Name: Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj metody pomiaru cytotoksyczności i migracji komórek NK wobec komórek nowotworowych wątroby. Protokoły LDH i Calcein AM umożliwiają badanie funkcji komórek NK bez użycia promieniowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za granty od National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) i 1R01 CA218008-01A1 (NW). Potwierdzamy również finansowanie Departamentu Obrony W81XWH1910480 i W81XWH-18-1-0069 dla NW.

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej dla komórek NK i komórek guza wątroby
<ol>
	<li>Wykorzystać ludzkie komórki natural killer (np. NK92MI) oraz ludzką linię komórkową raka wątroby (np. SK-HEP-1).</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórek NK dla ludzkich komórek NK92MI, dodając do 50 mL minimalnej pożywki podstawowej Eagle alpha (MEM alpha) bez rybonukleozydów i deoksyrybonukleozydów następujące składniki do wskazanych stężeń końcowych: 0,02 mM kwasu foliowego (10 µL kwasu foliowego 100 mM), 0,2 mM mioinozytolu (50 µL mioinozytolu 200 mM), 0,1 mM β-merkaptoetanolu (3,5 µL β-merkaptoetanolu 14,3 M), 2 mM L-glutaminy (5 mL L-glutaminy 20 mM), 1% penicyliny/streptomycyny (5 mL penicyliny/streptomycyny 10x), 12,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 12,5% surowicy koni. Wymieszać i wysterylizować poprzez filtrację przy użyciu sterylnej jednostki filtrującej 0,2 µm, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli linii komórkowej guza wątroby SK-HEP-1, dodając 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny do pożywki Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy, zawierającej 2 mM L-glutaminy.</li>
</ol>
2. Test cytotoksyczności pośredniej komórek NK oparty na kolorymetrycznym pomiarze aktywności LDH
<ol>
	<li>Hodować komórki SK-HEP-1 do 70−80% konfluencji w 10 mm szalce Petri do hodowli komórkowej w 5% CO22 w 37 °C w CO2 inkubator. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, najpierw płukąc komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), a następnie inkubując je z 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA w 5% CO22 w 37 °C w CO2 w inkubatorze aż do momentu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. 
	UWAGA: Aktywność komórek NK może zostać indukowana przez obciążone komórki nowotworowe w wyniku zmian w ekspresji ligandów aktywujących komórki NK w tych komórkach. Aby uzyskać dokładne wyniki, należy stosować zdrowe i subkonfluentne komórki nowotworowe. Należy również zauważyć, że receptory komórek NK oraz ich ligandy mogą być wrażliwe na trypsynizację.26,27W związku z tym protokół trypsynizacji należy starannie zoptymalizować i należy unikać nadmiernej trypsynizacji.</li>
	<li>Po trypsynizacji dodać 10 ml pożywki do hodowli komórek SK-HEP-1 i odwirować przy 160 x g przez 3 min w sterylnym stożkowym probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Osad komórkowy przemyć 5 ml 1x PBS i resuspendować w 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Równolegle odwiruj komórki NK92MI przy 160 x g przez 3 min w sterylnej probówce do wirowania o pojemności 15 ml. Osad komórkowy przemyć 5 ml 1x PBS i resuspender w 5 ml pożywki do hodowli komórek NK92MI. 
	UWAGA: Komórki NK92MI są hodowane w pożywce do hodowli komórek NK i otrzymywane w sposób analogiczny do opisanego w punkcie 2.1.</li>
	<li>Należy policzyć komórki SK-HEP-1 i NK92MI za pomocą komory licznikowej (hemocytometru) lub dowolnego dostępnego automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Dodaj komórki SK-HEP-1 (komórki docelowe) (1 x 104/100 µL/well) oraz komórki NK92MI (komórki efektorowe) (1 x 105/100 µL/well) w stosunku 1:10 (komórki docelowe:efektory) i wysiać w trzech powtórzeniach w płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C w atmosferze składającej się z 95% powietrza i 5% CO22 przez 3 h. Po inkubacji odwiruj płytkę przy 450 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Niezaburzając osadu komórkowego, zebrać 100 µL supernatantu z każdej studzienki i przenieść do studzienki w nowej płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Dodaj 50 µL substratu LDH, wymieszać dokładnie i inkubować płytkę przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 50 µL roztworu zatrzymującego (50% dimetylformamidu i 20% dodecylosiarczanu sodu o pH 4,7). Następnie bezzwłocznie zmierz absorbancję płytki przy 490 nm i 680 nm przy użyciu czytnika płytek.</li>
	<li>Odejmij absorbancję przy 680 nm od absorbancji przy 490 nm. Oblicz procent (%) cytotoksyczności komórek NK, korzystając z poniższego wzoru. 
	<img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg" alt="Równanie cytotoksyczności komórek NK, wzór na procent cytotoksyczności z wykorzystaniem testu LDH, schemat równania." data-altupdatedat="1788250015000"> 
	gdzie LDH experimentalne (komórki efektorowe + docelowe) to absorbancja komórek NK92MI i komórek SK-HEP-1, LDH komórek efektorowych to absorbancja samych komórek NK92MI, LDH spontaniczne to absorbancja samych komórek SK-HEP-1, a LDH maksymalne to absorbancja komórek SK-HEP-1 z buforem lizującym. 
	UWAGA: Aby zminimalizować interferencję surowicy, należy zawsze stosować następujące kontrole: same komórki docelowe (SK-HEP-1), same komórki efektorowe (NK92MI), komórki docelowe z buforem lizującym jako kontrolę pełnej lizy, podłoże dla komórek docelowych, podłoże dla NK92MI, a także mieszaninę podłoża dla komórek docelowych i podłoża dla NK92MI w stosunku 1:1.</li>
</ol>
3. Mikroskopowa metoda pomiaru cytotoksyczności zależnej od komórek NK oparta na barwieniu calceiną AM
<ol>
	<li>Hodować komórki SK-HEP-1 do uzyskania 70-80% konfluencji. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, najpierw przemywając komórki 5 ml 1x PBS, a następnie inkubując je w 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Odwiruj komórki SK-HEP-1 w sterylnej probówce do wirowania o pojemności 1 ml przy 160 x g przez 3 min. Przesuspender osad w 3 ml medium DMEM bez surowicy.</li>
