Name: Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Poznaj metodę łączącą fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ do analizy aktywności komórek nerwowych u Xenopus laevis. Protokół umożliwia korelację sygnałów wapniowych z ekspresją genów na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Wendy Herbst i Lindsay Schleifer za ich wkład w rozwój tych protokołów. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 i 1R15HD096415-01) dla MSS.

<ol><li>Humeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+cell+cycle%3A+Progression+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and cell cycle: Progression or death.</a> Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).</li>
<li>Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+toolkit+reveals+the+role+of+Ca2%2B+sparklets+in+coordinated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration.</a> PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).</li>
<li>Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+death%3A+the+calcium-apoptosis+link%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).</li>
<li>Pham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+and+Mg2%2B+module+conformational+dynamics+and+stability+of+downstream+regulatory+element+antagonist+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator.</a> Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).</li>
<li>Smedler, E., Uhlén, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+decoding+of+calcium+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Frequency decoding of calcium oscillations.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).</li>
<li>Moreau, M., Néant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+coding+and+decoding+strategies+for+the+specification+of+neural+and+renal+precursor+cells+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development.</a> Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).</li>
<li>Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFAT+functions+as+a+working+memory+of+Ca2%2B+signals+in+decoding+Ca2%2B+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO%22%5BJournal%5D)">NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation.</a> EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).</li>
<li>Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Control+of+Calcium+Oscillation+Waveform+Defines+NFAT+as+an+Integrator+of+Calcium+Load%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load.</a> Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).</li>
<li>Li, L., Stefan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Le+Nov%C3%A8re+N.+Calcium+input+frequency%2C+duration+and+amplitude+differentially+module+the+relative+activation+of+calcineurin+and+CaMKII%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Le Novère N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII.</a> PLoS One. 7 (9), 43810(2012).</li>
<li>Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+tuning%3A+Competition%27s+role+in+setting+the+frequency-dependence+of+Ca2%2B-dependent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins.</a> PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820(2017).</li>
<li>Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Tuning+Among+Ca2%2B%2FCalmodulin-Dependent+Proteins%3A+Analysis+of+in+silico+Model+Robustness+and+Parameter+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).</li>
<li>Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+neuronal+calcium+spikes+during+early+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).</li>
<li>Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+homeostatic+specification+of+transmitter+expression+in+embryonic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons.</a> Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).</li>
<li>Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+Global+Spontaneous+Calcium+Events+Regulate+Neurite+Outgrowth+and+Onset+of+GABAergic+Phenotype+during+Neural+Precursor+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).</li>
<li>Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Waves+Propagate+through+Radial+Glial+Cells+and+Modulate+Proliferation+in+the+Developing+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).</li>
<li>Nieuewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuewkoop%2C+PD+%22The+stages+of+Xenopus+embryonic+development.+Normal+Table+of+Xenopus+laevis%22">The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis</a>. , North Holland Publishing Company. (1994).</li>
<li>Paudel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Activity+Dynamics+Correlate+with+Neuronal+Phenotype+at+a+Single+Cell+Level+and+in+a+Threshold-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880(2019).</li>
<li>Marken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Markovian+Entropy+Measure+for+the+Analysis+of+Calcium+Activity+Time+Series%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series.</a> PLoS One. 11 (12), 0168342(2016).</li>
<li>Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+Correction+with+Asymmetric+Least+Squares+Smoothing%5BTitle%5D)+AND+%22Leiden+University+Medical+Centre+Report%22%5BJournal%5D)">Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing.</a> Leiden University Medical Centre Report. , (2005).</li>
<li>Guemez-Gamboa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cell-autonomous+mechanism+of+activity-dependent+neurotransmitter+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching.</a> Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).</li>
<li>Paredes, R., Madelaine,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W komórkach tworzących rozwijający się układ nerwowy zaobserwowano charakterystyczne wzorce aktywności wapnia, przy czym określone typy aktywności są związane z odrębnymi procesami neurorozwojowymi. Jednak dalsze zrozumienie mechanizmów, za pomocą których te gęste od informacji wzorce aktywności są przekształcane w odpowiedzi transkrypcyjne, wymaga zebrania informacji o aktywności wapnia i ekspresji genów z rozdzielczością pojedynczej komórki. Podczas gdy systemy, które wykazują bardziej stereotypową aktywność wapnia, takie jak dojrzałe neurony, mogą być rozsądnie oceniane na poziomie masowym, nieregularne wzorce, które charakteryzują embrionalny układ nerwowy, można łatwo zamaskować za pomocą mniej precyzyjnych zapisów.
