Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego
14 lutego 2020
Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.
Metoda ta umożliwia analizę ludzkiej bariery krew-mózg poprzez pomiar przenikania bakterii przy różnych zabiegach. Może pomóc w odkryciu patogenezy bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenia pooperacyjnego. Jest to prosta metoda, a efekty leczenia są bezpośrednio reprezentowane przez liczbę bakterii.
Można go zmodyfikować, aby umożliwić wysokoprzepustową analizę związków na komórkach śródbłonka. Zacznij od złożenia 12-dołkowej płytki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Rozpakuj płytkę i każdą wkładkę, a następnie użyj wysterylizowanych kleszczy, aby chwycić wkładki u podstawy i włożyć je do studzienek.
Pokryj porowatą błonę każdej wkładki 90 mikrolitrami po 10 mikrogramów na mikrolitr kolagenu IV i fibronektyny mieszaniny i inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji umyć wkładki dwukrotnie, pipetując jeden mililitr PBS do każdej wkładki i zasysając ją za pomocą pompy próżniowej. Następnie zrównoważyć membrany, pipetując wstępnie podgrzaną pożywkę DMEM F12 w górnej i dolnej komorze i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Aby wysiać ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego, odessać pożywkę z kolby do hodowli komórkowych i przemyć komórki 10 mililitrami PBS. Przykryj komórki całkowicie pięcioma mililitrami trypsyny EDTA i inkubuj kolbę przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś pięć mililitrów komórek do 15-mililitrowej probówki i dodaj pięć mililitrów pożywki zawierającej FCS, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
Odwirować zawiesinę przez trzy minuty w temperaturze 210 razy g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki. Dodać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do 10 mikrolitrów 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego, a następnie dodać 10 mikrolitrów mieszaniny do komory liczącej. Włóż komorę zliczającą do licznika komórek i uruchom odpowiedni program, upewniając się, że licznik jest zogniskowany.
Po zliczeniu wysiewaj 200 000 komórek do każdej górnej komory na 12-dołkowej płytce i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 dni, zmieniając pożywkę w górnej i dolnej komorze co dwa do trzech dni. Po 14 dniach upewnij się, że zbieżność komórek wynosi 100%, obrazując je pod mikroskopem. Na dzień przed pomiarem przepuszczalności umieść jedną kolonię szczepu E. coli GM2163 w trzech mililitrach pożywki LB.
Hodować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w wytrząsarce do inkubacji. Aby potraktować komórki interesującym je związkiem, rozcieńczyć go do końcowego stężenia w pożywce DMEM F12 i dodać tę mieszaninę do górnej i dolnej komory na 12-dołkowej płytce, a następnie inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po inkubacji należy wymienić całe podłoże na podłoże wolne od antybiotyków.
Określ stężenie nocnej kultury bakteryjnej, mierząc jej gęstość optyczną na 600 nanometrach, a następnie rozcieńcz ją do OD600 0,5 w 50-mililitrowej probówce Falcona. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 450 mikrolitrów roztworu bakteryjnego do każdej górnej komory 12-dołkowej płytki, a następnie inkubuj płytkę przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji wyjąć wkładkę za pomocą kleszczy i pobrać próbkę 50 mikrolitrów pożywki z każdej dolnej komory, uważając, aby nie rozlać pożywki z górnych komór do dolnych.
Ważne jest, aby ściśle oddzielić pożywkę górnej i dolnej komory, ponieważ rozlanie się bakterii z górnej komory doprowadziłoby do fałszywie dodatnich wyników. Upuść każdą próbkę na osobną płytkę agarową i rozprowadź roztwór za pomocą rozsiewacza komórek. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, a następnie policz kolonie.
Aby zbadać wpływ glikacji na przechodzenie drobnoustrojów przez barierę krew-mózg, komórki traktowano 0,5 i 0,15 milimolowym roztworem glioksalu przez jedną godzinę, przy czym nieleczone komórki służyły jako kontrola. Glikację wykryto następnie za pomocą immunoblottingu z przeciwciałami anty-AGE. Uzyskane kolonie bakteryjne policzono i przedstawiono jako bezwzględną liczbę kolonii lub względną liczbę kolonii znormalizowaną do kontroli.
Próbki poddane działaniu glioksalu wykazywały zwiększoną liczbę kolonii, co wskazuje, że leczenie ma wpływ na gęstość bariery komórkowej. Aby zbadać glikację białek indukowaną przez glukozę, THBMEC hodowano w pożywce o normalnej i wysokiej zawartości glukozy. Bezwzględna liczba kolonii i względna liczba kolonii znormalizowana do grupy kontrolnej wskazały, że glukoza nie miała znaczącego wpływu na integralność bariery krew-mózg.
Leczone komórki śródbłonka mogą być dalej analizowane za pomocą podejść proteomicznych, na przykład spektrometrii mas, w celu analizy zmian w proteomie. Ta technika pomaga w zrozumieniu ludzkiej bariery krew-mózg i przenikania bakterii. Może być wykorzystany do odkrywania aspektów starzenia się i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę analizy ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) poprzez pomiar przenikania bakterii przy zastosowaniu różnych form leczenia. Ma ono na celu pogłębienie wiedzy na temat takich schorzeń jak bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych oraz majaczenie pooperacyjne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikrobiologia
Wstęp
- Bariera krew-mózg (BKM) selektywnie ogranicza przenikanie cząsteczek hydrofilowych oraz patogenów do mózgu.