	<li>Dodaj 1.5 µL roztworu kalceiny AM (10 mM) do komórek SK-HEP-1 i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Odwiruj oznakowane kalceiną AM komórki SK-HEP-1 przy 160 x g przez 3 min w sterylnej probówce wirówkowej o objętości 15 ml.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml 1x PBS, aby usunąć nadmiar barwnika calcein AM.</li>
	<li>Równocześnie odwiruj komórki NK92MI z prędkością 160 x g przez 3 min w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Osad komórkowy przemyć raz 5 ml 1x PBS, a następnie resuspender w 5 ml pożywki dla komórek NK92MI.</li>
	<li>Policzyć komórki SK-HEP-1 oraz komórki NK92MI znakowane kalceiną AM, używając hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Resuspender komórki SK-HEP-1 w pożywce hodowlanej w stężeniu 1 x 105 komórek/ml oraz komórki NK92MI w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w medium dla komórek NK.</li>
	<li>Wysiać na płytkę komórki SK-HEP-1 (komórki docelowe) znakowane kalceiną AM (1 x 104/100 µL/well) z komórkami NK92MI (komórki efektorowe) (1 x 105/100 µL/well) (stosunek docelowy:efektor 1:10) na studzienkę, w trzech powtórzeniach w płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C w atmosferze składającej się z 95% powietrza i 5% CO22 przez 4 h. Po inkubacji należy wykonać obrazy fluorescencyjne komórek znakowanych calceiną AM przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 10x. Należy zarejestrować co najmniej 10 różnych pól widzenia dla każdego powtórzenia w każdym wariancie traktowania.</li>
	<li>Losowo wybierz 10 obrazów dla każdej powtórki i policz komórki docelowe znakowane calceiną AM dodatnie w grupach inkubowanych z komórkami NK92MI lub bez nich. Oblicz % cytotoksyczności, korzystając z poniższego wzoru. 
	<img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg" alt="Wzór cytotoksyczności komórek NK; schemat; równanie służące do oceny cytotoksyczności komórek odpornościowych in vitro." data-altupdatedat="1788250015000"> 
	UWAGA: Jako kontrole należy zastosować komórki docelowe bez komórek NK92MI oraz całkowicie lizowane komórki docelowe jako kontrolę całkowitej lizy. W celu przeprowadzenia całkowitej lizy należy inkubować komórki w 0,5% Triton X-10 przez 1 h (20 µL 5% Triton X-10 w 200 µL pożywek hodowlanych).</li>
</ol>
4. Test migracji komórek NK
<ol>
	<li>Hodować komórki NK92MI i wirować komórki z prędkością 160 x g przez 3 min w sterylnym probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Osad komórkowy przemyć dwukrotnie 5 ml 1x PBS, a następnie zawiesić komórki w 3 ml bezsurowiczego pożywki dla komórek NK92MI. Liczbę komórek NK92MI oznaczyć za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Wysiać komórki NK92MI (2,5 x 105 komórki/100 µL/well) w górnej komorze przepuszczalnej wkładki Transwell (wkładka o średnicy 6,5 mm i 5 µm wielkość porów).</li>
	<li>Do dolnej komory należy dodać 0,6 ml medium bezsurowiczego zawierającego materiał badany pod kątem właściwości chemoatraktacyjnych dla komórek NK (np. medium kondycjonowane, chemokiny, cytokiny). 
	UWAGA: Podczas przygotowywania medium warunkującego należy użyć medium o obniżonej zawartości surowicy bez dodatku surowicy, aby wyeliminować interferencję białek surowicy w teście migracji.</li>
	<li>Inkubować przepuszczalne komory 24-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 4 h. Po 4 h należy zebrać nieprzyległe i zmigrowane komórki NK92MI z dolnej komory i przenieść je do probówek do sortera komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu dalszej analizy. 
	UWAGA: Czas hodowli może się różnić w zależności od rodzaju komórek docelowych, a także od ilości i kinetyki chemokin produkowanych przez te komórki. W związku z tym czas ten należy ustalić empirycznie dla każdego typu komórek, chemokiny i eksperymentu.</li>
	<li>Dodaj określoną liczbę kulek liczących do cytometrii przepływowej w objętości 50 µL do każdej probówki zawierającej migrujące komórki NK. Oceń objętość 300 µL/well zawiesinę komórkową przy użyciu dowolnego cytometru przepływowego umożliwiającego zautomatyzowane liczenie komórek metodą FACS. 
	UWAGA: Przed każdym użyciem należy dokładnie wymieszać lub wymieszać w wirówce laboratoryjnej (vortex) kulek do liczenia w cytometrii przepływowej, aby zapewnić wykorzystanie stałej liczby kulek i zminimalizować zmienność eksperymentalną. W celu zachowania dokładności przy pracy z kulkami do liczenia zaleca się stosowanie pipetowania odwrotnego. Jako kontrole analizy FACS należy używać wyłącznie komórek NK oraz kulek do liczenia w cytometrii przepływowej. Autorzy zalecają odczyt co najmniej 10 0 łącznie kulek i komórek NK, co w ich doświadczeniu przyniosło dobre rezultaty. Liczba ta może się jednak różnić w zależności od warunków eksperymentalnych. W związku z tym łączna liczba kulek i komórek NK powinna zostać określona empirycznie dla każdego rodzaju eksperymentu. Ponadto ważne jest przeprowadzanie doświadczeń w trzech powtórzeniach biologicznych, aby uzyskać statystycznie istotne wyniki i uwzględnić zmienność między różnymi liczbami komórek.</li>
	<li>Oblicz bezwzględną liczbę migrowanych komórek NK92MI, korzystając z następującego wzoru: 
	<img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg" alt="Wzór na migrację komórek NK92MI: A/B × C/D. Równanie, metoda obliczania migracji komórek." data-altupdatedat="1788250015000"> 
	gdzie A = liczba komórek, B = liczba kulek, C = przypisana liczba kulek w partii (liczba kulek liczących do cytometrii przepływowej/50 µL; w tym przykładzie 49 50), a D = objętość próbki (µL). 
	UWAGA: Jeśli 300 µL objętości próbki (migrowane komórki) wykorzystuje się do analizy FACS przy użyciu 50 µL liczby kulek do cytometrii przepływowej, absolutna liczba migrowanych komórek = 1 70 komórek / 3 30 zdarzeń kulek x 49 50 kulek/300 µL = 84,975 komórek/µLObliczenia należy skorygować w przypadku rozcieńczenia próbki lub zastosowania innej objętości kulek liczących do FACS.</li>
</ol>

