Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

Protokół ten demonstruje ekspresję i oczyszczanie przeciwciał oraz monitorowanie dystrybucji przeciwciał w czasie rzeczywistym w guzie i tkance. Badania przesiewowe przeciwciał za pomocą opisanego protokołu pomogą wyselekcjonować przeciwciała, które mają ograniczoną niespecyficzną dystrybucję w tkankach i wzbogacą lokalizacje guza. Opisana technika jest szybka i opłacalna.

Inne techniki, takie jak tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów i pozytonowa tomografia emisyjna, są bardzo drogie i wymagają radioaktywnych i innych wyrafinowanych znaczników. Technika ta nie ogranicza się do przeciwciał ukierunkowanych na raka. Może być stosowany do każdej innej choroby, takiej jak choroby płuc lub serca, do analizy dystrybucji przeciwciał w organizmie.

Procedurę zademonstruje Jeremy Gatesman, technik weterynarii z mojego uniwersytetu. Surowe ogniwa CHO w 200 mililitrach pożywki, w Delong, Erlenmeyer przegrodował kolby. Połącz pięć mililitrów pożywki CHO freestyle z 50 mikrogramami zmiennego ciężkiego klonu DNA i 75 mikrogramów zmiennego lekkiego klonu DNA w 15-mililitrowej probówce.

Następnie przekręć rurkę w wir. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na pięć minut. Dodaj 750 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr bulionu polietylenowego do roztworu DNA i agresywnie wiruj go przez 30 sekund.

Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na dodatkowe pięć minut. Dodać całą mieszaninę do komórek CHO, ręcznie potrząsając kolbą. Natychmiast inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 130 obr./min.

Następnego dnia dodaj do komórek dwa mililitry środka przeciwzbrylającego 100 X i dwa mililitry przeciwbakteryjnego roztworu przeciwgrzybiczego 100 X. Inkubować kolby w temperaturze od 32 do 34 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 130 obr./min. Kontynuuj hodowlę komórek przez 10 do 11 dni, dodając 10 mililitrów paszy Tryptone N1 i dwa mililitry suplementu glutaminy 100 X co piąty dzień.

Policz komórki co trzeci dzień, aby upewnić się, że żywotność komórek utrzymuje się powyżej 80%W dniu 10 lub 11 zbierz podłoże do oczyszczania przeciwciał, odwirowując kulturę w temperaturze 3000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 40 do 60 minut. Następnie przefiltruj przezroczyste media za pomocą filtra butelkowego o średnicy 0,22 mikrometra. Aby oczyścić przeciwciała, należy zrównoważyć kolumnę białka A z dwiema objętościami buforu wiążącego w kolumnie.

Przepuść przefiltrowane media przez kolumnę z natężeniem przepływu jednego mililitra na minutę. Następnie umyj kolumnę dwiema objętościami kolumn buforu wiążącego. Użyj pięciu mililitrów buforu elucyjnego, aby wymyć przeciwciało do frakcji o pojemności 500 mikrolitrów.

I zneutralizować pH wspomnianego przeciwciała, dodając 10 mikrolitrów buforu neutralizującego dla frakcji. Zmierzyć stężenie oczyszczonego przeciwciała za pomocą spektrofotometru, używając domyślnego protokołu dla IgG. Dializować 0,5 mililitra przeciwciała za pomocą kasety dializacyjnej w jednym litrze buforu koniugacyjnego.

Po czterech godzinach przenieść kasetę dializacyjną do nowego buforu i dializować przez noc. Aby wywołać reakcję koniugacji, dodaj 0,03 mikrograma barwnika IRR 800 CWU na jeden miligram przeciwciała w całkowitej objętości 500 mikrolitrów. Inkubować mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza, a następnie oczyścić znakowane koniugaty przez intensywną dializę przeciwko PBS.

Oszacuj stopień znakowania, mierząc absorbancję barwnika 780 nanometrów i absorbancję białka przy 280 nanometrach. Aby rozwinąć ksenografie myszy, delikatnie podnieś skórę zwierzęcia i oddziel ją od leżącej poniżej warstwy mięśniowej. Powoli wstrzyknąć 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej pod skórę za pomocą igły o rozmiarze 26.

Odczekać kilka sekund przed wyjęciem igły, tak aby podłoże z matrycy podstawowej informowało o półstałej żelowej strukturze wraz z komórkami pod skórą, co zapobiegnie wydostawaniu się mieszaniny z miejsca wstrzyknięcia. Aby wykonać obrazowanie in vivo, wstrzyknij przeciwciało znakowane barwnikiem przez żyłę ogonową. Po znieczuleniu myszy sprawdź, czy nie ma reakcji na odruchy pedałowania i rozszerz żyłę, podając ciepłą wodę.

Użyj strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26, aby wstrzyknąć 25 mikrogramów znakowanego przeciwciała w objętości 100 mikrolitrów. Jako kontrolę ujemną należy oznaczyć i wstrzyknąć niespecyficzne przeciwciało izotypu IgG, które nie jest skierowane przeciwko komórkom nowotworowym. Wykonaj obrazowanie in vivo osiem, 24 i 48 godzin po wstrzyknięciu przeciwciał.

W oprogramowaniu do obrazowania kliknij przycisk inicjuj. Upewnij się, że temperatura stage wynosi 37 stopni Celsjusza. W panelu sterowania skonfiguruj obrazowanie fluorescencyjne za pomocą kreatora obrazowania i ustaw wzbudzenie na 773 nanometry, emisję na 792 nanometry.

Przenieś znieczuloną mysz do komory obrazowania. Umieść go w polu obrazowania za pomocą stożka nosowego. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij przycisk Acquire (Pobieranie) w panelu sterowania, aby uzyskać informacje o pobieraniu obrazu, a następnie kliknij przycisk Auto Expose (Automatyczne naświetlanie).

Wygenerowany obraz jest nałożeniem fluorescencji na obraz fotograficzny z fluorescencją optyczną i gęstością wyświetlaną w jednostkach zliczeń lub fotonów. Dodatnie klony cDNA ze zmiennymi ciężkimi i zmiennymi domenami świetlnymi potwierdzono za pomocą PCR kolonii. Reprezentatywne wyniki badania oczyszczonego farletuzumabu na stronie SDS bez redukcji i redukcji przedstawiono tutaj.

Łańcuchy ciężkie i lekkie po redukcji wytwarzały pasma o mocy 50 i 25 kilodaltonów. Potwierdzono również wiązanie przeciwciał z białkami natywnymi na powierzchni komórki. Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie wstrzyknięto do żyły ogonowej myszom z pełnymi guzami wykazującymi ekspresję R1.

Zwierzęta były obrazowane na żywo w wielu punktach czasowych za pomocą IVIS. dane potwierdzają selektywne wzbogacanie pełnych przeciwciał R1 i BaCa w guzy. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że utrzymanie komórek CHO ma kluczowe znaczenie dla wydajności przeciwciał.

I ważne jest, aby mieć podobny stopień koniugacji barwnika fluorescencyjnego dla konkurencyjnej lokalizacji guza. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia tkanek i test ELISA specyficzny dla tkanki lub nowotworu, aby wesprzeć dane obrazowania żywych myszy.