Ramy eksperymentalne ustanowione w tym protokole można łatwo dostosować do szerokiej gamy typów komórek i reporterów fluorescencyjnych. Tkanka zawierająca praktycznie dowolny typ komórki lub kombinację typów komórek może zostać wypreparowana z organizmu modelowego będącego przedmiotem zainteresowania i posiew w celu obrazowania pojedynczych komórek. Oprócz umożliwienia identyfikacji komórek i wyizolowania efektu procesów autonomicznych komórek, podejście oparte na pierwotnej hodowli komórkowej pozwala eksperymentatorowi zdefiniować składniki pożywki zgodnie z życzeniem. Na przykład przeprowadzono eksperymenty porównujące aktywność prekursorów neuronalnych w roztworze 2 mM Ca2 + w celu zbadania, czy relacje między częstotliwością skoków a fenotypem neuroprzekaźnika w embrionalnym rdzeniu kręgowym można podsumować bez wpływu interakcji komórka-komórka13,20.
Chociaż protokół ten wykorzystuje marker fluorescencyjny Fluo4-AM do wykrywania wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia, w zależności od kryteriów wyboru, użytkownicy mogą wybrać inne dostępne na rynku markery21, w tym genetycznie kodowane wskaźniki wapnia. Podobnie, alternatywne markery mogą być używane do monitorowania dynamicznych zmian stężenia jonu będącego przedmiotem zainteresowania (w tym K+, Na+ i Zn2+), potencjału błonowego lub pH komórkowego. Ustawienia obrazowania i czas trwania obrazu można modyfikować w razie potrzeby.
Chociaż skorelowaliśmy aktywność wapnia i fenotyp neuronów jako konkretne zastosowanie, metoda ta ma również zastosowanie do wielu innych właściwości komórkowych. Na przykład fluorescencyjna hybrydyzacja in situ może być przeprowadzana za pomocą sond przeciwko dowolnemu genowi będącemu przedmiotem zainteresowania, w tym markerowi neuronalnemu ChAT lub czynnikowi transkrypcyjnemu Engrailed, co pozwala na czułe wykrywanie konfigurowalnego panelu gatunków mRNA. Sondy te można zaprojektować tak, aby były specyficzne dla izoformy, w razie potrzeby obsługując dodatkową specyficzność docelową. Double FISH można przeprowadzić za pomocą sond sprzężonych z kilkoma dwoma różnymi fluoroforami, co pozwala na jednoczesną ocenę ekspresji wielu genów. Jednak dodatkowe płukania wymagane w tego typu eksperymencie wiążą się ze zwiększonym ryzykiem utraty lub ruchu komórek i wymagają doświadczenia i delikatności, aby można je było pomyślnie przeprowadzić.
Niezależnie od wszelkich modyfikacji specyficznych dla eksperymentu wprowadzonych do tego protokołu, istnieje kilka kluczowych kroków, które wymagają szczególnej uwagi. Sekcje powinny być wykonywane z ostrożnością, aby usunąć wszystkie zanieczyszczające tkanki lub populacje komórek; Ponieważ wzorzec przestrzenny zostaje utracony, gdy eksplantaty są dysocjowane, wszelkie pozostałe komórki z sąsiednich tkanek będą przeplatać się i nie do odróżnienia od komórek będących przedmiotem zainteresowania. Po poszczepieniu komórek z próbkami należy obchodzić się tak delikatnie, jak to możliwe, aby zapobiec ich przemieszczeniu. Co najważniejsze, oznacza to, że wszystkie zmiany roztworu powinny być wykonywane powoli i ostrożnie, z pipetą umieszczoną na krawędzi płytki podczas wyjmowania i dodawania roztworu. Zapewni to pewność identyfikacji komórek zarówno na obrazach wapnia, jak i FISH. Jeśli komórki zostaną zakłócone podczas przetwarzania, identyfikacja niektórych lub wszystkich odpowiadających im komórek między dwoma obrazami może być niemożliwa. Zalecamy ostrożność przy tych przypisaniach, tak aby do dalszej analizy używane były tylko jednoznacznie odpowiadające komórki.
W zależności od poruszanej kwestii biologicznej odpowiednie mogą być różne podejścia analityczne. Aktywność wapnia w szeregach czasowych może być przetwarzana i określana ilościowo na różne sposoby, przy czym eksperymentator może elastycznie wybierać parametry detrendingu, metryki analizy i parametry analizy (na przykład % progu wyjściowego używany do definiowania skoku wapnia). Korelacje między aktywnością wapnia a poziomem ekspresji genów można wyznaczyć, analizując ekspresję genów jako bezwzględną lub względną wartość fluorescencji wyekstrahowaną z obrazu FISH. Alternatywnie, korelacje między aktywnością wapnia a ekspresją genów (obecność/brak) można wyznaczyć poprzez zdefiniowanie progu fluorescencji dla pozytywnego sygnału ekspresji genów i przypisanie identyfikatorów "tak" lub "nie" poszczególnym komórkom. Ogólnie rzecz biorąc, ten schemat eksperymentalny zapewnia niezwykle elastyczny potok do zbierania i wstępnej analizy danych szeregów czasowych w połączeniu z danymi dotyczącymi ekspresji genów dopasowanymi do komórek. Takie eksperymenty będą miały kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia złożonych relacji między dynamiką komórkową a zmianami transkrypcyjnymi, czego przykładem jest identyfikacja wzorców aktywności wapnia charakterystycznych dla prekursorów neuronów o losie hamującym i pobudzającym u embrionalnego Xenopus laevis.