<ol><li>Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+and+other+innate+lymphoid+cells+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).</li>
<li>Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy of cancer.</a> European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).</li>
<li>Kalbasi, A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-intrinsic+resistance+to+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade.</a> Nature Reviews Immunology. , (2019).</li>
<li>Zhang, Q., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+innate+immune+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the innate immune response to infection.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).</li>
<li>Janeway, C. A. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+evolved+to+discriminate+infectious+nonself+from+noninfectious+self%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self.</a> Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).</li>
<li>Natoli, G., Ostuni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+memory+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and memory in immune responses.</a> Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).</li>
<li>Cooper, M. D., Alder, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+adaptive+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The evolution of adaptive immune systems.</a> Cell. 124 (4), 815-822 (2006).</li>
<li>Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+vertebrates%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in vertebrates: an overview.</a> Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).</li>
<li>Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+innate+lymphoid+cells+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li>
<li>Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+features+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific features of natural killer cells.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).</li>
<li>Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+functions+of+cytotoxic+lymphocyte+granule+constituents+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo.</a> Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).</li>
<li>Krzewski, K., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+killer%27s+kiss%3A+the+many+functions+of+NK+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The killer's kiss: the many functions of NK cell immunological synapses.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).</li>
<li>Berke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+and+lysis+of+target+cells+by+cytotoxic+lymphocytes%3A+molecular+and+cellular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects.</a> Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).</li>
<li>Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells%3A+Development%2C+Maturation%2C+and+Clinical+Utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1869(2018).</li>
<li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+%28NK%29+cell-mediated+cytotoxicity%3A+differential+use+of+TRAIL+and+Fas+ligand+by+immature+and+mature+primary+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).</li>
<li>Marcus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+tumors+by+the+innate+immune+system+and+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells.</a> Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).</li>
<li>Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+innate+and+adaptive+immunity+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural innate and adaptive immunity to cancer.</a> Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li>
<li>Bryceson, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+evaluation+of+degranulation+assays+in+the+rapid+diagnosis+of+familial+hemophagocytic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes.</a> Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).</li>
<li>Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+NK+Cell+Degranulation+Assay+Applicable+for+Routine+Evaluation+of+NK+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 3769590(2016).</li>
<li>Pietra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+cells+inhibit+natural+killer+cell+function+by+modulating+the+expression+of+activating+receptors+and+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity.</a> Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).</li>
<li>Fehniger, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+mechanisms+of+human+natural+killer+cell+expansion+in+vivo+during+low-dose+IL-2+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).</li>
<li>Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ligands+for+the+Natural+Killer+cell+receptors+NKp30+and+NKp44%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44.</a> PLoS One. 2 (12), e1339(2007).</li>
<li>Nitahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+ligation+without+T+cell+receptor+engagement+triggers+both+cytotoxicity+and+cytokine+production+in+dendritic+epidermal+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells.</a> Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).</li>
