Kwantyfikacja cytotoksyczności Staphylococcus aureus w stosunku do ludzkich leukocytów wielojądrzastych

Staphylococcus aureus to bakteria Gram-dodatnia, która wytwarza szeroką gamę czynników wirulencji, które promują patogenezę. Należą do nich dwuskładnikowe leukotoksyny, które zaburzają integralność błony leukocytów wielojądrzastych, zwanych również PMN lub neutrofilami. Ten film ilustruje izolację PMN z ludzkiej krwi pełnej i dwa odrębne testy do ilościowego określania cytotoksyczności S.aureus wobec tych ważnych wrodzonych komórek odpornościowych.

Wszystkie te testy można wykonać za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego i można je łatwo dostosować do badania innych aspektów interakcji patogenów gospodarza. Eksperymenty te będą wykorzystywać pełną krew pobraną od ludzkich dawców i będą wymagały zgody odpowiedniego komitetu instytucjonalnego lub komisji rewizyjnej, a także oświadczenia, że uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników. Pierwszym etapem tej procedury jest izolacja neutrofili poprzez zastosowanie wirowania i gradientów gęstości.

Najpierw przynieś 50 mililitrów 3% dekstranu 0,9% chlorku sodu, 35 mililitrów 0,9% chlorku sodu, 20 mililitrów 1,8% chlorku sodu, 12 mililitrów 1,077 grama na mililitr roztworu figolu i 20 mililitrów wody do temperatury pokojowej. Przenieś 25 mililitrów świeżo pobranej heparynizowanej pełnej krwi ludzkiej do dwóch stożkowych probówek wirówkowych. Połącz 25 mililitrów świeżo pobranej heparynizowanej krwi pełnej z 25 mililitrami równoważnej objętości w temperaturze pokojowej, 3% dekstranu, 0,9% chlorku sodu w stosunku jeden do jednego.

Wymieszaj, delikatnie kołysząc każdą 50-mililitrową stożkową rurkę, a następnie odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po inkubacji w temperaturze pokojowej pojawią się dwie oddzielne warstwy. Przenieś górną warstwę każdej mieszaniny krwi dekstranu do nowych 50-mililitrowych stożkowych probówek.

Wirować przy 450 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z małymi przerwami lub bez nich. Ostrożnie odessać oba supernatanty i wyrzucić, nie naruszając osadów komórkowych. Delikatnie zawieś każdą komórkę w dwóch mililitrach 0,9% chlorku sodu.

Połącz zawieszone granulki w pojedynczym, stożkowym o pojemności 50 mililitrów, a następnie dodaj pozostałe 0,9% chlorku sodu do końcowej objętości 35 mililitrów. Ostrożnie umieść 10 mililitrów 1,077 grama na mililitr roztworu fikolu pod zawiesiną komórek za pomocą pipety ręcznej. Po wirowaniu z masą 450 g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, z małymi przerwami lub bez nich, delikatnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego, jak pokazano wcześniej.

Liza czerwonych krwinek poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 20 mililitrach wody o temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszaj, kołysząc przez 30 sekund. Natychmiast dodać 20 mililitrów 1,8% chlorku sodu i odwirować próbkę o masie 450 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Ostrożnie odessać supernatant, jak pokazano wcześniej. Delikatnie zawieś ponownie osad ogniwa w dwóch mililitrach RPMI w temperaturze pokojowej i umieść na lodzie. Policz komórki za pomocą hemekytometru.

Ponownie zawiesić oczyszczone PMN w stężeniu od jednego razy 10 do 7 komórek na mililitr z lodowatym RPMI i trzymać na lodzie. Połącz 100 mikrolitrów oczyszczonych PMN z 300 mikrolitrami DPBS, zawierającymi jeden mikrolitr barwienia jodkiem propidyny w dwóch probówkach do cytometrii przepływowej z replikami. W celu uzyskania kontroli dodatniej dodaj 40 mikrolitrów 0,5% roztworu Triton X-100 do jednej z probówek cytometrii przepływowej i dokładnie wymieszaj.

Użyj cytometrii przepływowej do pomiaru rozproszenia do przodu, rozproszenia bocznego i barwienia jodkiem propidyny, aby określić czystość i integralność izolowanych PMN. Należy stosować wyłącznie preparaty PMN o czystości powyżej 98% i ujemnej zawartości jodku propidu powyżej 95%. Aby zapoznać się z protokołem opisującym izolację normalnej ludzkiej surowicy, należy zapoznać się z pełnym rękopisem.