Wolny cytozolowy wapń ma kluczowe znaczenie dla różnych procesów biologicznych, począwszy od proliferacji i migracji komórek, a skończywszy na apoptozie i autofagii1,2,3. W ramach tych szlaków wapń może wywierać dalszy wpływ na ekspresję genów poprzez interakcję z domenami wiążącymi wapń w celu wywołania zmian konformacyjnych, które modulują aktywność i interakcje białek. Na przykład neuronalny czujnik wapnia znany jako Modulator Antagonisty Elementu Regulatorowego (DREAM) jest utrzymywany w rozwiniętej konformacji pośredniej, gdy jest związany przez wapń, co uniemożliwia mu interakcję z jego białkami i celami DNA4. Poza tym, że służy jako prosta cząsteczka sygnałowa, dynamiczna natura wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia pozwala tym wzorcom aktywności kodować bardziej złożone sygnały oparte na amplitudzie lub częstotliwości5,6. Translokacja jądrowa czynnika transkrypcyjnego czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T (NFAT) jest wzmacniana przez oscylacje wapnia o wysokiej częstotliwości, ale hamowana przez oscylacje o niskiej częstotliwości7. Co ciekawe, ostatnie prace sugerują, że NFAT może faktycznie reagować na skumulowaną ekspozycję na wapń8. Zarówno kalcyneuryna, jak i kinaza białkowa zależna od Ca2 + / kalmoduliny II (CaMKII) wykazują również wyraźne odpowiedzi na stany przejściowe wapnia o określonej częstotliwości, czasie trwania lub amplitudzie9. Aby dodać dodatkowy poziom złożoności regulacyjnej, modele obliczeniowe sugerują, że wiele białek wiążących wapń staje się mniej lub bardziej zależnych od częstotliwości w odpowiedzi na obecność lub brak wiążących konkurentów10,11.
W rozwijającym się układzie nerwowym zdefiniowano dwie główne klasy zachowań związanych z aktywnością wapnia i są one związane z określonymi procesami biologicznymi. Napływy wapnia są klasyfikowane jako "skoki", jeśli występują w pojedynczych komórkach, osiągają szczytową intensywność ~400% wartości podstawowej w ciągu pięciu sekund i wykazują podwójną wykładniczą degradację12. Ten typ sygnału jest związany przede wszystkim ze specyfikacją fenotypu neuroprzekaźnika13. W przeciwieństwie do tego, "fale" są definiowane jako wolniejsze, mniej ekstremalne stany przejściowe wapnia, w których wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia w komórce wzrasta do ~200% wartości wyjściowej w ciągu trzydziestu sekund lub dłużej, a następnie zanika w ciągu kilku minut12. Sygnały te często rozchodzą się po wielu sąsiednich komórkach, a ich obecność wiąże się z rozrostem neurytów i proliferacją komórek14,15. Jednakże, chociaż te dwie klasy zostały zdefiniowane na podstawie charakterystycznych profili kinetycznych, nie jest jasne, które dokładnie cechy tych wzorców są faktycznie wykrywane przez komórki i translowane przez dalsze efektory.
Zrozumienie związku między wewnątrzkomórkowymi oscylacjami wapnia a ekspresją genów dostarczyłoby kluczowego wglądu w jeden z mechanizmów regulacyjnych, które zapewniają prawidłowy rozwój i wzorcowanie układu nerwowego. W tym celu badania embrionalnego rdzenia kręgowego wykazały, że zwiększona aktywność skoków wapnia podczas rozwoju wiąże się z wyższymi poziomami neuronów hamujących, podczas gdy zmniejszona aktywność skoków wapnia wiąże się z wyższymi poziomami neuronów pobudzających13. Jednak te testy na poziomie populacji nie zostały wykorzystane do powiązania aktywności wapnia z ekspresją genów na poziomie pojedynczej komórki.
Podejście do tych pytań na poziomie pojedynczej komórki daje kilka wyraźnych zalet w porównaniu z poprzednimi pracami. Po pierwsze, możliwość oceny aktywności wapnia i ekspresji genów w wielu komórkach z osobna pozwala na obserwację pełnego repertuaru różnych wzorców aktywności bez zaciemniania przez pomiar na poziomie masowym. Ponadto badanie tych zależności w hodowli pierwotnej pojedynczej komórki oznacza, że autonomiczne powiązania między aktywnością wapnia a ekspresją genów zostaną utrzymane, podczas gdy interakcje wymagające komunikacji komórka-komórka zostaną zniesione. Dlatego takie podejście pozwala na badanie tych autonomicznych mechanizmów komórkowych w izolacji. Pozwala jednak również na wyjaśnienie i zbadanie roli nieautonomicznej dla komórek aktywności wapnia. Na przykład, komórki mogą być wypreparowane z zarodka na etapie płytki nerwowej, hodowane do momentu, gdy rodzeństwo kontrolne osiągnie stadium cewy nerwowej, a następnie porównane z komórkami, które zostały świeżo wypreparowane z zarodka w stadium cewy nerwowej. Pozwala to na bezpośrednie porównanie komórek, które zachowały komunikację komórka-komórka w kluczowym okresie rozwoju, z tymi, w których komunikacja komórka-komórka została zniesiona.
