Name: Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę Fbio CLIP-seq do profilowania interakcji białko-RNA w komórkach ssaków. Technika ta umożliwia wykrywanie bezpośrednich wiązań RNA z białkami bez izotopów i specyficznych przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie grantowe pochodzi z Narodowego Programu Badań Podstawowych Chin (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31630095) oraz Centrum Nauk Przyrodniczych na Uniwersytecie Tsinghua.

1. Budowa linii komórkowej
<ol>
	<li>Sklonuj interesujący nas gen do wektora PiggyBac pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA odnoszącego zainteresowanie]-(odpornego na higromycynę) plazmidu, który przenosi epitop biotyny FLAG13,21, aby wyrazić znacznik FLAG-biotyna połączony RBP (FBRBP).</li>
	<li>Kotransfekcja wektora wyrażającego RBP FBz wektorem pBase do linii komórkowej wyrażającej enzym BirA22. 
	UWAGA: W tym badaniu gen FBRBP został transfekowany do mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) przenoszących zintegrowany wektor ekspresyjny BirA21. Alternatywnie, wektor ekspresji RBP FBmoże być kotransfekowany do komórek z pBase i pPiggyBac-BirA-V5 razem.</li>
	<li>Hodować komórki w mESC na żelatynizowanych szalkach i utrzymywać w pożywce hodowlanej mES (tabela materiałów) w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Wybrać transfekowane komórki z higromycyną b (100 μg/ml) przez 1 tydzień.</li>
	<li>Po wyborze leku należy pobrać komórki za pomocą bufora ładującego SDS (Tabela 1) i użyć Western blot 23, aby potwierdzić znakowanie i ekspresję genu odpowiednio przeciwciałem FLAG i streptawidyną-HRP.</li>
</ol>
2. Sieciowanie
<ol>
	<li>Płytka ~3 x 106 mES komórek w 10 cm płytce 1 dzień przed eksperymentem, tak aby komórki rosły do 70−90% konfluencji po pobraniu (~5−10 milionów komórek na próbkę).</li>
	<li>Usuń podłoże za pomocą próżni. Potraktuj komórki 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT) i wygadź trypsynę przez 4 ml świeżej pożywki mESC. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawieś komórki za pomocą 4 ml zimnego PBS i umieść komórki z powrotem na 10-centymetrowej płytce w celu usieciowania. Sieciować ogniwa za pomocą promieniowania światłem UV o długości fali 254 nm (ustawić sieciownik UV na parametr 400 mJ/cm2). 
	UWAGA: W przypadku monowarstw komórkowych komórki można usieciować światłem UV bezpośrednio na płytce przed leczeniem trypsyną.</li>
	<li>Przenieś usieciowane komórki do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. 
	UWAGA: Usieciowany osad komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie lizatu komórkowego
<ol>
	<li>Lizować komórki za pomocą 500 μl buforu płuczącego A (Tabela 1) świeżo uzupełnionego 1 mM DTT, 1 mM PMSF, koktajlem inhibitorów proteazy 1/500 i inhibitorem RNazy 400 U/mL. Przenieś komórki do probówki 1,5 ml bez RNaz. Inkubować komórki przez 30−60 minut na wirniku z delikatnymi obrotami w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Potraktować lizat 30 μl DNazy I w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zatrzymać reakcję, dodając 4 μl 0,5 M EDTA. Odwirować nierozpuszczalny osad o objętości 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Do natychmiastowego użycia przechowywać na lodzie. Jeżeli supernatant nie zostanie natychmiast użyty, należy przechowywać go do czasu użycia w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Przygotowanie koralików FLAG
<ol>
	<li>Dodaj 40 μl kulek FLAG zawiesiny na próbkę do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Szybko umyj kulki 0,5 ml lodowatego buforu do płukania A i odwiruj 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz krok 4.2 raz. Obracać kulki o gramaturze 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyjąć bufor za pomocą wąskiej końcówki do pipety. Unikaj usuwania koralików.</li>
</ol>
5. Immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Przenieś lizat komórkowy z kroku 3.2 do wstępnie zrównoważonych kulek FLAG. Delikatnie obrócić wszystkie próbki na wytrząsarce rolkowej w temperaturze 4 °C. Inkubować kulki FLAG z lizatem przez 2-4 godziny lub przez noc.</li>
	<li>Odwirować kulki przez 2 minuty przy 3 000 x g i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przepłukać kulki 0,5 ml wstępnie schłodzonego buforu A do płukania przez inkubację przez 5 minut w rotatorze w temperaturze 4 °C, odwirować kulki z 3 000 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant. Powtórz pranie 1x.</li>
	<li>Powtórzyć płukanie 2 razy, jak opisano w kroku 5.3, z 0,5 ml wstępnie schłodzonego buforu do płukania B (Tabela 1).</li>
</ol>
6. Elucja z 3x peptydem FLAG
<ol>
	<li>Przygotować 3x roztwór elucyjny FLAG, rozpuszczając 1 mg peptydu 3x FLAG w 5 ml buforu płuczącego A do końcowego stężenia 200 ng / ml.</li>
