Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Tylko i wyłącznie białka wiążące kontrolują wiele procesów biologicznych. Ta metoda FLAG-Biotin CLIP-seq pozwala na globalne profilowanie specjalnego i czasowego układu RNA i RBP w komórkach ssaków. Metoda ta pozwala na skuteczne wykrywanie bezpośrednich RNA związanych z białkami bez SDS-PAGE i procedur transferu błonowego.

W porównaniu z tradycyjnym CLIP-seq nie zawiera izotopów i nie wymaga przeciwciał specyficznych dla białka. Zacznij od posiewu około 3 milionów embrionalnych komórek macierzystych myszy na 10-centymetrowej płytce i inkubacji przez noc. Następnego dnia usuń pożywkę za pomocą próżni i potraktuj komórki dwoma mililitrami 0,25% trypsyny EDTA przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Ugasić trypsynę czterema mililitrami świeżej pożywki MESC i przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie odwiruj je w temperaturze 300 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usuń supernatant. Zawieś komórki w czterech mililitrach zimnego PBS i przenieś je z powrotem na 10-centymetrową płytkę w celu usieciowania.

Naświetl komórki światłem UV o długości 254 nanometrów, a następnie przenieś usieciowane komórki do 15-mililitrowej probówki. Wirować te komórki w temperaturze 300 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, następnie usunąć supernatant i poddać komórki lizie za pomocą 500 mikrolitrów buforu A przygotowanego zgodnie z instrukcjami manuskryptu. Przenieś komórki do wolnej od RNAzy probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem przez 30 do 60 minut.

Potraktuj lizat 30 mikrolitrami DNAzy 1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając cztery mikrolitry 0,5 molowego EDTA. Odwiruj nierozpuszczalny osad przez odwirowanie w temperaturze 12 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieś supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Przenieś lizat komórkowy do wstępnie zrównoważonych kulek FLAG i inkubuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji odwirować kulki przez dwie minuty w temperaturze 3000 razy G i usunąć supernatant. Dodać 500 mikrolitrów buforu A do próbki i inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie odwirować kulki i usunąć supernatant.

Powtórzyć płukanie buforem A, a następnie dwa przemycia wstępnie schłodzonym buforem B.To wymyć peptydem trzy X FLAG, przygotować roztwór elucji zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i odwirować kulki FLAG. Usunąć supernatant za pomocą wąskiej końcówki pipety końcowej i dodać 200 mikrolitrów trzech roztworów elucyjnych X FLAG do każdej próbki. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie obracając je.

Następnie wiruj kulki przez dwie minuty po 3000 razy G. Przenieś supernat do nowej probówki i powtórz elucję dwukrotnie. Zaoszczędź 5% eluentów do analizy Western blot lub barwienia srebrem, aby sprawdzić skuteczność immunoprecypitacji FLAG. Przenieść pobrane eluenty do przygotowanych kulek streptawidyny i delikatnie obracać próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do trzech godzin lub przez noc.

Następnie zbierz koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu C z delikatnymi obrotami przez pięć minut na pranie. Następnie umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu D i dwukrotnie 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK, zbierając kulki na stojaku magnetycznym i usuwając supernatant między myciami.

Aby przeprowadzić częściowe trawienie RNA, dodaj 100 mikrolitrów roztworu MNA do każdej próbki i wiruj w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika termicznego przez 10 minut. Zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 sekund i usuń supernatant. Następnie umyj je buforem PNK-EDTA, buforem C i buforem PNK zgodnie ze wskazówkami rękopisu.

Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Następnie dodaj mieszankę reakcyjną i wiruj kulki w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika termicznego przez 10 minut. Szybko umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK EDTA, a następnie dwukrotnie przepłucz 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK.

Po umyciu dodaj 40 mikrolitrów trzech głównych mieszanek ligacyjnych do kulek i wiruj je w temperaturze 16 stopni Celsjusza za pomocą miksera termicznego przez trzy godziny lub przez noc. Skuteczne podwiązanie łącznika ze sprzymierzeńcami ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu. Od czasu do czasu sprawdzaj rurkę reakcyjną, aby upewnić się, że nie wytrącają się one podczas podwiązywania.

Po inkubacji powtórzyć płukanie PNK EDTA i PNK, dodać 40 mikrolitrów PNK zmieszanych z kulkami i wirować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą miksera termicznego przez 10 minut. Umyj koraliki PNK EDTA i PNK, a następnie przystąp do izolacji RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. W porównaniu z jednoetapowym oczyszczaniem powinowactwa za pośrednictwem FLAG lub streptawidyny, oczyszczanie tandemowe FLAG-Biotin usunęło prawie wszystkie oczyszczone białka rdzeniowe, unikając zanieczyszczenia pośrednich interakcji białkowych RNA.

LIN28 i WDR43, Fbio CLIP-seq przeprowadzono przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy. W sumie pobrano około 7,7 miliona i 2,2 miliona unikalnych odczytów odpowiednio dla LIN28 i WDR43. Porównanie widoków ścieżek pokazuje różne wzorce wiązania w locus pre-rRNA RN45.

Miejsca usieciowane na motywie GGA G pre-let7-g RNA przez LIN28, Fbio CLIP-seq lub zidentyfikowane. Ponadto określono wzbogacone motywy RNA w miejscach wiązania oraz odsetek zmutowanych nukleotydów w różnych typach mutacji. Pokazuje, że LIN28 woli wiązać się z nukleotydem genu.

Cóż, o godzinie 22:00, ten protokół, ważne jest, aby potwierdzić skuteczność immunoprecypitacji, aby upewnić się, że kompleksy tylko białkowe zostały pomyślnie oczyszczone.