<li>Gowen, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forward+genetic+screen+reveals+novel+independent+regulators+of+ULBP1%2C+an+activating+ligand+for+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells.</a> Elife. 4, e08474(2015).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+cell+line%2C+NKL%2C+derived+from+an+aggressive+human+natural+killer+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia.</a> Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody cytotoksyczności i migracji mogą być wykorzystane do oceny cytotoksyczności komórek NK dla komórek nowotworowych i mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek NK w nowotworach złośliwych, a także do identyfikacji środków terapeutycznych, które zwiększą aktywność/funkcję komórek NK. Protokoły są proste, czułe, powtarzalne i stanowią preferowaną alternatywę dla klasycznego testu uwalniania chromu 51opartego na radioaktywności. Protokoły zostały specjalnie zaprojektowane tak, aby można je było łatwo dostosować do użytku w większości laboratoriów, z prostymi odczytami kolorymetrycznymi, mikroskopowymi lub opartymi na FACS, które są łatwe do interpretacji, co pozwala badaczom na wyciągnięcie wiarygodnych wniosków. Wszystkie są skalowalne pod kątem wysokoprzepustowych podejść opartych na badaniach przesiewowych. Chociaż protokoły są przedstawione w kontekście pojedynczej linii komórkowej guza wątroby, można je łatwo dostosować do innych typów komórek rakowych i/lub innych nienowotworowych komórek docelowych.
Podczas gdy wszystkie przedstawione metody są solidne i powtarzalne, różnice międzyeksperymentalne mogą wystąpić w przypadku różnych partii komórek nowotworowych i komórek NK. Aby upewnić się, że wyniki dokładnie wspierają wnioski z eksperymentów, zaleca się powtórzenie eksperymentu co najmniej dwa razy przy użyciu biologicznych trzech prób.
Ograniczeniem tej metody jest to, że tempo wzrostu komórek NK92MI może być powolne. Dlatego w przypadku eksperymentów z 50 lub więcej próbkami należy wcześniej wyhodować wystarczającą liczbę NK92MI, aby zapobiec opóźnieniom. Ponadto wszystkie kontrole opisane w protokołach muszą zostać wdrożone, aby uniknąć fałszywych i niepowtarzalnych wyników. Innym ograniczeniem testu cytotoksyczności NK jest to, że stosunek NK do komórek rakowych, a także czas inkubacji, muszą być zoptymalizowane dla każdej komórki docelowej. Na przykład przetestowaliśmy różne proporcje komórek rakowych do komórek NK (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 i 1:80) dla linii komórkowych raka wątroby, a także wielokrotne czasy inkubacji (2, 3, 4, 5 i 6 godzin). Na podstawie naszych wyników zaobserwowaliśmy najbardziej spójne wyniki ze stosunkami 1:10 i 1:20 komórek nowotworowych do komórek NK i inkubacją przez 3 godziny.
Ponadto komórki rakowe pochodzące z guzów litych przyczepiają się i rosną na powierzchni płytki hodowlanej, podczas gdy komórki NK rosną w zawiesinie. Jeśli czas inkubacji jest dłuższy niż 3 godziny, zaleca się stosowanie 96-dołkowych płytek o ultraniskim przyłączu, co poprawi spójność i odtwarzalność między eksperymentami i kontrpróbami biologicznymi. Ważne jest również, aby pamiętać, że testy cytotoksyczności indukowanej komórkami NK można również przeprowadzić przy użyciu pierwotnych komórek NK wyizolowanych z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Istnieją jednak pewne ograniczenia związane z takimi eksperymentami. Po pierwsze, eksperymenty te nie mogą być tak łatwo skalowane, jak w przypadku ogniw NK92MI. Po drugie, zmienność aktywności cytotoksycznej komórek NK wyizolowanych z PMBC z partii na partię może być problematyczna pod względem odtwarzalności i interpretacji wyników. Podobnie, inne ludzkie linie komórkowe NK są opisane w literaturze i mogą być wykorzystane w tego typu eksperymentach, w tym komórki NKL29; jednak w przeciwieństwie do komórek NK-92MI, komórki NKL są zależne od IL-2 i nie są dostępne na rynku.
Biorąc pod uwagę opisane eksperymenty z kalceiną AM, ważne jest, aby zauważyć, że kalceina AM pozostaje w ciałach apoptotycznych po śmierci komórki30. Z tego względu należy dokładnie przeprowadzić ilościowe oznaczanie kalceiną AM, ponieważ może to prowadzić do niedoszacowania cytotoksyczności NK.
Podobnie jak w przypadku cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK, modulacja migracji komórek NK przez cytokiny i inne chemoatraktanty odgrywa ważną rolę w regulacji funkcji komórek NK. Opisany tutaj test migracji komórek NK stanowi prostą platformę do oceny migracji komórek NK w kontekście bodźca, takiego jak chemokina lub chemoatraktant. Test ten może być wykorzystany do oceny czynników, które mogą promować lub zakłócać migrację komórek NK - identyfikując w ten sposób wzmacniacze i represory migracji komórek NK. Metoda ta może być również przydatna do badania zdolności regulacyjnej migracji komórek NK w wyniku zmian genetycznych/epigenetycznych (regulacja w górę lub w dół) lub w wyniku leczenia farmakologicznego.
Aby dokładnie zmierzyć migrację komórek NK, należy wykonać kilka krytycznych kroków. W przypadku wszystkich eksperymentów z użyciem kondycjonowanej pożywki ważne jest, aby w celu uzyskania dokładnych pomiarów stosować równoważne kondycjonowane podłoże zarówno w warunkach kontrolnych, jak i leczniczych. Czas inkubacji będzie urozmaicony oczyszczonymi chemoatraktantami i kondycjonowaną pożywką. Wreszcie, testy migracji transwell są dobrze ugruntowane i uważane za doskonałą metodę oceny migracji komórek NK; jednak jednorodne monokultury zastosowane w testach nie mają złożonej fizjologii tkanek, a nawet kultur 3D, które mogłyby dokładniej naśladować mikrośrodowisko guza.
Tak więc, chociaż istnieją pewne ograniczenia dotyczące testów cytotoksyczności komórek NK i testów migracji NK przedstawionych w tym artykule, testy te mają zastosowanie w szerokim zakresie badań immunologicznych, a tym samym zapewniają ważne i wiarygodne metody oceny funkcji komórek NK i modulujących immunoterapii komórek NK.

