Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Nasz protokół może być wykorzystany do wizualizacji złożoności strukturalnej organoidów, umożliwiając mapowanie tożsamości, siarczanów i dystrybucji w tych strukturach 3D w rozdzielczości pojedynczej komórki. Nasz szybki, trzydniowy protokół jest w pełni zoptymalizowany pod kątem organoidów różnego pochodzenia i wykorzystuje proste przygotowanie próbki, które obejmuje nietoksyczny etap oczyszczania optycznego i metodę montażu na bazie krzemu. Chociaż nasz protokół jest prosty, niektóre z nich to kluczowe kroki, takie jak zorganizowana obsługa lub przygotowanie slajdów, które można lepiej wyjaśnić za pomocą wizualnej demonstracji niż za pomocą tekstu.

Aby odzyskać organoidy o średnicy od 100 do 500 mikrometrów wyhodowane w ekstrakcie z błony podstawnej w 24 dołkach, umyj każdą spoinę, która ma zostać zebrana, za pomocą PBS bez naruszania matryc 3D i umieść płytkę na lodzie. Dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu regeneracyjnego do każdej studzienki i umieść płytkę na poziomym wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 do 60 minut. Zanurz jedną mililitrową końcówkę pipety w 1% BSA w roztworze PBS i pipetuj w górę iw dół dwa razy, aby pokryć każdą końcówkę BSA.

Następnie dodaj pięć mililitrów 1% PBS BSA do jednej 15-mililitrowej probówki na warunek i odwróć probówkę dwa do trzech razy przed wyrzuceniem roztworu, aby pokryć wnętrze probówki. Aby zebrać organoidy, użyj powlekanej końcówki, aby delikatnie ponownie zawiesić zawartość studzienki od pięciu do 10 razy i wyciągnij wszystkie organoidy z każdego stanu w jednej powlekanej 15-mililitrowej probówce. Przepłukać każdą studzienkę jednym mililitrem lodowatego 1% PBS BSA, aby upewnić się, że wszystkie organoidy zostały zebrane, a następnie przenieść popłuczyny do odpowiednich probówek.

Doprowadzić końcową objętość w każdej probówce do 10 mililitrów za pomocą zimnego PBS i osadnić organoidy przez odwirowanie, aby uzyskać szczelną paletę bez widocznej warstwy matrycy 3D. Aby utrwalić organoidy, użyj powlekanej końcówki pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie ponownie zawiesić każdą granulkę w jednym mililitrze lodowatego paraformaldehydu i utrwalić w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Delikatnie ponownie zawiesić organoidy w połowie czasu utrwalania.

Po 45 minutach dodaj 10 mililitrów lodowatego PBS plus 20 do każdej probówki i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie, a następnie umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 10 minut. Aby zablokować organoidy, pod koniec inkubacji należy odwirować próbki i ponownie zawiesić granulki w co najmniej 200 mikrolitrach lodowatego buforu do płukania organoidów na dołek, który ma być platerowany. Następnie przenieść organoidy do indywidualnych studzienek na 24-dołkowej płytce zawiesinowej na 15-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W celu znakowania immunologicznego dodać 200 mikrolitrów buforu do płukania organoidów do pustego dołka referencyjnego i pozwolić organoidom osiąść na dnie płytki. Gdy organoidy osiądą, przechylić płytkę pod kątem 45 stopni, aby umożliwić usunięcie wszystkich oprócz ostatnich 200 mikrolitrów buforu do płukania. Następnie dodaj 200 mikrolitrów organoidowego buforu do płukania zawierającego podstawowe przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania i umieść płytkę na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, lekko kołysząc i potrząsając z prędkością 40 obrotów na minutę.

Następnego ranka dodaj jeden mililitr buforu do płukania organoidów do każdej studzienki i pozwól organoidom osiąść na dnie płytki przez trzy minuty. Kiedy organoidy osiądą, usuń wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów z każdej studzienki i umyj organoidy trzema dwugodzinnymi płukaniami jednym mililitrem świeżego buforu do płukania organoidów i łagodnym kołysaniem i potrząsaniem na mycie. Po trzecim przemyciu należy pozostawić organoidy na dnie płytki na trzy minuty przed usunięciem z każdej studzienki wszystkich mikrolitrów buforu do płukania organoidów z wyjątkiem ostatnich 200

Dodać 200 mikrolitrów organoidowego buforu do przemywania zawierającego odpowiednie przeciwciała drugorzędowe do każdej studzienki w celu nocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z łagodnym kołysaniem i wstrząsaniem. Następnego ranka umyj organoidy trzema dwugodzinnymi płukaniami w jednym mililitrze świeżego buforu do płukania organoidów na jedno pranie, jak pokazano. Po ostatnim myciu przenieś organoidy do jednej 1,5 mililitrowej probówki na studzienkę i zbierz organoidy przez odwirowanie.

