Name: Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Poznaj metodę analizy przepuszczalności bariery krew-mózg poprzez pomiar przenikania bakterii E. coli przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego. Technika ta umożliwia badanie patogenezy zapalenia opon mózgowych i delirium pooperacyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Maryam Hussain za wcześniejszą pracę nad tą metodą, grupie PD dr Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) za dostarczenie THBMEC i Juliane Weber za krytyczną lekturę rękopisu. Badanie to było wspierane przez RTK 2155 (ProMoAge).

1. Przygotowanie buforu i odczynników
<ol>
	<li>Przygotować 10-krotny bufor fosforanowo-solny (10x PBS), dodając 80 g chlorku sodu (NaCl), 2 g chlorku potasu (KCl), 14,4 g wodorofosforanu sodu dwuwodnego (Na2HPO4 · 2H2O) oraz 2 g wodorofosforanu potasu (KH2PO4) do 1 L szklanej kolby z 1 L podwójnie destylowanej wody H2O. Roztwór 10x PBS poddać autoklawowaniu, a następnie 100 mL tego roztworu rozcieńczyć w 900 mL podwójnie destylowanej wody, aby otrzymać 1x PBS.
	<ol>
		<li>Do sterylizacji roztworów użyć autoklawu. Umieścić szklaną kolbę w koszyku, zamknąć pokrywę i sterylizować przez 15 min w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 98,9 kPa. 
		UWAGA: Protokół ten jest zawsze stosowany podczas autoklawowania roztworów w kolejnych etapach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór kolagenu IV o stężeniu 10 µg/mL oraz roztwór fibronektyny o stężeniu 10 µg/mL poprzez rozcieńczenie roztworu fibronektyny 0,5 mg/mL oraz roztworu kolagenu IV 0,3 mg/mL za pomocą 1x PBS do alikwotów 100 mg/µL w probówkach mikrocentryfugowych 1,5 mL. Następnie zmieszać 100 µL obu alikwotów z 1 800 µL 1x PBS w probówkach mikrocentryfugowych 2 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę DMEM/F-12, dodając do niej 4% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy oraz 100 mg/L penicyliny/streptomycyny, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 1-krotny roztwór trypsyny-EDTA poprzez rozcieńczenie 5 mL 10-krotnie stężonego roztworu trypsyny-EDTA w 45 mL 1x PBS w probówce 50 mL i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 500 mL pożywki LB, odważając 10 g bazy bulionu LB do 500 mL szklanej kolby. Dodać 500 mL sterylnej wody i poddać autoklawowaniu.</li>
	<li>Przygotować agar LB, odważając 10 g bazy bulionu LB i 7,5 g agar-agaru do 500 mL szklanej kolby. Przed autoklawowaniem dodać 500 mL sterylnej wody, nie zamykając pokrywy kolby. Poddać autoklawowaniu i pozostawić roztwór do ostygnięcia, aż będzie ciepły w dotyku.</li>
	<li>Przygotować pożywkę bez antybiotyków, dodając 4% płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM L-glutaminy, ale bez penicyliny/streptomycyny, do pożywki DMEM/F-12 i przechowywać w temperaturze 4 °C, analogicznie jak w kroku 1.3.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek imitujących barierę krew-mózg
<ol>
	<li>Aby przygotować płytkę 12-dołkową, umieść wkłady do hodowli komórkowych w dołkach (Rysunek 2A).
	<ol>
		<li>Rozpakuj płytkę oraz każdy wkład w komorze z laminarnym przepływem powietrza i tam wykonuj kolejne kroki. Używaj wysterylizowanej pęsety, chwytając wkład za szeroką podstawę, aby go przemieścić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj porowatą membranę każdego wkładu 90 µL mieszaniny 10 µg/mL kolagenu IV i 10 µg/mL fibronektyny. Inkubuj płytkę 12-dołkową przez 24 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych (Rysunek 2B).</li>
	<li>Przemyj wkłady dwukrotnie, pipetując 1 mL 1x PBS do każdego wkładu, a następnie odessij roztwór za pomocą pompy próżniowej do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Urównoważ membrany, pipetując 0,5 mL uprzednio ogrzanej pożywki DMEM/F-12 do komory górnej i 1,5 mL do komory dolnej. Inkubuj płytkę przez 30 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych w atmosferze 5% CO2 (Rysunek 2C).</li>
	<li>Zasiej 2 x 105 ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka do każdej komory górnej i inkubuj płytkę 12-dołkową w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych (Rysunek 2D).
	<ol>
		<li>Odessij pożywkę z kolby do hodowli komórkowych za pomocą pompy próżniowej do hodowli komórkowych i przemyj monowarstwę, pipetując 10 mL 1x PBS, a następnie odsysając roztwór pompą próżniową.</li>
		<li>Całkowicie pokryj komórki 1x stężoną trypsyną-EDTA, pipetując 5 mL roztworu do kolby do hodowli komórkowych. Inkubuj kolbę przez 3-5 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. 
		UWAGA: Jeśli komórki nie uległy dysocjacji, energicznie uderz kolbą o wnętrze dłoni, aby oderwać komórki.</li>
		<li>Pobierz pipetą 5 mL zawiesiny komórkowej do probówki 15 mL i dodaj 5 mL pożywki zawierającej FCS, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
		<li>Wirowarkuj zawiesinę przez 3 min przy 210 x g, usuń nadsącz za pomocą pompy próżniowej i resuspenduj osad w 5 mL pożywki za pomocą pipety.</li>
		<li>Użyj licznika komórek, mieszając 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL 0,4% barwnika trypan blue w mikroprobówce 1,5 mL. Dodaj 10 µL mieszaniny do komory liczbowej, umieść ją w liczniku komórek i rozpocznij liczenie.
		<ol>
			<li>Ustaw ostrość licznika na komórkach tak, aby ich krawędzie były ciemnoniebieskie, a środek biały. Następnie uruchom odpowiedni program do liczenia komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby obliczyć objętość dla każdego wkładu, podziel uzyskaną liczbę 2 x 105 komórek na wkład przez obliczone stężenie zawiesiny komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla modelu bariery krew-mózg
<ol>
	<li>Inkubować płytkę 12-dołkową przez 14 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wymieniać 0,5 mL pożywki w komorze górnej oraz 1,5 mL pożywki w komorze dolnej co 2-3 dni. Pożywkę należy ogrzać przed dodaniem do kolby z komórkami. Odessać ciecz za pomocą pompy próżniowej (Rysunek 2E). 
	UWAGA: Pracować ostrożnie, aby nie dotknąć membrany.</li>
	<li>Sprawdzić stan komórek za pomocą mikroskopu i określić stopień konfluencji. Upewnić się, że po 14 dniach konfluencja wynosi 100%.</li>
</ol>
4. Przygotowanie bakterii
<ol>
	<li>Dzień przed pomiarem należy przenieść kolonię szczepu E. coli GM2163 do pożywki LB. Inkubować probówkę z kulturą przez 24 h w temperaturze 37 °C przy 180 rpm w inkubatorze z wytrząsaniem (Rycina 2F).
	<ol>
		<li>Hodować szczep E. coli na płytce z agarem LB w temperaturze 4 °C. Za pomocą wysterylizowanej pętlki pobrać jedną kolonię i przenieść ją do przygotowanej probówki zawierającej 3 mL pożywki LB.</li>
		<li>Przygotować płytkę z agarem LB dla każdego insertu, używając ciepłego roztworu agaru LB i wypełniając szalki Petriego do połowy ich całkowitej objętości. Pozostawić do zastygnięcia i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Traktowanie komórek
<ol>
	<li>W 14. dniu po wysianiu komórek, traktuj je związkami lub zmierz transendotelialną oporność elektryczną (TEER), jeśli było to zaplanowane (Rysunek 2G). 
	UWAGA: Zawsze należy zachować grupę komórek nietraktowanych jako kontrolę.
	<ol>
		<li>Aby potraktować komórki badanym związkiem, rozcieńcz go do stężenia końcowego w pożywce DMEM/F-12. Dodaj 0,5 mL tej mieszaniny do komory górnej i 1,5 mL do komory dolnej. Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez wymagany czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie wymień pożywkę kompletną na pożywkę bez antybiotyków, odsysając starą pożywkę za pomocą pompy próżniowej i pipety (Rysunek 2H).</li>