Zdolność ludzkiego ciała do identyfikowania obcych obiektów jest kluczem do przetrwania człowieka przed patogenami i nowotworami złośliwymi1. Najważniejszą rolę w tym procesie odgrywa ludzka odpowiedź immunologiczna2,3,4. Na podstawie kluczowych cech i funkcji ludzki układ odpornościowy można ogólnie podzielić na dwie główne grupy funkcjonalne: adaptacyjny układ odpornościowy i wrodzony układ odpornościowy. Adaptacyjny układ odpornościowy jest zazwyczaj specyficzny dla danego patogenu i posiada pamięć immunologiczną, a zatem jest długotrwały i reaguje na przyszłe ponowne zakażenie tym samym patogenem5,6,7,8,9. W przeciwieństwie do tego, odporność wrodzona jest znacznie szersza w docelowym zwalczaniu i stosunkowo niespecyficzna. Dlatego zazwyczaj wrodzona odpowiedź immunologiczna służy jako pierwsza linia obrony immunologicznej10. Komórki NK należą do wrodzonego układu odpornościowego i stanowią 10−15% wszystkich krążących limfocytów11. Komórki NK eliminują komórki docelowe za pomocą dwóch głównych mechanizmów. Po pierwsze, po związaniu się z komórkami docelowymi eksprymującymi aktywujące ligandy, komórki NK uwalniają zaburzające błonę białko perforynę i proteazę serynową granzymy poprzez egzocytozę, które wspólnie indukują apoptozę w komórkach docelowych12,13,14,15. Dodatkowo, komórki NK eksprymujące FasL i ligand indukujący apoptozę związany z czynnikiem martwicy nowotworu (TRAIL) oddziałują z komórkami docelowymi wyrażającymi receptory śmierci (Fas / CD95), prowadząc do apoptozy zależnej od kaspazy16. Co najważniejsze, komórki NK nie wymagają wstępnej stymulacji, takiej jak prezentacja antygenu, w celu wyeliminowania komórek zakażonych patogenami lub złośliwych; W związku z tym są one zwykle w stanie gotowym do zabicia17,18. Aby zahamować rozwój i progresję guza oraz wyeliminować komórki rakowe, komórki NK muszą migrować do miejsca guza, a po znalezieniu się w mikrośrodowisku guza zidentyfikować i zaatakować komórki docelowe.
W przeszłości funkcje efektorów komórek NK były głównie monitorowane za pomocą testów degranulacji i cytotoksyczności19,20,21. Cytotoksyczność komórek NK można również zmierzyć za pomocą testu uwalniania chromu 5122,23,24,25. Jednak test ten ma pewne specyficzne wymagania, w tym potrzebę licznika promieniowania gamma, i jest oparty na radioaktywności, co wymaga szkolenia w zakresie obchodzenia się z materiałami promieniotwórczymi i ich usuwania oraz stanowi poziom ryzyka dla użytkownika. W związku z tym opracowano i zastosowano kilka nowych testów nieopartych na radioaktywności, które zastosowano do badania aktywności komórek NK.
Tutaj opisujemy dwa takie protokoły, kolorymetryczną dehydrogenazę mlekową (LDH) opartą na pomiarze cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK oraz mikroskopową metodę barwienia opartą na acetoksymetylu kalceiny (AM) do pomiaru eradykacji komórek rakowych za pośrednictwem komórek NK. Testy te nie wymagają stosowania izotopów promieniotwórczych, są proste, czułe i w powtarzalny sposób identyfikują czynniki, które modulują funkcję komórek NK. Dodatkowo, ponieważ funkcja komórek NK nie może być w pełni oceniona bez monitorowania zmian w migracji komórek NK, przedstawiamy również metodę ilościową opartą na cytometrii przepływowej do monitorowania migracji komórek NK.

