowatego DPBS zawierającego jeden mikrolitr jodku propidyny do każdej probówki cytometrii przepływowej. Przenieść próbki do probówek do cytometrii przepływowej na lodzie.W przypadku studzienki kontroli dodatniej dodać 20 mikrolitrów 10% Triton X do próbki przed przeniesieniem do probówki do cytometrii przepływowej. Analiza barwienia jodkiem propidyny zatrutych PMN za pomocą cytometrii przepływowej. W tej sekcji opisano test, który określa ilościowo cytotoksyczność S.aureus po fagocytozie przez ludzkie PMN.Krzywe wzrostu określone przez gęstość optyczną przy 600 nanometrach i stężenie bakterii muszą zostać określone dla odpowiednich szczepów gronkowca złocistego przed użyciem w tym badaniu. Rozpocznij nocne hodowle szczepów S.aureus i subkultur bakterii, jak opisano wcześniej. Gdy subkulturowany gronkowiec złocisty osiągnie średni wykładniczy wzrost, przenieś jeden mililitr bakterii hodowlanych do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i odwiruj przy 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Przemyć S.aureus poprzez zassanie jego supernatantu bez naruszania osadu i ponownie zawiesić granulowane bakterie w jednym mililitrze DPBS. Wirować próbki przez 30 sekund. Odwirować próbki o masie 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Aby namsić gronkowca złocistego, najpierw ponownie zawieś osad bakteryjny w jednym mililitrze 20% ludzkiej surowicy. Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem przez 15 minut. Umyć zawijanego gronkowca złocistego po odwirowaniu, jak pokazano wcześniej.Rozcieńczone szczepy gronkowca złocistego do 10 razy do 8 jednostek tworzących kolonię, CFU na mililitr, z lodowatym RPMI. Wirować próbkę przez 30 sekund i umieścić na lodzie. Potwierdź stężenia gronkowca złocistego użytego do tych testów, posiewając od jednego do 10 seryjnych rozcieńczeń bakterii na agarze .Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę każdego szczepu Staph aureus lub RPMI dla kontroli pozytywnej i ujemnej do PMN w 96-dołkowej płytce na lodzie od kroku 1.14. Delikatnie kołysz płytę, aby rozprowadzić gronkowca złocistego w studzienkach. Zsynchronizuj fagocytozę, odwirowując płytkę o masie 500 g przez osiem minut w czterech stopniach Celsjusza i inkubując płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza natychmiast po odwirowaniu jako czas zerowy.W żądanych punktach czasowych umieść płytkę na lodzie i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego DPBS zawierającego jeden mikrolitr jodku propidyny do każdej probówki cytometrii przepływowej, a następnie przenieś próbki do odpowiedniej probówki. Analizować próbki pod kątem barwienia jodkiem propidyny przy użyciu cytometrii przepływowej, jak opisano w ppkt 2.8 i 2.9. Transkrypcja dwuskładnikowych leukotoksyn, które są ukierunkowane na ludzkie PMN przez Staph aureus, wymaga układu składowego SA lub S2 do wykazania użyteczności opisanych testów do ilościowego określania cytotoksyczności gronkowca złocistego wobec ludzkich PMN.Eksperymenty te przeprowadzono z klinicznie istotnym izolatem gronkowca złocistego zidentyfikowanym jako USA300 w zmutowanym delecji isologennej SA lub S w tym szczepie. Lewy panel przedstawia oczyszczone PMN, a prawy panel przedstawia celowo zanieczyszczone próbki jako przykład. PMN wyizolowane przy użyciu procedur opisanych w sekcji pierwszej niniejszego protokołu wybarwiono jodkiem propidyny i zbadano za pomocą cytometrii przepływowej.Wykresy rozproszenia przedniego i bocznego wykorzystano do wykrycia zanieczyszczenia oczyszczonymi PMN przez monocyty lub limfocyty w latach 1A i 1B. Integralność PMN określono za pomocą barwienia jodkiem propidyny. Stosując opisaną metodę oczyszczania ludzkiego PMN, możemy konsekwentnie izolować pięć razy od 10 do 7 do jednego razy od 10 do 8 PMN, które mają ponad 98% czystości i są ponad 95% ujemne pod względem jodku propidyny.Cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez USA300 i mutanta AsaeR/S badano w stosunku do oczyszczonych PMN. Eksperymenty te wykazują zależny od stężenia wzrost barwienia jodkiem propidyny oczyszczonych PMN po 30 minutach zatrucia białkami zewnątrzkomórkowymi wytwarzanymi przez USA300, ale nie mutantem AsaeR/S. Dalsze eksperymenty wykazały stały wzrost odsetka PMN dodatnich na jodku propidyny po zatruciu białkami zewnątrzkomórkowymi USA300, które ustabilizowały się po około 30 minutach.Minimalne zabarwienie jodkiem propidyny ludzkich PMN odnotowano we wszystkich punktach czasowych po ekspozycji na białka zewnątrzkomórkowe wytwarzane przez mutanta AsaeR/S. Na koniec przetestowano cytotoksyczność mutantu USA300 i AsaeR/S wobec PMN po zsynchronizowanej fagocytozie, zaobserwowano zależny od stężenia wzrost proporcji PMN dodatnich dla jodku propidyny 90 minut po fagocytozie USA300. Istotnie mniej PMN było dodatnich pod względem jodku propidyny po fagocytozie mutanta AsaeR/S.W każdym z tych eksperymentów zastosowano wyliczenie zmutowanych inokulum USA300 i AsaeR/S, które wykazało, że kontrast w cytotoksyczności między tymi szczepami nie był spowodowany różnicami w stężeniu użytych bakterii. Protokół ten opisuje oczyszczanie PMN z ludzkiej krwi za pomocą dwóch odrębnych technik ilościowego określania cytotoksyczności S.aureus wobec tych wrodzonych komórek odpornościowych. Powodzenie tych procedur będzie zależało od jakości oczyszczonych PMN i odpowiedniego przygotowania bakterii Stahrus lub supernatantów.Prosimy o zapoznanie się z pełnym manuskryptem, aby zapoznać się z ważnymi punktami, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania tych procedur. USA300 jest zjadliwym izolatem MRSA, a utrata AsaeR/S radykalnie zmniejsza transkrypcję czynników wirulencji, które są ukierunkowane na ludzkie PMN, co czyni te szczepy idealnymi modelami do porównywania cytotoksyczności przy użyciu opisanych testów. W przypadku stosowania innych szczepów gronkowca złocistego może być konieczne dostosowanie warunków wzrostu, ilości dodawanych supernatantów lub stosunku bakterii do PMN.