</ol>
6. Pomiar przepuszczalności
<ol>
	<li>Aby uzyskać stałe stężenia bakterii, zmierz gęstość optyczną fotometrem przy długości fali 600 nm. Rozcieńcz nocną kulturę bakterii w pożywce LB w probówce typu Falcon 50 mL do wartości OD600 wynoszącej 0,5 ± 0,05. Pracuj w warunkach chłodzenia na lodzie.
	<ol>
		<li>Napełnij kuwetę 1 mL pożywki LB. Uruchom fotometr i włóż kuwetę stroną z oznaczeniem do przodu. Naciśnij dolny przycisk „Blank”, aby zmierzyć wartość tła.</li>
		<li>Zmierz gęstość roztworu bakteryjnego, przelewając go do kuwety, wkładając ją do urządzenia i naciskając dolny przycisk próbki. Powtarzaj pomiar podczas rozcieńczania, aż do uzyskania końcowego stężenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza, gdzie można operować bakteriami, używając przygotowanej płytki 12-dołkowej oraz roztworu bakteryjnego o OD600 = 0,5. Dodaj 450 µL roztworu bakteryjnego wyłącznie do każdej górnej komory zawierającej 0,5 mL pożywki (Rysunek 2I).</li>
	<li>Inkubuj płytkę 12-dołkową przez 6 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze. 
	UWAGA: Protokół nakazuje w tym miejscu przerwanie pracy.</li>
	<li>Pobierz pipetą próbkę 50 µL pożywki z każdej dolnej komory, usuwając wkładkę za pomocą pęsety (Rysunek 2J). Uważaj, aby nie przelać pożywki z komór górnych do dolnych.</li>
	<li>Wysiej każdą próbkę na oddzielną płytkę z agarem (Rysunek 2K). Nanieś próbkę na płytkę i rozprowadź roztwór za pomocą rozpylacza do komórek.</li>
	<li>Inkubuj płytki z agarem przez 24 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Policz kolonie na każdej płytce (Rysunek 2L).</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Wprowadź dane do tabeli, a następnie oblicz średnią oraz odchylenie standardowe liczby zaobserwowanych kolonii dla komórek traktowanych i nietraktowanych.</li>
	<li>Przedstaw średnią jako bezwzględną liczbę kolonii.
	<ol>
		<li>W celu normalizacji wyników oblicz względną liczbę kolonii, dzieląc wszystkie wyniki przez wartość kontrolną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Mikroekstrakcja w fazie stałej; schemat doświadczenia; adsorpcja na włóknie, zbieranie analitytów, konfiguracja analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Szczegółowa prezentacja poszczególnych kroków protokołu. (A) Za pomocą wysterylizowanej pęsety umieścić wkładki w płytce 12-dołkowej. (B) Każdą wkładkę pokryć 90 µL mieszaniny fibronektyny i kolagenu IV, a następnie inkubować przez 24 h. (C) Równoważyć membrany w uprzednio ogrzanym medium przez 30 min. (D) Wysiać 2 x 105 ludzkich komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego na każdą wkładkę. (E) Hodować płytkę przez odpowiedni czas. (F) Na dzień przed pomiarem przenieść kolonię E. coli do probówki z medium LB i inkubować przez 24 h. (G) Poddać komórki działaniu czynnika lub zmierzyć TEER. (H) Wymienić medium kompletne na medium bez antybiotyków. (I) Do każdej górnej komory dodać 450 µL roztworu bakterii (OD600 = 0.5) i inkubować przez 6 h. (J) Pobrać próbkę 50 µL medium z każdej dolnej komory, usuwając wkładkę pęsetą. (K) Wysiać próbkę na płytki z agarem i inkubować przez 24 h. (L) Policzyć kolonie i przeanalizować dane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ograniczony wgląd w patogenezę przemieszczania się drobnoustrojów ogranicza dalszy rozwój terapii POD lub zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Śmiertelność i zachorowalność z powodu tych chorób wymagają lepszego leczenia pacjentów, badań nad mechanizmami leżącymi u ich podstaw oraz solidnej platformy do badań przesiewowych związków. Zdarzenia wieloczynnikowe można badać za pomocą ludzkich BMEC. Kilka zgłoszonych pomyślnie procedur izolacji BMEC z wielu gatunków wykazało utratę cech charakterystycznych sygnatury molekularnej komórek52,53. Opisane THBMEC w tej procedurze były transfekowane w bardzo wczesnych pasażach, gdzie wykazywały specyficzne cechy komórek śródbłonka mózgu i zachowywały je43. Jest to ważne, ponieważ do tej pory nie odkryto wszystkich etapów w dotkniętych szlakach, a model ten wydaje się naśladować konwencjonalne BMEC. Prezentowany przez nas model wykazuje bezpośrednie wpływy na BMEC i przenikanie drobnoustrojów przez barierę krew-mózg.
Obsługa ogniw THBMEC jest prosta, a wymagane wyposażenie techniczne znajduje się w większości laboratoriów nauk przyrodniczych. Nasz model pozwala na natychmiastowe rozpoczęcie procedur dochodzeniowych po tym, jak THBMEC zbudują szczelną monowarstwę. Zakres zastosowań może być szeroki ze względu na możliwe kombinacje nowych testów z konwencjonalnymi testami, takimi jak pomiar TEER lub znakowanie za pomocą znaczników54. Możliwe jest również dodanie astrocytów lub perycytów w celu stworzenia modelu współ- lub potrójnej hodowli. Wpływ leków na przenikanie drobnoustrojów można również przetestować w naszym modelu, traktując THBMEC związkami przed zaszczepieniem górnej komory bakteriami. W rzeczywistości istnieje możliwość zakupu wkładów z filtrami do płytek 96-dołkowych, co pozwala na automatyzację zabiegu. Może to ułatwić wdrożenie wysokoprzepustowych systemów badań przesiewowych leków w celu przyspieszenia odkrywania leków przeciwko wspomnianym chorobom i zmniejszenia skutków ubocznych dla bariery krew-mózg podczas opracowywania leków.
Krytycznym etapem w prezentowanej metodzie jest czas inkubacji po dodaniu bakterii do górnej komory. Ważne jest, aby używać godzin jako osi czasu w protokole, ponieważ czas generowania E. coli wynosi tylko 20 minuti 55 minut. W przeciwnym razie użycie różnych punktów czasowych może prowadzić do mylących wyników. Istnieje również możliwe ryzyko zanieczyszczenia między górną a dolną komorą podczas ekspozycji na bakterie, jeśli płytki nie są obchodzone z ostrożnością. Wszelkie zmiany w płytce 12-dołkowej w tym momencie mogą zanieczyścić pożywkę w dolnej komorze.
E. coli jest jedną z dobrze znanych, bardzo częstych przyczyn bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Dalsze badania powinny przetestować różne bakterie, które są również związane z zapaleniem opon mózgowych, takie jak Neisseria meningitidis56 lub Streptococcus pneumoniae57. Wydaje się, że wykorzystują one różne mechanizmy do przekraczania bariery krew-mózg i muszą być lepiej zrozumiane w leczeniu pacjentów. U pacjentów w podeszłym wieku częstość występowania POD wzrastao 26 , podobnie jak liczba występujących chorób współistniejących. Wiadomo, że zachodzą interakcje między różnymi chorobami, zwłaszcza ogólnoustrojowymi, takimi jak cukrzyca. W naszym modelu możliwe jest symulowanie tych warunków lub traktowanie komórek przed dodaniem bakterii.
Model jest ograniczony przez bezpośredni kontakt THBMEC i bakterii, dlatego konieczne są dalsze badania w celu zbadania potencjalnych mechanizmów kontaktu w celu wykrycia zaangażowanych szlaków i białek. Możliwe jest jednak usunięcie wkładek i pobranie komórek do dalszej analizy. TEER modelu jest niższy w porównaniu z modelami komórek macierzystych 38,39,40. Potwierdziliśmy to, stosując stężenie bakterii, które nie przekroczyło bariery krew-mózg w nieleczonych komórkach po 6 godzinach.
Podsumowując, metoda ta stanowi solidną platformę do analizy przenikania bakterii przez barierę krew-mózg z potencjałem do jej rozszerzenia w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.

