Name: Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Naucz się metody oczyszczania i obrazowania biofilmów Candida albicans przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia szczegółową wizualizację struktur wewnętrznych w trzech wymiarach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez granty NIH R01 AI067703, R21 AI100270 i R21 AI135178 dla A.P. Mitchella. Autorzy są wdzięczni Greenfieldowi "Kipowi" Sluderowi za dostarczenie obiektywu do zanurzania w oleju na duże odległości robocze użytego w tej pracy, a także Danielowi Shiwarskiemu za mikroskopię konfokalną z bezpośrednim zanurzeniem w salicylanie metylu.

1. Wzrost kultur biofilmu
UWAGA: Candida albicans jest ludzkim patogenem. W niektórych instytucjach hodowla tego organizmu wymaga hermetyzacji BSL-2.
<ol>
	<li>Umieść wybrany szczep na płytce agarowej z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) i hoduj 48 godzin w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Wybierz pojedyncze kolonie z płytki, aby zaszczepić 5 ml pożywki YPD w probówkach hodowlanych o pojemności 15 ml w celu nocnego wzrostu tlenowego (rotator karuzelowy, 52–55 obr./min) w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Określić gęstość komórek, stosując 40-50-krotne rozcieńczenie nocnej hodowli. Oblicz współczynnik rozcieńczenia potrzebny do doprowadzenia gęstości komórek do 3 x 106 komórek/ml dla substratów silikonowych lub 0,6–1,2 x 106 komórek/ml dla powierzchni szkła nakrywkowego poddanych działaniu konkanawaliny-A (ConA) lub aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) (patrz Dyskusja).</li>
	<li>W przypadku wzrostu biofilmu na płytce 12-dołkowej (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1) należy dozować 2,0 ml sterylnego podłoża do filamentacji do każdej studzienki i ogrzać płytkę do 37 °C w wilgotnym inkubatorze. Różne podłoża będą indukować filamentację, silniej w podwyższonej temperaturze (37 °C) i z dodatkiem surowicy. Zalecana jest płodowa surowica bydlęca (FBS). Zalecane podłoża to YPD, Spider-Mannitol lub RPMI-1640.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pęsety umieść przygotowane podłoże w każdym dołku w podgrzanej płytce i usuń pęcherzyki. Dodać inokulum z hodowli przez noc, aby osiągnąć gęstość komórek zalecaną w kroku 1.3 w każdym dołku. Jedna studzienka bez inokulum służy jako wizualna ślepa próba i kontrola przed zanieczyszczeniem.</li>
	<li>Umieść płytkę na mieszalniku orbitalnym o prędkości 60 obr./min w nawilżonym inkubatorze powietrza o temperaturze 37 °C na 90 minut, aby dać czas na przyleganie komórek. Po 90 minutach usunąć pożywkę i nieprzyłączone komórki, przemyć sterylną pożywką lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i umieścić zaszczepione podłoża w szalkach hodowlanych lub innej płytce wielodołkowej zawierającej wstępnie podgrzaną pożywkę do filamentacji. W przypadku płytek wielodołkowych bardzo wygodne jest użycie drugiej płytki do etapu płukania i trzeciej płytki z 2,0 ml wstępnie podgrzanego podłoża na studzienkę, aby otrzymać umyte zaszczepione podłoża. Wysterylizuj pęsetę przed każdym transferem.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze z nawilżanym powietrzem otoczenia o temperaturze 37 °C i hodować biofilmy do 48 godzin z mieszaniem orbitalnym 60 obr./min w celu napowietrzenia. W każdej kulturze wzrost planktonu powinien być niewielki, chyba że rozwijający się biofilm zrzuca komórki w postaci drożdży. Wyhodowany w ten sposób biofilm jest pokazany na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie próbek do obrazowania
UWAGA: Utrwalacze aldehydu są lotne i niebezpieczne. Rozcieńczenia utrwalające należy przygotować w dygestorium, a nie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Nie należy umieszczać utrwalaczy w inkubatorach przeznaczonych do żywych komórek. Pracuj z rozcieńczonymi utrwalaczami w przykrytych naczyniach pod wyciągiem lub w dobrze wentylowanym blacie stołowym. Utrwalacze i roztwory myjące po utrwaleniu należy utylizować jako odpady niebezpieczne.
<ol>
	<li>Przygotować świeży utrwalacz, 4% formaldehydu lub paraformaldehydu w PBS, opcjonalnie z dodatkiem do 2% aldehydu glutarowego. Formalina rozcieńczona do 4% może być stosowana do rutynowych prac. 
	nuta: W szczególności aldehyd glutarowy zwiększa autofluorescencję szerokopasmową i może osłabiać fluorescencję wyrazalnych znaczników, takich jak dTomato.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z próbki i zastąpić PBS w celu rozcieńczenia białek surowicy lub przenieść biofilm na jego podłożu do PBS na kilka minut.</li>
	<li>Przenieś próbkę do utrwalacza i ustaw przykryte naczynie na wolnym mikserze orbitalnym na 20 minut. Wydłuż czas przetwarzania grubszych próbek (patrz Dyskusja). Do każdej potrawy należy dodać wystarczającą objętość utrwalacza, aby zanurzyć cały wzrost biofilmu, w tym wszelkie po wewnętrznej stronie naczynia.</li>
	<li>Usuń utrwalacz i ponownie napełnij naczynie PBS, aby wypłukać pozostały utrwalacz. Utrwalacz należy usunąć jako odpad niebezpieczny. Powtórz kilka krótkotrwałych płukań, a następnie dłuższych płukań, aby dać czas na dyfuzję resztkowego utrwalacza z biofilmu lub bloku agaru. Okres prania zależy od czasu przeznaczonego na utrwalenie (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Potrzebna ilość plamy będzie zależeć od masy biofilmu. Przed barwieniem należy usunąć cały biofilm z obszarów naczynia hodowlanego, które nie są próbkami, lub przenieść utrwaloną próbkę do nowego naczynia przed barwieniem. Nie pozwól, aby biofilm spłynął lub wyschł. Trzymaj go zanurzony w PBS.</li>
	<li>Dodaj plamę do naczynia (patrz Dyskusja) i ustaw przykryte naczynie na noc na wolnym mikserze orbitalnym (patrz Dyskusja). Chronić przed światłem.</li>
	<li>Rano usuń roztwór barwiący i ponownie napełnij naczynie PBS, aby rozcieńczyć niezwiązaną plamę. Ustaw naczynia na wolnym mikserze orbitalnym do odplamienia na kilka godzin.</li>
</ol>
3. Protokół Wyjaśnienia: Biofilmy na podłożach niezabezpieczonych
<ol>
	<li>Oczyszczone biofilmy są trudne do rozpoznania wizualnie. Dlatego, jeśli jest to pożądane, oznacz jedną stronę każdego podłoża zadrapaniem, aby wyznaczyć stronę do zaszczepienia.</li>
	<li>Używaj oznakowanych długich pipet Pasteura do wszystkich późniejszych transferów odpadów i rozpuszczalników, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego rozpuszczalników.</li>
	<li>Za pomocą pęsety przenieś utrwalony biofilm z PBS do 5 ml metanolu w proporcji 50:50 PBS:metanol w szklanej fiolce o pojemności 20 ml z biofilmem skierowanym do góry. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 5 minut (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady, uważając, aby uniknąć kontaktu pipety z biofilmem lub biofilmu z fiolką. Delikatnie uzupełnij 3 ml czystego metanolu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 3 minuty.</li>
	<li>Usuń rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast napełnij 5 ml metanolu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 5–10 minut. Usuń rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast napełnij 3 ml metanolu. Biofilmy często wyglądają na bardziej nieprzezroczyste w tym momencie niż ich początkowy wygląd.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast ponownie napełnić fiolkę 5 ml 50:50 metanolu: salicylanu metylu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 5–10 minut. Biofilm powinien być półprzezroczysty w tym zmieszanym rozpuszczalniku.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady. Delikatnie napełnić fiolkę 3 ml czystego salicylanu metylu (MS). Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 3 minuty.</li>
	<li>Usuń rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast napełnij ją 5 ml czystego MS. Ręcznie mieszaj ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 5-10 minut. W tym momencie biofilm powinien być przezroczysty. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast ponownie napełnić fiolkę 3 ml czystego MS. Przetworzony biofilm jest stabilny w tym rozpuszczalniku.</li>
	<li>W przypadku biofilmów na agarze (patrz Dyskusja) należy wydłużyć wszystkie okresy wymiany, aby umożliwić dyfuzję wody i rozpuszczalnika przez agar. Niezbędne okresy czasu można oszacować za pomocą mikroskopu preparacyjnego o małej mocy z oświetleniem ciemnego pola, aby zobaczyć przepływ rozpuszczalnika do agaru. Protokół zapewnia dobre klarowanie i brak większych efektów skurczu, gdy używany jest 2% agar, ale oczyszczony agar skondensuje się, jeśli zostanie ściśnięty podczas obchodzenia się z pęsetą. Zaleca się użycie szpatułki.</li>
</ol>
4. Konfiguracja obrazowania dla mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Poniższe kroki dotyczą korzystania z mikroskopu odwróconego. Użyj naczynia odpornego na rozpuszczalniki, które ma szklane dno nakrywkowe, aby przytrzymać odwróconą próbkę na stoliku mikroskopu (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Przygotuj przekładki do podparcia odwróconej próbki. Używaj małych prostokątów wyciętych ze szkiełek mikroskopowych (o grubości 1 000 μm), szkieł nakrywkowych (170 μm) lub silikonowych pierścieni o średnicy 13 mm (330 μm, patrz tabela materiałów), które można układać w stosy w zależności od potrzeb. Namocz pierścienie w salicylanie metylu przez 1 godzinę, aby zminimalizować dryf ostrości spowodowany obrzękiem.</li>
	<li>W przypadku biofilmu na kwadracie silikonowym klasy medycznej, odwróć kwadrat (tj. obróć go biofilmem w dół) i umieść go na przekładce w kałuży salicylanu metylu w naczyniu (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2). Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza pod próbką.</li>
	<li>Mocno zamontuj naczynie na stoliku mikroskopu i zetknij się z obiektywem zanurzonym w oleju (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Dostosuj ilość stwardnienia rozsianego w naczyniu tak, aby menisk mocno przytrzymywał próbkę na przekładce za pomocą napięcia powierzchniowego. Umieść kroplę MS na odwróconym kwadratowym podłożu, aby zmniejszyć rozproszenie światła z matowego wykończenia, i przykryj naczynie szklaną płytką, aby ograniczyć parowanie. Przed obrazowaniem odczekaj kilka minut, aż próbka osiądzie na przekładkach.</li>
	<li>Użyj światła przechodzącego, aby wizualnie sprawdzić pole widzenia i zlokalizować aktualną pozycję ostrości względem wierzchołkowych i podstawowych obszarów odwróconego biofilmu. Ustaw przysłonę numeryczną podświetlającą kondensator (INA) na minimum (zamknij przysłonę kondensatora), aby zwiększyć kontrast, w przeciwnym razie oczyszczony biofilm będzie prawie niewidoczny. Po zakończeniu wyłącz źródło światła przechodzącego.</li>
	<li>Przełącz się na fluorescencję konfokalną i ustaw dolną i górną granicę stosu obrazów o szeregowej ostrości potrzebnej do objęcia biofilmu. Zalecane stopniowanie napędu ostrości w górę najpierw pokaże przemieszczone komórki, które osiadły na szkle nakrywkowym i bardzo długie strzępki wierzchołkowe, które spoczywają na szkle. Na górnym końcu sekwencji powinny być widoczne komórki założycielskie przylegające do podłoża u podstawy biofilmu. Ustaw średnicę otworka, odstępy między pikselami w płaszczyźnie obrazu i przyrost kroku ostrości, korzystając z ogólnych kryteriów opisanych w dyskusji.</li>
</ol>