Szukając rozwiązania problemów poprzednich metod eksperymentalnych, opracowaliśmy protokół, który umożliwiłby ocenę zarówno aktywności wapnia, jak i ekspresji genów w poszczególnych neuronalnych komórkach progenitorowych, ułatwiając korelację określonych wzorców aktywności z późniejszymi programami różnicowania. Tkankę nerwową wypreparowano z Xenopus laevis na różnych etapach rozwoju neuronalnego, zdysocjowano na pojedyncze komórki i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w obecności fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Po obrazowaniu żywych komórek próbki utrwalono i oznaczono za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji genu lub izoformy będącej przedmiotem zainteresowania. Co ważne, poszczególne komórki mogą być śledzone w obu eksperymentach obrazowania, co oznacza, że profil aktywności wapnia w komórce i poziom ekspresji genów mogą być ze sobą powiązane (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Opisany tutaj protokół ma na celu zbadanie związków między wzorcami aktywności wapnia a ekspresją genów w rozwoju neurologicznym embrionalnym u Xenopus laevis. Jednak szersze ramy eksperymentalne (obrazowanie przebiegu czasowego pojedynczej komórki, a następnie FISH i korejestracja obrazu) mogą być modyfikowane i stosowane do praktycznie każdego typu komórki, reportera fluorescencyjnego i genu będącego przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Do hodowli zwierząt i Hodowla komórkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHORULON (gonodotropina kosmówkowa)</td><td>Merck Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu gentamycyny</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego Pyrex, 100 mm x 20 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3160102</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Falcon Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientifc Kultura komórkowa Nunc / szalki Petriego, szalka 35x10mm, nunclon Delta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Standardowe jednorazowe pipety transferowe, bez podziałki; Długość: 5,875 cala; Pojemność: 7,7 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian</td><td>Millipore Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Milipore Kleszcze Sigma</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55, Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze, Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Powierzchnia hodowli komórkowych Cellattice Micro-Lined</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CLS5-25D-050</td><td></td></tr><tr><td>Do obrazowania wapnia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, permeant komórkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0,2 i mikro; m przefiltrowany (10% roztwór w wodzie)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6866</td><td></td></tr><tr><td>Do generowania sondy RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>rATP</td><td>Promega</td><td>P1132</td><td></td></tr><tr><td>rCTP</td><td>Promega</td><td>P1142</td><td></td></tr><tr><td>rGTP</td><td>Promega</td><td>P1152</td><td></td></tr><tr><td>rUTP</td><td>Promega</td><td>P1162</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Millipore Sigma</td><td>3359247910</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNAZY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA</td><td>T3 Promega</td><td>P2083</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>SP6 Polimeraza RNA</td><td>Promega</td><td>P1085</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Bezrnazowy roztwór</td> wytrącający <td>Dnazy Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>LiCl (7,5 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9480</td><td></td></tr><tr><td>Do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>11096176001</tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-POD, fragmenty Fab</td><td>Millipore Sigma</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td><td>Millipore Sigma</td><td>GEPA13105</td><td></td></tr><tr><td>Solution Składniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, 96% ekstra czysty, proszek, bezwodny, ACROS Organixs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC349610</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Milipore Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hydrat</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Denhardta (50X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>DTT, klasa molekularna (DL-Ditiothreitol)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodzian</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Formamid (dejonizowany)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa herparyny z błony śluzowej jelit świń</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Millipore Sigma</td><td>H1109</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Millipore Sigma</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, czysty, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu, czystość 97%, ACROS Organixs, bezwodny</td><td>Kwas</td> maleinowy Fisher Scientific <td>AC413480050</td><td></td></tr>, <tr><td>99%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS125231000</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (drobne białe kryształy/biologia molekularna), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kwas rybonukleinowy z drożdży torula, typ IX</td><td>Milipore Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Millipore Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>model