Ludzka Bbariera krew-mózg (BBB) stanowi unikalną granicę tkanki mózgowej, oddzielającą mózg od krwi. Ściśle reguluje ona przenikanie większych i hydrofilowych cząsteczek, blokuje dyfuzję parakomórkową i utrzymuje homeostazę mózgu. Chroni ona również mózg przed wahaniami składu osocza, toksynami i drobnoustrojami oraz kieruje komórkami zapalnymi w ramach odporności ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Od czasu jej odkrycia przed stuleciem1, przeprowadzono wiele badań w celu zrozumienia struktury i funkcji BBB. Złożone interakcje komórek, białek i sygnałów z mózgu i krwi nadal wymagają dalszych badań oraz opracowania odpowiednich modeli.
Ludzka BBB składa się z trzech typów komórek: komórek śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (BMECs), perycytów oraz astrocytów2,3. BMECs różnią się od większości komórek śródbłonka w organizmie tym, że posiadają dużą liczbę połączeń ścisłych i połączeń przylegających4, niską aktywność pinocytarną2,5 oraz ciągłą błonę podstawną6,7, co blokuje dyfuzję parakomórkową. Małe cząsteczki lipofilowe mogą dyfundować i przenikać przez BBB zgodnie z gradientem stężeń; większe i hydrofilowe cząsteczki wnikają do mózgu lub go opuszczają wyłącznie poprzez polaryzowane, selektywne systemy transportowe8. Regulacja ta skutkuje wysokim transendotelialnym oporem elektrycznym (TEER) na poziomie 1,500-2,000 Ω·cm2, który jest odwrotnie skorelowany z przepuszczalnością9,10. Choć BMECs tworzą szczelną barierę, mogą one reagować na sygnały lokalne i obwodowe11,12. Między BMECs a astrocytami zachodzi ścisła interakcja13; stopki końcowe astrocytów tworzą warstwę wokół naczyń i indukują tworzenie połączeń ścisłych13,14. Są one zaangażowane w dojrzewanie BBB za pomocą różnych czynników, w tym czynnika wzrostu transformującego-β (TGF-β)15,16. Ponadto perycyty odgrywają kluczową rolę w regulacji angiogenezy17 oraz zapobieganiu apoptozie śródbłonka podczas różnicowania komórkowego18 (Rycina 1). Są one osadzone w błonie podstawnej i zapewniają stabilność strukturalną ściany naczynia19.
<img alt="Schemat bariery krew-mózg; komórki śródbłonka, astrocyty, połączenia ścisłe, transport regulowany." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczna budowa bariery krew-mózg. Wyjątkowa struktura ludzkiej BBB składa się z trzech różnych typów komórek. Światło mikronaczynia jest otoczone komórkami śródbłonka, które charakteryzują się licznymi połączeniami ścisłymi i nie są fenestrowane. Są one osadzone w błonie podstawnej, podobnie jak perycyty. Komórki te są istotne dla stabilności strukturalnej ściany naczynia i obok astrocytów odgrywają rolę w rozwoju BBB. Ich stopki tworzą gęstą warstwę wokół naczynia i wspierają formowanie się połączeń ścisłych. Wszystkie elementy BBB są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania fizjologicznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wiele różnych patologii wiąże się z załamaniem bariery krew-mózg (BBB) (np. encefalopatia septyczna). U dotkniętych tym schorzeniem pacjentów obserwuje się podwyższone poziomy białka w płynie mózgowo-rdzeniowym20, a w miąższu mózgu dotkniętych gryzoni stwierdza się zwiększony wychwyt znakowanego koloidalnego tlenku żelaza oraz aminokwasów21,22. Wyniki te wskazują na zwiększoną przepuszczalność BBB, która występuje równocześnie ze zwiększoną pinocytozą w BMECs21 oraz aktywacją śródbłonka23. Inną powiązaną patologią związaną ze zmienioną BBB jest zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych – stan nagły i złożony stan zapalny któremu towarzyszy obrzęk mózgu, mogący prowadzić do śmierci komórek neuronalnych. Przypuszcza się, że głównym miejscem wnikania krążących bakterii są naczynia mikrokrążenia24; jednak BBB zapobiega wnikaniu bakterii. Przepuszczalność BBB nie zawsze jest powiązana ze wzrostem w eksperymentalnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych pochodzenia hematogennego25, a mechanizmy te mogą być wieloczynnikowe. Współwystępowanie sepsy z poprzedsytowym majaczeniem (POD)26 oraz związek z infekcjami przedoperacyjnymi27,28 wskazują na potrzebę stworzenia modelu BBB, który umożliwia bezpośrednią ekspozycję na bakterie, aby lepiej zrozumieć patogenezę bakteryjną.
Istnieje wiele luk w zrozumieniu i kwantyfikacji przenikania drobnoustrojów przez barierę krew-mózg (BBB). Dlatego opracowaliśmy model, który umożliwia wygodne testowanie różnych czynników i warunków przy bezpośredniej korelacji między przenikaniem bakterii a wpływem na przepuszczalność BBB. Poprzednie prace koncentrowały się na przepuszczalności parakomórkowej i obejmowały pomiary TEER oraz strumień znaczników. Dodatkowo transport makrocząsteczek analizowano za pomocą cząsteczek sprzężonych lub przeciwciał, przy czym opracowano różne modele wykorzystujące wyłącznie komórki śródbłonka lub ich kombinacje z astrocytami i perycytami. Ze względu na trudności w regularnym pozyskiwaniu tkanek ludzkich, stosuje się wiele modeli opartych na zwierzętach. Komórki śródbłonka mózgu pochodzenia bydlęcego i świńskiego tworzą szczelne monowarstwy o wysokim TEER, wykazują dobrze ukształtowaną polaryzację apikalno-bazalną i nadają się do badań transportu małych cząsteczek przez BBB. Białka te różnią się sekwencją od ich ludzkich homologów29,30, co utrudnia badania nad przeciwciałami terapeutycznymi. Z tego powodu preferowane mogą być modele hodowli mysich lub ludzkich. Myszy lub szczury jako źródła próbek mają tę zaletę, że pochodzą z dobrze scharakteryzowanych gatunków, ale dostarczają niewielu komórek do celów badawczych. Można temu zaradzić poprzez zastosowanie unieśmiertelnionych linii komórkowych endotelialnych mózgu myszy (END) bEND.3, bEND.5 lub cEND31,32,33.
Pierwotne hodowle komórek z tkanek ludzkich są trudne do pozyskania i regularnego utrzymania. Dlatego większość ludzkich modeli komórkowych stosowanych w badaniach nad ludzką BBB to unieśmiertelnione linie komórek śródbłonka. Opublikowaną linią komórkową jest ludzka linia komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu hCMEC/D3, która dobrze nadaje się do badania wychwytu leków i jest łatwa w obsłudze. Komórki te tworzą monowarstwę i wykazują ekspresję charakterystycznych białek połączeń ścisłych BBB34, podczas gdy poziom ekspresji claudin-5 jest zgłaszany jako niższy niż w nienaruszonych mikronaczyniach35, a wiele specyficznych transporterów wykryto na poziomie transkrypcyjnym36 oraz w badaniach proteomicznych34. Stosunkowo niska wartość TEER w zakresie 30-50 Ω·cm2 wciąż stanowi wyzwanie37. Innym źródłem komórek śródbłonka mózgu są ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs)38 oraz ludzkie komórki macierzyste pochodzące z krwi pępowinowej z linii krążących progenitorów śródbłonka i linii hematopoetycznych39,40. Oba protokoły różnicowania prowadzą do powstania szczelnych monowarstw komórkowych i wysokich wartości TEER (np. 1,450 Ω·cm2 w kokulturach)38. Te modele komórek macierzystych wymagają szczególnej staranności w hodowli, jednak dają możliwość badania wpływu hormonów regulacyjnych41 lub chorób o podłożu genetycznym42 na rozwój BBB.
W niniejszym badaniu opracowaliśmy unieśmiertelnioną, transfekowaną linię ludzkich komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego, THBMEC43aby naśladować barierę krew-mózg (BBB) i badać przenikanie bakterii. Komórki są wysiewane na filtr i hodowane do uzyskania 100% konfluencji w tym modelu hodowli komórkowej. Bakterie są inokulowane w górnej części komory hodowlanej. Stosujemy Escherichia coli (E. coli) w naszej próbie badawczej ze względu na wysoką częstość występowania E. coli zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych44Wykazano, że najniższa przepuszczalność monowarstwy komórek występuje między 13. a 15. dniem po wysianiu.45Dlatego też traktowanie monowarstwy THBMEC przeprowadza się po tym czasie, a następnie inokuluje bakterie w medium na powierzchni apikalnej monowarstwy. Po czasie inkubacji bakterie, które były w stanie przekroczyć barierę, są kwantyfikowane poprzez wysiewanie medium z bakteriami na płytki z agarem i zliczanie kolonii. Zwiększona liczba kolonii koreluje z wyższą przenikalnością bakterii przez BHE. Wartość TEER wynosi około 70 Ω·cm.2 46Nie jest jednak konieczne pomiar TEER w opisanym метоdzie. Choć jest to uznana wartość określająca przepuszczalność BBB, wydaje się ona nie mieć wpływu na przenikanie bakterii przez BBB. Nieleczone komórki służą w naszym modelu jako kontrola szczelności. W poprzednich badaniach wykazano, że komórki są zdolne do reakcji na cytokiny prozapalne i wykazują ekspresję typowych białek połączeń ścisłych.47Umożliwia to przesiewanie związków oraz walidację większego zestawu substratów transporterów i receptorów.

