Name: Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Poznaj analizę metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi z kostniakomięsaka. Metoda amplifikacji sond specyficznych dla metylacji pozwala badać zmiany epigenetyczne w biologii nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Uniwersytet Helsiński (WBS490302, WBS73714112), Szpital Uniwersytecki w Helsinkach, państwowe fundusze na badania nad zdrowiem na poziomie uniwersyteckim (Y1014SUL05, TYH2016130), Fińsko-Norweską Fundację Medyczną oraz Fundusz Selmy i Maja-Lisy Selander (Fundacja Minerva). Dziękujemy firmie Walter Pavicic za dostarczenie zmodyfikowanego protokołu MSPA i związane z nim wsparcie techniczne. Jesteśmy wdzięczni Teemu Masalin (Uniwersytet w Helsinkach) za pomoc w produkcji wideo.

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Okręgu Szpitalnego Helsinki i Uusimaa (zatwierdzenie etyczne nr D. 217/13/03/02/2015).
1. Przygotowanie FBS pozbawionego EV metodą ultrawirowania
<ol>
	<li>Przenieść FBS do probówek do (ultra)wirowania i umieścić je w koszyczkach ultrawirowarki. Aby zapewnić płynny i bezpieczny przebieg ultrawirowania, należy zrównoważyć masę koszyczków z dokładnością do 10 mg.</li>
	<li>Załaduj wiadra do rotora z kątem (typ SW28, k-factor 246). Umieść rotor w ultrawirówce i wiruj przy 10 0 x g przez 19 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Kolejno i ostrożnie pobierz jasną górną warstwę supernatantu (około dziewięć dziesiątych objętości) i przenieś ją do probówki o pojemności 50 ml. Nie naruszaj i nie pipetuj ciemnobrązowego osadu, ponieważ zawiera on pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) z FBS.</li>
	<li>Przenieś nadnadkład przez 0.22 µm przefiltrować do nowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Podczas hodowli komórek do izolacji EV, do pożywek hodowlanych należy dodać filtrowaną sterylnie, pozbawioną EV płodową surowicę bydlęcą (FBS).</li>
</ol>
2. Izolacja EV pochodzących z osteosarkoma
<ol>
	<li>Wysiać komórki OS (linia komórkowa HOS-143B) do kolby T-175 z pożywką RPMI 1640, uzupełnioną o 10% normalnej FBS i 1% antybiotyków (10 U/mL penicyliny, 0,1 mg/mL streptomycyny). Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
	<li>Gdy komórki w kolbie osiągną 70%–80% konfluencji, przemyć je solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie hodować w pożywce zawierającej 10% FBS pozbawionej EV (dalej nazywanej pożywką pozbawioną EV). 
	UWAGA: 1 x 106 komórek HOS-143B wysianych do kolby T175 osiąga 70% konfluencji po około 60 h.</li>
	<li>W ciągu kolejnych 48 h zbierać pożywkę warunkową z komórek osteosarcoma co 24 h i dodawać świeżą pożywkę pozbawioną EV.</li>
	<li>Wiruwać pożywkę warunkową przy 250 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek i szczątków komórkowych. Przenieść supernatant do nowej probówki, pozostawiając około 2 mL pożywki na dnie. 
	UWAGA: Jeśli izolacja EV nie jest przeprowadzana bezpośrednio na tym etapie, supernatant można przechowywać w temperaturze -80 ᵒC.</li>
	<li>Przelać supernatant do probówek do ultrawirówki i zrównoważyć je jak wcześniej. Wirować probówki przy 10 0 x g przez 2 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając około 1 mL na dnie. Dodać do probówki około 20 mL PBS (filtrowanego przez 0,1 µm) i delikatnie pipetować, aby przemyć i resuspender osad EV.</li>
	<li>Zrównoważyć probówki i przeprowadzić kolejną rundę ultrawirowania przy tych samych ustawieniach.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i resuspender osad EV w 20 µL PBS poprzez delikatne pipetowanie. Przechowywać EV w probówkach o niskim stopniu wiązania (low binding). 
	UWAGA: EV można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Charakterystyka OS-EV
UWAGA: Oczyszczone EV można scharakteryzować za pomocą western blottingu (WB), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)16.
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę WB zgodnie ze standardowym protokołem16, wykorzystując markery EV CD63, TSG101 i Hsp70 oraz kalneksynę jako kontrolę negatywną w celu oceny czystości próbki EV20.</li>
	<li>W przypadku NTA najpierw rozcieńcz próbkę EV w filtrowanym przez filtr 0,1 µm PBS-ie Dulbecco, aby uzyskać (idealnie) 30–10 cząsteczek na klatkę.
	<ol>
		<li>Pobierz około 50 µL próbki do strzykawki 1 mL i wprowadź ją do portu wlotowego urządzenia NTA. Sprawdź, czy liczba cząsteczek na klatkę jest wystarczająca do uzyskania dokładnych pomiarów.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie NTA i nagraj pięć filmów o czasie trwania 60 s, używając poziomu kamery 13 w temperaturze otoczenia. Podczas analizy zastosuj próg detekcji (detection threshold) = 5 oraz wzmocnienie (gain) = 10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki EV przeanalizuj metodą TEM zgodnie z wcześniejszym opisem21.</li>
</ol>
4. Hodowla AT-MSC
UWAGA: Ludzka tkanka tłuszczowa do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych została dostarczona w formie aspiratu z liposukcji (Department of Plastic Surgery, Laser Tilkka Ltd., Finlandia). Od dawców lipoaspiratu, którzy poddawali się planowym zabiegom liposukcji, uzyskano pisemną zgodę na udział w badaniu.
<ol>
	<li>Wyizolować AT-MSCs z aspiratów liposukcyjnych, stosując standardowe metody izolacji mechanicznej i enzymatycznej2. 
	UWAGA: Można również stosować MSCs z innych źródeł (w tym komercyjne linie komórkowe).</li>
	<li>Hodować komórki w pożywce DMEM/F-12 uzupełnionej o 10% FBS i 1% antybiotyków.</li>
</ol>
5. Traktowanie MSCs za pomocą OS-EVs
<ol>
	<li>Wysiać 15 0 AT-MSCs na każdą studzienkę płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Po 24 h usunąć stare medium, przemyć komórki PBS i zmienić medium na pozbawione EV.</li>
	<li>Traktować komórki OS-EVs (przy stężeniu cząstek 1 x 106 EVs na komórkę) w dniu 1. (24 h po adhezji komórek), dniu 3. (48 h po dniu 1.) oraz w dniu 5. (96 h po dniu 1.).
	<ol>
		<li>Przerwać traktowanie OS-EV dla próbek z punktu czasowego (TP) 0 w dniu 1., próbek TP 3 w dniu 3. i próbek TP 7 w dniu 7. (48 h po dniu 5.). 
		UWAGA: Można również stosować inne harmonogramy punktów czasowych zgodnie z planami eksperymentalnymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyekstrahować DNA z MSCs przy użyciu odpowiedniej metody. Do analizy danych dołączyć próbki kontrolne pozytywne i negatywne.</li>
</ol>
6. Analiza metylacji LINE-1
<ol>
	<li>Zaprojektuj spersonalizowane primery do sond LINE-1, zgodnie z metodą opisaną wcześniej przez Pavic i wsp.23. W przypadku sond metylacji wybierz trzy sekwencje zawierające miejsce restrykcyjne HhaI w regionie promotora LINE-1. W przypadku sond kontrolnych wybierz siedem sekwencji pozbawionych miejsca restrykcyjnego HhaI z pozostałej części sekwencji LINE-1. 
	UWAGA: Sekwencja LINE-1 jest dostępna w bazie danych GenBank24 (L1.2, numer dostępu AH005269.2). Do projektowania sond należy użyć instrukcji producenta MSPA25.</li>