- Zwiększona przepuszczalność BKM jest powiązana z różnymi stanami patologicznymi.
- Zrozumienie przepuszczalności BKM może pomóc w odkryciu patogenezy niektórych chorób.
- Modele hodowli komórek śródbłonkowych są niezbędne do badania właściwości BKM.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu do badania przepuszczalności BBP.
- Zbadanie wpływu różnych terapii na przenikanie drobnoustrojów.
- Analiza znaczenia tych wyników w kontekście chorób związanych z dysfunkcją BBP.
Zastosowane metody
- Powlekanie wkładów kolagenem IV i fibronektyną do hodowli komórkowej.
- Wysiewanie ludzkich komórek śródbłonka naczyń mikrokrążenia i ich utrzymywanie przez 14 dni.
- Pomiar przenikania bakterii przy użyciu E. coli i analiza wyników poprzez liczenie kolonii.
- Badanie wpływu glikacji na przenikanie drobnoustrojów przy użyciu glioksalu.
Główne wyniki
- Obróbka glioksalem zwiększyła liczbę kolonii bakteryjnych, co wskazuje na zmianę szczelności bariery.
- Warunki wysokiego stężenia glukozy nie wpłynęły znacząco na integralność BBB.
- Metody proteomiczne mogą służyć do dalszej analizy poddanych obróbce komórek śródbłonka.
- Metoda ta umożliwia wysokoprzepustową analizę związków wpływających na BBB.
Wnioski
- Opracowany model jest skuteczny w badaniu przepuszczalności BBB.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia patogenezy chorób neurologicznych.
- Dalsze badania mogą wykorzystać tę metodę do analizy procesów starzenia oraz stanów neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda umożliwia ilościową ocenę przepuszczalności bariery krew-mózg poprzez migrację drobnoustrojów, zapewniając funkcjonalny odczyt służący do walidacji celów w procesie poszukiwania leków działających na ośrodkowy układ nerwowy. Poprzez powiązanie szczelności bariery z fenotypami istotnymi dla przebiegu choroby, takimi jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych oraz majaczenie, metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w weryfikacji hipotez terapeutycznych. Format testu pozwala na przesiewanie związków modulujących funkcję bariery śródbłonkowej, co dostarcza informacji niezbędnych do identyfikacji związków wiodących oraz zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących przepuszczalności barier oraz mechanizmów przenikania patogenów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowy odczyt oparty na liczeniu kolonii w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję związków z portfolio poprzez identyfikację substancji zmieniających gęstość bariery w kontekście danej jednostki chorobowej.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie zwalidowanych układów biologicznych do późniejszego przesiewania związków oraz oceny przepuszczalności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki zdefiniowanej hodowli komórek śródbłonka na kolagenie IV/fibonektynie.
- Skalowalność: Wspiera wysokoprzepustową analizę wpływu związków na komórki śródbłonka, zgodnie z opisem w protokole.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Modeluje przenikanie drobnoustrojów powiązane z patologiami takimi jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, umożliwiając ocenę systemów istotnych dla przebiegu choroby.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na analizę endogennych czynników komórkowych oraz wpływu glikacji na integralność bariery.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka poprzez powiązanie przepuszczalności in vitro z patogenezą in vivo.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, szczególnie w przypadku terapii skierowanych na OUN, gdzie przenikanie przez bariery jest krytycznym parametrem.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji barierowej oraz wyjaśnianie szlaków poprzez modele glikacji i traktowania glukozą.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz oraz wyniki ilościowe służące do oceny wpływu związków na przepuszczalność śródbłonka.
- Analityka: Dostarcza mierzalne zmienne zależne (liczba kolonii), które umożliwiają porównanie między różnymi warunkami traktowania.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie przenikania bakterii istotnego dla infekcji i stanów zapalnych układu nerwowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny modulacji BBB w wielu bibliotekach związków i modelach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej funkcji barierowej.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki zdefiniowanej hodowli komórkowej i pomiarowi przenikania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje go/no-go poprzez wczesną identyfikację związków modulujących barierę, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o profile przepuszczalności BBB powiązane z mechanizmami chorobowymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych, technik sterylnych oraz postępowania z mikroorganizmami w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Metoda zależy od dostępności aparatury do liczenia komórek, inkubacji oraz kwantyfikacji kolonii.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przepływów pracy biologicznych i mikrobiologicznych w celu zapobiegania artefaktom wynikającym z kontaminacji krzyżowej.
- Wymagane jest rozważenie adaptacji metody przy rozszerzaniu jej na inne szczepy bakteryjne lub modele patogenne.
- Ograniczenia praktyczne obejmują sześciogodzinne okno inkubacji oraz konieczność ścisłej separacji komór w celu uniknięcia wyników fałszywie dodatnich.