<table><tbody><tr><td>Agar - Agar</td><td>Carl Roth</td><td>6494.3</td><td>Autoklaw klasy BioScience</td></tr><tr><td></td><td>Systec</td><td>VX-150</td><td></td></tr><tr><td>Bakterie E.coli szczep GM2163</td><td>Fermentas Life Sciences, Litwa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotometr</td><td>Eppendorf</td><td>6131</td><td></td></tr><tr><td>Komórki THBMEC</td><td>Grupa M. F. Stinsa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa kolby</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Uniwersalna 320</td><td>Hettrichlab</td><td>1401</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>C6745</td><td>z hodowli komórek</td></tr><tr><td>ludzkich Countess Automatyczny licznik komórek ze szkiełkami komory do liczenia komórek i barwieniem Trypan Blue 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>C10311</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane</td><td>Greiner Bio-One</td><td>191180</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety</td><td>BRAND</td><td>759015</td><td></td></tr><tr><td>Di wodorofosforan sodu z hydratem</td><td>MERCK</td><td>1065800500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO/ Thermo Sc.</td><td>11330032</td><td>Probówki HEPES</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa Surowica Bydlęca</td><td>GIBCO/ Thermo Sc.</td><td>10270</td><td>wartość FBS -Brazylia</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>F0556</td><td>roztwór ludzkie fibroblasty</td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2 Inkubator Heraeus 50116047</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora I 26 Nowy Brunszwik</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td></td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna</td><td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td><td>641000</td><td></td></tr><tr><td>LB Baza bulionowa</td><td>GIBCO/ Termo Sc.</td><td></td><td></td>12780029</tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO/ Thermo Sc.</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mikrobiologiczny B 6200</td><td>Heraeus</td><td>51015192</td><td></td></tr><tr><td>Szafa Bezpieczeństwa Mikrobiologicznego AURA 2000 M.A.C. Klasa II</td><td>BIOAIR</td><td>12469</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss</td><td>TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72,695,400</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72,706,400</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>GIBCO / Thermo Sc.</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td><td>464-800</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Roth</td><td>HN02.3</td><td></td></tr><tr><td>Di-wodorofosforan potasu</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Roth</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>ThinCerts + płytki wielodołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665631</td><td>12 dołków, wielkość porów 3,0 &mikro; m</td></tr><tr><td>Trypsyna - EDTA</td><td>GIBCO/ Thermo Sc.</td><td></td><td></td>15400054</tr><tr><td>Pompa próżniowa Laboport</td><td>KNF N</td><td>86 KT.18</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