	<li>Rozcieńcz 70 ng próbki DNA w buforze TE do objętości 5 µL.</li>
	<li>Przeprowadź kolejne etapy termocyklingu i PCR zgodnie z Tabelą 1. Próbki podgrzewaj przez 10 min w 98 °C, a następnie schłodź do 25 °C.</li>
	<li>Dodaj 3 µL mieszaniny do hybrydyzacji sond do każdej próbki i uruchom termocykler, aby umożliwić hybrydyzację sond z DNA.</li>
	<li>W temperaturze pokojowej (RT) dodaj 13 µL mieszaniny pohybrydyzacyjnej do każdej próbki. Przenieś 10 µL do drugiej probówki.</li>
	<li>Umieść oba zestawy probówek w termocyklerze i inkubuj w 48 °C przez co najmniej 1 min.
	<ol>
		<li>Gdy próbki znajdują się w 48 °C, dodaj 10 µL mieszaniny ligacyjnej do pierwszego zestawu probówek (seria niepoddana trawieniu) oraz 10 µL mieszaniny ligacyjno-trawiennej do drugiego zestawu probówek (seria poddana trawieniu). Uruchom kolejny program termocyklera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwiruj probówki i jednocześnie ustaw termocykler na 72 °C.</li>
	<li>Dodaj 5 µL mieszaniny polimerazy do każdej probówki i umieść probówki w termocyklerze. Uruchom program PCR.</li>
	<li>Podczas trwania programu PCR przygotuj roztwór 1 mL formamidu zawierający 2,5 µL standardu wielkości. Pipetuj 10 µL tego roztworu do każdej studzienki optycznej płytki 96-dołkowej (z kodem kreskowym).</li>
	<li>Po PCR rozcieńcz próbki nietrawione i trawione odpowiednio w stosunku 1:10 i 1:20 w wodzie ultrapure. Dodaj 2 µL rozcieńczonego produktu PCR do płytki 96-dołkowej. Odwiruj płytkę przy 20 x g przez 15–20 s, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Przeprowadź analizę fragmentów próbek metodą elektroforezy kapilarnej. 
	UWAGA: Płytkę należy przechowywać w 4 °C w ciemności do czasu analizy.</li>
</ol>
7. Analiza danych fragmentów
<ol>
	<li>Otwórz wyniki elektroforezy kapilarnej w oprogramowaniu do analizy elektroferogramów.
	<ol>
		<li>Pod Panel kolumna, dla jednej z próbek, wybrać MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) z menu. Kliknij w Panel nagłówek i prasa Ctrl+D zastosować MLPA (wielokrotna analiza ligacji zależna od ligacji) do wszystkich próbek.</li>
		<li>W ten sam sposób ustaw Metoda analizy Proszę podać tekst do tłumaczenia. Domyślne ustawienia mikrosatelitów dla wszystkich próbek.</li>
		<li>Zaznacz wszystkie próbki i kliknij w Zielone odtworzenie przycisk do analizy próbek zgodnie z wybranymi ustawieniami.</li>
		<li>Zaznacz wszystkie próbki i kliknij w Wykres przycisk do wizualizacji pików sondy.</li>
		<li>Powiększ obszar piku, aby uzyskać wyższą rozdzielczość poszczególnych pików sond. Upewnij się, że wszystkie 10 pików odpowiadających sondom z mieszaniny sond LINE-1 zostało oznakowanych. Odrzuć dodatkowe piki (&lt;95 pz i &gt;160 bp).</li>
		<li>W Genotypy zakładka, wyeksportuj wyniki w formacie wartości rozdzielanych przecinkami (CSV).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz plik CSV w oprogramowaniu do analizy danych i podziel dane na kolumny.
	<ol>
		<li>Oznacz trzy piki miejsc metylacji na podstawie ich przybliżonych rozmiarów (L1-1m przy 153 bp, L1-2m przy 19 bp, L1-3m przy 133 bp). Pozostałe siedem pików odpowiada sondom kontrolnym. 
		UWAGA: W tym przypadku wykorzystano wartości pików sondy L1-2m o wielkości 17 bp, ponieważ region ten był stosowany w większości testów metylacji LINE-123.</li>
		<li>Dla każdej próbki (nientrawionej i trawionej) oblicz sumę pól wszystkich siedmiu pików kontrolnych. Pole piku każdej sondy LINE-1 podziel przez uzyskaną sumę.</li>
		<li>Dla każdej próbki DNA podziel wartość próbki poddanej trawieniu przez wartość próbki nietrawionej, aby otrzymać stosunek dawki metylacji (DM) przy użyciu następującego równania: 
		<img alt="Równanie analizy trawienia DNA, stosunek absorbancji, wzór do porównywania danych eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/60705/60705eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		Gdzie: DM stosunek dawki metylowania, Ax czy jest to pole pod pikiem Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. (np. szczyt L1-2m) oraz Agrupa kontrolna jest sumą pól powierzchni piku wszystkich siedmiu sond kontrolnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenomics%3A+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li>
<li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+Cancer%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li>
<li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li>
<li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462(2006).</li>
<li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li>
<li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiQ+Analyzer%3A+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li>
<li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57(2013).</li>
<li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-Specific+MLPA+%28MS-MLPA%29%3A+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128(2005).</li>
<li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li>
<li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA%2C+proteins%2C+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li>
<li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-+derived+microvesicles%3A+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li>
<li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+%22debris%22%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li>
<li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214(2019).</li>
<li>Mannerström, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li>
<li>Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783(2014).</li>
<li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175(2016).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674(2018).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li>
<li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824(2017).</li>
<li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast%3A+A+prospective+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li>
<li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li>
<li>L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000).</li>
<li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018).</li>
<li>Takara Bio Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018).</li>
<li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badanie to ilustruje, w jaki sposób MSPA może być wykorzystany do wykrywania i ilościowego określania stanu metylacji określonego elementu genetycznego. Skupiono się tutaj na LINE-1, ale sondy można zaprojektować tak, aby celowały w szereg genów i sekwencji. Co więcej, istnieje coraz dłuższa lista dostępnych mieszanek sond do różnych zastosowań. MSPA to prosta i solidna technika analizy metylacji DNA, która nie wymaga konwersji wodorosiarczynu10. Cała procedura, od przygotowania próbki do analizy ...

