Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka
1 lutego 2020
Opisane tutaj jest użycie metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji do analizy poziomów metylacji elementów LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka. Wykazano również ultrawirowanie, popularną procedurę oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płodowej surowicy bydlęcej.
Metylacja DNA jest jedną z najlepiej zbadanych sygnatur epigenetycznych. Wiele nowotworów charakteryzuje się zmianami w poziomach metylacji DNA, które są związane z nieprawidłową ekspresją genów i innymi nieprawidłowościami genomowymi. Długie, przeplatane elementy jądrowe to powtarzalne transpozycyjne sekwencje genomowe, które zwykle mają wysoki poziom metylacji.
Jednak często dochodzi do ich hipermetylacji w nowotworach, co powoduje ich aktywację i prowadzi do niestabilności chromosomalnej. W tym badaniu potraktowaliśmy mezenchymalne komórki macierzyste pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka, aby sprawdzić, czy rakowe EV mogą wpływać na metylację LINE-1 w MEC. Płodowa surowica bydlęca, która jest integralnym składnikiem pożywki do hodowli komórek ssaków, zawiera dużą liczbę EV pochodzenia bydlęcego.
Te Ev będą zakłócać analizę Ev z interesujących nas komórek, dlatego podczas hodowli komórek do izolacji EV ważne jest, aby używać FBS zubożonych w EV. Weź FBS do probówek ultrawirówek i umieść je w wiadrach do ultrawirówek. Zrównoważ wiadra z dokładnością do 10 miligramów przed załadowaniem ich na obracający się wirnik.
Umieścić wirnik w ultrawirówce i pracować z natężeniem 100 000 G przez 19 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przebiegu ostrożnie zbierz jasną górną warstwę supernatantu i przenieś ją do 50-mililitrowej probówki. Nie przeszkadzaj ani nie pipetuj ciemnobrązowego granulatu, ponieważ zawiera on EV firmy FBS.
Przepuść supernatant przez filtr 0,22 mikrona do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Ten wysterylizowany filtrem, zubożony w EV FBS może być teraz dodawany do pożywki do hodowli komórkowych podczas hodowli komórek w celu izolacji EV. Zbierz kondycjonowane pożywki z komórek kostniakomięsaka hodowanych w pożywce zubożonej w EV.
Aby usunąć komórki i resztki komórek, odwirować kondycjonowaną pożywkę o stężeniu 2500 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do probówek ultrawirówek i zrównoważyć je jak wcześniej. Odwirować probówki o stężeniu 100 000 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Ostrożnie wyrzuć supernatant, pozostawiając około jednego mililitra na dnie. Dodaj około 20 mililitrów PBS do probówki i delikatnie pipetuj, aby umyć i ponownie zawiesić granulat EV. Zrównoważyć probówki i przeprowadzić kolejną rundę ultrawirowania z tymi samymi ustawieniami.
Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad EV w 200 mikrolitrach PBS przez delikatne pipetowanie. Przechowuj EV w probówkach o niskim stopniu wiązania. Oczyszczone EV charakteryzują się western blot, analizą śledzenia nanocząstek i transmisyjną mikroskopią elektronową.
Płytka 15 000 MSC na studzienkę w płytce 24-dołkowej. Po 24 godzinach usuń stare pożywki, umyj ogniwa PBS i zmień na pożywkę o zubożonym EV. Traktuj komórki z OS-EV w zaplanowanych punktach czasowych.
Po przerwaniu leczenia EV należy pobrać DNA z komórek odpowiednią metodą. Do analizy metylacji użyliśmy niestandardowej metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji. Zaprojektuj niestandardowe sondy LINE-1, tak jak to zrobił wcześniej, Pavicic i inni.
W przypadku sond metylacji wybierz trzy sekwencje zawierające miejsce restrykcyjne HhaI w regionie promotora. W przypadku sond kontrolnych wybierz siedem sekwencji pozbawionych miejsca restrykcji HhaI z reszty sekwencji LINE-1. Rozcieńczyć 70 nanogramów próbki DNA w buforze TE do pięciu mikrolitrów.
Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 98 stopni Celsjusza, a następnie schłodzić do 25 stopni Celsjusza. Dodaj trzy mikrolitry mieszanki hybrydyzacyjnej sondy do każdej próbki i uruchom termocykler, aby umożliwić sondom hybrydyzację z DNA. W temperaturze pokojowej dodaj 30 mikrolitrów mieszanki po hybrydyzacji do każdej próbki.
Przenieś 10 mikrolitrów do drugiej probówki. Umieść oba zestawy probówek w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 48 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną minutę. Gdy próbki mają temperaturę 48 stopni Celsjusza, dodaj 10 mikrolitrów mieszanki ligacyjnej do pierwszego zestawu probówek i 10 mikrolitrów mieszanki podwiązania-trawienia do drugiego zestawu probówek.
Uruchom następny program termocyklera. Następnie odwiruj rurki i jednocześnie ustaw termocykler na 72 stopnie Celsjusza. Dodaj pięć mikrolitrów mieszanki polimerazy do każdej probówki i umieść probówki w termocyklerze.