do wyboru</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Wybrany <td>model</td> <td>mikroskopu preparacyjnego</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>TE200</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania elementów NIS</td> Inkubator wstrząsający firmy <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr> do <tr><td></td><td>wyboru</td><td></td><td></td>model</tr><tr><td>wirówki</td><td></td><td></td><td></td> z chłodzeniem</tr> <tr><td><silny>różny< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System filtrów próżniowych butelkowych Corning, 0,22 &mu; m porów, pojemność butelki 500 ml</td><td>Millipore</td><td></td> Stożkowe probówki wirówkowe Sigma CLS430769 <td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaniczną wewnątrzkomórkową aktywność wapnia można zaobserwować w różnych typach komórek i proponuje się odgrywanie kluczowych ról w różnych procesach fizjologicznych. W szczególności odpowiednia regulacja wzorców aktywności wapnia podczas embriogenezy jest niezbędna dla wielu aspektów rozwoju neuronalnego kręgowców, w tym prawidłowego zamykania cewy nerwowej, synaptogenezy i specyfikacji fenotypu neuroprzekaźników. Podczas gdy obserwacja, że wzorce aktywności wapnia mogą różnić się zarówno częstotliwością, jak i amplitudą, sugeruje przekonujący mechanizm, za pomocą którego strumienie te mogą przekazywać zakodowane sygnały do dalszych efektorów i regulować ekspresję genów, istniejące podejścia na poziomie populacji nie były wystarczająco precyzyjne, aby dalej badać tę możliwość. Co więcej, podejścia te ograniczają badania nad rolą interakcji komórka-komórka, wykluczając możliwość oznaczenia stanu determinacji neuronalnej przy braku kontaktu komórka-komórka. Dlatego ustaliliśmy eksperymentalny przepływ pracy, który łączy poklatkowe obrazowanie wapnia zdysocjowanych eksplantatów neuronalnych z fluorescencyjnym testem hybrydyzacji in situ, umożliwiając jednoznaczną korelację wzorca aktywności wapnia z fenotypem molekularnym na poziomie pojedynczej komórki. Udało nam się wykorzystać to podejście do rozróżnienia i scharakteryzowania określonych wzorców aktywności wapnia związanych odpowiednio z różnicowaniem komórek nerwowych i nerwowych komórek progenitorowych; Poza tym jednak ramy eksperymentalne opisane w tym artykule można łatwo dostosować do badania korelacji między dowolnym profilem aktywności szeregów czasowych a ekspresją genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania.

Udany przykład dysocjowanych komórek przygotowanych do obrazowania wapnia przedstawiono na Rysunku 2A. Komórki są wysiane gęsto, co pozwala na zebranie maksymalnej ilości informacji z każdego obrazu, ale nie na tyle gęsto, aby nie można było z pewnością odróżnić poszczególnych komórek od siebie. Fluorescencja jest wykrywana dla każdej zdefiniowanej komórki przez 2-godzinny okres obrazowania. Wizualizacja wykresu zbiorczego zawierającego ślady dla wszystkich komórek zarejestrowanych w eksperymencie ujawnia stopień, w jakim pomiary masowe lub populacyjne mogą zaciemniać bardziej subtelne wzorce aktywności impulsowej (Rysunek 2B). Po wyizolowaniu zarejestrowanych profili poszczególnych komórek można wyraźnie zidentyfikować przykłady nieregularnej aktywności impulsowej charakterystycznej dla neuralnych komórek progenitorowych. W przeciwieństwie do dojrzałych neuronów, embrionalne komórki neuronalne wykazują nieregularny, wysoce zmienny i złożony charakter aktywności wapniowej (Rysunek 2B). Aby ilościowo określić tę złożoność, zastosowano różne metody analizy danych17,18, w tym różnorodne parametry definiujące impuls (Rysunek 2C).
Poprawność przeprowadzenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, w tym prawidłowy projekt i synteza antysensownej sondy mRNA, można ocenić poprzez porównanie płytki eksperymentalnej z kontrolą tła inkubowaną z niewiążącą kontrolną RNA sensowną (Rysunek 3A,B). Kontrolę pozytywną sondy można również przeprowadzić, analizując typ komórek, o którym wiadomo, że wykazuje ekspresję docelowego mRNA na poziomach mierzalnych.
Identyfikacja tej samej komórki w obrazowaniu wapniowym oraz FISH wymaga, aby komórki zachowały w przybliżeniu tę samą pozycję podczas hybrydyzacji sond i dalszej obróbki. Jeśli płytki są traktowane niedbale lub płukanie jest wykonywane zbyt intensywnie, komórki mogą zostać oderwane od powierzchni płytki i albo utracone podczas usuwania roztworu, albo osadzone w innym miejscu na płytce, co uniemożliwia ich dopasowanie między obrazami (Rysunek 4A). Jeśli takie zaburzenie dotyczy tylko części komórek w polu widzenia, nadal może być możliwe wykrycie i przypisanie niektórych komórek w obrębie obrazu (Rysunek 4B). Jednak maksymalną ilość danych uzyskuje się w eksperymencie, w którym FISH jest przeprowadzany starannie, a niewiele komórek zostaje utraconych lub przesuniętych między obrazami (Rysunek 4C).
Po zebraniu danych opisujących zarówno aktywność wapniową, jak i ekspresję genów w odpowiedniej liczbie komórek na interesujących etapach rozwoju, można przeprowadzić dalsze analizy w celu oceny korelacji między tymi dwiema cechami (Rysunek 1). W celu ilościowego określenia wzorców aktywności wapniowej zastosowano szereg wskaźników, w tym zliczanie/częstotliwość impulsów, średnią moc, szacowanie wykładnika Hursta oraz pomiar entropii markowowskiej17,18. Ekspresję genów można zdefiniować ilościowo poprzez bezwzględny poziom fluorescencji lub ocenić w skali binarnej (tak/nie), w zależności od stawianych pytań badawczych.