Metylacja DNA to główna modyfikacja epigenetyczna zachodząca w komórkach ludzkich. Metylacja DNA odnosi się do powiązania grup metylowych z resztami cytozyny w dinukleotydach CpG. Takie dinukleotydy zwykle znajdują się w klastrach (wyspach CpG) w regionie 5' genów1. W normalnych komórkach większość tych dinukleotydów występuje w stanie niemetylowanym, co umożliwia transkrypcję DNA. Nawiasem mówiąc, wiele nowotworów jest związanych z hipermetylowanymi wyspami CpG i wyciszaniem transkryptomicznym2, szczególnie w genach supresorowych nowotworów, które z kolei przyczyniają się do różnych cech charakterystycznych raka3.
Z drugiej strony, długo przeplatane elementy jądrowe-1 (LINE-1 lub L1) są powtarzalnymi, transpozycyjnymi elementami DNA, które normalnie mają wysoki poziom metylacji na wyspach CpG. Metylacja LINE-1 zapobiega translokacji i pomaga w utrzymaniu integralności genomu. W kilku typach nowotworów LINE-1 jest hipometylowany, co powoduje aktywację, a następnie niestabilność chromosomalną za pośrednictwem retrotranspozycji4. LINE-1 stanowi prawie 17% ludzkiego genomu5, a jego status metylacji może służyć jako wskaźnik globalnych poziomów metylacji genomu6. Uważa się, że globalna hipometylacja LINE-1 poprzedza przejście komórek do fenotypu nowotworu7; W związku z tym jest obiecujący jako potencjalny marker wczesnego początku raka.
Obecnie istnieje kilka metod analizy metylacji, w tym pirosekwencjonowanie, PCR specyficzny dla metylacji, mikromacierze i immunoprecypitacja chromatyny1. Zastosowanie sekwencjonowania nowej generacji umożliwiło również włączenie podejść do wykrywania metylacji DNA obejmujących cały genom. Wiele z tych metod opiera się na DNA poddanym działaniu wodorosiarczynu, w którym niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, a cytozyny metylowane pozostają niezmienione. Jednak praca z DNA poddanym działaniu wodorosiarczynu wiąże się z kilkoma pułapkami, takimi jak niekompletna konwersja niemetylowanych cytozyn do uracylu, tendencyjna amplifikacja sekwencji i błędy sekwencjonowania8.
W amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji (MSPA), sondy złożone z dwóch oligonukleotydów celują w sekwencje DNA zawierające miejsce restrykcyjne (GCGC) dla wrażliwego na metylację enzymu restrykcyjnego HhaI9. Po hybrydyzacji sond z DNA, każda próbka jest dzielona na dwa zestawy. Sondy w pierwszym zestawie poddawane są podwiązaniu, podczas gdy sondy w drugim zestawie poddawane są podwiązaniu, a następnie trawieniu za pośrednictwem HhaI w niemetylowanych miejscach CGCG. Oba zestawy próbek są następnie amplifikowane metodą PCR, a produkty są rozdzielane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Sondy w miejscach niemetylowanych są trawione przez HhaI i nie są wzmacniane podczas PCR, co skutkuje brakiem sygnałów szczytowych. W przeciwieństwie do tego, sondy w miejscach metylacji są chronione przed trawieniem i dlatego są wzmacniane podczas PCR, a następnie generują sygnały szczytowe10.
MSPA ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami. Po pierwsze, wymaga niewielkiej ilości DNA (50–100 ng) i dobrze nadaje się do analizy DNA z próbek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie10. Nie wymaga DNA poddanego działaniu wodorosiarczynu; w rzeczywistości nie nadaje się do DNA, które jest modyfikowane w ten sposób. Wiele próbek może być analizowanych w tym samym czasie, a sondy MSPA mogą być zaprojektowane tak, aby celowały w wiele genów lub sekwencji jednocześnie. Dodatkowo sondy są specyficzne i wrażliwe na metylowane DNA, ponieważ miejsce restrykcyjne HhaI odpowiada sekwencji typowej dla wysp CpG10.
To badanie dotyczyło wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z kostniakomięsaka (OS) na metylację LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (AT-MSC; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). EV to nanoskalowe, połączone błoną pęcherzyki wydzielane przez większość typów komórek. Przenoszą białka, lipidy, mRNA, mikroRNA i dodatkowe cząsteczki z komórek macierzystych11,12. EV pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej i odgrywają ważną rolę w kilku stanach patofizjologicznych13,14. Niedawne badanie wykazało, że EV pochodzące z raka mogą przenosić aktywną LINE-1 do komórek biorcy15. Wcześniej informowano, że EV z linii komórkowej HOS-143B mogą zmieniać status metylacji LINE-1 w MSC, oprócz innych efektów genetycznych16.
Podczas hodowli komórek do izolacji EV, ważne jest, aby używać w pożywce wzrostowej surowicy bydlęcej zubożonej w EV, ponieważ EV pochodzące z FBS mogą zakłócać EV z innych źródeł i utrudniać wyniki17,18. Ultrawirowanie jest jedną z najczęstszych metod wyczerpywania EV z FBS. Jest to stosunkowo prosta i opłacalna procedura w porównaniu z alternatywami, takimi jak ultrafiltracja i komercyjne FBS19. W tym przypadku protokół pokazuje również, jak przygotować FBS zubożony w EV za pomocą ultrawirowania.
