Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Badanie transportu bakterii w systemach porowatych jest ważne z punktu widzenia zanieczyszczenia, rozprzestrzeniania się chorób i bioremediacji. Do tych eksperymentów w modelach matematycznych działających na pojedynczej komórce wymagany jest poziom populacji i społeczności drobnoustrojów. Prezentujemy tutaj narzędzia do badania transportu bakterii za pomocą urządzeń mikroprzepływowych i mikroskopii, a także większych urządzeń w połączeniu z cytometrią przepływową.

Połączenie urządzeń mikroprzepływowych z mikroskopią i cytometrią przepływową daje szereg możliwości badania zjawisk transportu bakterii w różnych skalach przestrzennych. Aby w pełni zbadać ten protokół, sugeruje się, aby mieć wcześniejsze doświadczenie w mikroskopii, podstawowym przetwarzaniu obrazu, projektowaniu urządzeń mikroprzepływowych i opanowaniu cytometrii przepływowej. Ten film opisuje dwie metody badania transportu bakterii w różnych skalach przestrzennych.

Pierwsza metoda, oparta na urządzeniach mikroprzepływowych, opiera się na mikroskopii w celu zliczenia pojedynczych komórek. System ten może być używany do badania transportu bakterii w wielu skalach przestrzennych, od porów do całej skali systemu porowatego. Druga metoda, wykorzystująca większe urządzenia fluidyczne sprzężone z automatycznym dozownikiem i cytometrią przepływową, może być wykorzystana do badania zjawiska transportu bakterii w skali całych układów porowatych.

Takie metody mogą być również stosowane w laboratoryjnych badaniach kolumnowych, a także w małych badaniach terenowych. Aby rozpocząć, zaprojektuj żądaną porowatą geometrię, która składa się z macierzy okręgów. Na podstawie wybranej geometrii przygotuj formę przy użyciu standardowej fotolitografii SU-8.

Przygotuj 50 gramów PDMS, dodając 90% elastomeru do 10% utwardzacza do 90% wagowo elastomeru w czystym jednorazowym pojemniku i wymieszaj oba odczynniki czystym narzędziem. Zastosuj próżnię 100 milibarów przez 30 minut, aby usunąć rozpuszczone powietrze i pęcherzyki. Umieść formę na szalce Petriego i wlej PDMS na formę na żądaną wysokość od dwóch do pięciu milimetrów.

Przykryj szalkę Petriego pokrywką i utrzymuj ją w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Następnie pozwól urządzeniu mikroprzepływowemu ostygnąć do temperatury pokojowej. Po schłodzeniu ostrożnie usuń żądaną porcję PDMS za pomocą skalpela.

Tymczasowo uszczelnij dolną część kanału PDMS taśmą. Za pomocą dziurkacza o średnicy 0,5 milimetra przebij kanały, aby utworzyć wlot i wylot. Usuń taśmę z kanału PDMS i umieść kanał porowatą stroną do góry.

Szkiełko podstawowe i powierzchnie PDMS należy traktować plazmą przez około 45 sekund w temperaturze pokojowej. Umieść wstępnie obrobiony kanał PDMS na wstępnie obrobionym szkiełku szklanym i podgrzewaj w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 30 minut na gorącej płycie, a następnie wyjmij urządzenie mikroprzepływowe z płyty grzejnej i schłodzić je do temperatury pokojowej. Zastosuj próżnię przez 30 minut, aby usunąć powietrze z PDMS.

Aby wyprodukować podstawę zawierającą komorę porów, użyj precyzyjnego mikrofrezowania, aby usunąć 0,5 milimetra z podstawowej warstwy PMMA i wyfrezuj rowek o wymiarach 1,1 na 1,1 milimetra dla gumowego O-ringu. Wywierć dwa gwintowane otwory na wlot i wylot w górnej części urządzenia fluidycznego oraz 12 otworów na. Służy ona jako pokrywa urządzenia fluidycznego.