<table><tbody><tr><td>Koraliki do liczenia bezwzględnego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4256</td><td></td></tr><tr><td>Amicon ultra Filtry odśrodkowe</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Gibco</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>2530081</td><td></td></tr> Test <tr><td>cytotoksyczny LDH Zestaw</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88953</td><td></td></tr><tr><td>mio-inozytol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>NK92MI komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-2408</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>SKHEP-1 Komórki</td><td>ATCC</td><td>HTB-52</td><td></td></tr><tr><td>Komory przepuszczalne Transwell</td><td>Costar</td><td>3241</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar cytotoksyczności i migracji komórek nk w kontekście komórek nowotworowych wątroby

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

Komórki NK są podzbiorem populacji limfocytów cytotoksycznych wrodzonego układu odpornościowego i stanowią pierwszą linię obrony poprzez usuwanie komórek zakażonych patogenami, złośliwych i zestresowanych. Zdolność komórek NK do eliminowania komórek nowotworowych sprawia, że są one ważnym narzędziem w walce z rakiem. Obecnie badanych jest kilka nowych terapii immunologicznych w leczeniu raka, które polegają albo na zwiększeniu aktywności komórek NK, albo na zwiększeniu wrażliwości komórek nowotworowych na eradykację za pośrednictwem komórek NK. Jednak, aby skutecznie opracować te podejścia terapeutyczne, potrzebne są również opłacalne testy in vitro do monitorowania cytotoksyczności i migracji komórek NK. W tym miejscu przedstawiamy dwa protokoły in vitro, które mogą niezawodnie i powtarzalnie monitorować wpływ cytotoksyczności komórek NK na komórki nowotworowe (lub inne komórki docelowe). Protokoły te nie są oparte na radioaktywności, są proste w konfiguracji i mogą być skalowane w celu przeprowadzenia badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Przedstawiamy również protokół oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego monitorowania migracji komórek NK, który można również rozszerzyć do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Łącznie te trzy protokoły mogą być wykorzystywane do monitorowania kluczowych aspektów aktywności komórek NK, które są niezbędne dla zdolności komórek do eliminowania dysfunkcyjnych komórek docelowych.

Testy cytotoksyczności komórek NK oraz test migracji komórek NK przeprowadzono z wykorzystaniem linii komórek guza wątroby SK-HEP-1 jako systemu modelowego. Aby zmierzyć cytotoksyczność komórek NK za pomocą testu LDH, komórki SK-HEP-1 wykazujące ekspresję niespecyficznego (NS) shRNA lub shRNA skierowanego przeciwko aktywującemu czynnikowi transkrypcyjnemu 4 (ATF4) inkubowano z komórkami NK92MI na płytce 96-dołkowej przez 3 h (Rysunek 1A). Wcześniej wykazano, że ATF4 reguluje cytotoksyczność komórek NK poprzez upregulację aktywującego ligandu ULBP128. Aktywność LDH związaną z zabijaniem komórek docelowych przez komórki NK mierzono kolorymetrycznie, a procent cytotoksyczności obliczono zgodnie z formułą opisaną w protokole 1. Nokdown ATF4 znacząco zredukował cytotoksyczność indukowaną przez komórki NK w porównaniu z komórkami NK wykazującymi ekspresję NS shRNA (Rysunek 1B-D). Zmierzyliśmy również cytotoksyczność komórek NK za pomocą testu opartego na barwieniu kalceiną AM. W tym celu komórki SK-HEP-1 wykazujące ekspresję NS shRNA lub shRNA skierowanego przeciwko ATF4 znakowano kalceiną AM i inkubowano z komórkami NK92MI na płytkach 96-dołkowych przez 4 h, jak pokazano na Rysunku 2A. Po inkubacji obrazowane komórki pozytywne pod kątem kalceiny AM przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z filtrem FITC/GFP. Komórek zabitych przez komórki NK nie wykrywa się tą metodą, ponieważ nie zatrzymują one już barwnika kalceiny AM. Jak pokazano na Rysunku 2B,C, liczba komórek SK-HEP-1 pozytywnych pod kątem kalceiny AM zmniejsza się po kokulturze z komórkami NK92MI w porównaniu z komórkami SK-HEP-1 hodowanymi bez komórek NK92MI. Jednakże, zgodnie z oczekiwaniami, nokdown ATF4 za pomocą shRNA zredukował zabijanie komórek SK-HEP-1 przez komórki NK, co objawiło się większą liczbą komórek pozytywnych pod kątem kalceiny AM (Rysunek 2B,C). Zatem zarówno testy oparte na LDH, jak i kalceinie AM wykazały spójne wyniki i potwierdziły, że nokdown ATF4 redukuje indukowaną przez NK cytotoksyczność komórek nowotworowych. Każdy z tych testów jest wystarczający do oceny cytotoksyczności indukowanej przez komórki NK; zalecamy jednak stosowanie obu metod w celu zwiększenia rygoru oraz pewności uzyskanych wyników.
Przedstawiamy również wyniki testu migracji komórek NK w 24-dołkowej płytce. Komórki NK92MI zawieszono ponownie w bezsurowiczym medium NK92MI w górnej komorze, a do dolnej komory przepuszczalnej dodano ligand 2 chemokiny o motywie CC (CCL2). Migrację komórek NK oceniano zgodnie z opisem w sekcji 3 (Rysunek 3A). Liczbę migrujących komórek NK92MI określono poprzez dodanie kulek liczonych do cytometrii przepływowej, a następnie przeprowadzono analizę FACS. Jak pokazano na Rysunku 3B-C, odnotowano istotny wzrost liczby komórek NK92MI, które migrowały w kierunku medium zawierającego CCL2, w porównaniu do medium kontrolnego.
<img alt="Schemat testu cytotoksyczności LDH z udziałem komórek NK i komórek nowotworowych, pomiar absorbancji przy 490/680 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kolorymetryczny test cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki NK oparty na aktywności LDH. (A) Schemat przedstawiający kluczowe etapy kolorymetrycznego testu cytotoksyczności komórek NK opartego na aktywności LDH. (B,C) Analizowano ekspresję ATF4 w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję nieswoistego (NS) shRNA lub shRNA skierowanych przeciwko ATF4 za pomocą ilościowej RT-PCR i western blottingu. (B) Względny ATF4 poziom mRNA przedstawiono po normalizacji do ACTINB poziom w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję shRNA przeciwko NS lub shRNA przeciwko ATF4. (C) poziom białek ATF4 i ACTINB w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję NS shRNA lub ATF4 shRNA (małe cząsteczki interferencyjne RNA). (D) cytotoksyczność zależną od komórek NK analizowano w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję albo NS shRNA, albo ATF4 shRNA metodą LDH. Przedstawiono procent (%) cytotoksyczności zależnej od komórek NK. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; ns – brak istotności statystycznej; **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Równowaga statyczna w cytolizie; schemat testu komórek NK z mikroskopią, przedstawiający wyniki lizy komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Mikroskopowa metoda pomiaru cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki NK oparta na barwieniu Calcein AM. (A) Schemat przedstawiający kluczowe etapy mikroskopowej metody pomiaru cytotoksyczności zależnej od komórek NK, opartej na barwieniu kalceiną AM. (B) Cytotoksyczność zależna od komórek NK analizowano w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję shRNA dla NS lub ATF4 shRNA z zastosowaniem metody z calceiną AM. Przedstawiono reprezentatywne obrazy. Pasek skali = 200 μm. (C) Procent komórek pozytywnych pod względem calceiny AM dla eksperymentu przedstawionego na panelu B. **p &lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Test Transwell migracji komórek NK, analiza cytometryczna; stymulator CCL2; wynik przedstawiony na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Ilościowy test migracji komórek NK oparty na metodzie FACS. (A) Schemat przedstawiający kluczowe etapy testu migracji komórek NK w oparciu o metodę FACS. (B,CAnalizę migracji komórek NK przeprowadzono po dodaniu 50 ng CCL2 do dolnej komory płytki 24-dołkowej.B) Przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe migracii komórek NK dla grupy kontrolnej oraz dla pożywki hodowlanej z dodatkiem CCL2. (C) Dane dotyczące migracji komórek NK (średnia ± SEM) przedstawiono dla eksperymentu pokazanego na panelu B. ***p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Unikanie eliminacji za pośrednictwem komórek NK przez komórki rakowe jest ważne dla inicjacji i progresji raka. Tutaj przedstawiamy dwa protokoły nieoparte na radioaktywności do oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych wątroby. Dodatkowo przedstawiono trzeci protokół do analizy migracji komórek NK.