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół dla wyżej wymienionych technik, od izolacji EV z linii komórkowej OS do analizy metylacji LINE-1 w MSC traktowanych OS-EV (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1</td><td>do płytki 24-dołkowej NTA</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3524</td><td>MSC Hodowla</td></tr><tr><td>komórkowa Analizator DNA 3730xl</td><td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td><td>3730XL</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima LE-80K Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BlueStar Prestained Protein Marker</td><td>Nippon Genetics</td><td>MWP03</td><td>WB: marker białkowy</td></tr><tr><td>Calnexin (klon C5C9)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2679</td><td>WB, rozcieńczenie 1:800</td></tr><tr><td>CD63 (klon H5C6)</td><td>BD Biosciences</td><td>556019</td><td>WB, rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Wirówka 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td>5703000010</td><td>Do kondycjonowanych pożywek i komórek</td></tr><tr><td>Wirówka 5810</td><td>Eppendorf</td><td>5810000010</td><td>Do wirowania 96-dołkowej płytki</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa (poliallomer, 14x95 mm)</td><td>Beckman</td><td>331374</td><td>Ultrawirowanie</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + pożywka GlutaMAX</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31331-028</td><td>Do hodowli AT-MSC</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco, Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ rozmiar standardowy</td><td>Zastosowany Biosystems, Life Technologies</td><td>4322682</td><td>do elektroforezy kapilarnej</td></tr><tr><td>Zestaw do kompletnej amplifikacji całego genomu (WGA) GenomePlex</td><td>Sigma</td><td>WGA2-10RXN</td><td>do kontroli negatywnej MSPA</td></tr><tr><td>Formamid Hi-Di</td><td>Applied Biosystems, Life Technologies</td><td>4311320</td><td>do elektroforezy kapilarnej</td></tr><tr><td>Linia komórkowa HOS-143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Hsp70 (klon 5G10)</td><td>BD Biosciences</td><td>554243</td><td>WB, rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Kozia anty-mysia</td><td>Li-Cor</td><td>926-32210</td><td>WB: wtórny</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Koza anty-królik</td><td>Li-Cor</td><td>926-32211</td><td>WB: wtórne</td></tr><tr><td>startery sondy i mieszanki LINE-1</td> Sekwencje <td>IDT</td><td></td><td>w tabeli 1</td></tr><tr><td>MicroAmp Optykalna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym</td><td>Biosystemy stosowane, Technologie życia</td><td>4306737</td><td>wymaga również folii uszczelniającej</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td>mierzy stężenie białka</td></tr><tr><td>MiniProtean TGX 10% żele</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1034</td><td>WB: elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>NanoSight LM14C</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>do membrany</td></tr><tr><td>nitrocelulozowej NTA 0,2 i mikro; m</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td>WB: transfer białek</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue XS</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740901.50</td><td>do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer</td><td>Li-Cor</td><td>927-40000</td><td>WB: blokowanie, przeciwciała</td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>DE17-602E</td><td>Antybiotyki do pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana Probówka białkowa LoBind, 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431064</td><td>Do przechowywania Evs</td></tr><tr><td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td><td>Li-Cor</td><td>926-11015</td><td>WB: całkowita linia</td></tr><tr><td>komórkowa RKO</td> do barwienia białek <td>ATCC</td><td>CRL-2577</td><td>do kontroli pozytywnej MSPA</td></tr><tr><td>Pożywka RPMI 1640 + GlutaMAX</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>61870-010</td><td>Do hodowli komórkowych HOS-143B</td></tr><tr><td>SALSA MLPA HhaI enzym</td><td>MRC-Holland</td><td>SMR50</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników SALSA MLPA</td><td>MRC-Holland</td><td>EK1-FAM</td><td></td></tr><tr><td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td><td>MRC-Holland</td><td>P300-100R</td><td></td></tr><tr><td>Rotor wahadłowy SW-28</td><td>Beckman Coulter</td><td>342207</td><td>Ultrawirówka</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m</td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-030</td><td>sterylna filtracja FBS</td></tr><tr><td>Tecnai 12</td><td>FEI Firma</td><td></td><td>wyposażona w kamerę CCD Gatan Orius SC 1000B (Gatan Inc., USA); dla TEM</td></tr><tr><td>TBS, 1X tabletki</td><td>Medicago</td><td>09-7500-100</td><td>WB: bufor</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>WB: transfer</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>TCA0096</tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>do trypsynizacji komórek</td></tr><tr><td>TSG101 (klon 4A10)</td><td>Sigma</td><td>SAB2702167</td><td>WB, rozcieńczenie 1:500</td></tr></tbody></table>

