Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Metoda ta zapewnia szybką, kontrolowaną temperaturę edycję genów CRISPR-Cas9 pod małą cząsteczką Shield-1. Oferuje również mniej efektów off-target, niższą toksyczność komórkową, a także wyższą wewnętrznie kontrolowaną edycję genów w porównaniu z konstytutywną aktywacją Cas9. Główną zaletą tej cząstki jest to, że można ją wykorzystać do charakterystyki niezbędnych genów, a także genów przeżycia guza.

Destabilizacja DD-Cas9 jest niezależna od jego ekspresji, a to pozwala na koekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania w tym samym promotorze. Metodę tę można łatwo zastosować w badaniach in vivo i in vitro. Shield-1 może również przenikać przez barierę krew-mózg, co ułatwia również badanie genów zaangażowanych w rozwój mózgu.

Równomiernie wysiewaj zdrowe komórki HEK293T o gęstości od jednego do dwóch milionów komórek na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej, używając 10 mililitrów glukozy DMEM z 10% przefiltrowanym FBS. Inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza przez 20 godzin. Następnego dnia potwierdź, że komórki osiągnęły 70% konfluencji za pomocą mikroskopii jasnego pola i że są równomiernie rozproszone na płytce.

Zmień pożywkę na godzinę przed transfekcją z końcową objętością 10 mililitrów. Przygotuj dwie probówki z 500 mikrolitrami ciepłego podłoża. Dodaj 25 mikrolitrów odczynnika do transfekcji do pierwszej probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Do drugiej probówki dodaj mieszaninę plazmidów. Wymieszaj probówkę pierwszą z probówką drugą, aby utworzyć mieszaninę transfekcji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami do komórek HEK293T i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Po 18 godzinach ostrożnie zmień pożywkę na 10 mililitrów świeżego DMEM z 10% FBS, aby usunąć odczynnik do transfekcji. Inkubuj komórki przez następne 48 godzin. Po 48 godzinach zebrać supernatant za pomocą 10-mililitrowej strzykawki i przepuścić go przez filtr 0,45 mikrometra.

Podzielić na porcje supernatant wirusa i przechowywać go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić miano wirusa, należy wysiać 5 milionów HEK293T komórek na studzienkę na dwie sześciodołkowe płytki. Inkubuj obie płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc, aby osiągnąć 50 do 60% zgrywki.

Następnego dnia użyj jednej z sześciodołkowych płytek, aby policzyć komórki w sześciu dołkach. Rozmrozić podwielokrotność wirusa, która zostanie użyta do przeprowadzenia seryjnego rozcieńczania i dodać osiem mikrogramów na mililitr odczynnika polibrenowego, przygotować DMEM z 10% FBS do seryjnego rozcieńczania wirusa i dodać odczynnik polibrenowy. Przygotować dwa mililitry dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń lentiwirusa od 0,1 do 0,0001 w pożywce zawierającej polibren.

Usuń pożywkę z płytki sześciodołkowej i dodaj jeden mililitr rozcieńczeń wirusa do studzienek, pozostawiając jedną studzienkę z samą pożywką jako kontrolę negatywną i jedną studzienkę ze 100% wirusem. Inkubuj komórki przez 24 godziny. Następnego dnia usuń pożywkę z wirusem z płytek sześciodołkowych i zmień ją na dwa mililitry świeżego DMEM z 10% FBS.

Inkubuj komórki przez 48 do 72 godzin, obserwując GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego każdego dnia. Po 48 do 72 godzinach odłącz ogniwa i ponownie zawieś je w buforze max. Użyć cytometru przepływowego, aby określić procentową zawartość wyrażenia GFP i obliczyć miano wirusa, korzystając ze wzoru podanego w manuskrypcie.

Umieść linię komórkową zainteresowania na 10-centymetrowej płytce i inkubuj przez noc, aby osiągnąć zbieg od 50 do 60%Następnie zainfekuj komórki 500 do 2 000 mikrolitrów cząstek wirusa w 10 mililitrach całkowitej objętości pożywki hodowlanej. Inkubuj pożywkę wirusową przez 24 godziny. Następnego dnia zmień pożywkę wirusową na pożywkę hodowlaną i określ procent komórek GFP dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.

Wybierz komórki GFP dodatnie przy użyciu BD FACSAria II do sortowania komórek. Rozwiń pozytywnie wybrane komórki i zamroź zapas. Dodatnio wybrane komórki i komórki nietransdukowane należy umieścić osobno na płytkach 12-dołkowych, 24 godziny po zakażeniu.

Poczekaj, aż komórki się przyczepią i zmień pożywkę na pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą 200 nanomolowych Shield-1. Zastąp pożywkę w płytkach komórkami transdukowanymi i nietransdukowanymi, pozostawiając dwie studzienki na płytkę ze zwykłymi pożywkami jako kontrolę ujemną. Inkubować i ekstrahować białka z każdej studzienki w temperaturze zero, dwóch, sześciu, 12, 24, 48 i 72 godzin po dodaniu Shield-1 do studzienek.

Następnie usuń pożywkę z Shield-1 z pozostałych studzienek i zmień ją na zwykłą pożywkę komórkową. Zbierz białka z tych studzienek po dwóch, sześciu i 12 godzinach po zmianie pożywki. Indukcję białka Cas9 potwierdzono przez to, że poziomy jego ekspresji były podobne wśród transdukowanych komórek i nośnika, niezależnie od obecności lub braku Shield-1.

Ekspresja Cas9 w transdukowanej linii komórkowej A549 jest wystarczająca dwie godziny po leczeniu Shield-1, która staje się nieistotna w ciągu sześciu do 12 godzin po odstawieniu Shield-1. Liczba transdukowanych komórek A549 poddanych działaniu Shield-1 zmniejszyła się po 48 godzinach bez wpływu na próbkę Rinella, która została zwalidowana przez immunoblotting przy użyciu przeciwciała przeciwko zubożonemu białku RPA3. Mutacje inwersyjne lub indel związane z edycją genów potwierdzono za pomocą testów nukleazy geodezyjnej.

Zaprojektowany konstrukt wektora lentiwirusa był systemem bicystronicznym zawierającym inny interesujący nas gen pod tym samym promotorem EF-1a. Zmodyfikowane białko fluorescencyjne, P2A, zostało dodane do śladowych zainfekowanych komórek. Ekspresję białka mVenus obserwowano w nośniku i komórkach transdukowanych A549, niezależnie od ekspresji DD-Cas9 i leczenia Shield-1.

Wydajna transdukcja linii komórkowej za pomocą wektora DD-Cas9 jest jednym z etapów ograniczających szybkość, ponieważ posiadanie zdrowych komórek HEK293T i wykorzystanie ich niskiej liczby pasażów ma kluczowe znaczenie. Optymalizacja stosunku między plazmidem DD-Cas9, plazmidem pakującym i plazmidem otoczki jest bardzo ważna dla optymalnej transfekcji. Ale oprócz tego, również ilość Shield-1, która jest potrzebna do ustabilizowania komórek docelowych DD-Cas9, jest czymś, na co należy uważać.

Dostępny jest również DD-Cas9 z plazmidem Cre, który może być wykorzystywany do badania interakcji genetycznych w badaniach in vivo opartych na systemie Cre-lox.