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Zamierzamy dzisiaj zademonstrować dwa protokoły, które pokazują, jak badać funkcję komórek NK. Istnieją dwa kluczowe aspekty funkcji komórek NK, czyli są one w stanie wyeliminować komórki nowotworowe i są w stanie migrować do mikrośrodowiska guza. Te dwa protokoły zademonstrujemy zdolność komórek NK do eliminowania komórek nowotworowych, a także są w stanie migrować do mikrośrodowiska guza.Tak więc dwa protokoły, które zamierzamy dzisiaj zademonstrować, są proste, nie wymagają użycia aktywności radiowej i mogą być ustanowione w większości laboratoriów, które mają możliwość prowadzenia badań nad biologią molekularną i hodowlą komórkową. Suresh Bugide i Suresh Chava, którzy są współpracownikami po doktoracie w moim laboratorium, zademonstrują dzisiaj te dwa protokoły. Dwa oceniają cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK za pomocą LDH, najpierw hodują ludzką linię komórkową raka wątroby do 70-80% konfluencji w 100-milimetrowej hodowli komórkowej na szalce Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.W dniu eksperymentu przemyj kulturę pięcioma mililitrami PBS, a następnie potraktuj komórki jednym mililitrem 0,25% trypsyny EDTA, aż komórki oderwą się od dna płytki. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki dodać 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej do komórek i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów w celu odwirowania. Umyj osad komórkowy pięcioma mililitrami PBS przed ponownym zawiesieniem komórek w stężeniu od jednego do 10 do 5 komórek na mililitr świeżej pożywki hodowlanej.Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów docelowych ludzkich komórek raka wątroby na studzienkę w trzech powtórzeniach na warunki leczenia na 96-dołkowej płytce i dodaj jeden razy 10 do 5. ludzkich komórek NK w 100 mikrolitrach pożywki do każdej studzienki docelowej. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie i przenieść 100 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki do indywidualnych studzienek nowej płytki 96-dołkowej.Dodaj 50 mikrolitrów substratu LDH do każdej studzienki po dokładnym wymieszaniu i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję za pomocą 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego i natychmiast zmierzyć absorbancję na czytniku płytkowym przy 490 i 680 nanometrach. Następnie użyj wzoru, aby obliczyć procentową cytotoksyczność komórek NK.Aby ocenić cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK przy użyciu kalceiny AM po wyhodowaniu ludzkich komórek linii komórkowej raka wątroby do 70-80% konfluencji, jak wykazano, ponownie zawiesić komórki w trzech mililitrach DMEM bez surowicy i oznaczyć komórki 1,5 mikrolitra 10-milimolowego roztworu kalceiny AM przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i przemyć komórki dwa razy pięcioma mililitrami PBS na przemycie. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu od jednego do 10 do 5 komórek na mililitr pożywki hodowlanej i dodać 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach na warunki traktowania.Następnie, jednorazowo od 10 do 5 ludzkich komórek NK w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej do każdego dołka komórek docelowych i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny. Po zakończeniu inkubacji należy zarejestrować co najmniej 10 różnych pól obrazów komórek dodatnich kalceiny AM dla każdej kontrpróby każdego warunku leczenia pod mikroskopem fluorescencyjnym w 10-krotnym powiększeniu. Następnie oblicz procentową cytotoksyczność za pomocą wzoru.Aby zmierzyć migrację komórek NK w odpowiedzi na bodźce chemotaktyczne, należy pobrać ludzkie komórki NK z 70-80% zlewającej się hodowli i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2,5 razy 10 do 6 komórek na mililitr pożywki do hodowli komórek NK bez surowicy. Następnie dodaj 600 mikrolitrów pożywki bez surowicy zawierającej interesujący nas atraktant chemioterapii komórek NK na studzienkę i umieść jedną wkładkę hodowlaną o średnicy 6,5 milimetra z pięcioma mikrometrycznymi porami do każdej studzienki pożywki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek NK do górnej komory każdej wkładki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny.Pod koniec inkubacji przenieś całą objętość migrowanych komórek nieprzylegających z dna każdej studzienki do pojedynczych pięciomililitrowych probówek FACS i dodaj 50 mikrolitrów z góry określonej liczby kulek zliczających cytometrię przepływową do każdej probówki. Następnie za pomocą cytometru przepływowego oceń każdą próbkę komórkową zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej i oblicz bezwzględną liczbę migrowanych komórek NK za pomocą wzoru. Nokaut ATF4 znacznie zmniejsza cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK w porównaniu z komórkami NK eksprymującymi niespecyficzne RNA z krótką spinką do włosów.Po barwieniu kalceiną AM liczba żywotnych ludzkich komórek raka wątroby zmniejsza się po jednoczesnej hodowli z ludzkimi komórkami NK w porównaniu z ludzkimi komórkami raka wątroby hodowanymi bez komórek NK. Zgodnie z oczekiwaniami, knockdown ATF4 za pomocą krótkiego RNA spinki do włosów zmniejsza zabijanie ludzkich komórek raka wątroby za pośrednictwem komórek NK, o czym świadczy większa liczba komórek AM-dodatnich kalceiny w tych hodowlach. Ponadto obserwuje się znacznie większą migrację komórek NK w odpowiedzi na pożywkę zawierającą chemokiny w porównaniu z komórkami NK wystawionymi na działanie pożywki kontrolnej bez chemokiny.W celu oceny cytotoksyczności komórek NK ważne jest ujednolicenie naszych wysiłków i docelowych proporcji oraz czasu inkubacji dla każdej linii komórek nowotworowych. Po zidentyfikowaniu i walidacji standardów, ocena in vitro jest uzupełniana eksperymentami in vivo na myszach w celu dalszej oceny ich roli w eradykacji komórek nowotworowych.