analiza metylacji line-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Amplifikacja sondy specyficzna dla metylacji (MSPA) to prosta i solidna technika, która może być używana do wykrywania względnych różnic w poziomach metylacji próbek DNA. Jest zaradny, wymaga niewielkich ilości DNA i zajmuje około 4-5 godzin pracy praktycznej. W prezentowanej technice próbki DNA są najpierw denaturowane, a następnie hybrydyzowane do sond, które celują w DNA w miejscach metylowanych lub referencyjnych jako kontrolę. Zhybrydyzowane DNA jest rozdzielane na równoległe reakcje, z których jedna przechodzi tylko ligację, a druga ligację, po której następuje trawienie za pośrednictwem HhaI w niemetylowanych sekwencjach GCGC. Powstałe w ten sposób fragmenty DNA są amplifikowane metodą PCR i rozdzielane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Metylowane miejsca GCGC nie są trawione przez HhaI i wytwarzają sygnały szczytowe, podczas gdy niemetylowane miejsca GCGC są trawione i nie są generowane żadne sygnały szczytowe. Porównanie znormalizowanych kontrolnie pików strawionych i niestrawionych wersji każdej próbki zapewnia stosunek dawki metylacji próbki DNA. W tym przypadku MSPA służy do wykrywania wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z kostniakomięsaka na stan metylacji długo przeplatanego pierwiastka jądrowego-1 (LINE-1) w mezenchymalnych komórkach macierzystych. LINE-1 to powtarzalne elementy DNA, które zazwyczaj ulegają hipometylacji w raku i w tym charakterze mogą służyć jako biomarker. Ultrawirowanie jest również stosowane jako opłacalna metoda oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płynów biologicznych (tj. podczas przygotowywania płodowej surowicy bydlęcej o zubożonej w EV [FBS] i izolowania EV z pożywki kondycjonowanej kostniakomięsakiem [wirowanie różnicowe]). Do analizy metylacji niestandardowe sondy LINE-1 są zaprojektowane tak, aby celować w trzy miejsca metylacji w sekwencji promotora LINE-1 i siedem miejsc kontrolnych. Protokół ten demonstruje zastosowanie MSPA do analizy metylacji LINE-1 i opisuje przygotowanie FBS zubożonego w EV przez ultrawirowanie.