<ol><li>Desai, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+Candida+albicans+invasion+and+infection+functions+by+phosphoglycerol+phosphatase+Rh2%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2.</a> Pathogens. 4, 573-589 (2015).</li>
<li>Miramón, P., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feast+for+Candida%3A+Metabolic+plasticity+confers+an+edge+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence.</a> PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144(2017).</li>
<li>Bonhomme, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+glycolytic+flux+and+hypoxia+adaptation+to+efficient+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).</li>
<li>Ramírez-Zavala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Snf1-activating+kinase+Sak1+is+a+key+regulator+of+metabolic+adaptation+and+in+vivo+fitness+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).</li>
<li>Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+hyphal+expansion+causes+phagosomal+membrane+damage+and+luminal+alkalinization%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization.</a> mBio. 9, 01226(2018).</li>
<li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).</li>
<li>Finkel, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portrait+of+Candida+albicans+adherence+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Portrait of Candida albicans adherence regulators.</a> PLoS Pathogens. 8, 1002525(2012).</li>
<li>de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesins+in+human+fungal+pathogens%3A+glue+with+plenty+of+stick%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick.</a> Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).</li>
<li>Lagree, K., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Biofilms%3A+Inside+Out%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Fungal Biofilms: Inside Out.</a> Microbiology Spectrum. 5, (2017).</li>
<li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Candida+albicans+biofilms+to+antifungal+agents+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).</li>
<li>Chandra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans%3A+development%2C+architecture%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li>
<li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).</li>
<li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+of+fungal+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li>
<li>Woolford, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypass+of+Candida+albicans+filamentation%2Fbiofilm+regulators+though+diminished+expression+of+protein+kinase+Cak1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1.</a> PLoS Genetics. 12, 1006487(2016).</li>
<li>Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+diversification+in+a+biofilm+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Circuit diversification in a biofilm regulatory network.</a> PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787(2019).</li>
<li>Ganguly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zap1+control+of+cell-cell+signaling+in+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms.</a> Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).</li>
<li>Frisken, G. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+test+of+an+analytical+model+of+aberration+in+an+oil-immersion+objective+lens+used+in+three-dimensional+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).</li>
<li>Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLanni%2C+F+%22Imaging%2C+A+Laboratory+Manual%22">Imaging, A Laboratory Manual</a>. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347, 543-548 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+column+and+whole+brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Carl+Zeiss%22">Carl Zeiss</a>. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48(1971).</li>
<li>Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+unsectioned+specimens+for+three-dimensional+imaging+via+optical+transmission+and+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113(2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Postępy w mikroskopii fluorescencyjnej w zakresie przekroju optycznego, rozdzielczości, szybkości, unikania lub kompensacji aberracji, akwizycji wielokanałowej oraz mocy obliczeniowej spowodowały odrodzenie obrazowania nienaruszonych próbek. W przypadku próbek utrwalonych duży wpływ miały zarówno klasyczne, jak i nowatorskie metody klarowania i ekspandowania 19,20,21,22,23,24. W tym przypadku zastosowaliśmy szybkie i proste podejście oparte na dopasowywaniu indeksów opartych na rozpuszczalnikach, aby zbadać strukturę biofilmów grzybów, które są mocno przezroczyste lub nieprzezroczyste.
Poprzednie protokoły zostały przetestowane na różnych próbkach. W naszym laboratorium biofilmy Candida albicans są najczęściej hodowane na kwadratach o średnicy 14 mm wyciętych z arkusza kauczuku silikonowego klasy medycznej (patrz Tabela Materiałów). Podłoże to jest wykorzystywane, ponieważ wzrost na PDMS (polidimetylosiloksan) zanurzony w płynnej pożywce hodowlanej został uznany za ważny model in vitro dla zakażeń związanych z implantami medycznymi, w szczególności cewnikami na stałe. Zestresowane komórki inicjujące filamentację szybko przylegają do powierzchni niepolarnych, takich jak PDMS. W praktyce zużyte kwadraty, które zostały oczyszczone i ponownie wysterylizowane w autoklawie (cykl suchy), dają najbardziej spójne biofilmy dla każdego konkretnego szczepu. Biofilmy są również powszechnie hodowane na szkłach nakrywkowych, w naczyniach hodowlanych ze szkła nakrywkowego, w standardowych naczyniach z polistyrenu klasy bakteriologicznej oraz na agarze . Ponieważ komórki C. albicans nie przylegają dobrze do szkła, szkła nakrywkowe powinny być traktowane lektyną, która wiąże polisacharydy ściany komórkowej. Na każdą powierzchnię szkiełka nakrywkowego nakładamy 40 μl 1 mg/ml ConA lub WGA w sterylnej wodzie. Po wyschnięciu szkła nakrywkowe są poddawane działaniu 40 μl 1% aldehydu glutarowego przez 3 minuty w celu usieciowania białka w nierozpuszczalny film. Następnie przemywa się je sterylną wodą destylowaną w celu usunięcia utrwalacza i rozpuszczalnej lektyny i suszy na powietrzu. W razie potrzeby poddane obróbce szkła lub naczynia nakrywkowe są ponownie sterylizowane pod bakteriobójczą lampą UV przez 10 minut.
Grubość próbki będzie miała wpływ na wymagane okresy inkubacji w protokołach. Dyfuzja utrwalająca do biofilmu o wielkości 300 μm wymaga kilku minut do zrównoważenia. Okres ten zwiększa się wraz z kwadratem grubości próbki i powinien być wydłużony do godziny lub więcej w przypadku bardzo grubych biofilmów lub próbek bloków agarowych, które mogą mieć grubość 2–3 mm. Okres równowagi barwienia zależy również od grubości próbki zgodnie z opisem dla utrwalania i wymłukiwania. Ponieważ jednak lektyny dyfundują wolniej niż utrwalacze o niskiej MW, zwłaszcza w żelu agarowym, barwienie powinno być przedłużone z dnia na dzień. To samo należy zrobić z wypłukaniem nadmiaru plamy.
Do protokołów mogą być włączane różnego rodzaju plamy. Do obrazowania strukturalnego używamy barwienia ściany komórkowej, najczęściej Calcofluor White M2R (Fluor. Rozjaśniacz #28) lub lektyna oznaczona barwnikiem, taka jak ConA-Alexafluor 594 lub WGA-Alexafluor 594. Należy zwrócić uwagę na wartościowość białka. Tetramer ConA może powodować sieciowanie wysoce elastycznych strzępek w okolicy wierzchołkowej biofilmu. Jest to mniej widoczne w przypadku dimera WGA. Specyfika kanoniczna tych markerów to Calcofluor dla chityny, ConA dla reszt mannozy oraz WGA dla reszty N-acetylo-D-glukozaminy i kwasu sjalowego.
Ponieważ protokół wymiany rozpuszczalnika jest klasyfikowany z PBS lub wody przez metanol do salicylanu metylu, pojemniki na próbki muszą być odporne na rozpuszczalniki. Salicylan metylu (MS) szybko zmiękczy wyroby z polistyrenu i powoli zmiękczy inne tworzywa sztuczne. Zgodnie z protokołem, stosowanie czystego metanolu może odbywać się w wyrobach z tworzyw sztucznych, ale w tym momencie protokołu zazwyczaj przechodzimy na standardowe szklane fiolki scyntylacyjne o pojemności 20 ml z nakrętkami odpornymi na rozpuszczalniki. Fiolki są wygodne w przypadku biofilmów na silikonowych kwadratowych podłożach, ponieważ kwadraty można podnosić i przenosić za pomocą cienkiej pęsety. Fiolkę można również opróżnić i ponownie napełnić płaskim kwadratem spoczywającym na wewnętrznej zakrzywionej powierzchni, tak aby biofilm nie stykał się ze szkłem. Podłoże powinno być poddane biofilmowi, gdy jest zanurzone w pionowej fiolce. Fiolki doskonale nadają się do długotrwałego przechowywania próbek.
W protokole klarowania bardziej stopniowane etapy wymiany rozpuszczalnika minimalizują ryzyko deformacji próbki w wyniku mieszania rozpuszczalników. Aby zapewnić szybkość i wygodę w podstawowym protokole, istnieją cztery kroki: 1) krok 3.3, PBS do 50:50 PBS: metanol; 2) kroki 3.4 i 3.5, PBS: metanol do czystego metanolu, 3) krok 3.6, czysty metanol do 50:50 metanol: MS; oraz 4) kroki 3.7 i 3.8, metanol:MS do czystego MS. Metanol zapewnia mieszalność przejściową. Ponieważ jednak woda i stwardnienie rozsiane są prawie niemieszające się, ważne jest, aby cała woda została wyparta przez metanol przed wprowadzeniem jakiegokolwiek stwardnienia rozsianego. Podobnie, ponieważ metanol jest bardzo lotny, ważne jest, aby wyprzeć cały metanol przez stwardnienie rozsiane. W przeciwnym razie ciągłe parowanie resztkowego metanolu spowoduje zmiany współczynnika załamania światła w próbce. W ramach czteroetapowej sekwencji wskazane jest powtórzenie drugiego i czwartego kroku poprzez dodanie kolejnej zmiany czystego rozpuszczalnika, a nawet trzeciej zmiany. W przypadku szczególnie delikatnych próbek zmiany rozpuszczalnika można formułować w mniejszych krokach procentowych.
W przypadku próbek bloków agarowych, kroki 3.4 i 3.5 (czysty metanol) mogą powodować pojawienie się kryształów soli w agarze z powodu nierozpuszczalności pozostałości soli PBS w metanolu. Można tego uniknąć, stosując wodę destylowaną (DW) w pierwszym etapie mieszania rozpuszczalnika zamiast PBS do rozcieńczania soli podczas wymiany woda-metanol. Alternatywna sekwencja wymiany rozpuszczalnika dla utrwalonych biofilmów składa się z następujących etapów: 1) etap 3.3, przenieść próbkę z PBS do 50:50 DW:metanol (należy odczekać dodatkowy czas na dyfuzję przez agar); 2) krok 3.4, przenieść próbkę z 50:50 DW: metanol do czystego metanolu (powtórzyć 2x z metanolem, jak w kroku 3.5); 3) Krok 3.6, przenieś próbkę z metanolu do 50:50 metanol: salicylan metylu; i 4) krok 3.7, przenieść próbkę z 50:50 metanol:MS do czystego MS (powtórzyć 2x z MS, jak w kroku 3.8).
Ponieważ salicylan metylu szybko zmiękcza tworzywa polistyrenowe, używamy naczynia z anodyzowanego aluminium ze szklanym dnem do utrzymywania oczyszczonego biofilmu na stoliku mikroskopu odwróconego. Szkło nakrywkowe jest utrzymywane na miejscu za pomocą cementu optycznego utwardzanego promieniami UV (Norland Optical Adhesive #61, patrz Tabela materiałów). Pod warunkiem, że stwardnienie rozsiane zostanie usunięte pod koniec dnia poprzez umycie naczynia izopropanolem, a następnie wodą z mydłem i spłukanie, cementowane szkło nakrywkowe będzie służyć przez wiele miesięcy.
Dobór obiektywu jest niezwykle ważny w wielkoskalowym obrazowaniu oczyszczonych próbek ze względu na znaczenie minimalizacji aberracji sferycznej i potrzebę wystarczającej odległości roboczej. Mamy doświadczenie z trzema celami w tych badaniach. W konfiguracji mikroskopu odwróconego używamy oleju obiektywowego o dużej odległości roboczej i umiarkowanej aperturze numerycznej (NA) zanurzonego pod szkłem nakrywkowym z biofilmem zanurzonym w salicylanie metylu w naczyniu nad szkłem nakrywkowym. Większość naszych prac została wykonana przy użyciu obiektywu achromatycznego z serii Zeiss Universal, typu 461708, 40x 0,85NA Oel 160/1,5, używanego z adapterem o ogniskowej ujemnej 160 mm w celu zapewnienia nominalnej kompatybilności z konjugatem nieskończonym (IC). Obiektyw ten został pierwotnie zaprojektowany do oglądania zanurzonego w oleju przez szkiełka mikroskopowe 1,5 mm z odległością roboczą 0,35 mm25. W przypadku stosowania ze standardowym szkłem nakrywkowym (0,17 mm) odległość robocza jest znacznie większa: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1 680 μm. Używamy również nowego obiektywu wielofunkcyjnego Zeiss, typu 420852, planapochromatu 25x 0,8 NA LD LCI o odległości roboczej przekraczającej 540 μm, z korekcją zanurzenia ustawioną na wysoką stronę "oleju". Ten obiektyw jest wysoce skorygowany i zapewnia doskonały obraz. Na pionowym statywie mikroskopowym zastosowaliśmy nowy obiektyw multiimmersyjny firmy Nikon, typ MRD71120, planapochromat 10x 0,5NA CFI o odległości roboczej przekraczającej 5 000 μm (5 mm), również z korekcją zanurzenia ustawioną na wysoką stronę "oleju" (n = 1,518). Chociaż ten cel ma niższy poziom NA niż inne, ma tę zaletę, że można go bezpośrednio zanurzyć w salicylanie metylu.
Aby zoptymalizować akwizycję danych pod względem szybkości i rozdzielczości, ustawienia mikroskopu konfokalnego powinny idealnie spełniać zarówno poprzeczne, jak i osiowe gęstości próbkowania Nyquista18. Korzystając z konwencjonalnych kryteriów, ustaw średnicę otworu konfokalnego nominalnie na 1 jednostkę Airy. W powiększonych współrzędnych,
dP (μm) = 1,22 x powiększenie x (długość fali emisji w μm) / NA
Próbkowanie poprzeczne (odstępy między pikselami) nie powinno przekraczać (1/2) x limit rozdzielczości Abbego. We współrzędnych przestrzeni obiektu,
∆x, ∆y = (długość fali emisji w nm) / (4 NA)
Próbkowanie osiowe (przyrost ogniska) nie powinno przekraczać odwrotnej szerokości pasma osiowego,
∆z = (wskaźnik zanurzenia) x (długość fali emisji w nm) / (NA2)
Konfokalny układ optyczny rozszerza pasmo mikroskopu i wyostrza zarówno rozdzielczość poprzeczną, jak i osiową o co najmniej 1/√2.
Dla najczęściej używanego przez nas obiektywu 40x 0,85 NA, w tabeli 1 przedstawiono wyniki tych wzorów dla długości fali emisji 600 nm (Alexa Fluor 594).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>formuła</td>
			<td>x 1/√2</td>
			<td>zestaw (typowy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dP (μm)</td>
			<td>34,5 μm</td>
			<td>-</td>
			<td>25 lub 50 μm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>∆x, ∆y</td>
			<td>176 nm</td>
			<td>125 nm</td>
			<td>161 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>∆z</td>
			<td>1200 nm</td>
			<td>848 nm</td>
			<td>900 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Konfokalna średnica otworka, poprzeczne pobieranie próbek i osiowe wartości próbkowania dla długości fali emisji 600 nm.
Korzystając ze skanera konfokalnego z wirującym dyskiem z tymi ustawieniami i polem skanowania o wymiarach 1 392 x 1 040 pikseli, dane z próbek biofilmu można uzyskać z rozsądną szybkością i rozdzielczością. Typowe jednokolorowe stosy obrazów 3D mają pojemność od 0,35 do 1,55 GB.
Media klarujące w szerokim zastosowaniu obejmują znaczny zakres współczynnika załamania światła. Dzięki oświetleniu ciemnego pola i oględzinom stwierdziliśmy, że utrwalone biofilmy C. albicans były najbardziej przezroczyste powyżej n = 1,5. Zostało to uściślone za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym do n = 1,530–1,535. Z wielu praktycznych powodów stosujemy salicylan metylu (n = 1,537) jako końcowy rozpuszczalnik pasujący do indeksu. Chociaż wymiana rozpuszczalnika niesie ze sobą ryzyko deformacji próbki lub innych artefaktów, komórki w stałych, oczyszczonych próbkach mają podobne wymiary ciała komórki, średnicę strzępki i wymiary długości międzyprzegrodowej jak żywe próbki.
Możliwych jest wiele wariantów procesu wymiany rozpuszczalnika (np. przy użyciu innego rozpuszczalnika przejściowego lub innego rozpuszczalnika końcowego). Metanol został wybrany ze względu na jego wysoką polarność i szybką dyfuzję, ale wykazano, że etanol lepiej zachowuje wydajność kwantową białka czerwonej fluorescencji (RFP)26 jako rozpuszczalnik przejściowy. Salicylan metylu został wybrany ze względu na jego indeks, umiarkowaną polarność, niską prężność pary i kompatybilność z wieloma barwnikami, barwnikami i białkami fluorescencyjnymi. Jednak końcowy rozpuszczalnik o nieco niższym indeksie lub mieszanina salicylanu metylu i rozpuszczalnika o niższym indeksie, takiego jak butanol, może służyć lepiej.
Nieoczekiwanie zdolność widzenia przez biofilm ujawnia nie tylko jego uwarstwione cechy wewnętrzne, ale także pomaga w zobaczeniu pochodzenia rozszerzonych struktur, takich jak długie, niesplątane strzępki wierzchołkowe i inwazyjne strzępki podstawy na niektórych podłożach. Oportunistyczna zjadliwość C. albicans zależy od jego genetycznej wszechstronności (tj. przejścia na wzrost strzępek, regulacji w górę podłoża komórkowego i przylegania do komórek komórkowych, wytwarzania osmolitów do pączkowania i wydłużania komórek oraz stosowania alternatywnych składników odżywczych). Rozszerzenie strzępek umożliwia wyrwanie pojedynczych komórek C. albicans z fagocytarnych komórek odpornościowych, ale jest również niezbędne do inwazji. Wydaje się, że adhezja biofilmu i splątanie strzępek zapewniają zakotwiczenie powierzchni potrzebne do skutecznego zaatakowania podłoża przez strzępki. Gdy tym podłożem jest tkanka gospodarza, może dojść do zwiększonej zjadliwości.
Obrazowanie nienaruszonych biofilmów umożliwia przeprowadzenie ogromnej liczby eksperymentów informacyjnych z wykorzystaniem szczepów reporterowych do ekspresji genów, modelowych substratów tkanek oraz włączenia innych organizmów, takich jak bakterie znajdujące się w naturalnych biofilmach. Nawet w najprostszym przypadku obrazowania czysto strukturalnego z barwieniem ściany komórkowej, ujawniają się fenotypy in situ, które następnie mogą być określone ilościowo i przeanalizowane genetycznie.