Uruchom program PCR. Podczas działania programu PCR należy przygotować roztwór jednego mililitra formamidu zawierający 2,5 mikrolitra wzorca wielkości. Odpipetować 10 mikrolitrów tego roztworu do każdego rzędu płytki optycznej 96-dołkowej.
Po PCR rozcieńczyć niestrawione i strawione próbki odpowiednio do stu do stu i od jednego do dwustu w ultra czystej wodzie. Dodać dwa mikrolitry rozcieńczonego produktu PCR do płytki 96-dołkowej. Odwirować płytkę o stężeniu 200 G przez 15 do 20 sekund w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
Przeprowadzić analizę fragmentów próbek za pomocą elektroforezy kapilarnej. Otwórz wyniki elektroforezy kapilarnej w oprogramowaniu do analizy elektroferogramu. Wybierz przykład i ustaw panel na MLPA z menu.
Kliknij panel i naciśnij D, aby zastosować to ustawienie do wszystkich próbek. W podobny sposób ustaw metodę analizy na domyślną mikrosatelitę dla wszystkich próbek. Wybierz wszystkie próbki i kliknij zielony przycisk odtwarzania, aby uruchomić analizę, a następnie wybierz wszystkie próbki i kliknij przycisk wykresu, aby wyświetlić piki sondy.
Powiększ obszar szczytu, aby uzyskać wyższą rozdzielczość poszczególnych szczytów. Upewnij się, że wszystkie 10 pików odpowiadających sondom z mieszanki sond LINE-1 jest oznaczonych. W zakładce genotypy wyeksportuj wyniki w formacie CSV.
Otwórz plik CSV w oprogramowaniu do analizy danych i posortuj dane w kolumnach. Oznacz trzy piki miejsca metylacji na podstawie ich rozmiarów. Pozostałe siedem pików odpowiada sondom kontrolnym.
Tutaj używamy pików sondy LINE-1 2M, które mają rozmiar około 117 par zasad. Dla każdej próbki należy obliczyć łączną powierzchnię pików wszystkich siedmiu pików kontrolnych. Podziel powierzchnię piku każdej sondy LINE-1 przez tę sumę.
Dla każdej próbki należy podzielić wartość strawionej próbki przez wartość próbki niestrawionej, aby uzyskać stosunek dawki metylacji. Analiza Western blot potwierdziła obecność OS-EV z sygnałami zaobserwowanymi dla TSG101, HSP70 i CD63. Brak sygnału kalneksyny wskazywał, że próbka EV była czysta.
Dodatkowe wskazanie czystości zaobserwowano w przypadku TEM z nienaruszonymi pęcherzykami o różnych rozmiarach obecnymi w próbce OS-EV. Stężenie i rozkład wielkości cząstek OS-EV zmierzono za pomocą NTA. 80% pojazdów elektrycznych miało rozmiar od 50 do 200 nanometrów.
Tutaj możemy zobaczyć proporcje dawkowania metylacji LINE-1 z MSC w różnych punktach czasowych leczenia EV. Szara linia reprezentuje podstawowy poziom metylacji od punktu zerowego. W trzecim punkcie czasowym następuje spadek średniego stosunku dawki metylacji po podaniu EV, co wskazuje na hipermetylację.
Ten hipermetylacyjny efekt EV jest mniej wyraźny w siódmym punkcie czasowym. Tutaj pokazaliśmy prostą, bardzo czułą i solidną technikę analizy metylacji. Wymaga niewielkiej ilości DNA bez konwersji wodorosiarczynu i nadaje się również do DNA wyizolowanego z próbek zatopionych w parafinie.
Cała metoda, wraz z częścią eksperymentalną i analityczną, trwa około dwóch dni. Ze względu na wysoką liczbę kopii LINE-1 w genomie, wyjściowa metylacja LINE-1 jest wysoka w normalnych próbkach. W związku z tym różnice w poziomach metylacji próbek, obserwowane za pomocą tej metody, mogą być niewielkie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wpływ pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osteosarcoma na metylację LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych. W badaniu zastosowano metodę amplifikacji sond specyficznych dla metylacji w celu analizy poziomów metylacji, co podkreśla rolę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w biologii nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Epigenetyka
- Biologia nowotworów
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wprowadzenie
- Metylacja DNA jest kluczową modyfikacją epigenetyczną powiązaną z nowotworami.
- Elementy LINE-1 są zazwyczaj hipermetylowane, lecz mogą zostać aktywowane w przebiegu nowotworu.
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają rolę w komunikacji międzykomórkowej i mogą wpływać na ekspresję genów.
- Płodowa surowica bydlęca zawiera liczne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, które mogą wpływać na zachowanie komórek.
Cel badania
- Określenie wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z nowotworu na metylację LINE-1.
- Zbadanie związku między pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi a zmianami epigenetycznymi w mezenchymalnych komórkach macierzystych.
- Wykorzystanie metody amplifikacji sond specyficznych dla metylacji do przeprowadzenia analizy.
Zastosowane metody
- Traktowanie mezenchymalnych komórek macierzystych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z osteosarcoma.