Ludzka bariera krew-mózg (BBB) charakteryzuje się bardzo niską przepuszczalnością dla biomolekuł w celu ochrony i regulacji metabolizmu mózgu. Bariera krew-mózg składa się głównie z komórek śródbłonka osadzonych w błonach podstawnych bogatych w kolagen IV i fibronektynę. Kilka patologii wynika z dysfunkcji bariery krew-mózg, a następnie przenikania drobnoustrojów, powodując choroby, takie jak zapalenie opon mózgowych. W celu zbadania wpływu wielu parametrów, w tym różnych leków i środków znieczulających, na przepuszczalność bariery krew-mózg, stworzyliśmy nowatorski model hodowli komórek ludzkich naśladujący barierę krew-mózg z komórkami śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu. Komórki śródbłonka są hodowane na jednostkach filtracyjnych pokrytych kolagenem i fibronektyną aż do zbiegu, a następnie mogą być leczone różnymi interesującymi związkami. Aby zademonstrować przenikanie mikrobiologiczne, górna komora z wierzchołkową powierzchnią komórek śródbłonka jest zaszczepiana bakteriami. Po okresie inkubacji próbki z dolnej komory posiewa się na płytkach agarowych i liczy otrzymane kolonie, przy czym liczba kolonii koreluje z przepuszczalnością BBB. Endogenne czynniki komórkowe mogą być analizowane w tym układzie eksperymentalnym w celu wyjaśnienia podstawowych mechanizmów komórkowych komórek śródbłonka przyczyniających się do BBB. Ponadto platforma ta pozwala na wykonanie badania przesiewowego pod kątem związków, które mogą wpływać na przepuszczalność komórek śródbłonka. Wreszcie, przenikanie bakterii może być badane i łączone z różnymi patologiami, takimi jak zapalenie opon mózgowych. Być może uda się rozszerzyć model i przeanalizować szlaki bakterii przez barierę krew-mózg. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół opisanej metody w celu zbadania przepuszczalności bariery krew-mózg.