Candida albicans to grzyb drobnoustrojowy, który jest typowo komensalny u ludzi. Ma fundamentalne znaczenie dla biologów, ponieważ organizm ma wiele morfologii. Na przykład, w odpowiedzi na pewne sygnały środowiskowe lub stresory, pączkujące komórki tworzące drożdże przełączą się na nitkowaty wzrost jako łańcuchy przegrodowe bardzo wydłużonych komórek znanych jako strzępki. Przejście jest ważne jako przykład fenotypowej ekspresji przejścia między jednokomórkowym i wielokomórkowym programem ekspresji genów. Podobnie C. albicans ma znaczenie biomedyczne, ponieważ organizm ten jest dobrze znanym patogenem oportunistycznym. Jest odpowiedzialny za infekcje drożdżakowe błony śluzowej, takie jak pleśniawki (kandydoza jamy ustnej), infekcje układu moczowo-płciowego oraz jest przyczyną groźnych infekcji inwazyjnych lub ogólnoustrojowych u pacjentów osłabionych immunologicznie.
Potencjał zjadliwości tego organizmu jest ściśle związany z jego licznymi morfotypami i innymi aspektami jego genetycznej wszechstronności1,2,3,4. Wydłużenie cegiełki rozrodczej, pierwszy widoczny etap przejścia do wzrostu strzępek, zachodzi z wystarczającą szybkością, aby umożliwić pochłoniętym komórkom C. albicans wyrwanie się z fagocytów, a tym samym ucieczkę przed wczesną fazą komórkowej odpowiedzi immunologicznej gospodarza5. Dodatkowo filamentacja jest poprzedzona i towarzyszy jej duży wzrost przylegania między komórkami i komórkami do powierzchni, co jest spowodowane regulowaną ekspresją kilku klas białek ściany komórkowej znanych jako adhezyny6,7,8,9. W wielu różnych warunkach połączenie przylegania i filamentacji powoduje dramatyczne przejście od planktonowego, jednokomórkowego wzrostu do związanego z powierzchnią wzrostu kolonialnego, który tworzy biofilm. Biofilmy C. albicans mogą rozwijać się na powszechnie stosowanych urządzeniach medycznych, takich jak cewniki dożylne. Rozsiane infekcje mogą powstawać, gdy takie biofilmy zaczynają pączkować z komórek drożdży i zrzucać je do krążącej krwi. Liczne badania wykazały, że komórki biofilmu są bardziej odporne na leki przeciwgrzybicze niż komórki planktonowe10,11, co może być częściowo spowodowane obniżonym metabolizmem12. Co więcej, wysoka ogólna przylegalność biofilmu może zapewnić zakotwiczenie potrzebne do skutecznego inwazyjnego wzrostu strzępek w tkance gospodarza1.
Optyczne wyjaśnienie biofilmów C. albicans poprzez dopasowanie współczynnika załamania światła miało duży wpływ na naszą zdolność do wizualizacji struktury tej społeczności mikrobiologicznej i odkrycia związków między ekspresją genów a fenotypem. Biofilmy hodowane w laboratorium na powierzchniach testowych pod płynnym podłożem hodowlanym przez 48 godzin pojawiają się jako biaława powłoka, która jest wystarczająco gęsta i wystarczająco gruba, aby była nieprzezroczysta (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W związku z tym wiele interesujących cech fenotypowych biofilmu jest ukrytych przed wzrokiem. Biofilmy typu dzikiego uprawiane w pożywce YPD, RPMI-1640 lub pająku w temperaturze 37 °C mają grubość do 300 μm, przy czym biofilmy 48 godzin często osiągają 500 μm. Nieprzezroczystość jest spowodowana rozpraszaniem światła, które wynika z niejednorodności refrakcji: ściana komórkowa grzyba jest bardziej załamana niż otaczający ośrodek, a cytoplazma jest nieco bardziej załamana niż ściana komórkowa. Wynikająca z tego wysoka gęstość optyczna natywnego biofilmu zasłania wszystkie struktury o głębokości większej niż 30 μm, gdy są oglądane za pomocą konwencjonalnego mikroskopu lub nawet skanera konfokalnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Jednak duży stopień klarowania można osiągnąć poprzez infiltrację utrwalonych biofilmów cieczą o wysokim współczynniku załamania światła, która w przybliżeniu odpowiada załamaniu głównych składników komórkowych. Po wyjaśnieniu, obrazowanie w rozdzielczości submikronowej można przeprowadzić za pomocą mikroskopii konfokalnej na całej grubości prawie każdego biofilmu C. albicans13. W osobnikach dzikich łatwo zauważyć, że biofilmy składają się z długich, splątanych splątanych strzępek, skupisk pączkujących komórek w postaci drożdży lub komórek pseudostrzępkowych, pustych przestrzeni i pewnej ilości macierzy zewnątrzkomórkowej. Co więcej, biofilmy są na ogół stratyfikowane, wykazując przestrzennie zróżnicowane różnice morfologiczne w typie komórki, gęstości komórek oraz obecności komórek pączkujących lub rozgałęziających się. Wiele różnic w jednej lub więcej z tych cech zaobserwowano w biofilmach opracowanych przez zmutowane szczepy14,15. Dodatkowo, szczepy reporterowe wykazują in situ przestrzenne różnice w ekspresji genów16,9,13. Zaskakujący stopień wyjaśnienia, jaki można uzyskać za pomocą tego stosunkowo prostego i niedrogiego podejścia, pozwala również zauważyć, że wiele biofilmów zawiera strzępki wierzchołkowe i podstawowe strzępki inwazyjne rozciągające się na milimetrowe odległości.
W tym protokole wizualizacji demonstrujemy utrwalanie, etykietowanie, klarowanie i obrazowanie biofilmu C. albicans za pomocą prostego markera ściany komórkowej jako barwnika. Źródłem obecnej wersji protokołu jest poprawa klarowności, którą zaobserwowaliśmy, gdy biofilmy utrwalone formaldehydem zostały przesączone 97% metakrylanem glikolu (GMA), który następnie został spolimeryzowany w celu osadzenia biofilmu w twardym plastiku o umiarkowanie wysokim współczynniku załamania światła (n = 1,49). Następnie użyliśmy konwencjonalnej mikroskopii z kontrastem fazowym i serii cieczy referencyjnych o indeksie załamania światła, aby dokładniej określić punkt odwrócenia kontrastu (maksymalna przezroczystość) biofilmu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). W przypadku biofilmów C. albicans wystąpiło to blisko n = 1,530, co było zaskakująco wysokie, biorąc pod uwagę, że gęsta struktura białkowa, taka jak keratyna włosów, jest tylko nieznacznie bardziej załamana (1,54–1,55). Chociaż znajduje się na górnym końcu optymalnego zakresu w <klasa silna = "xfig" > Rysunek 3, przyjęliśmy salicylan metylu (olej wintergrinowy, n = 1,537) w obecnym protokole, ponieważ od dawna jest używany jako środek klarujący do mikroskopii w embriologii i histologii, ma niską toksyczność i niską prężność par oraz dał doskonałe wyniki w naszych próbach z użyciem optyki zanurzeniowej z umiarkowaną powłoką olejową NA.
Należy tutaj zwrócić uwagę na cztery punkty:
(1) Z nielicznymi wyjątkami, idealną sytuacją w mikroskopii jest to, że współczynnik załamania światła próbki powinien być równy współczynnikowi załamania płynu zanurzeniowego soczewki obiektywu17,18,13. W przypadku badań obrazowania trójwymiarowego (3D), w których konieczne jest głębokie ogniskowanie, jest to zawsze ważne.
(2) Nasz eksperymentalny wynik dla optymalnego oczyszczania (n = 1,525–1,535) jest nieco wyższy niż standardowe olejki immersyjne (n = 1,515, 1,518) i dlatego narusza punkt (1), a tym samym wprowadza źródło aberracji sferycznej przy użyciu standardowych olejowych optyki immersyjnej. Jednym z rozwiązań tego problemu jest użycie obiektywu zaprojektowanego dla wskaźnika zanurzenia w wyższym zakresie. Ze względu na odrodzenie zainteresowania obrazowaniem oczyszczonych próbek, dostępne stają się specjalistyczne obiektywy z potrzebną korekcją. Innym rozwiązaniem jest obniżenie indeksu pożywki klarującej do 1,515 lub 1,518 poprzez dodanie niewielkiej ilości butanolu (n = 1,399) w celu uzyskania optymalnej wydajności zanurzenia w oleju i zaakceptowania nieznacznie obniżonej klarowności.
(3) Mikroskopia nienaruszonych biofilmów (i innych próbek w tej skali) wymaga znacznej odległości roboczej, aby dostosować się do grubości próbki. Jest to ważny wzgląd praktyczny. Duża odległość robocza ogranicza optykę do umiarkowanej apertury numerycznej (NA = 0,6–1,25), co ogranicza rozdzielczość, ale także ogranicza nasilenie aberracji sferycznej.
(4) Optymalny współczynnik załamania światła dla wyjaśnienia może być różny dla innych typów stałych próbek. Próbki powinny być odpowiednio testowane przy użyciu kontrastu fazowego i serii cieczy odniesienia indeksu załamania światła, jak pokazano na Rysunek 3.

