Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna
May 18th, 2020
Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.
Tylko i wyłącznie białka wiążące kontrolują wiele procesów biologicznych. Ta metoda FLAG-Biotin CLIP-seq pozwala na globalne profilowanie specjalnego i czasowego układu RNA i RBP w komórkach ssaków. Metoda ta pozwala na skuteczne wykrywanie bezpośrednich RNA związanych z białkami bez SDS-PAGE i procedur transferu błonowego.
W porównaniu z tradycyjnym CLIP-seq nie zawiera izotopów i nie wymaga przeciwciał specyficznych dla białka. Zacznij od posiewu około 3 milionów embrionalnych komórek macierzystych myszy na 10-centymetrowej płytce i inkubacji przez noc. Następnego dnia usuń pożywkę za pomocą próżni i potraktuj komórki dwoma mililitrami 0,25% trypsyny EDTA przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.
Ugasić trypsynę czterema mililitrami świeżej pożywki MESC i przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie odwiruj je w temperaturze 300 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usuń supernatant. Zawieś komórki w czterech mililitrach zimnego PBS i przenieś je z powrotem na 10-centymetrową płytkę w celu usieciowania.
Naświetl komórki światłem UV o długości 254 nanometrów, a następnie przenieś usieciowane komórki do 15-mililitrowej probówki. Wirować te komórki w temperaturze 300 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, następnie usunąć supernatant i poddać komórki lizie za pomocą 500 mikrolitrów buforu A przygotowanego zgodnie z instrukcjami manuskryptu. Przenieś komórki do wolnej od RNAzy probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem przez 30 do 60 minut.
Potraktuj lizat 30 mikrolitrami DNAzy 1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając cztery mikrolitry 0,5 molowego EDTA. Odwiruj nierozpuszczalny osad przez odwirowanie w temperaturze 12 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieś supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Przenieś lizat komórkowy do wstępnie zrównoważonych kulek FLAG i inkubuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji odwirować kulki przez dwie minuty w temperaturze 3000 razy G i usunąć supernatant. Dodać 500 mikrolitrów buforu A do próbki i inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie odwirować kulki i usunąć supernatant.
Powtórzyć płukanie buforem A, a następnie dwa przemycia wstępnie schłodzonym buforem B.To wymyć peptydem trzy X FLAG, przygotować roztwór elucji zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i odwirować kulki FLAG. Usunąć supernatant za pomocą wąskiej końcówki pipety końcowej i dodać 200 mikrolitrów trzech roztworów elucyjnych X FLAG do każdej próbki. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie obracając je.
Następnie wiruj kulki przez dwie minuty po 3000 razy G. Przenieś supernat do nowej probówki i powtórz elucję dwukrotnie. Zaoszczędź 5% eluentów do analizy Western blot lub barwienia srebrem, aby sprawdzić skuteczność immunoprecypitacji FLAG. Przenieść pobrane eluenty do przygotowanych kulek streptawidyny i delikatnie obracać próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do trzech godzin lub przez noc.
Następnie zbierz koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu C z delikatnymi obrotami przez pięć minut na pranie. Następnie umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu D i dwukrotnie 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK, zbierając kulki na stojaku magnetycznym i usuwając supernatant między myciami.
Aby przeprowadzić częściowe trawienie RNA, dodaj 100 mikrolitrów roztworu MNA do każdej próbki i wiruj w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika termicznego przez 10 minut. Zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 sekund i usuń supernatant. Następnie umyj je buforem PNK-EDTA, buforem C i buforem PNK zgodnie ze wskazówkami rękopisu.
Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Następnie dodaj mieszankę reakcyjną i wiruj kulki w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika termicznego przez 10 minut. Szybko umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK EDTA, a następnie dwukrotnie przepłucz 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK.
Po umyciu dodaj 40 mikrolitrów trzech głównych mieszanek ligacyjnych do kulek i wiruj je w temperaturze 16 stopni Celsjusza za pomocą miksera termicznego przez trzy godziny lub przez noc. Skuteczne podwiązanie łącznika ze sprzymierzeńcami ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu. Od czasu do czasu sprawdzaj rurkę reakcyjną, aby upewnić się, że nie wytrącają się one podczas podwiązywania.
Po inkubacji powtórzyć płukanie PNK EDTA i PNK, dodać 40 mikrolitrów PNK zmieszanych z kulkami i wirować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą miksera termicznego przez 10 minut. Umyj koraliki PNK EDTA i PNK, a następnie przystąp do izolacji RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. W porównaniu z jednoetapowym oczyszczaniem powinowactwa za pośrednictwem FLAG lub streptawidyny, oczyszczanie tandemowe FLAG-Biotin usunęło prawie wszystkie oczyszczone białka rdzeniowe, unikając zanieczyszczenia pośrednich interakcji białkowych RNA.
LIN28 i WDR43, Fbio CLIP-seq przeprowadzono przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy. W sumie pobrano około 7,7 miliona i 2,2 miliona unikalnych odczytów odpowiednio dla LIN28 i WDR43. Porównanie widoków ścieżek pokazuje różne wzorce wiązania w locus pre-rRNA RN45.
Miejsca usieciowane na motywie GGA G pre-let7-g RNA przez LIN28, Fbio CLIP-seq lub zidentyfikowane. Ponadto określono wzbogacone motywy RNA w miejscach wiązania oraz odsetek zmutowanych nukleotydów w różnych typach mutacji. Pokazuje, że LIN28 woli wiązać się z nukleotydem genu.
Cóż, o godzinie 22:00, ten protokół, ważne jest, aby potwierdzić skuteczność immunoprecypitacji, aby upewnić się, że kompleksy tylko białkowe zostały pomyślnie oczyszczone.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie Fbio CLIP-seq, który wykorzystuje tandemową czyszczenie FLAG-biotyny do identyfikacji celów RNA białek wiązających RNA (RBP) w komórkach ssaków. Metoda ta pozwala na efektywne wykrywanie bezpośrednio związanych z białkami RNA bez konieczności stosowania procedur SDS-PAGE i transferu na membranę.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Tło
- Białka wiązające RNA (RBP) odgrywają kluczową rolę w regulowaniu różnych procesów biologicznych.
- Tradycyjne metody CLIP-seq często wymagają izotopów i specyficznych przeciwciał.
- Fbio CLIP-seq ma na celu uproszczenie procesu profilowania RBP i ich celów RNA.
- Ta metoda jest szczególnie przydatna w badaniach komórek ssaków.
Cel badania
- Rozwój bardziej efektywnej metody identyfikacji celów RNA białek RBP.
- Wyeliminowanie potrzeby stosowania złożonych procedur jak SDS-PAGE.
- Dostarczenie protokołu, który może być łatwo stosowany w badaniach komórek ssaków.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek macierzystych embrionalnych myszy na 10 cm talerzu.
- Inkubacja komórek przez noc przed obróbką.
- Obróbka trypsyną EDTA w celu odczepienia komórek.
- Wykorzystanie tandemowego czyszczenia FLAG-biotyny do izolowaniu RNA.
Główne wyniki
- Metoda Fbio CLIP-seq z powodzeniem profiluje RBP i ich cele RNA.
- Wykazano efektywność w wykrywaniu związanych z białkami RNA.
- Wykazano, że metoda jest wolna od izotopów i przeciwciał.
- Dostarczono uproszczone podejście do badania interakcji RNA-białko.
Konkluzje
- Fbio CLIP-seq jest cennym narzędziem dla badaczy studiujących RBP w komórkach ssaków.
- Metoda poprawia zdolność profilowania interakcji RNA bez tradycyjnych ograniczeń.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć się na różne konteksty biologiczne i typy komórek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct mapping of protein-RNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines. The Fbio CLIP-seq method enables transcriptome-wide identification of direct RNA-binding protein targets without reliance on isotopes or protein-specific antibodies, reducing confounding from indirect interactions. This capability enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in RNA-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables transcriptome-wide interrogation of direct protein-RNA interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating indirect RNA-binding protein contaminants.
- Supports predictive confidence in target engagement and pathway mapping.
- Facilitates triage of RNA-binding proteins based on direct interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, antibody-free workflow for preparing validated protein-RNA complexes.
- Delivers quantitative readouts of direct binding events suitable for downstream screening.
- Improves reproducibility and scalability by removing isotope and antibody dependencies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by profiling endogenous interactions in mammalian cells.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by mapping direct RNA targets.
- De-risks translational biomarker selection through high-specificity interaction data.
- Facilitates risk-adjusted advancement of RNA-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
The Fbio CLIP-seq method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing direct evidence of protein-RNA interactions for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-binding protein targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound screening and assay standardization.
- Analytics: Enables transcriptome-wide comparison of binding patterns and motif enrichment.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by profiling interactions in disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, antibody-independent platform for diverse RNA-binding protein studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through antibody-free, isotope-free, and scalable purification steps.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-protein biochemistry and cross-linking techniques.
- Needs access to UV cross-linking, FLAG and streptavidin bead purification, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mammalian cell models with protocol optimization.
- Potential limitations include requirement for tagged protein expression and careful validation of purification efficiency.