Wyniki eksperymentów korelujących aktywność wapniową z ekspresją genów markerowych progenitorów neuronalnych ujawniły liczne powiązania między konkretnymi wzorcami aktywności wapniowej a fenotypami neuroprzekaźników. Na etapie płytki neuronalnej (Stadium 14) komórki GABAergiczne wykazujące ekspresję markera neuronów hamujących gad1.1 wykazują aktywność wapniową o większej regularności i wyższej amplitudzie niż komórki pozbawione ekspresji gad1.1 (Rysunek 5A). Co więcej, podczas gdy komórki te wykazujące ekspresję gad1.1 są powiązane z wyższym poziomem impulsacji o wysokiej amplitudzie, impulsacja o niskiej amplitudzie występuje częściej w komórkach glutaminergicznych wykazujących ekspresję markera neuronów pobudzających slc17a7.
<img alt="Proces sekcji tkanki nerwowej i FISH; aktywność Ca²⁺ w pojedynczych komórkach; obrazy nałożone." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przebiegu eksperymentu. Pasek skali = 100 μm. Obrazy w panelach 3-5 zostały pobrane z pracy Paudel i wsp. (2019)17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna z analizą danych spektralnych i wynikami w formie wykresów dla badania aktywności komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazowanie wapnia i przykładowe profile aktywności. (A) Aktywność wapnia wewnątrzkomórkowego raportowana przez Fluo4-AM. Każdy obraz z 2 h składa się z 901 klatek, z czego jedna reprezentatywna klatka jest pokazana tutaj. (B) Zbiorczy wykres intensywności fluorescencji w czasie dla wszystkich komórek w obrazowanym polu widzenia. Ślady wyraźnie wskazują na fotobleaching barwnika wskaźnikowego (Fluo4) w czasie. Wykres rastrowy w lewym górnym rogu przedstawia reprezentatywne ślady aktywności wapnia po zastosowaniu algorytmu usuwania trendu opracowanego przez Eilersa i Boelena19, gdzie przedstawione tutaj komórki wykazują zróżnicowany wzorzec zachowań impulsowych. (C) Zastosowanie różnych progów (150% i 200% linii bazowej, gdzie linia bazowa jest średnią zdetrendowanej intensywności fluorescencji) w celu zdefiniowania impulsu (zielona i niebieska strzałka). Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna porównująca próbki komórek A i B, wykazująca różnicową ekspresję białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazowanie FISH. (A) Metoda FISH przeprowadzona z użyciem nie wiążącej się sondy RNA sens jako kontroli negatywnej. Ustawienia obrazowania zostały dostosowane tak, aby żadne komórki nie wykazywały fluorescencji. Niektóre pola widzenia mogą zawierać niekomórkowe zanieczyszczenia wykazujące pewną fluorescencję, jak widać w prawym górnym i prawym dolnym rogu (A); można je zignorować przy ustawianiu tła. (B) Te same ustawienia obrazowania zostały następnie zastosowane do obrazowania płytki eksperymentalnej (sonda RNA antysens). Fluorescencja w tych warunkach odpowiada ekspresji genu powyżej poziomu tła. Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat statycznej równowagi z zielonymi kółkami i czerwonymi obrysami; wizualne porównanie eksperymentów A-C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Nakładanie obrazów i korejestracja. Schematyczne przedstawienie próbki obrazowanej pod kątem aktywności wapniowej (komórki przedstawione jako wypełnione zielone kółka) oraz po FISH (komórki przedstawione jako zacieniowane czerwone kółka). (A) Komórki, które znacząco przesunęły się podczas manipulowania próbką i jej przetwarzania, nie mogą być wiarygodnie zidentyfikowane na obu obrazach. (B) Uszkodzenie komórek może dotyczyć tylko niektórych komórek w polu widzenia. Niektóre komórki można wyraźnie zidentyfikować na obu obrazach, podczas gdy inne nie mogą zostać pewnie dopasowane. (C) Jeśli próbkami manipuluje się ostrożnie, większość komórek pozostanie niezakłócona i będzie można je zidentyfikować na obu obrazach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Entropia markowowska, wykresy pudełkowe częstotliwości impulsów, GABA vs Glut, porównanie statystyczne, analiza neuronauki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przykład zastosowania tej metody; wykresy pudełkowe przedstawiające korelacje między aktywnością wapnia a ekspresją genów (odpowiednio GABA i Glut dla genów gad1.1 oraz slc17a7) w stadium płytki nerwowej Xenopus laevis. W stadium 14 komórki gad1.1-dodatnie (GABA) wykazują wyższą amplitudę i bardziej regularną aktywność wapnia, zdefiniowaną przez (A) entropię markowską18 oraz (B) liczbę impulsów przy użyciu progów 125%, 150%, 200% i 300% średniej odtrendowanej intensywności fluorescencji (baseline)17, niż komórki slc17a7-dodatnie (Glut). Gwiazdki oznaczają różnice istotne