<table><tbody><tr><td>Pojemnik na odpady niebezpieczne biologicznie Komora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bezpieczeństwa biologicznego z bakteriobójczą lampą</td><td></td><td></td><td></td>UV</tr><tr><td>Calcofluor White M2R (2,5 mg/ml w metanolu)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Konkanawalina A - Alexafluor-594 lub inna sprzężona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>DW</td></tr><tr><td>Woda destylowana, sterylna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolutny</td><td></td><td></td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), sterylna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka na odpady utrwalające w wtórnym zabezpieczeniu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 20% w wodzie, ampułki</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki Alternatywy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dla formaldehydu: proszek paraformaldehydu, formalina 37%</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dygestorium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 25% w wodzie, ampułki</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Naukowy - 30 & deg; C, z mieszalnikiem obrotowym (60 obr./min) do probówek hodowlanych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator - 37 &deg; C, z mieszalnikiem orbitalnym do płytek</td><td></td><td></td><td></td>hodowlanych</tr><tr><td>Isopropanol 70%</td><td></td><td></td><td>iPrOH 70%</td></tr><tr><td>Longwave (365 nm) Lampa UV, 5 W</td><td>Cole-Parmer Scientific</td><td></td><td>do utwardzania cementu NOA-61</td></tr><tr><td>Arkusz silikonowy klasy medycznej, grubość 0,060 cala (1,52 mm)</td><td>Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/</td><td></td> <td>Niewzmocniona folia silikonowa klasy medycznej</td></tr><tr><td>Metanol 99,9% </td><td></td><td></td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Salicylan metylu 99%</td><td></td><td></td><td>MS</td></tr><tr><td>Millipore Swinnex 13 mm białe silikonowe uszczelki pierścieniowe</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>SX0001301</tr><tr><td>Norland Klej optyczny utwardzany promieniami UV - typ NOA-61</td><td>Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com</td><td>NOA-61</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik orbitalny, stołowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), sterylne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ciecze o standardowym indeksie załamania światła, n = 1,500 do 1,640 (29 cieczy, przyrost 0,005)</td><td>Cargille Laboratories, https://cargille.com</td><td>Seria E</td><td>Cedar Grove, NJ 07009, USA</td></tr><tr><td>RPMI-1640 podłoże bazowe, buforowane HEPES, sterylne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fiolki scyntylacyjne, 20 ml - Wheaton, wkładka do stożka PE z nasadką mocznikową</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>03-341-25H</td><td>do przetwarzania i przechowywania próbek</td></tr><tr><td>Butelka na odpady rozpuszczalnikowe w wtórnym zabezpieczeniu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka pająka z mannitolem, sterylna (1% bulion odżywczy Difco, 0,2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z kiełków pszenicy - Alexafluor-594 lub inny koniugat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki agarowe z drożdżowo-peptonowo-dekstrozowymi (YPD), sterylne (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton baktowy, 2% dekstroza, 2% agar bakto)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka YPD, płynna, sterylna (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton bakto, 2% dekstroza)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i obrazowanie biofilmów candida albicans

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Mikrobiologiczny grzyb Candida albicans może przejść zmianę z kolonizacji komensalnej na zjadliwość, która jest silnie skorelowana z jego zdolnością do przejścia ze wzrostu drożdży na wzrost strzępek. Komórki inicjujące ten proces przylegają zarówno do powierzchni, jak i do siebie nawzajem, w wyniku czego powstaje kolonia biofilmu. Dzieje się tak często nie tylko na powierzchniach tkanek błony śluzowej w infekcjach drożdżakowych, ale także na implantach medycznych, takich jak cewniki. Powszechnie wiadomo, że komórki biofilmu są oporne na leki przeciwgrzybicze, a komórki, które wydzielają się z biofilmu, mogą prowadzić do niebezpiecznych infekcji ogólnoustrojowych. Biofilmy wahają się od mocno przezroczystych do nieprzezroczystych ze względu na niejednorodność refrakcyjną. Dlatego biofilmy grzybów są trudne do zbadania za pomocą mikroskopii optycznej. Aby uwidocznić wewnętrzne cechy strukturalne, komórkowe i subkomórkowe, klarujemy utrwalone nienaruszone biofilmy poprzez stopniową wymianę rozpuszczalnika do punktu optymalnego dopasowania współczynnika załamania światła. W przypadku biofilmów C. albicans wystarczające oczyszczenie uzyskuje się za pomocą salicylanu metylu (n = 1,537), aby umożliwić mikroskopię konfokalną od wierzchołka do podstawy w biofilmach 600 μm przy niewielkim tłumieniu. W tym protokole wizualizacji przedstawiamy refraktometrię z kontrastem fazowym, wzrost biofilmów laboratoryjnych, utrwalanie, barwienie, wymianę rozpuszczalnika, konfigurację do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i reprezentatywne wyniki.

Biofilmy, takie jak ten przedstawiony na Rysunku 1, są silnie półprzezroczyste lub nieprzezroczyste, lecz rutynowo są klarowane i obrazowane przy zastosowaniu powyższego protokołu. Rysunek 2 pokazuje silne tłumienie fluorescencji wraz z głębokością ogniskowania w utrwalonym biofilmie w PBS w porównaniu do tego samego biofilmu po dopasowaniu współczynnika załamania światła. Jak pokazano na Rysunku 3, wykorzystując seryjnie mieszalne rozpuszczalniki o coraz wyższym współczynniku załamania, można szybko oszacować maksimum klarowności. Jest ono doprecyzowane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fazowo-kontrastowej w celu znalezienia punktu minimalnego kontrastu (maksymalnej przejrzystości). Jest oczywiste, że optimum to nie jest osiągane poprzez jednorodne dopasowanie współczynnika załamania. Wynika to z faktu, że struktury subkomórkowe różnią się nieco współczynnikiem załamania światła. W tym przypadku odwrócenie kontrastu wystąpiło w ścianie komórkowej przy nieco niższym współczynniku załamania rozpuszczalnika niż w cytoplazmie. Dla biofilmów Candida albicans optimum występuje w pobliżu n = 1.530. Biofilmy typu dzikiego oraz mutanty cak1 DX po 48 h przedstawione na Rysunku 4A miały grubość 500 µm, a mimo to komórki drożdży u podstawy zostały obrazowane niemal tak ostro, jak komórki apikalne. Podobnie, jak pokazano na Rysunku 4C, tłumienie fluorescencji nie było silnie skorelowane z głębokością ogniskowania. Rysunek 5 przedstawia inwazyjne strzępki w agarze, setki mikrometrów poniżej powierzchniowego biofilmu. Dojrzałe strzępki inwazyjne konsekwentnie wytwarzają boczne pączkujące komórki drożdżopodobne w pobliżu przegród w łańcuchu strzępek, co prowadzi do powstawania subkolonii komórek drożdżopodobnych w regularnych odstępach wzdłuż strzępki inwazyjnej.
<img alt="Proces krystalizacji w szalce Petriego, obraz mikroskopowy, analiza tworzenia się kryształów białka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Kultury biofilmu przed klarowaniem. Biofilm hodowany przez 24 h z izolatu komplementowanego efg1 ∆/∆ szczep C. albicans na płytce 12-dołkowej, na silikonowym kwadracie, w płynnym medium RPMI-1640 uzupełnionym o 10% FBS. Sterylna próba kontrolna znajduje się w dołku C4. Wstawka przedstawia przekrój poprzeczny biofilmu typu dzikiego po 96 h wzrostu na płytce 6-dołkowej na podłożu agarowym o średnicy 3,75 mm w tym samym medium, wykazujący obecność strzępek inwazyjnych. Oba panele są w tej samej skali. Pasek skali = 2,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Struktura biofilmu i konfiguracja mikroskopowa; schematy przedstawiają zastosowanie olejku imersyjnego i metodę z salicylanem metylu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Poprawa obrazowania w głębokich warstwach dzięki dopasowaniu współczynnika załamania światła. Rysunek przedstawia projekcje boczne stosów obrazów konfokalnych z 48 h biofilmu typu dzikiego, który został utrwalony i barwiony ConA-Alexafluor 594. (A) Próbkę obrazowano w PBS przy użyciu obiektywu wodnego 63x 1.0 NA. Tłumienie sygnału było znaczne przy głębokości ogniskowania 30 μm. (B) Po wyjaśnianiu zgodnie z krokami protokołu 3.3–3.8, ten sam biofilm obrazowano w salicylanie metylu przy minimalnym tłumieniu, używając obiektywu olejowego 40x 0.85 NA. Po odjęciu tła i wykonaniu projekcji bocznej trójwymiarowych stosów obrazów, dane z obiektywu 40x zostały przeskalowane przestrzennie, aby dopasować je do danych z obiektywu 63x w celu porównania. (C) Schemat przedstawiający odwrócone montowanie wyjaśnionej próbki (z MS) poprzez przeniesienie do MS w czarnym anodowanym aluminiowym naczyniu z przyklejonym szkiełkiem podstawowym (patrz Dyskusja). Pasek skali = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe z różnicami współczynnika załamania światła, analiza biofilmu, wykres jasności w kontraście fazowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Refraktometria w kontraście fazowym wykazuje odwrócenie kontrastu cech komórkowych w zakresie optymalnego dopasowania współczynnika załamania. Biofilmy unieruchomione na szkiełkach podstawowych przeniesiono z PBS do metanolu, a następnie do ksylenu (n = 1.496). Następnie biofilmy te przenoszono pojedynczo z ksylenu do zestawu cieczy referencyjnych o różnych współczynnikach załamania (Seria E, Cargille Laboratories, patrz Tabela materiałów) i badano wizualnie obok siebie, aby określić zakres współczynnika zapewniający najwyższą przejrzystość. (panel górny) Obrazy w kontraście fazowym: Jeden biofilm był seryjnie przenoszony między ksylenem a wąskim zestawem cieczy referencyjnych w tym zakresie. Po każdej wymianie odnajdywano to samo pole widzenia i obserwowano je przez szkiełko nakrywkowe za pomocą olejowego obiektywu do kontrastu fazowego Ph2 40x 0.85 NA oraz kondensora Ph2. Wszystkie obrazy zarejestrowano przy tych samych ustawieniach lampy i czasie ekspozycji kamery, aby dokładnie przedstawić zmiany. Wraz ze wzrostem współczynnika załamania, odwrócenie kontrastu jest najpierw widoczne przy n = 1.530 dla ściany komórkowej, a następnie przy n = 1.535 dla cytoplazmy. Pasek skali = 10 μm. (panel dolny) Wykres przedstawiający minimum średniej jasności biofilmu w punkcie maksymalnej przejrzystości. Silne rozpraszanie światła wewnątrz biofilmu powoduje, że średnia jasność przekracza jasność tła. Izolowane komórki wydają się ciemniejsze od tła, aż do momentu odwrócenia kontrastu w zakresie 1.530–1.535. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie mikroskopii konfokalnej grzybów WT i cak1 DX; obejmuje strukturę komórkową i wykres analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Głębokie obrazowanie biofilmu mutanta i typu dzikiego C. albicans. Szczep typu dzikiego (DAY185) oraz szczep o obniżonej ekspresji kinazy białkowej związanej z cyklem komórkowym (cak1 DX)14 hodowano w temperaturze 37 °C przez 48 h na podłożach silikonowych w płynnym medium YPD. Biofilmy utrwalono, zabarwiono ConA-Alexafluor 594 i sklarowano, stosując protokół wymiany rozpuszczalnika na salicylan metylu. Mikroskopia konfokalna 3D wykazała, że oba biofilmy miały grubość ~500 μm. Dane obrazowe przekonwertowano do formatu 32-bitowego w programie ImageJ lub Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ lub http://fiji.sc), a następnie przetworzono za pomocą funkcji Subtract Background z promieniem toczącej się kuli wynoszącym 50 pikseli, zastosowano progowanie, aby ustawić ujemne piksele na zero, wykonano ponowne cięcie (reslicing) i zastosowano projekcję maksymalnej intensywności w celu uzyskania widoków bocznych. (A) Projekcje osiowe i widok boczne: Biofilm typu dzikiego wyrósł do grubości 502 μm, co widać na projekcji widoku bocznego stosu obrazów konfokalnych składającego się z 558 płaszczyzn. Pasek skali = 100 μm. (panele po lewej stronie) 40-płaszczyznowe projekcje osiowe od wierzchołka (góra) do podstawy (dół) pokazują zmienność typów komórek w różnych warstwach biofilmu. Ten przykład ukazał charakterystyczną strukturę typu dzikiego: komórki przylegające u podstawy dają początek strzępkom, które wznoszą się do gęstej strefy środkowej składającej się z komórek pseudostrzępkowych i drożdżakopodobnych. Powyżej strefy środkowej ponownie pojawiły się strzępki, z których powstały skupiska pączkujących drożdży. Długie strzępki widoczne w strefie wierzchołkowej prawdopodobnie rozciągały się do medium hodowlanego w żywym biofilmie, ale zagięły się na powierzchnię biofilmu podczas przetwarzania próbki. Biofilm cak1 DX wyrósł do grubości 500 μm, co widać na projekcji widoku bocznego stosu obrazów z 556 płaszczyzn. Mutant ten, o którym wiadomo, że wykazuje wzrost strzępkowy w przypadku braku stresów indukujących14, wytworzył dramatycznie inną architekturę. Jak widać zarówno w projekcjach bocznych, jak i osiowych (panele po prawej stronie), wiele komórek rozgałęzionych dało początek wypustkom radialnym. (B) Przykłady rozgałęzionych strzępek wewnątrz biofilmu cak1 DX. Pasek skali = 10 μm. (C) Tłumienie fluorescencji wraz z głębokością w sklarowanym biofilmie typu dzikiego zostało ilościowo określone poprzez zamaskowanie pikseli tła, a następnie obliczenie średniego sygnału cyfrowego dla wszystkich pikseli niebędących tłem w każdej płaszczyźnie obrazu. Z wyjątkiem strzępek wierzchołkowych, które są wyraźnie znakowane lektyną, nie stwierdzono silnego trendu tłumienia wraz z głębokością ogniskowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej sieci neuronalnej; ilustrujący połączenia i ścieżki komórek nerwowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Strzępki inwazyjne w agarze. Strzępki C. albicans w biofilmie powierzchniowym penetrują podłoże agarowe na odległość kilku milimetrów (patrz Rycina 1). Po klarowaniu struktury inwazyjne można obserwować z góry, przez biofilm, lub z dołu, od spodniej strony agaru. Ta druga metoda wymaga większej odległości roboczej. Alternatywnie, po utrwaleniu, lecz przed barwieniem i wymianą rozpuszczalnika, agar można przeciąć pionowo skalpelem lub żyletką na plastry o grubości 1–2 mm, które następnie można obrócić na bok i obrazować bezpośrednio w widoku bocznym po barwieniu i klarowaniu. Procedura ta jest zalecana. W tej projekcji pola widzenia o wymiarach 213 μm kwadratowych zastosowano tęczową skalę kolorystyczną do zakodowania pozycji osiowej w zakresie 75 μm: elementy niebieskie znajdują się bliżej, a czerwone głębiej w płaszczyźnie strony. Widok ten pokazuje, że długie strzępki wypuszczają boczne komórki w formie drożdżowców w półregularnych odstępach, z których powstają subkolonie. Pasek skali = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Aby zobaczyć i określić ilościowo wewnętrzne cechy biofilmów Candida albicans, przygotowujemy nienaruszone próbki stałe, które są klarowane przez dopasowanie współczynnika załamania. Następnie można wykorzystać optyczną mikroskopię przekrojową do uzyskania trójwymiarowych danych obrazowych na całej grubości biofilmu.

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Biofilmy Candida albicans, podobnie jak wiele innych okazów biologicznych, są w swoim rodzimym stanie mocno przezroczyste do nieprzezroczystych. W tych protokołach pokazujemy, że przy użyciu metod klarowania, wewnętrzną strukturę utrwalonych nienaruszonych biofilmów można zobrazować za pomocą optycznej mikroskopii przekrojowej. Dzięki prostym, niedrogim i stosunkowo szybkim etapom przetwarzania, utrwalone nienaruszone biofilmy mogą być przezroczyste do obrazowania 3D za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej.Dzisiaj tę procedurę zademonstrujemy Katie Lagree, badaczka z tytułem doktora, oraz ja. Aby rozpocząć wzrost biofilmu na płytce 12-dołkowej, należy przygotować płytkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść płytkę na mikserze orbitalnym o prędkości 60 obr./min w nawilżonym inkubatorze powietrza o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut, aby dać czas na przyleganie komórek.Po 90 minutach usuń pożywkę i nieprzyłączone komórki i przemyj sterylnym podłożem lub PBS. Przenieść zaszczepione podłoże do innej płytki wielodołkowej zawierającej wstępnie podgrzane podłoże do filamentacji. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora z nawilżanym powietrzem otoczenia o temperaturze 37 stopni Celsjusza i hoduj biofilmy do 48 godzin z mieszaniem orbitalnym 60 obr./min w celu napowietrzenia.Wyjąć 48-godzinną płytkę z inkubatora i usunąć pożywkę hodowlaną z każdej próbki. Zastąp pożywkę PBS i inkubuj przez kilka minut, aby rozcieńczyć białka surowicy. Po wyjęciu PBS napełnij studzienki utrwalaczem.Do każdej potrawy należy dodać wystarczającą objętość utrwalacza, aby zanurzyć cały wzrost biofilmu, w tym wszelkie po wewnętrznej stronie naczynia. Ustaw przykryte naczynie na wolnym mikserze orbitalnym na 20 minut. Po usunięciu utrwalacza zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować się do barwienia, opróżniając PBS i szybko ponownie napełniając studzienki roztworem zawierającym PBS i wymaganą barwę.Nie pozwól, aby biofilm spłynął lub wyschł dłużej niż kilka sekund. Dodaj plamę do naczynia. Potrzebna ilość barwnika zależy od masy biofilmu.Następnie przykryte naczynie należy na noc umieszczać na wolnym mikserze orbitalnym i chronić przed światłem folią lub kawałkiem czarnego papieru. Za pomocą pęsety przenieś utrwalony barwiony biofilm z PBS na pięć mililitrów metanolu 50/50 PBS w 20-mililitrowej szklanej fiolce z biofilmem skierowanym do góry. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w jednominutowych odstępach przez pięć minut.Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady, zachowując ostrożność, aby uniknąć kontaktu pipety z biofilmem lub biofilmem z fiolką. Delikatnie napełnij trzema mililitrami czystego metanolu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w jednominutowych odstępach przez trzy minuty.Teraz usuń rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast napełnij pięcioma mililitrami metanolu. Po ręcznym mieszaniu z ruchem orbitalnym w odstępach jednominutowych przez pięć do 10 minut, usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady. Natychmiast napełnij trzema mililitrami metanolu.Biofilmy często wyglądają na bardziej nieprzezroczyste w tym momencie niż ich początkowy wygląd. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast ponownie napełnić fiolkę pięcioma mililitrami salicylanu metanolu i metylu w proporcji 50/50. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w jednominutowych odstępach przez pięć do 10 minut.Biofilm powinien być półprzezroczysty w tym zmieszanym rozpuszczalniku. Po przelaniu rozpuszczalnika do butelki na odpady, delikatnie napełnij fiolkę trzema mililitrami czystego salicylanu metylu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w jednominutowych odstępach przez trzy minuty.Powtórz proces ponownie z pięcioma mililitrami czystego salicylanu metylu, ręcznie mieszając w odstępach jednominutowych przez pięć do 10 minut. W tym momencie biofilm powinien być przezroczysty. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast ponownie napełnić fiolkę trzema mililitrami czystego salicylanu metylu.Przetworzony biofilm jest stabilny w tym rozpuszczalniku. Jeśli używasz mikroskopu odwróconego, użyj naczynia odpornego na rozpuszczalniki, które ma szklane dno i przygotuj przekładki do podparcia odwróconej próbki. W tym przypadku przekładki to 13-milimetrowe silikonowe pierścienie, które są wstępnie nasączone salicylanem metylu przez godzinę, aby zminimalizować dryf ostrości spowodowany obrzękiem.Aby uzyskać biofilm na kwadracie silikonowym klasy medycznej, odwróć kwadrat i umieść go na przekładce w kałuży salicylanu metylu w naczyniu. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza pod próbką. Mocno zamontuj naczynie na stoliku mikroskopu i zetknij się z obiektywem zanurzonym w oleju.Dostosuj ilość salicylanu metylu w naczyniu tak, aby menisk mocno przytrzymywał próbkę na przekładce za pomocą napięcia powierzchniowego. Umieść kroplę salicylanu metylu na wierzchu odwróconego kwadratowego podłoża, aby zmniejszyć rozproszenie światła z matowego wykończenia. Następnie przykryj naczynie szklaną płytą, aby ograniczyć parowanie.Przed obrazowaniem odczekaj kilka minut, aż próbka osiądzie na przekładkach. Teraz wykonaj mikroskopię konfokalną, aby zobrazować próbkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przetworzyć obrazy, otwórz ImageJ lub Fidżi.Sprawdź, czy program ma wystarczającą ilość przypisanej pamięci do przetworzenia danych. Przetwarzanie dwugigabajtowego zestawu danych wymaga co najmniej ośmiu gigabajtów dedykowanej pamięci RAM w celu zapewnienia płynnego działania. Otwórz plik obrazu płaszczyzny szeregowej, który ma zostać przetworzony.Jeśli komputer nie ma wystarczającej ilości pamięci RAM do przetworzenia całego stosu, stosy podrzędne mogą zostać przetworzone, a następnie ponownie złożone w jeden stos. Przekonwertuj dane na format 32-bitowy, aby włączyć operacje arytmetyczne zmiennoprzecinkowe przy użyciu menu obrazu, wpisz 32-bitowy. Spowoduje to podwojenie rozmiaru pliku.Odejmij gładkie tło, aby zwiększyć kontrast ostrych elementów. Przetwórz cały stos, przechodząc do menu przetwarzania, odejmij tło. W razie potrzeby wyreguluj promień toczącej się kulki.Promień kuli powinien być znacznie większy niż największy wymiar obiektów ostrości, które mają zostać zachowane. Aby wyzerować wszystkie piksele ujemne, dodaj każdy obraz do jego wartości bezwzględnej. Najpierw zduplikuj stos za pomocą menu obrazu, zduplikuj, zduplikuj stos.Następnie weź wartość bezwzględną zduplikowanych danych za pomocą menu procesu, matematyki, wartości bezwzględnej. Dodaj dwa stosy, przechodząc do menu procesu, kalkulatora obrazów, dodaj. Aby ponownie przeciąć stos obrazów w osiowym rozmiarze, użyj menu obrazów, stosów, pokrój ponownie.Następnie wybierz odstęp wyjściowy 1.0, zacznij od góry i unikaj interpolacji. Oś fokusu jest teraz osią pionową w stosie. Wymiar Y ponownie pociętego stosu jest równy liczbie płaszczyzn ostrości.Aby wykonać rzut z boku części lub całości stosu, przejdź do menu obrazu, stosów, projektu Z. Ustaw plasterek początkowy i plasterek końcowy tak, aby zawierał niektóre lub wszystkie płaszczyzny widoku z boku. Wybierz maksymalną intensywność, aby uzyskać najlepsze wyniki.Popraw skalowanie osiowe rzutu bocznego, przechodząc do menu obrazu, skala. Projekcja musi być skorygowana o nierówną pikselizację płaszczyzny obrazu i przyrost ostrości przy użyciu współczynnika skali osiowej. Ustaw skalę X na jeden, a skalę Y na współczynnik skali osiowej.Wybierz interpolację dwusześcienną. Wybierz pozycję Utwórz nowe okno. Dostosuj jasność i kontrast.Następnie przekonwertuj na format ośmiobitowy do wyświetlenia. Alternatywnie można zastosować tabelę wyszukiwania kolorów i zapisać ją jako kolor RGB lub ośmiobitowy. Stosując szeregowo mieszalne rozpuszczalniki o rosnącym współczynniku załamania światła, można szybko oszacować maksymalną klarowność.Jest to udoskonalane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii z kontrastem fazowym, aby znaleźć punkt minimalnego kontrastu. Jeden biofilm był seryjnie wymieniany między ksylenem a wąskim zestawem cieczy referencyjnych w tym zakresie. Po każdej wymianie to samo pole było przenoszone i oglądane przez szkło nakrywkowe.Wraz ze wzrostem indeksu, odwrócenie kontrastu jest najpierw widoczne, gdy n jest równe 1,530 dla ściany komórkowej, a następnie cytoplazma, gdy n jest równe 1,535. Przedstawiono tutaj głębokie obrazowanie zmutowanych i dzikich biofilmów C.albicans. Biofilm typu dzikiego urósł do grubości 502 mikronów, co widać w projekcji bocznej stosu obrazów konfokalnych w płaszczyźnie 538.Projekcje osiowe od wierzchołka do podstawy pokazują zmienność typów komórek i różnych warstw biofilmu. Ten przykład pokazuje charakterystyczną strukturę typu dzikiego. Zmutowany biofilm urósł do grubości 500 mikronów, co widać w projekcji bocznej stosu obrazów w płaszczyźnie 556.Ten mutant, o którym wiadomo, że ulega nitkowatemu wzrostowi przy braku indukujących stresorów, wytworzył dramatycznie odmienną architekturę. Jak widać zarówno w widoku bocznym, jak i w rzutach osiowych, wiele rozgałęziających się komórek powoduje powstawanie promienistych wyrostków. Jest to protokół głębokiego obrazowania o wysokim współczynniku załamania światła.Idealnie byłoby, gdyby współczynnik załamania światła próbki i współczynnik załamania światła olejku immersyjnego były zgodne. Dlatego w tym przypadku używamy obiektywu immersyjnego z olejkiem. Większość naszych badań dotyczyła obrazowania strukturalnego biofilmów przy użyciu markerów ściany komórkowej, ale każda metoda fluorescencji, która jest stosowana z utrwalonymi próbkami, powinna działać, w tym immunofluorescencja, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i ekspresja genu reporterowego.Ten konkretny organizm, Candida albicans, jest komensalny u zdrowych ludzi, ale jest również oportunistycznym patogenem, który może powodować infekcje drożdżakowe błony śluzowej lub układowej. W niektórych instytucjach wymagane są metody i protokoły hermetyzacji BSL II. Dodatkowo utrwalacze formaldehydu i aldehydu glutarowego są lotne i niebezpieczne.Są one znanymi substancjami rakotwórczymi. Rozcieńczenia utrwalaczy uzupełnić w dygestorium. Naczynia zawierające rozcieńczone utrwalacze należy przechowywać pod przykryciem i nie umieszczać pojemników zawierających te utrwalacze w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub w inkubatorze do hodowli komórkowych.