Zgodnie z protokołem wysiano komórki i zbudowano model BBB. W 14. dniu po wysianiu komórki poddano działaniu glioksalu jako reaktywnego aldehydu. Celem eksperymentu było zbadanie korelacji między wiekiem a cukrzycą w POD27 oraz wysokiej zapadalności na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u starszych pacjentów48. Podwyższone poziomy końcowych produktów zaawansowanej glikacji (AGEs) zarówno w procesie starzenia, jak i w cukrzycy49 wymagają dalszego zbadania wpływu glikacji na patogenezę przenikania drobnoustrojów przez BBB. Glikacja jest nieenzymatyczną reakcją wolnych grup aminowych w białkach z grupami karbonylowymi cukrów redukujących lub innymi związkami karbonylowymi. Glukoza jest znanym donorem grup karbonylowych; istnieją jednak związki bardziej reaktywne. Po utworzeniu niestabilnej zasady Schiffa ulegają one przegrupowaniu do bardziej stabilnych i reaktywnych związków dikarbonylowych, takich jak glioksal. AGEs, będące produktami końcowymi, mogą powodować tworzenie wiązań krzyżowych między białkami50. Mogą one uszkadzać struktury komórkowe i zmieniać funkcje komórek poprzez oddziaływanie z receptorem AGEs (RAGE)51.
Komórki traktowano roztworem glioksalu (GO) o stężeniu 0,05 i 0,15 mM przez 1 h, a jako kontrolę wykorzystano komórki nietraktowane. Glikację wykryto za pomocą immunoblottingu oraz detekcji z użyciem przeciwciała anty-AGE (Rysunek 3). Uzyskane kolonie bakterii policzono i przedstawiono jako bezwzględną liczbę kolonii (Rysunek 4A) lub względną liczbę kolonii znormalizowaną względem kontroli (Rysunek 4B). Pożywka pobrana z dołków z komórkami nietraktowanymi utworzyła bardzo mało kolonii. Wynik ten wykazał, że nietraktowane komórki były w stanie stworzyć barierę i mogły służyć jako kontrola. Próbki traktowane glioksalem wykazały zwiększoną liczbę kolonii, co prowadzi do wniosku, że glioksal wpływa na THBMECs i gęstość bariery komórkowej, ponieważ liczba kolonii wykazała istotną różnicę między komórkami nietraktowanymi a traktowanymi. Zwiększone przenikanie bakterii przez barierę po traktowaniu glioksalem może wyjaśniać, dlaczego cukrzyca koreluje z chorobami przebiegającymi z rozpadem BBB.
<img alt="Wyniki elektroforezy białek, przeciwciało anty-CML, barwienie Ponceau S, komórki THBMEC, analiza żelu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Detekcja glikacji białek za pomocą immunoblottingu. Komórki THBMECs traktowano GO w różnych stężeniach przez 1 h. Całkowite białko wyizolowano i rozdzielono za pomocą SDS-PAGE. Glikację białek wykryto za pomocą immunoblottingu z użyciem przeciwciała anty-AGE (CML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W innym układzie glikację białek THBMECs indukowano za pomocą glukozy. Do pożywki DMEM/F-12 dodano sterylną glukozę, aby zwiększyć jej stężenie z poziomu pożywki z normalną zawartością glukozy (NG) wynoszącej 17.5 mM do pożywki z wysoką zawartością glukozy (HG) wynoszącej 42.5 mM. Komórki THBMECs hodowano w dwóch różnych kolbach do hodowli komórkowej: jednej w pożywce z normalną zawartością glukozy (NG) i drugiej w pożywce z wysoką zawartością glukozy (HG). Te dwa różne rodzaje pożywek stosowano również do wzrostu BBB na filtrach w płytkach 12-dołkowych. Komórki hodowane w pożywce NG służyły jako kontrola. Uzyskane kolonie przedstawiono jako bezwzględną liczbę kolonii (Rysunek 4C) lub względną liczbę kolonii znormalizowaną względem kontroli (Rysunek 4D). Wyniki wskazują na brak istotnego wpływu na przenikanie bakterii przez ludzką BBB, co prowadzi do wniosku, że różnica między NG a HG nie była na tyle znacząca, aby wpłynąć na integralność BBB. Różne scenariusze zostały zaprojektowane w celu walidacji modelu oraz integralności komórek naśladujących BBB.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący liczbę kolonii; efekt glioksalu i poziomy glukozy; dołączona analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Bezwzględna i względna liczba policzonych kolonii bakterii w modelu BBB z wykorzystaniem THBMECs. Komórki THBMECs traktowano 0,15 mM GO przez 1 h; nietraktowane komórki służyły jako kontrola. Do każdej górnej komory dodano łącznie 450 µL zawiesiny E. coli (OD600 = 0,5). Po 6 h pożywkę z dolnych komór wysiano na płytki agarowe. (A) Wykres przedstawia średnią +/- SEM z policzonych kolonii. (B) Wykres przedstawia liczbę policzonych kolonii znormalizowaną względem nietraktowanych komórek kontrolnych +/- SEM (n = 4). Na panelach (C) i (D) komórki THBMECs hodowano w pożywce NG i HG. Do każdej górnej komory dodano łącznie 450 µL zawiesiny E. coli (OD600 = 0,5). Po 6 h pożywkę z dolnej komory wysiano na płytki agarowe. (C) Wykres przedstawia średnią +/- SEM z policzonych kolonii. (D) Wykres przedstawia liczbę policzonych kolonii znormalizowaną względem nietraktowanych komórek kontrolnych +/- SEM (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.

Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Metoda ta umożliwia analizę ludzkiej bariery krew-mózg poprzez pomiar przenikania bakterii przy różnych zabiegach. Może pomóc w odkryciu patogenezy bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenia pooperacyjnego. Jest to prosta metoda, a efekty leczenia są bezpośrednio reprezentowane przez liczbę bakterii.Można go zmodyfikować, aby umożliwić wysokoprzepustową analizę związków na komórkach śródbłonka. Zacznij od złożenia 12-dołkowej płytki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Rozpakuj płytkę i każdą wkładkę, a następnie użyj wysterylizowanych kleszczy, aby chwycić wkładki u podstawy i włożyć je do studzienek.Pokryj porowatą błonę każdej wkładki 90 mikrolitrami po 10 mikrogramów na mikrolitr kolagenu IV i fibronektyny mieszaniny i inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji umyć wkładki dwukrotnie, pipetując jeden mililitr PBS do każdej wkładki i zasysając ją za pomocą pompy próżniowej. Następnie zrównoważyć membrany, pipetując wstępnie podgrzaną pożywkę DMEM F12 w górnej i dolnej komorze i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby wysiać ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego, odessać pożywkę z kolby do hodowli komórkowych i przemyć komórki 10 mililitrami PBS. Przykryj komórki całkowicie pięcioma mililitrami trypsyny EDTA i inkubuj kolbę przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś pięć mililitrów komórek do 15-mililitrowej probówki i dodaj pięć mililitrów pożywki zawierającej FCS, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.Odwirować zawiesinę przez trzy minuty w temperaturze 210 razy g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki. Dodać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do 10 mikrolitrów 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego, a następnie dodać 10 mikrolitrów mieszaniny do komory liczącej. Włóż komorę zliczającą do licznika komórek i uruchom odpowiedni program, upewniając się, że licznik jest zogniskowany.Po zliczeniu wysiewaj 200 000 komórek do każdej górnej komory na 12-dołkowej płytce i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 dni, zmieniając pożywkę w górnej i dolnej komorze co dwa do trzech dni. Po 14 dniach upewnij się, że zbieżność komórek wynosi 100%, obrazując je pod mikroskopem. Na dzień przed pomiarem przepuszczalności umieść jedną kolonię szczepu E. coli GM2163 w trzech mililitrach pożywki LB.Hodować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w wytrząsarce do inkubacji. Aby potraktować komórki interesującym je związkiem, rozcieńczyć go do końcowego stężenia w pożywce DMEM F12 i dodać tę mieszaninę do górnej i dolnej komory na 12-dołkowej płytce, a następnie inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po inkubacji należy wymienić całe podłoże na podłoże wolne od antybiotyków.Określ stężenie nocnej kultury bakteryjnej, mierząc jej gęstość optyczną na 600 nanometrach, a następnie rozcieńcz ją do OD600 0,5 w 50-mililitrowej probówce Falcona. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 450 mikrolitrów roztworu bakteryjnego do każdej górnej komory 12-dołkowej płytki, a następnie inkubuj płytkę przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji wyjąć wkładkę za pomocą kleszczy i pobrać próbkę 50 mikrolitrów pożywki z każdej dolnej komory, uważając, aby nie rozlać pożywki z górnych komór do dolnych.Ważne jest, aby ściśle oddzielić pożywkę górnej i dolnej komory, ponieważ rozlanie się bakterii z górnej komory doprowadziłoby do fałszywie dodatnich wyników. Upuść każdą próbkę na osobną płytkę agarową i rozprowadź roztwór za pomocą rozsiewacza komórek. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, a następnie policz kolonie.Aby zbadać wpływ glikacji na przechodzenie drobnoustrojów przez barierę krew-mózg, komórki traktowano 0,5 i 0,15 milimolowym roztworem glioksalu przez jedną godzinę, przy czym nieleczone komórki służyły jako kontrola. Glikację wykryto następnie za pomocą immunoblottingu z przeciwciałami anty-AGE. Uzyskane kolonie bakteryjne policzono i przedstawiono jako bezwzględną liczbę kolonii lub względną liczbę kolonii znormalizowaną do kontroli.Próbki poddane działaniu glioksalu wykazywały zwiększoną liczbę kolonii, co wskazuje, że leczenie ma wpływ na gęstość bariery komórkowej. Aby zbadać glikację białek indukowaną przez glukozę, THBMEC hodowano w pożywce o normalnej i wysokiej zawartości glukozy. Bezwzględna liczba kolonii i względna liczba kolonii znormalizowana do grupy kontrolnej wskazały, że glukoza nie miała znaczącego wpływu na integralność bariery krew-mózg.Leczone komórki śródbłonka mogą być dalej analizowane za pomocą podejść proteomicznych, na przykład spektrometrii mas, w celu analizy zmian w proteomie. Ta technika pomaga w zrozumieniu ludzkiej bariery krew-mózg i przenikania bakterii. Może być wykorzystany do odkrywania aspektów starzenia się i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera.