quantifying-cytotoxicity-staphylococcus-aureus-against-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy test ochrony enzymatycznej in vitro oparty na lizostafinach, aby określić ilościowo internalizację Staphylococcus aureus w komórkach A549. Test pomaga w badaniach jakościowych, ilościowych i charakteryzacyjnych wewnątrzkomórkowego obciążenia bakteryjnego w komórkach gospodarza.

Test ochrony enzymatycznej oparty na lizostafininie: metoda in vitro do ilościowego określania wewnątrzkomórkowego obciążenia Staphylococcus aureus poprzez selektywne zabijanie bakterii zewnątrzkomórkowych za pośrednictwem enzymów

Ten film demonstruje test do pomiaru cytotoksyczności komórek NK przeciwko komórkom rakowym za pomocą barwienia Calcein AM. Zmniejszona liczba fluorescencyjnych komórek nowotworowych po jednoczesnej hodowli z komórkami NK wskazuje na cytotoksyczność komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych.

Barwienie kalceiną acetoksymetylową w celu oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek rakowych

Ten film demonstruje test do badania cytotoksyczności białek wytwarzanych przez Staphylococcus aureus, bakterię chorobotwórcze, na izolowanych ludzkich leukocytach wielojądrzastych (PMN). Wydzielane białka cytotoksyczne tworzą pory na błonie komórkowej PMN, inicjując śmierć komórki. Po barwieniu martwych komórek za pomocą jodku propidyny przeprowadza się cytometrię przepływową w celu ilościowego określenia martwych komórek i oceny cytotoksyczności bakterii.

Test cytotoksyczności PMN za pośrednictwem białek zewnątrzkomórkowych bakterii

W tym filmie demonstrujemy test do wykrywania cytotoksyczności zjadliwych i mniej zjadliwych szczepów Staphylococcus aureus przeciwko ludzkim neutrofilom po fagocytozie za pomocą cytometrii przepływowej.

Test cytotoksyczności szczepów Staphylococcus aureus na neutrofilach po fagocytozie

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Ten protokół ma na celu opisanie sposobu badania zakresu internalizacji Staphylococcus aureus i jego zdolności do przetrwania wewnątrz ludzkiej komórki gospodarza, a także wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych.

Ulepszony test ochrony enzymatycznej do badania internalizacji Staphylococcus aureus i wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych

Obecny protokół przygotowuje i ocenia właściwości fizyczne, odpowiedź immunologiczną i efekt ochronny in vivo nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym.

Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Staphylococcus aureus (S. aureus) ma zdolność rozprzestrzeniania się po całym ciele, powodując uporczywe i nawracające infekcje. Aby lepiej zrozumieć te procesy, w badaniu tym ustanowiono wewnątrzkomórkowy model infekcji S. aureus. Model ten będzie stanowił kluczową podstawę do badania mechanizmów stojących za infekcjami wewnątrzkomórkowymi.

Opracowanie i ocena wewnątrzkomórkowych modeli zakażeń Staphylococcus aureus

Poznaj metodę izolacji leukocytów wielojądrzastych z krwi ludzkiej oraz dwa testy ilościowej oceny cytotoksyczności Staphylococcus aureus wobec tych komórek odpornościowych.

Kwantyfikacja cytotoksyczności Staphylococcus aureus w stosunku do ludzkich leukocytów wielojądrzastych

Przeglądaj więcej filmów