statystycznie zgodnie z testem Kołmogorowa-Smirnowa dla dwóch prób z korektą Bonferroniego (p &lt; 0.05) oraz statystyką d Cohena dla wielkości efektu (n = 5 kultur i &gt;100 komórek; * 0.2 ≤ |d| &lt; 0.5). Rysunek został przerysowany i zaadaptowany na podstawie zbioru danych uzyskanych od Paudel et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Protokół ten może być wykorzystany do skorelowania wzorców aktywności wapnia z ekspresją genów na poziomie pojedynczej komórki, umożliwiając naukowcom zbadanie nowych pytań dotyczących relacji między tymi dwiema cechami. W przeciwieństwie do poprzednich podejść, które zazwyczaj badają całe tkanki, nasza technika skupia się na poziomie pojedynczej komórki, umożliwiając nam ocenę autonomicznych zależności między aktywnością wapnia a ekspresją genów. Zacznij od sterylizacji UV dwóch 35-milimetrowych plastikowych szalek Petriego i jednej 35-milimetrowej płytki do hodowli komórkowych przez około 30 minut.Pracując w okapie z przepływem laminarnym, dodaj 10 mililitrów dwóch milimolowych roztworów wapnia do każdej z dwóch 50-mililitrowych plastikowych probówek stożkowych, jednej wysterylizowanej promieniami UV szalki Petriego i naczynia do hodowli komórkowych wysterylizowanej promieniami UV. Dodaj dwa mililitry roztworu wolnego od wapnia i magnezu do drugiej wysterylizowanej promieniami UV szalki Petriego i napełnij dwie 100-milimetrowe plastikowe szalki Petriego i jedną 35-milimetrową plastikową szalkę Petriego 0,1X MMR uzupełnioną gentamycyną. Następnie napełnij 60-milimetrową plastikową szalkę Petriego 70% etanolem.Bezpośrednio przed sekcją dokładnie wymieszaj 0,01 grama kolagenu B w jednej probówce roztworu wapnia. Dodaj roztwór do nowej 60-milimetrowej plastikowej szalki Petriego i użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować zarodki o pożądanym stadium rozwoju. Za pomocą sterylnej pipety transferowej umieścić co najmniej sześć odpowiednich zarodków na jednej 100-milimetrowej płytce zawierającej MMR i gentamycynę.Następnie przenieś jeden zarodek z płytki podtrzymującej na drugą 100-milimetrową płytkę MMR z gentamycyną i umieść tę płytkę preparacyjną pod mikroskopem. Używając pary kleszczy do ustabilizowania zarodka, ostrożnie oderwij błonę witelinową otaczającą zarodek parą cienkich kleszczy. Po usunięciu całej błony użyj cienkich kleszczy, aby uszczypnąć zarodek wzdłuż przedniej tylnej osi, aby oddzielić obszar grzbietowy i brzuszny.Użyj nowej sterylnej pipety do przenoszenia, aby przenieść część grzbietową na 60-milimetrową płytkę roztworu kolagenowego na jedną do dwóch minut, a następnie ostrożnie przenieś próbkę z powrotem na płytkę separacyjną. Aby zakończyć sekcję, ostrożnie usuń wszystkie resztki zanieczyszczenia endodermalnego i mezodermalnego z przypuszczalnej tkanki nerwowej ektodermy i delikatnie przenieś eksplant na 35-milimetrową płytkę roztworu wapnia. Po zebraniu trzech kolejnych eksplantatów użyj mikropipety P1000, aby przenieść wszystkie cztery eksplantaty na 35-milimetrową płytkę z roztworem wolnym od wapnia i magnezu, uważając, aby uniknąć kontaktu między eksplantatami a interfejsem powietrze-woda.Następnie delikatnie zakręć naczyniem, tak aby wszystkie eksplantaty skupiły się na środku płytki i inkubuj próbki przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić dysocjację tkanek. Podczas tej inkubacji należy przenieść dwa ostatnie zarodki do drugiej szalki MMR z gentamycyną i przykryć szalkę, aby umożliwić tym próbkom niezakłócony rozwój. Pod koniec inkubacji użyj super kleju, aby przymocować szkiełko nakrywkowe z mikroliniaturą do dna 35-milimetrowej naczynia do hodowli komórkowej i użyj mikropipety P100, aby zebrać zdysocjowane eksplantaty.Trzymając pipetę pod płytkim kątem blisko powierzchni naczynia do hodowli komórkowej, umieść końcówkę pipety w rogu siatki skierowaną do wewnątrz i mocno wypchnij zawiesinę komórek w poprzek obszaru z siatką. Idealnie byłoby, gdyby komórki osiadły w ciasnym, gęstym klastrze. Pozwól komórkom przylegać do płytki przez godzinę w temperaturze pokojowej.Podczas osiadania komórek określ i zapisz etap rozwoju zarodków kontrolnych rodzeństwa. Pod koniec inkubacji przenieść naczynie na próbkę w miejsce chronione przed światłem i odessać 100 mikrolitrów roztworu od krawędzi naczynia. Wymieszać ten roztwór z siedmioma mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu kwasu Fluo-4 AM Pluronic F127 z pipetowaniem w górę i w dół, a następnie włożyć pełną objętość do naczynia na próbkę.Delikatnie zamieszaj i przykryj talerz folią aluminiową. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej zastąp jeden mililitr supernatantu z naczynia do hodowli eksplantatów trzema mililitrami świeżego dwumilimolowego roztworu wapnia. Następnie zastąp trzy mililitry supernatantu trzema mililitrami świeżego roztworu wapnia jeszcze dwa razy.W celu obrazowania aktywności wapnia w eksplantatach należy umieścić płytkę z próbką na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego chronionego przed ekspozycją na światło otoczenia i użyć markera do oznaczenia przedniego punktu płytki, tak aby można było znaleźć to samo pole widzenia podczas kolejnych sesji obrazowania. Użyj obiektywów 10 i 20 razy, aby zlokalizować próbkę pod mikroskopem i wybrać odpowiednie pole widzenia, które jest gęste w komórkach, ale nie tak gęste, aby komórki były zbite lub trudne do odróżnienia pojedynczo. Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby szkiełko nakrywkowe w kształcie siatki było widoczne, zmieniając pierwotne pole widzenia, aż w razie potrzeby w kadrze pojawi się możliwa do zidentyfikowania liczba.Uzyskaj obraz w jasnym polu wybranego pola widzenia z wyostrzonym szkiełkiem nakrywkowym w siatce oraz obraz w jasnym polu wybranego pola widzenia z ostrymi komórkami. Bez wyraźnego obrazu szkiełka nakrywkowego w kratkę i pola widzenia nie będziesz w stanie zarejestrować swoich komórek z tymi na obrazach ryb, które wygenerujesz później. Następnie oświetl próbki laserem o długości fali 488 nanometrów.W przypadku obrazu dwugodzinnego zmodyfikuj konfigurację obrazowania, aby zarejestrować 901 klatek z czasem skanowania 3,93 sekundy w odstępie ośmiu sekund przed uruchomieniem konfiguracji w celu uzyskania obrazu. Po zakończeniu obrazowania wyjmij płytkę ze stolika mikroskopowego i zastąp supernatant hodowli jednym mililitrem 1X MEMFA na dwugodzinną inkubację w temperaturze pokojowej, zwracając uwagę na zarejestrowanie etapu rozwojowego zarodków kontrolnych rodzeństwa na początku inkubacji. Wizualizacja wykresu złożonego zawierającego ślady dla wszystkich komórek zarejestrowanych w eksperymencie ujawnia stopień, w jakim pomiary masowe lub populacji mogą przesłonić bardziej zniuansowane wzorce zachowań związanych z pikowaniem.Po wyizolowaniu zarejestrowanych profili poszczególnych komórek można wyraźnie zidentyfikować przykłady nieregularnej aktywności impulsowej charakterystycznej dla nerwowych komórek progenitorowych. Aby określić ilościowo tę złożoność, można zastosować różne metody analizy danych, w tym różne parametry, w celu zdefiniowania skoku. Jeśli płytki są traktowane z grubsza lub płukanie jest wykonywane zbyt mocno podczas fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, komórki mogą zostać usunięte z powierzchni płytki, co uniemożliwi dopasowanie komórek na obrazach.Jeśli to zakłócenie dotyczy tylko niektórych komórek w polu widzenia, nadal może być możliwe wykrycie i przypisanie niektórych komórek na obrazie. Jednak maksymalna ilość danych jest uzyskiwana z eksperymentu, w którym hybrydyzacja jest przeprowadzana ostrożnie, a niewiele komórek jest traconych lub przenoszonych między obrazami. Wyniki eksperymentów zestawiających aktywność wapnia z ekspresją neuronalnych genów markerowych mogą ujawnić liczne powiązania między określonymi wzorcami aktywności wapnia a fenotypami neuroprzekaźników.Dzięki tym danym naukowcy mogą badać bardziej złożone cechy tych dynamicznych wzorców wapnia i ich związki z ekspresją genów, zamiast ograniczać się do prostego liczenia impulsów.

fluorescent-calcium-imaging-subsequent-situ-hybridization-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Ten artykuł przedstawia wygodną i szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków Xenopus za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na skrawkach.

Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego

Tutaj opisujemy protokół pomiaru i analizy reakcji na temperaturę w opuszce węchowej Xenopus laevis. Neurony receptorów węchowych i komórki mitralne są barwione różnicowo, po czym rejestrowane są zmiany wapnia, odzwierciedlające wrażliwość niektórych sieci neuronowych w bańce na spadki temperatury wywołane w nosie.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej wywołanej temperaturą poprzez monitorowanie zmian wapnia w opuszce węchowej Xenopus laevis

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Poznaj metodę łączącą fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ do analizy aktywności komórek nerwowych u Xenopus laevis. Protokół umożliwia korelację sygnałów wapniowych z ekspresją genów na poziomie pojedynczych komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów