Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

Biofilmy Candida albicans, podobnie jak wiele innych okazów biologicznych, są w swoim rodzimym stanie mocno przezroczyste do nieprzezroczystych. W tych protokołach pokazujemy, że przy użyciu metod klarowania, wewnętrzną strukturę utrwalonych nienaruszonych biofilmów można zobrazować za pomocą optycznej mikroskopii przekrojowej. Dzięki prostym, niedrogim i stosunkowo szybkim etapom przetwarzania, utrwalone nienaruszone biofilmy mogą być przezroczyste do obrazowania 3D za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej.

Dzisiaj tę procedurę zademonstrujemy Katie Lagree, badaczka z tytułem doktora, oraz ja. Aby rozpocząć wzrost biofilmu na płytce 12-dołkowej, należy przygotować płytkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść płytkę na mikserze orbitalnym o prędkości 60 obr./min w nawilżonym inkubatorze powietrza o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut, aby dać czas na przyleganie komórek.

Po 90 minutach usuń pożywkę i nieprzyłączone komórki i przemyj sterylnym podłożem lub PBS. Przenieść zaszczepione podłoże do innej płytki wielodołkowej zawierającej wstępnie podgrzane podłoże do filamentacji. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora z nawilżanym powietrzem otoczenia o temperaturze 37 stopni Celsjusza i hoduj biofilmy do 48 godzin z mieszaniem orbitalnym 60 obr./min w celu napowietrzenia.

Wyjąć 48-godzinną płytkę z inkubatora i usunąć pożywkę hodowlaną z każdej próbki. Zastąp pożywkę PBS i inkubuj przez kilka minut, aby rozcieńczyć białka surowicy. Po wyjęciu PBS napełnij studzienki utrwalaczem.

Do każdej potrawy należy dodać wystarczającą objętość utrwalacza, aby zanurzyć cały wzrost biofilmu, w tym wszelkie po wewnętrznej stronie naczynia. Ustaw przykryte naczynie na wolnym mikserze orbitalnym na 20 minut. Po usunięciu utrwalacza zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować się do barwienia, opróżniając PBS i szybko ponownie napełniając studzienki roztworem zawierającym PBS i wymaganą barwę.

Nie pozwól, aby biofilm spłynął lub wyschł dłużej niż kilka sekund. Dodaj plamę do naczynia. Potrzebna ilość barwnika zależy od masy biofilmu.

Następnie przykryte naczynie należy na noc umieszczać na wolnym mikserze orbitalnym i chronić przed światłem folią lub kawałkiem czarnego papieru. Za pomocą pęsety przenieś utrwalony barwiony biofilm z PBS na pięć mililitrów metanolu 50/50 PBS w 20-mililitrowej szklanej fiolce z biofilmem skierowanym do góry. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w jednominutowych odstępach przez pięć minut.

Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady, zachowując ostrożność, aby uniknąć kontaktu pipety z biofilmem lub biofilmem z fiolką. Delikatnie napełnij trzema mililitrami czystego metanolu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w jednominutowych odstępach przez trzy minuty.

Teraz usuń rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast napełnij pięcioma mililitrami metanolu. Po ręcznym mieszaniu z ruchem orbitalnym w odstępach jednominutowych przez pięć do 10 minut, usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady. Natychmiast napełnij trzema mililitrami metanolu.

Biofilmy często wyglądają na bardziej nieprzezroczyste w tym momencie niż ich początkowy wygląd. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast ponownie napełnić fiolkę pięcioma mililitrami salicylanu metanolu i metylu w proporcji 50/50. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w jednominutowych odstępach przez pięć do 10 minut.

Biofilm powinien być półprzezroczysty w tym zmieszanym rozpuszczalniku. Po przelaniu rozpuszczalnika do butelki na odpady, delikatnie napełnij fiolkę trzema mililitrami czystego salicylanu metylu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w jednominutowych odstępach przez trzy minuty.

Powtórz proces ponownie z pięcioma mililitrami czystego salicylanu metylu, ręcznie mieszając w odstępach jednominutowych przez pięć do 10 minut. W tym momencie biofilm powinien być przezroczysty. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast ponownie napełnić fiolkę trzema mililitrami czystego salicylanu metylu.

Przetworzony biofilm jest stabilny w tym rozpuszczalniku. Jeśli używasz mikroskopu odwróconego, użyj naczynia odpornego na rozpuszczalniki, które ma szklane dno i przygotuj przekładki do podparcia odwróconej próbki. W tym przypadku przekładki to 13-milimetrowe silikonowe pierścienie, które są wstępnie nasączone salicylanem metylu przez godzinę, aby zminimalizować dryf ostrości spowodowany obrzękiem.

Aby uzyskać biofilm na kwadracie silikonowym klasy medycznej, odwróć kwadrat i umieść go na przekładce w kałuży salicylanu metylu w naczyniu. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza pod próbką. Mocno zamontuj naczynie na stoliku mikroskopu i zetknij się z obiektywem zanurzonym w oleju.

Dostosuj ilość salicylanu metylu w naczyniu tak, aby menisk mocno przytrzymywał próbkę na przekładce za pomocą napięcia powierzchniowego. Umieść kroplę salicylanu metylu na wierzchu odwróconego kwadratowego podłoża, aby zmniejszyć rozproszenie światła z matowego wykończenia. Następnie przykryj naczynie szklaną płytą, aby ograniczyć parowanie.

Przed obrazowaniem odczekaj kilka minut, aż próbka osiądzie na przekładkach. Teraz wykonaj mikroskopię konfokalną, aby zobrazować próbkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przetworzyć obrazy, otwórz ImageJ lub Fidżi.

Sprawdź, czy program ma wystarczającą ilość przypisanej pamięci do przetworzenia danych. Przetwarzanie dwugigabajtowego zestawu danych wymaga co najmniej ośmiu gigabajtów dedykowanej pamięci RAM w celu zapewnienia płynnego działania. Otwórz plik obrazu płaszczyzny szeregowej, który ma zostać przetworzony.

Jeśli komputer nie ma wystarczającej ilości pamięci RAM do przetworzenia całego stosu, stosy podrzędne mogą zostać przetworzone, a następnie ponownie złożone w jeden stos. Przekonwertuj dane na format 32-bitowy, aby włączyć operacje arytmetyczne zmiennoprzecinkowe przy użyciu menu obrazu, wpisz 32-bitowy. Spowoduje to podwojenie rozmiaru pliku.

Odejmij gładkie tło, aby zwiększyć kontrast ostrych elementów. Przetwórz cały stos, przechodząc do menu przetwarzania, odejmij tło. W razie potrzeby wyreguluj promień toczącej się kulki.

Promień kuli powinien być znacznie większy niż największy wymiar obiektów ostrości, które mają zostać zachowane. Aby wyzerować wszystkie piksele ujemne, dodaj każdy obraz do jego wartości bezwzględnej. Najpierw zduplikuj stos za pomocą menu obrazu, zduplikuj, zduplikuj stos

Następnie weź wartość bezwzględną zduplikowanych danych za pomocą menu procesu, matematyki, wartości bezwzględnej. Dodaj dwa stosy, przechodząc do menu procesu, kalkulatora obrazów, dodaj. Aby ponownie przeciąć stos obrazów w osiowym rozmiarze, użyj menu obrazów, stosów, pokrój ponownie.

Następnie wybierz odstęp wyjściowy 1.0, zacznij od góry i unikaj interpolacji. Oś fokusu jest teraz osią pionową w stosie. Wymiar Y ponownie pociętego stosu jest równy liczbie płaszczyzn ostrości.

Aby wykonać rzut z boku części lub całości stosu, przejdź do menu obrazu, stosów, projektu Z. Ustaw plasterek początkowy i plasterek końcowy tak, aby zawierał niektóre lub wszystkie płaszczyzny widoku z boku. Wybierz maksymalną intensywność, aby uzyskać najlepsze wyniki.

Popraw skalowanie osiowe rzutu bocznego, przechodząc do menu obrazu, skala. Projekcja musi być skorygowana o nierówną pikselizację płaszczyzny obrazu i przyrost ostrości przy użyciu współczynnika skali osiowej. Ustaw skalę X na jeden, a skalę Y na współczynnik skali osiowej.

Wybierz interpolację dwusześcienną. Wybierz pozycję Utwórz nowe okno. Dostosuj jasność i kontrast.

Następnie przekonwertuj na format ośmiobitowy do wyświetlenia. Alternatywnie można zastosować tabelę wyszukiwania kolorów i zapisać ją jako kolor RGB lub ośmiobitowy. Stosując szeregowo mieszalne rozpuszczalniki o rosnącym współczynniku załamania światła, można szybko oszacować maksymalną klarowność.

Jest to udoskonalane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii z kontrastem fazowym, aby znaleźć punkt minimalnego kontrastu. Jeden biofilm był seryjnie wymieniany między ksylenem a wąskim zestawem cieczy referencyjnych w tym zakresie. Po każdej wymianie to samo pole było przenoszone i oglądane przez szkło nakrywkowe.

Wraz ze wzrostem indeksu, odwrócenie kontrastu jest najpierw widoczne, gdy n jest równe 1,530 dla ściany komórkowej, a następnie cytoplazma, gdy n jest równe 1,535. Przedstawiono tutaj głębokie obrazowanie zmutowanych i dzikich biofilmów C.albicans. Biofilm typu dzikiego urósł do grubości 502 mikronów, co widać w projekcji bocznej stosu obrazów konfokalnych w płaszczyźnie 538.

Projekcje osiowe od wierzchołka do podstawy pokazują zmienność typów komórek i różnych warstw biofilmu. Ten przykład pokazuje charakterystyczną strukturę typu dzikiego. Zmutowany biofilm urósł do grubości 500 mikronów, co widać w projekcji bocznej stosu obrazów w płaszczyźnie 556.

Ten mutant, o którym wiadomo, że ulega nitkowatemu wzrostowi przy braku indukujących stresorów, wytworzył dramatycznie odmienną architekturę. Jak widać zarówno w widoku bocznym, jak i w rzutach osiowych, wiele rozgałęziających się komórek powoduje powstawanie promienistych wyrostków. Jest to protokół głębokiego obrazowania o wysokim współczynniku załamania światła.

Idealnie byłoby, gdyby współczynnik załamania światła próbki i współczynnik załamania światła olejku immersyjnego były zgodne. Dlatego w tym przypadku używamy obiektywu immersyjnego z olejkiem. Większość naszych badań dotyczyła obrazowania strukturalnego biofilmów przy użyciu markerów ściany komórkowej, ale każda metoda fluorescencji, która jest stosowana z utrwalonymi próbkami, powinna działać, w tym immunofluorescencja, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i ekspresja genu reporterowego.

Ten konkretny organizm, Candida albicans, jest komensalny u zdrowych ludzi, ale jest również oportunistycznym patogenem, który może powodować infekcje drożdżakowe błony śluzowej lub układowej. W niektórych instytucjach wymagane są metody i protokoły hermetyzacji BSL II. Dodatkowo utrwalacze formaldehydu i aldehydu glutarowego są lotne i niebezpieczne.

Są one znanymi substancjami rakotwórczymi. Rozcieńczenia utrwalaczy uzupełnić w dygestorium. Naczynia zawierające rozcieńczone utrwalacze należy przechowywać pod przykryciem i nie umieszczać pojemników zawierających te utrwalacze w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub w inkubatorze do hodowli komórkowych.