Głównym celem niniejszego badania była ocena efektów epigenetycznych OS-EVs w odniesieniu do MSCs. OS-EVs wyizolowano z komórek HOS-143B, stosując standardową metodę wirowania różnicowego. Ekspresja typowych markerów EV, takich jak CD63, Hsp70 i TSG101, potwierdzona za pomocą western blottingu, dowiodła obecności OS-EVs (Rycina 2A). Brak sygnału kalneksyny wskazywał na czystość izolatu OS-EV. Dodatkowym potwierdzeniem czystości była analiza TEM, w której zaobserwowano nienar...

Opisane tutaj jest użycie metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji do analizy poziomów metylacji elementów LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka. Wykazano również ultrawirowanie, popularną procedurę oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płodowej surowicy bydlęcej.

Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

Metylacja DNA jest jedną z najlepiej zbadanych sygnatur epigenetycznych. Wiele nowotworów charakteryzuje się zmianami w poziomach metylacji DNA, które są związane z nieprawidłową ekspresją genów i innymi nieprawidłowościami genomowymi. Długie, przeplatane elementy jądrowe to powtarzalne transpozycyjne sekwencje genomowe, które zwykle mają wysoki poziom metylacji.Jednak często dochodzi do ich hipermetylacji w nowotworach, co powoduje ich aktywację i prowadzi do niestabilności chromosomalnej. W tym badaniu potraktowaliśmy mezenchymalne komórki macierzyste pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka, aby sprawdzić, czy rakowe EV mogą wpływać na metylację LINE-1 w MEC. Płodowa surowica bydlęca, która jest integralnym składnikiem pożywki do hodowli komórek ssaków, zawiera dużą liczbę EV pochodzenia bydlęcego.Te Ev będą zakłócać analizę Ev z interesujących nas komórek, dlatego podczas hodowli komórek do izolacji EV ważne jest, aby używać FBS zubożonych w EV. Weź FBS do probówek ultrawirówek i umieść je w wiadrach do ultrawirówek. Zrównoważ wiadra z dokładnością do 10 miligramów przed załadowaniem ich na obracający się wirnik.Umieścić wirnik w ultrawirówce i pracować z natężeniem 100 000 G przez 19 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przebiegu ostrożnie zbierz jasną górną warstwę supernatantu i przenieś ją do 50-mililitrowej probówki. Nie przeszkadzaj ani nie pipetuj ciemnobrązowego granulatu, ponieważ zawiera on EV firmy FBS.Przepuść supernatant przez filtr 0,22 mikrona do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Ten wysterylizowany filtrem, zubożony w EV FBS może być teraz dodawany do pożywki do hodowli komórkowych podczas hodowli komórek w celu izolacji EV. Zbierz kondycjonowane pożywki z komórek kostniakomięsaka hodowanych w pożywce zubożonej w EV.Aby usunąć komórki i resztki komórek, odwirować kondycjonowaną pożywkę o stężeniu 2500 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do probówek ultrawirówek i zrównoważyć je jak wcześniej. Odwirować probówki o stężeniu 100 000 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie wyrzuć supernatant, pozostawiając około jednego mililitra na dnie. Dodaj około 20 mililitrów PBS do probówki i delikatnie pipetuj, aby umyć i ponownie zawiesić granulat EV. Zrównoważyć probówki i przeprowadzić kolejną rundę ultrawirowania z tymi samymi ustawieniami.Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad EV w 200 mikrolitrach PBS przez delikatne pipetowanie. Przechowuj EV w probówkach o niskim stopniu wiązania. Oczyszczone EV charakteryzują się western blot, analizą śledzenia nanocząstek i transmisyjną mikroskopią elektronową.Płytka 15 000 MSC na studzienkę w płytce 24-dołkowej. Po 24 godzinach usuń stare pożywki, umyj ogniwa PBS i zmień na pożywkę o zubożonym EV. Traktuj komórki z OS-EV w zaplanowanych punktach czasowych.Po przerwaniu leczenia EV należy pobrać DNA z komórek odpowiednią metodą. Do analizy metylacji użyliśmy niestandardowej metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji. Zaprojektuj niestandardowe sondy LINE-1, tak jak to zrobił wcześniej, Pavicic i inni.W przypadku sond metylacji wybierz trzy sekwencje zawierające miejsce restrykcyjne HhaI w regionie promotora. W przypadku sond kontrolnych wybierz siedem sekwencji pozbawionych miejsca restrykcji HhaI z reszty sekwencji LINE-1. Rozcieńczyć 70 nanogramów próbki DNA w buforze TE do pięciu mikrolitrów.Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 98 stopni Celsjusza, a następnie schłodzić do 25 stopni Celsjusza. Dodaj trzy mikrolitry mieszanki hybrydyzacyjnej sondy do każdej próbki i uruchom termocykler, aby umożliwić sondom hybrydyzację z DNA. W temperaturze pokojowej dodaj 30 mikrolitrów mieszanki po hybrydyzacji do każdej próbki.Przenieś 10 mikrolitrów do drugiej probówki. Umieść oba zestawy probówek w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 48 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną minutę. Gdy próbki mają temperaturę 48 stopni Celsjusza, dodaj 10 mikrolitrów mieszanki ligacyjnej do pierwszego zestawu probówek i 10 mikrolitrów mieszanki podwiązania-trawienia do drugiego zestawu probówek.Uruchom następny program termocyklera. Następnie odwiruj rurki i jednocześnie ustaw termocykler na 72 stopnie Celsjusza. Dodaj pięć mikrolitrów mieszanki polimerazy do każdej probówki i umieść probówki w termocyklerze.Uruchom program PCR. Podczas działania programu PCR należy przygotować roztwór jednego mililitra formamidu zawierający 2,5 mikrolitra wzorca wielkości. Odpipetować 10 mikrolitrów tego roztworu do każdego rzędu płytki optycznej 96-dołkowej.Po PCR rozcieńczyć niestrawione i strawione próbki odpowiednio do stu do stu i od jednego do dwustu w ultra czystej wodzie. Dodać dwa mikrolitry rozcieńczonego produktu PCR do płytki 96-dołkowej. Odwirować płytkę o stężeniu 200 G przez 15 do 20 sekund w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.Przeprowadzić analizę fragmentów próbek za pomocą elektroforezy kapilarnej. Otwórz wyniki elektroforezy kapilarnej w oprogramowaniu do analizy elektroferogramu. Wybierz przykład i ustaw panel na MLPA z menu.Kliknij panel i naciśnij D, aby zastosować to ustawienie do wszystkich próbek. W podobny sposób ustaw metodę analizy na domyślną mikrosatelitę dla wszystkich próbek. Wybierz wszystkie próbki i kliknij zielony przycisk odtwarzania, aby uruchomić analizę, a następnie wybierz wszystkie próbki i kliknij przycisk wykresu, aby wyświetlić piki sondy.Powiększ obszar szczytu, aby uzyskać wyższą rozdzielczość poszczególnych szczytów. Upewnij się, że wszystkie 10 pików odpowiadających sondom z mieszanki sond LINE-1 jest oznaczonych. W zakładce genotypy wyeksportuj wyniki w formacie CSV.Otwórz plik CSV w oprogramowaniu do analizy danych i posortuj dane w kolumnach. Oznacz trzy piki miejsca metylacji na podstawie ich rozmiarów. Pozostałe siedem pików odpowiada sondom kontrolnym.Tutaj używamy pików sondy LINE-1 2M, które mają rozmiar około 117 par zasad. Dla każdej próbki należy obliczyć łączną powierzchnię pików wszystkich siedmiu pików kontrolnych. Podziel powierzchnię piku każdej sondy LINE-1 przez tę sumę.Dla każdej próbki należy podzielić wartość strawionej próbki przez wartość próbki niestrawionej, aby uzyskać stosunek dawki metylacji. Analiza Western blot potwierdziła obecność OS-EV z sygnałami zaobserwowanymi dla TSG101, HSP70 i CD63. Brak sygnału kalneksyny wskazywał, że próbka EV była czysta.Dodatkowe wskazanie czystości zaobserwowano w przypadku TEM z nienaruszonymi pęcherzykami o różnych rozmiarach obecnymi w próbce OS-EV. Stężenie i rozkład wielkości cząstek OS-EV zmierzono za pomocą NTA. 80% pojazdów elektrycznych miało rozmiar od 50 do 200 nanometrów.Tutaj możemy zobaczyć proporcje dawkowania metylacji LINE-1 z MSC w różnych punktach czasowych leczenia EV. Szara linia reprezentuje podstawowy poziom metylacji od punktu zerowego. W trzecim punkcie czasowym następuje spadek średniego stosunku dawki metylacji po podaniu EV, co wskazuje na hipermetylację.Ten hipermetylacyjny efekt EV jest mniej wyraźny w siódmym punkcie czasowym. Tutaj pokazaliśmy prostą, bardzo czułą i solidną technikę analizy metylacji. Wymaga niewielkiej ilości DNA bez konwersji wodorosiarczynu i nadaje się również do DNA wyizolowanego z próbek zatopionych w parafinie.Cała metoda, wraz z częścią eksperymentalną i analityczną, trwa około dwóch dni. Ze względu na wysoką liczbę kopii LINE-1 w genomie, wyjściowa metylacja LINE-1 jest wysoka w normalnych próbkach. W związku z tym różnice w poziomach metylacji próbek, obserwowane za pomocą tej metody, mogą być niewielkie.

