Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

Zamierzamy dzisiaj zademonstrować dwa protokoły, które pokazują, jak badać funkcję komórek NK. Istnieją dwa kluczowe aspekty funkcji komórek NK, czyli są one w stanie wyeliminować komórki nowotworowe i są w stanie migrować do mikrośrodowiska guza. Te dwa protokoły zademonstrujemy zdolność komórek NK do eliminowania komórek nowotworowych, a także są w stanie migrować do mikrośrodowiska guza.

Tak więc dwa protokoły, które zamierzamy dzisiaj zademonstrować, są proste, nie wymagają użycia aktywności radiowej i mogą być ustanowione w większości laboratoriów, które mają możliwość prowadzenia badań nad biologią molekularną i hodowlą komórkową. Suresh Bugide i Suresh Chava, którzy są współpracownikami po doktoracie w moim laboratorium, zademonstrują dzisiaj te dwa protokoły. Dwa oceniają cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK za pomocą LDH, najpierw hodują ludzką linię komórkową raka wątroby do 70-80% konfluencji w 100-milimetrowej hodowli komórkowej na szalce Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

W dniu eksperymentu przemyj kulturę pięcioma mililitrami PBS, a następnie potraktuj komórki jednym mililitrem 0,25% trypsyny EDTA, aż komórki oderwą się od dna płytki. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki dodać 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej do komórek i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów w celu odwirowania. Umyj osad komórkowy pięcioma mililitrami PBS przed ponownym zawiesieniem komórek w stężeniu od jednego do 10 do 5 komórek na mililitr świeżej pożywki hodowlanej.

Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów docelowych ludzkich komórek raka wątroby na studzienkę w trzech powtórzeniach na warunki leczenia na 96-dołkowej płytce i dodaj jeden razy 10 do 5. ludzkich komórek NK w 100 mikrolitrach pożywki do każdej studzienki docelowej. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie i przenieść 100 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki do indywidualnych studzienek nowej płytki 96-dołkowej.

Dodaj 50 mikrolitrów substratu LDH do każdej studzienki po dokładnym wymieszaniu i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję za pomocą 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego i natychmiast zmierzyć absorbancję na czytniku płytkowym przy 490 i 680 nanometrach. Następnie użyj wzoru, aby obliczyć procentową cytotoksyczność komórek NK.

Aby ocenić cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK przy użyciu kalceiny AM po wyhodowaniu ludzkich komórek linii komórkowej raka wątroby do 70-80% konfluencji, jak wykazano, ponownie zawiesić komórki w trzech mililitrach DMEM bez surowicy i oznaczyć komórki 1,5 mikrolitra 10-milimolowego roztworu kalceiny AM przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i przemyć komórki dwa razy pięcioma mililitrami PBS na przemycie. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu od jednego do 10 do 5 komórek na mililitr pożywki hodowlanej i dodać 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach na warunki traktowania.

Następnie, jednorazowo od 10 do 5 ludzkich komórek NK w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej do każdego dołka komórek docelowych i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny. Po zakończeniu inkubacji należy zarejestrować co najmniej 10 różnych pól obrazów komórek dodatnich kalceiny AM dla każdej kontrpróby każdego warunku leczenia pod mikroskopem fluorescencyjnym w 10-krotnym powiększeniu. Następnie oblicz procentową cytotoksyczność za pomocą wzoru.

Aby zmierzyć migrację komórek NK w odpowiedzi na bodźce chemotaktyczne, należy pobrać ludzkie komórki NK z 70-80% zlewającej się hodowli i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2,5 razy 10 do 6 komórek na mililitr pożywki do hodowli komórek NK bez surowicy. Następnie dodaj 600 mikrolitrów pożywki bez surowicy zawierającej interesujący nas atraktant chemioterapii komórek NK na studzienkę i umieść jedną wkładkę hodowlaną o średnicy 6,5 milimetra z pięcioma mikrometrycznymi porami do każdej studzienki pożywki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek NK do górnej komory każdej wkładki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny.

Pod koniec inkubacji przenieś całą objętość migrowanych komórek nieprzylegających z dna każdej studzienki do pojedynczych pięciomililitrowych probówek FACS i dodaj 50 mikrolitrów z góry określonej liczby kulek zliczających cytometrię przepływową do każdej probówki. Następnie za pomocą cytometru przepływowego oceń każdą próbkę komórkową zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej i oblicz bezwzględną liczbę migrowanych komórek NK za pomocą wzoru. Nokaut ATF4 znacznie zmniejsza cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK w porównaniu z komórkami NK eksprymującymi niespecyficzne RNA z krótką spinką do włosów.

Po barwieniu kalceiną AM liczba żywotnych ludzkich komórek raka wątroby zmniejsza się po jednoczesnej hodowli z ludzkimi komórkami NK w porównaniu z ludzkimi komórkami raka wątroby hodowanymi bez komórek NK. Zgodnie z oczekiwaniami, knockdown ATF4 za pomocą krótkiego RNA spinki do włosów zmniejsza zabijanie ludzkich komórek raka wątroby za pośrednictwem komórek NK, o czym świadczy większa liczba komórek AM-dodatnich kalceiny w tych hodowlach. Ponadto obserwuje się znacznie większą migrację komórek NK w odpowiedzi na pożywkę zawierającą chemokiny w porównaniu z komórkami NK wystawionymi na działanie pożywki kontrolnej bez chemokiny.

W celu oceny cytotoksyczności komórek NK ważne jest ujednolicenie naszych wysiłków i docelowych proporcji oraz czasu inkubacji dla każdej linii komórek nowotworowych. Po zidentyfikowaniu i walidacji standardów, ocena in vitro jest uzupełniana eksperymentami in vivo na myszach w celu dalszej oceny ich roli w eradykacji komórek nowotworowych.