clarifying-and-imaging-candida-albicans-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Ten film demonstruje rozwój mysiego modelu in vivo do badania tworzenia biofilmu Candida albicans w tkance podskórnej. Eksperyment polega na wszczepieniu urządzeń zakażonych Candida w okolicy pleców zwierzęcia w celu rozwoju biofilmu.

Candida albicans (Candida albicans) Tworzenie biofilmu w mysim modelu in vivo

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu zastosowania czerwonego światła na wzrost biofilmu Candida albicans. Niekoherentne urządzenie do pomiaru światła czerwonego o długości fali 635 nm i gęstości energii 87,6 J·cm-2 stosowano przez cały okres wzrostu biofilmów Candida albicans przez 48 godzin.

Codzienna fototerapia czerwonym światłem regulująca wzrost biofilmu Candida albicans

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Protokół oparty na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej przy użyciu testu redukcji 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilid-2H-tetrazolium (XTT) jest opisany tutaj, w celu zbadania wpływu przeciwciał na biofilmy utworzone przez C. tropicalis. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

Tworzymy mysi model infekcji związanej z cewnikiem (CRI) związanej z C.albicans, w której na cewniku tworzy się biofilm, a interakcja między C.albicans a gospodarzem dobrze koreluje z klinicznym CRI. Model ten pomaga w badaniach przesiewowych w kierunku CRI związanego z biofilmem C. albicans, kładąc podwaliny pod transformację kliniczną.

Model zakażenia Candida albicans związany z cewnikiem u myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (aPDT) w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. aPDT wykonano przy użyciu rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów i niebieskiego światła LED.

Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Naucz się metody oczyszczania i obrazowania biofilmów Candida albicans przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia szczegółową wizualizację struktur wewnętrznych w trzech wymiarach.

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

Przeglądaj więcej filmów