line-1-methylation-analysis-mesenchymal-stem-cells-treated-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Bezpośrednie wstrzykiwanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia rakowego (EV) prowadzi do przeprogramowania szpiku kostnego, co wspomaga postęp nowotworu; jednak nie jest jasne, które komórki pośredniczą w tym efekcie. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół badania interakcji nowotworowo-mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) za pośrednictwem EV in vivo, ujawniając kluczową rolę MSC edukowanych przez EV w przerzutach.

Przedkliniczny mysi model kostniakomięsaka w celu zdefiniowania komunikacji za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych między guzem a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi

Tutaj prezentujemy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z fibroblastów pochodzących od pacjentów z zespołem Li-Fraumeni (LFS), różnicowania iPSC poprzez mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) do osteoblastów oraz modelowania nowotworzenia in vivo przy użyciu osteoblastów pochodzących od pacjentów z LFS.

Modelowanie kostniakomięsaka za pomocą zespołu Li-Fraumeni Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.

Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Protokół ten oferuje szczegółowe podejście do oceny poziomów modyfikacji m6Aspecyficznego RNA za pomocą MeRIP-qPCR.

Test MeRIP-qPCR do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

Ten raport opisuje metodę bioinżynierii do projektowania i konstruowania nowych sztucznych czynników splicingu (ASF), które specyficznie modulują splicing docelowych genów w komórkach ssaków. Metoda ta może być dalej rozszerzana w celu inżynierii różnych sztucznych czynników w celu manipulowania innymi aspektami metabolizmu RNA.

Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli komórek ludzkich do analizy czynników inicjacji translacji, które wiążą 5' czapeczkę mRNA podczas fizjologicznych warunków tlenowych. Metoda ta wykorzystuje analog kapu m7GTP sprzężonego z agarozą i jest odpowiednia do badania czynników wiążących kap i ich oddziałujących partnerów.

Analiza białek wiążących czapeczki w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe

Poznaj analizę metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi z kostniakomięsaka. Metoda amplifikacji sond specyficznych dla metylacji pozwala badać zmiany epigenetyczne w biologii nowotworowej.

Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka (Wideo) | JoVE Journal

Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka

Przeglądaj więcej filmów