Przygotuj 96-dołkową płytkę do testów cytotoksyczności PMN, dodając 100 mikrolitrów 20% izolowanej ludzkiej surowicy rozcieńczonej DPBS do poszczególnych studzienek, które zostaną użyte w tym teście. Należy pamiętać o dołączeniu co najmniej jednej studzienki kontroli ujemnej, która będzie otrzymywać tylko pożywkę i co najmniej jednej studzienki kontroli pozytywnej, która otrzyma 0,05% Triton X. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji umyj zakodowane studzienki dwukrotnie 100 mikrolitrami lodowatego DPBS i umieść płytkę na lodzie.

Usuń wszelkie pozostałości DPBS z dołków płytkowych i delikatnie dodaj 100 mikrolitrów oczyszczonych ludzkich PMN jednorazowo od 10 do 7 komórek na mililitr do każdej zakodowanej studzienki. Pozostawić posiane neutrofile do ustabilizowania się, pozostawiając je na lodzie na co najmniej pięć minut przed użyciem w następujących testach cytotoksyczności. W tej sekcji opisano test, który określa ilościowo cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez gronkowca złocistego w stosunku do ludzkich PMN.

Hodowlę S.aureus przez noc w odpowiednich pożywkach za pomocą inkubatora wstrząsającego ustawionego na 37 stopni Celsjusza dzień przed eksperymentem. Subkultura S.aureus, wykonując rozcieńczenie od 1 do 100 nocnych kultur bakterii ze świeżą pożywką. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem, aż bakterie osiągną wczesną fazę wzrostu stacjonarnego.

Po pięciu godzinach wzrostu przenieś jeden mililitr subkultury S.aureus do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i odwiruj przy 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odessać supernatanty. Przepuścić zassane supernatanty przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i umieścić na lodzie.

Wykonać seryjne rozcieńczenia supernatantów lodowatymi pożywkami używanymi do hodowli gronkowca złocistego. Delikatnie dodać próbki supernatantu lub pożywkę wypożyczoną do kontroli ujemnej i pozytywnej do poszczególnych studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej PMN na lodzie, jak opisano wcześniej. Delikatnie kołysz płytę, aby rozprowadzić supernatanty w studzienkach i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W pożądanym czasie wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić na lodzie. Dodaj 300 mikrolitrów lodowatego DPBS zawierającego jeden mikrolitr jodku propidyny do każdej probówki cytometrii przepływowej. Przenieść próbki do probówek do cytometrii przepływowej na lodzie.

W przypadku studzienki kontroli dodatniej dodać 20 mikrolitrów 10% Triton X do próbki przed przeniesieniem do probówki do cytometrii przepływowej. Analiza barwienia jodkiem propidyny zatrutych PMN za pomocą cytometrii przepływowej. W tej sekcji opisano test, który określa ilościowo cytotoksyczność S.aureus po fagocytozie przez ludzkie PMN.

Krzywe wzrostu określone przez gęstość optyczną przy 600 nanometrach i stężenie bakterii muszą zostać określone dla odpowiednich szczepów gronkowca złocistego przed użyciem w tym badaniu. Rozpocznij nocne hodowle szczepów S.aureus i subkultur bakterii, jak opisano wcześniej. Gdy subkulturowany gronkowiec złocisty osiągnie średni wykładniczy wzrost, przenieś jeden mililitr bakterii hodowlanych do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i odwiruj przy 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Przemyć S.aureus poprzez zassanie jego supernatantu bez naruszania osadu i ponownie zawiesić granulowane bakterie w jednym mililitrze DPBS. Wirować próbki przez 30 sekund. Odwirować próbki o masie 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Aby namsić gronkowca złocistego, najpierw ponownie zawieś osad bakteryjny w jednym mililitrze 20% ludzkiej surowicy. Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem przez 15 minut. Umyć zawijanego gronkowca złocistego po odwirowaniu, jak pokazano wcześniej.

Rozcieńczone szczepy gronkowca złocistego do 10 razy do 8 jednostek tworzących kolonię, CFU na mililitr, z lodowatym RPMI. Wirować próbkę przez 30 sekund i umieścić na lodzie. Potwierdź stężenia gronkowca złocistego użytego do tych testów, posiewając od jednego do 10 seryjnych rozcieńczeń bakterii na agarze .

Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę każdego szczepu Staph aureus lub RPMI dla kontroli pozytywnej i ujemnej do PMN w 96-dołkowej płytce na lodzie od kroku 1.14. Delikatnie kołysz płytę, aby rozprowadzić gronkowca złocistego w studzienkach. Zsynchronizuj fagocytozę, odwirowując płytkę o masie 500 g przez osiem minut w czterech stopniach Celsjusza i inkubując płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza natychmiast po odwirowaniu jako czas zerowy.

W żądanych punktach czasowych umieść płytkę na lodzie i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego DPBS zawierającego jeden mikrolitr jodku propidyny do każdej probówki cytometrii przepływowej, a następnie przenieś próbki do odpowiedniej probówki. Analizować próbki pod kątem barwienia jodkiem propidyny przy użyciu cytometrii przepływowej, jak opisano w ppkt 2.8 i 2.9. Transkrypcja dwuskładnikowych leukotoksyn, które są ukierunkowane na ludzkie PMN przez Staph aureus, wymaga układu składowego SA lub S2 do wykazania użyteczności opisanych testów do ilościowego określania cytotoksyczności gronkowca złocistego wobec ludzkich PMN.

Eksperymenty te przeprowadzono z klinicznie istotnym izolatem gronkowca złocistego zidentyfikowanym jako USA300 w zmutowanym delecji isologennej SA lub S w tym szczepie. Lewy panel przedstawia oczyszczone PMN, a prawy panel przedstawia celowo zanieczyszczone próbki jako przykład. PMN wyizolowane przy użyciu procedur opisanych w sekcji pierwszej niniejszego protokołu wybarwiono jodkiem propidyny i zbadano za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykresy rozproszenia przedniego i bocznego wykorzystano do wykrycia zanieczyszczenia oczyszczonymi PMN przez monocyty lub limfocyty w latach 1A i 1B. Integralność PMN określono za pomocą barwienia jodkiem propidyny. Stosując opisaną metodę oczyszczania ludzkiego PMN, możemy konsekwentnie izolować pięć razy od 10 do 7 do jednego razy od 10 do 8 PMN, które mają ponad 98% czystości i są ponad 95% ujemne pod względem jodku propidyny.

Cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez USA300 i mutanta AsaeR/S badano w stosunku do oczyszczonych PMN. Eksperymenty te wykazują zależny od stężenia wzrost barwienia jodkiem propidyny oczyszczonych PMN po 30 minutach zatrucia białkami zewnątrzkomórkowymi wytwarzanymi przez USA300, ale nie mutantem AsaeR/S. Dalsze eksperymenty wykazały stały wzrost odsetka PMN dodatnich na jodku propidyny po zatruciu białkami zewnątrzkomórkowymi USA300, które ustabilizowały się po około 30 minutach.

Minimalne zabarwienie jodkiem propidyny ludzkich PMN odnotowano we wszystkich punktach czasowych po ekspozycji na białka zewnątrzkomórkowe wytwarzane przez mutanta AsaeR/S. Na koniec przetestowano cytotoksyczność mutantu USA300 i AsaeR/S wobec PMN po zsynchronizowanej fagocytozie, zaobserwowano zależny od stężenia wzrost proporcji PMN dodatnich dla jodku propidyny 90 minut po fagocytozie USA300. Istotnie mniej PMN było dodatnich pod względem jodku propidyny po fagocytozie mutanta AsaeR/S.

W każdym z tych eksperymentów zastosowano wyliczenie zmutowanych inokulum USA300 i AsaeR/S, które wykazało, że kontrast w cytotoksyczności między tymi szczepami nie był spowodowany różnicami w stężeniu użytych bakterii. Protokół ten opisuje oczyszczanie PMN z ludzkiej krwi za pomocą dwóch odrębnych technik ilościowego określania cytotoksyczności S.aureus wobec tych wrodzonych komórek odpornościowych. Powodzenie tych procedur będzie zależało od jakości oczyszczonych PMN i odpowiedniego przygotowania bakterii Stahrus lub supernatantów.

Prosimy o zapoznanie się z pełnym manuskryptem, aby zapoznać się z ważnymi punktami, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania tych procedur. USA300 jest zjadliwym izolatem MRSA, a utrata AsaeR/S radykalnie zmniejsza transkrypcję czynników wirulencji, które są ukierunkowane na ludzkie PMN, co czyni te szczepy idealnymi modelami do porównywania cytotoksyczności przy użyciu opisanych testów. W przypadku stosowania innych szczepów gronkowca złocistego może być konieczne dostosowanie warunków wzrostu, ilości dodawanych supernatantów lub stosunku bakterii do PMN.