Po wyczyszczeniu urządzenia fluidycznego przykręć ze sobą podstawę i pokrywę za pomocą 12 gwintowanych otworów. Wyjmij mikroprzepływowy z próżni i umieść go na stoliku mikroskopu. Użyj pompy strzykawkowej, aby nasycić go buforem ruchliwości.

Korzystając z mikroskopii Brightfield lub kontrastu fazowego, dostosuj powiększenie, aby uwidocznić poszczególne komórki bakteryjne i skupić się na środku kanału obserwacyjnego. Przełącz ustawienia ścieżki światła na mikroskopię fluorescencyjną. Dostosuj ostrość za pomocą przesunięcia i czasu ekspozycji aparatu, aby rozdzielić poszczególne komórki bakteryjne.

W tym przypadku 100 milisekund. Następnie włóż rurkę wlotową do dwumililitrowej rurki zawierającej zawiesinę bakteryjną. Odwróć kierunek pompy i rozpocznij pobieranie zawiesiny przy natężeniu przepływu jednego mikrolitra na minutę.

Skanuj przekrój poprzeczny całego kanału obserwacyjnego, rejestrując obraz co minutę. Importuj obrazy do żądanej platformy oprogramowania. Zapisuje tło jako średnią z pierwszych obrazów, gdy nie zarejestrowano żadnych cząstek.

Odejmij tło od każdego obrazu, aby usunąć szumy aparatu i aberrację optyczną. Przytnij obrazy do obszaru zainteresowania. Zidentyfikuj wartość progową równą intensywności piksela fluorescencji komórki, tak aby wartości większe niż próg obejmowały komórki bakteryjne.

Użyj przetwarzania obrazu, aby odjąć wartość progową od każdego obrazu. Binarnie wynikowy obraz tak, aby komórki bakteryjne przyjmowały wartość jeden, podczas gdy tło przyjmowało wartość zero. Usuń skupiska pikseli o obszarze mniejszym niż najmniejszy rozmiar komórki bakteryjnej w pikselach.

Zsumuj binaryzowany obraz, aby uzyskać łączną liczbę pikseli pozostałych klastrów. Podziel liczbę pikseli przez średni rozmiar komórki bakteryjnej w pikselach, aby uzyskać szacunkową liczbę komórek. Przekształć liczby w stężenie w cząstkach na mililitr.

Aby określić stężenie wstrzykniętej zawiesiny bakteryjnej, należy wstrzyknąć zawiesinę bakteryjną do kanału obserwacyjnego czystego urządzenia mikroprzepływowego za pomocą strzykawki. Zapisz obraz i oblicz stężenie bakterii wpływających, jak pokazano wcześniej. Wizualizacja krzywych przełomu poprzez normalizację stężenia bakterii C w ściekach ze stężeniem bakterii wpływających C0 i wykreślenie C przez C0 w funkcji czasu.

Aby przeanalizować lokalne prędkości i trajektorie bakterii transportowanych przez porowatą matrycę, przesuń stolik mikroskopu w obszar zainteresowania i ustaw ostrość na środku urządzenia mikroprzepływowego. Ustaw konfigurację optyczną na kontrast fazowy lub mikroskopię fluorescencyjną. Nagrywaj zdjęcia poklatkowe i czas naświetlania wystarczająco krótki, aby uchwycić przemieszczenie bakterii.

W tym przypadku 50 milisekund. Nagrywaj zdjęcia przez wystarczająco długi czas, na przykład trzy minuty. Aby usunąć szum z każdego obrazu, odejmij tło, które jest średnią sumy wszystkich zarejestrowanych obrazów.

Określ moduł gradientu liczbowego i znormalizuj go o jego maksymalną wartość. Znajdź i zapisz współrzędne bakteryjne oraz czas pozyskania obrazu w pliku trzykolumnowym. Wykonaj analizę śledzenia cząstek, aby przetworzyć zarejestrowane dane i obliczyć trajektorie.