- Analiza poziomów metylacji LINE-1 z wykorzystaniem metody amplifikacji sond swoistych dla metylacji.
- Ultrawirowanie w celu oddzielenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płodowej surowicy bydlęcej.
- Ocena wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na ekspresję genów.
Główne wyniki
- Zaobserwowano zmiany poziomów metylacji LINE-1 po zastosowaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
- Badanie dostarcza informacji na temat roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w epigenetycznych zmianach związanych z nowotworami.
- Wyniki sugerują potencjalny mechanizm, za pomocą którego komórki nowotworowe wpływają na otaczające je komórki macierzyste.
- Wykazano skuteczność metody amplifikacji sond specyficznych dla metylacji.
Wnioski
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z osteosarcoma mogą zmieniać wzorce metylacji w mezenchymalnych komórkach macierzystych.
- Niniejsze badanie podkreśla znaczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w biologii nowotworów.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania wpływu tych wyników na terapię nowotworową.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsze badanie demonstruje, w jaki sposób pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z osteosarcoma mogą indukować zmiany epigenetyczne w mezenchymalnych komórkach macierzystych, konkretnie zmieniając wzorce metylacji LINE-1. Metoda amplifikacji sond specyficznych dla metylacji (MSPA) stanowi czułe podejście bez użycia bisulfitu do wykrywania subtelnych przesunięć metylacji w powtarzalnych elementach genomowych, wspierając wczesnym etapie mitygację ryzyka mechanistycznego w badaniach nad interakcjami między rakiem a zrębem. Takie spostrzeżenia pomagają ustalić priorytety dla celów zaangażowanych w komunikację międzykomórkową i przeprogramowanie epigenetyczne w mikrośrodowisku guza.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia zbadanie, czy pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) pochodzące z nowotworów mogą przeprogramować epigenetykę komórek macierzystych poprzez zmiany metylacji LINE-1.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje niską ilość wejściową DNA i eliminuje konieczność konwersji pirosiarczynowej, co zwiększa przepustowość screeningu epigenetycznego.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: MSPA generuje ilościowe stosunki piku w elektroforezie kapilarnej, co umożliwia znormalizowane porównania stopnia metylacji w różnych warunkach.
- Wartość operacyjna: Analiza jest stabilna, wymaga minimalnego nakładu pracy manualnej (~4–5 h) i jest kompatybilna z DNA z różnorodnych źródeł, w tym z próbek zatopionych w parafinie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Powiązano epigenetyczną modulację zapośredniczoną przez EV z potencjalnymi biomarkerami, ponieważ hipometylacja LINE-1 jest związana z progresją nowotworu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne monitorowanie zmian metylacji w komórkach macierzystych poddanych działaniu czynników pochodzenia nowotworowego, co pozwala ocenić istotność modelu przedklinicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Przepływ pracy MSPA wpisuje się w etap wczesnego odkrywania w celu oceny epigenetycznych skutków sygnalizacji za pośrednictwem EV, co pozwala na walidację celów i ograniczenie ryzyka mechanistycznego przed identyfikacją wiodących cząsteczek.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotezy, według której EV pochodzące z nowotworu zmieniają stan metylacji komórek gospodarza, co pozwala na wyjaśnienie ścieżek epigenetycznego oddziaływania.
- Przesiewy: Uzyskanie powtarzalnych, ilościowych wyników metylacji, odpowiednich do standaryzacji testów oraz porównywania różnych warunków.
- Analityka: Generowanie danych o powierzchni piku z frakcji trawionych i nietrawionych w celu obliczenia stosunków dawek metylacji, co umożliwia obiektywne porównania w różnych punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Powiązanie ekspozycji na EV z dryfem epigenetycznym w komórkach macierzystych, co jest istotne dla modelowania interakcji między guzem a zrąbkiem w systemach przedklinicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Metoda MSPA stanowi wielokrotnie wykorzystywalną platformę do analizy metylacji elementów powtarzalnych poza LINE-1, możliwą do zastosowania w wielu kampaniach walidacji celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Dostarcza wglądu mechanistycznego w to, w jaki sposób EV indukują zmiany epigenetyczne, ograniczając niejednoznaczność hipotez dotyczących przeprogramowania stromy.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany projekt sond oraz wyniki elektroforezy kapilarnej zapewniają powtarzalność między laboratoriami i partiami próbek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu interwencji celowanych w EV poprzez ilościowe określenie wpływu epigenetycznego w komórkach stromy.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów zaangażowanych w regulację epigenetyczną opartą na EV, z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu testów epigenetycznych, hybrydyzacji sond oraz analizie danych z elektroforezy kapilarnej.
- Zależność od dostępu do termocyklera, odczynników do ligacji/trawienia oraz aparatury do analizy fragmentów.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów izolacji EV (np. ultrawirowania), aby zapewnić powtarzalność preparatów EV.
- Należy uwzględnić zmienność jakości i ilości DNA podczas normalizacji względem sond kontrolnych.
- Metoda ograniczona do wykrywania względnych zmian metylacji w określonych miejscach GCGC; nieprzydatna do analiz całego genomu lub rozdzielczości pojedynczego nukleotydu.