analyzing-permeability-blood-brain-barrier-microbial-traversal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Ten film przedstawia eksperymentalne badanie transmigracji limfocytów przez model śródbłonka bariery krew-mózg (BBB). Monowarstwa komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (HBMEC) jest generowana in vitro, a komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zawierające limfocyty są dodawane do monowarstwy. Komórki są następnie inkubowane, aby umożliwić transmigrację limfocytów, a migrowane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej.

Badanie migracji limfocytów przez monowarstwę komórek śródbłonka mikronaczyniowego

Ten film przedstawia model in vitro do badania patogenów przekraczających barierę krew-mózg (BBB). Komórki śródbłonka mikronaczyniowego, które wyrażają ścisłe połączenia, tworzą warstwę śródbłonka w górnej komorze, podczas gdy neurony, astrocyty i mikroglej reprezentują miąższ mózgu w dolnej komorze, oddzielony porowatą błoną. Zakażenie wirusem w modelu BBB naśladuje patogen przechodzący z krwi do mózgu. Po wprowadzeniu wirusa neurotropowego przenika on przez barierę krew-mózg poprzez...

Model in vitro do badania przenikania patogenów przez barierę krew-mózg i infekcji komórek mózgowych

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Tutaj opisujemy model ludzkiej bariery krew-mózg, umożliwiający badanie transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.

Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

Ten protokół szczegółowo opisuje dostosowaną metodę pozyskiwania, rozszerzania i kriokonserwacji mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu uzyskanych przez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, oraz badania właściwości bariery krew-mózg w modelu ex vivo.

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę analizy przepuszczalności bariery krew-mózg poprzez pomiar przenikania bakterii E. coli przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego. Technika ta umożliwia badanie patogenezy zapalenia opon mózgowych i delirium pooperacyjnego.

Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Przeglądaj więcej filmów