Aby uzyskać profile osadzania, należy zarejestrować złożony obraz całego kanału porowatego przed, czyli tłem, oraz po wstrzyknięciu zawiesiny bakteryjnej przez urządzenie mikroprzepływowe. Usuń tło z obrazów zarejestrowanych po wstrzyknięciu bakterii. Obliczyć profil osadzania D jako sumę sygnału fluorescencji bakteryjnej wzdłuż przekrojów poprzecznych o długości x kanału porowatego.

Wizualizuj profil osadzania jako lokalny sygnał fluorescencyjny w funkcji porowatego kanału. Aby skonfigurować automatyczny dozownik, umieść dozownik automatyczny w pobliżu urządzenia fluidycznego. Podłącz zrobotyzowany dozownik do komputera z uruchomionym BCNC i zidentyfikuj właściwy port COM.

W BCNC kliknij przycisk home, aby przywrócić automatyczny dozownik do pozycji wyjściowej. Połącz pompę perystaltyczną z wlotem za pomocą rurki o długości 50 centymetrów i średnicy wewnętrznej jednego milimetra, a odpływ z automatycznym dozownikiem za pomocą tego samego wężyka. Przepompuj podłoże uprawowe przez urządzenie fluidyczne.

Zwróć uwagę na przybycie pożywki do rurki wylotowej przymocowanej do dozownika automatycznego i umieść 96-dołkową płytkę, która będzie zbierać odpływ. W tym samym czasie aktywuj zrobotyzowany dozownik i wstrzyknij zawiesinę bakteryjną przez urządzenie fluidyczne PMMA z natężeniem przepływu 0,2 mililitra na minutę. Wstrzyknąć zawiesinę bakteryjną odpowiadającą kilku objętościom porów.

Na przykład 30 razy większa objętość urządzenia hydraulicznego. Po wstrzyknięciu należy przejść na sterylne podłoże hodowlane do końca eksperymentu. Po wykonaniu 96-dołkowej płytki przykryj ją i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.

Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej i wizualizuj krzywe przełomu, normalizując stężenie bakterii C w ściekach ze stężeniem bakterii wpływających C0 i wykreślając C przez C0 w funkcji czasu. W tym badaniu, przy użyciu zarówno ruchliwych, jak i nieruchomych Pseudomonas putida KT2440, przeprowadzono sekwencyjne eksperymenty w urządzeniach mikroprzepływowych PDMS z losowym układem filarów. Pokazano tutaj krzywe przełomu znormalizowane do stężenia wstrzykiwanych komórek, a także trajektorie bakteryjne w skali porów.

Przeprowadzono również eksperymenty z wielkoskalowymi urządzeniami fluidycznymi mielonymi z PMMA. Motylne i nieruchome Pseudomonas putida KT2440 wstrzyknięto do regularnie rozmieszczonej porowatej matrycy. Uderzające jest to, że w porowatym środowisku pozbawionym biofilmu, ruchliwe i nieruchliwe Pseudomonas putida KT2440 wykazywały wyraźnie odmienne zachowanie transportowe w oparciu o krzywe przełomowe.

W porowatej matrycy skolonizowanej przez 48 godzin złożoną społecznością biofilmu strumieniowego, te różnice w krzywych przełomu między ruchliwymi i nieruchliwymi Pseudomonas putida KT2440 zniknęły. Używamy tego systemu do badania transportu bakterii w strumieniach, ale narzędzia te można łatwo dostosować do badania zjawisk transportu bakteryjnego w innych systemach inżynieryjnych i środowiskowych. Transport bakterii przez uwodnione pożywki porowate zamykają procesy w wielu skalach przestrzennych.

Przedstawiona tu metodologia pozwala na powiązanie miejscowego przemieszczenia bakterii w skali porów z mikroskopijnym transportem w całym ośrodku porowatym.