W celu optycznego oczyszczenia organoidów należy usunąć jak najwięcej buforu do płukania z każdej probówki, nie naruszając organoidów, i użyć zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby dodać co najmniej 50 mikrolitrów FUnGI do każdej granulki. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej organoidy mogą być przechowywane przez okres do jednego tygodnia w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub do sześciu miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować szkiełka do obrazowania organoidów za pomocą mikroskopii konfokalnej, napełnij 10-mililitrową strzykawkę silikonowym uszczelniaczem i przymocuj zmodyfikowaną końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do strzykawki.

Użyj strzykawki, aby narysować prostokąt o wymiarach jeden na dwa centymetry na środku szkiełka i użyj drugiej zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby umieścić oczyszczone organoidy na środku prostokąta. Aby nałożyć szkiełko nakrywkowe na organoidy, należy najpierw przyłożyć lewą stronę szkiełka nakrywkowego, a następnie powoli opuszczać szkiełko nakrywkowe od lewej do prawej, aż nie będzie uwięzionego powietrza. Następnie delikatnie dociśnij wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby mocno przymocować je do szczeliwa silikonowego.

Aby zobrazować organoidy, umieść szkiełko na stoliku konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i wybierz obiektyw multi immersion 25 X do obrazowania konfokalnego. Ustaw mikroskop na odpowiednie ustawienia akwizycji, wybierając niską moc lasera, aby zmniejszyć wybielanie zdjęć. Użyj trybu stosu Z, aby zdefiniować dolną górną granicę i ustaw rozmiar kroku Z na optymalny.

Podczas obrazowania dużych struktur organoidowych lub wielu organoidów razem, należy użyć trybu kafelkowania z 10% nałożeniem i wskazać obszar zainteresowania. Po ustawieniu wszystkich parametrów uzyskaj renderowaną w 3D reprezentację obrazowania w oprogramowaniu do obrazowania i zoptymalizuj jasność, kontrast i właściwości renderowania 3D. Następnie wyeksportuj migawki RGB wyników jako pliki TIFF.

Siła obrazowania 3D w porównaniu z obrazowaniem 2D jest zilustrowana tymi obrazami organoidów gruczołu sutkowego myszy, które zostały wygenerowane, jak pokazano. Środkowa warstwa tych reprezentatywnych organoidów składa się z dodatnich komórek luminalnych K8 / K18 w kształcie kolumny, a warstwa zewnętrzna zawiera wydłużone komórki bazylii K5 dodatnie, rekapitulując morfologię gruczołu sutkowego in vivo. Ta spolaryzowana organizacja jest trudna do oceny z sekcji optycznej 2D tego samego organoidu.

Innym przykładem złożonej struktury, której nie można zinterpretować bez informacji 3D, jest sieć kanalików MRP2-dodatnich, które ułatwiają zbieranie płynu żółciowego z organoidów ludzkiej wątroby. Co więcej, uzyskana jakość i rozdzielczość pozwala na półautomatyczną segmentację i analizę obrazu. W ten sposób całkowita liczba komórek i obecność markerów mogą być określone ilościowo w określonych podtypach komórkowych w całych organoidach.

Poprzez segmentację jąder całego organoidu zawierającego 140 komórek, można zidentyfikować trzy komórki, które wykazują wysoką dodatniość dla markera cyklu komórkowego Ki67. Optyczny środek czyszczący, FUnGI, przewyższa usuwanie nieoczyszczone i fruktozy-glicerolu w jakości sygnału fluorescencyjnego głęboko w organoidzie. Z FUnGI oczyszczone organoidy wykazują ogólnie zwiększoną intensywność fluorescencji w porównaniu z nieoczyszczonymi organoidami.

Należy pamiętać, że wszelkie resztki BME w próbce mogą powodować zmniejszoną penetrację przeciwciał i mogą prowadzić do wysokiego sygnału tła. Ponadto organoidy torbielowate nie powinny być optycznie usuwane, jeśli się zapadną. Przy niewielkich dostosowaniach do protokołu, próbki mogą być używane z mikroskopią konfokalną, wielofotonową i lekką mikroskopią arkuszową.