measurement-natural-killer-cell-mediated-cytotoxicity-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje izolację limfocytów, w tym komórek NK lub komórek NK, z ludzkiej tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne, po którym następuje separacja w gradieniu gęstości, sprzyja izolacji limfocytów, w tym komórek NK. Pobrane limfocyty mogą być dalej wykorzystywane do selektywnej ekspansji komórek NK.

Izolacja komórek NK z tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji

Ten film demonstruje test do pomiaru cytotoksyczności komórek NK przeciwko komórkom rakowym za pomocą barwienia Calcein AM. Zmniejszona liczba fluorescencyjnych komórek nowotworowych po jednoczesnej hodowli z komórkami NK wskazuje na cytotoksyczność komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych.

Barwienie kalceiną acetoksymetylową w celu oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek rakowych

Ten film demonstruje metodę badania migracji komórek NK (natural killer) przez system wstawiania porowatej błony w odpowiedzi na chemoatraktanty. Metoda ta umożliwia ilościową analizę migracji komórek NK z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Pomiar migracji komórek NK w odpowiedzi na bodźce chemotaktyczne

Ten film demonstruje przeprowadzenie testu uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu określenia cytotoksyczności komórek NK (natural killer) w stosunku do docelowych komórek nowotworowych. Test określa ilościowo uwalnianie enzymu cytoplazmatycznej dehydrogenazy mleczanowej z komórek rakowych, mierząc absorbancję powstałego produktu o czerwonym zabarwieniu.

Test in vitro do oceny cytotoksyczności komórek NK wobec komórek rakowych

Ten film przedstawia eksperymentalne badanie transmigracji limfocytów przez model śródbłonka bariery krew-mózg (BBB). Monowarstwa komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (HBMEC) jest generowana in vitro, a komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zawierające limfocyty są dodawane do monowarstwy. Komórki są następnie inkubowane, aby umożliwić transmigrację limfocytów, a migrowane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej.

Badanie migracji limfocytów przez monowarstwę komórek śródbłonka mikronaczyniowego

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Margining-hepatic leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy metodę selektywnego pobierania tej specyficznej populacji komórek wątroby poprzez wymuszoną perfuzję wątroby szczurów lub myszy. Leukocyty wątroby z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby wątrobowe i przerzuty.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

W tym artykule opisujemy metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w pierwotnych ludzkich komórkach NK (Natural Killer) wyizolowanych z krwi obwodowej, w spoczynku lub po aktywacji wywołanej przez IL15. Opisany protokół można łatwo rozszerzyć na pierwotne ludzkie komórki NK aktywowane przez inne cytokiny lub rozpuszczalne bodźce.

Analiza metabolizmu ludzkich komórek NK

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj metody pomiaru cytotoksyczności i migracji komórek NK wobec komórek nowotworowych wątroby. Protokoły LDH i Calcein AM umożliwiają badanie funkcji komórek NK bez użycia promieniowania.

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

Przeglądaj więcej filmów