	<li>Obracaj koraliki FLAG z kroku 5.4 za pomocą 3 000 x g przez 2 minuty. Ostrożnie usuń supernatant. Upewnij się, że większość supernatantu została usunięta za pomocą wąskiej końcówki pipety.</li>
	<li>Dodać 200 μl 3x roztworu elucyjnego FLAG do każdej próbki. Inkubować próbki, delikatnie obracając je przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Obracać kulki FLAG przez 2 minuty przy 3 000 x g. Przenieść supernatanty do świeżych probówek.</li>
	<li>Powtórzyć elucję 2 razy, jak opisano w krokach 6.2 i 6.3 i połączyć eluenty razem. Zaoszczędź 5% eluentów do analizy Western blot lub barwienia srebrem, aby sprawdzić skuteczność FLAG-IP.</li>
</ol>
7. Przygotowanie kulek streptawidyny
<ol>
	<li>Przygotować 50 μl zawiesiny z kulkami streptawidyny dla każdej próbki. Zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 s i usuń supernatant za pomocą końcówki pipety.</li>
	<li>Szybko umyj koraliki 0,5 ml lodowatego buforu do mycia A i zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 sekund.</li>
	<li>Powtórzyć pranie 1x. Usunąć supernatant po umyciu.</li>
</ol>
8. Oczyszczanie powinowactwa do biotyny
<ol>
	<li>Przenieść zebrane eluenty z kroku 6.4 do kulek streptawidyny z kroku 7.3 i delikatnie obracać próbki w temperaturze 4 °C przez 1-3 godziny lub przez noc.</li>
	<li>Zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 s i usuń supernatant. Przemyć kulki 2x 500 μl buforu do przemywania C (tabela 1) delikatnie obracając w temperaturze RT przez 5 minut.</li>
	<li>Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i usuń supernatant. Przemyć kulki 2x 500 μl buforu płuczącego D (tabela 1), obracając w pozycji RT przez 5 minut.</li>
	<li>Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i usuń supernatant. Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK (Tabela 1).</li>
</ol>
9. Częściowe trawienie RNA
<ol>
	<li>Wykonać10-krotne 5-krotne rozcieńczenie MNazy za pomocą buforu reakcyjnego MNazy (Tabela 1). Dodać 100 μl roztworu MNazy do każdej próbki. Wirować kulki w temperaturze 37 °C za pomocą mieszalnika termicznego ustawionego na 1 200 obr./min (5 s biegu, 30 s zatrzymania) przez 10 minut, zbierać kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 s i usuwać supernatant. 
	UWAGA: Stężenie MNazy powinno być zoptymalizowane dla różnych białek wiążących RNA. Stężenie MNazy, które może trawić RNA na fragmenty 30-50 nt (określone przez wielkość insertu końcowej biblioteki) jest optymalne.</li>
	<li>Szybko umyj kulki 2x 500 μl lodowatego buforu PNK+EGTA (Tabela 1). Zbierz kulki za pomocą podstawki magnetycznej i usuń supernatant między każdym etapem mycia.</li>
	<li>Przemyć kulki 2x 500 μl buforu myjącego C, delikatnie obracając przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Następnie szybko umyj kulki 2x 500 μl lodowatego buforu PNK.</li>
</ol>
10. Defosforylacja RNA
<ol>
	<li>Przygotować mieszankę reakcyjną fosfatazy jelita cielęcego () z 8 μl 10x buforu (tabela materiałów), 3 μl enzymu i 69 μl wody. Całkowita objętość wynosi 80 μl na reakcję.</li>
	<li>Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Dodaj mieszaninę reakcyjną do kulek. Wirować kulki w temperaturze 37 °C za pomocą mieszarki termicznej ustawionej na 1 200 obr./min (5 s bieg, 30 s zatrzymania) przez 10 min.</li>
	<li>Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK+EGTA. Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK.</li>
</ol>
11. 3' podwiązanie łącznika
<ol>
	<li>Przygotuj 3' mieszankę łącznika z 4 μL 20 μM 3' łącznika, 4 μL 10x buforu ligazy T4 RNA, 4 μL 50% PEG8000, 2 μL ligazy T4 RNA 2 (obcięte) i 26 μL wody. Całkowita objętość wynosi 40 μl na reakcję.</li>
	<li>Zbierz koraliki z kroku 10.3 za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Dodaj 40 μl 3-calowej mieszanki ligacyjnej łącznika do kulek. Wirować kulki w temperaturze 16 °C za pomocą mieszarki termicznej ustawionej na 1 200 obr./min (5 s biegu, 30 s zatrzymania) przez 3 godziny lub przez noc.</li>
	<li>Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK+EGTA. Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK.</li>
</ol>
12. Leczenie PNK
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę PNK z 4 μl 10x buforu PNK, 2 μl enzymu T4 PNK, 1 μl 10 mM ATP i 33 μl wody. Całkowita objętość wynosi 40 μl na reakcję.</li>
	<li>Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Dodaj 40 μl mieszanki PNK do kulek. Delikatnie mieszać kulki w temperaturze 37 °C za pomocą mieszarki termicznej ustawionej na 1 200 obr./min (5 s biegu, 30 s zatrzymania) przez 10 min.</li>
	<li>Szybko umyj kulki za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK+EGTA.</li>
	<li>Szybko umyj kulki 500 μl lodowatego buforu PNK. Zaoszczędź 5% koralików do analizy barwienia zachodniego lub srebrem, aby potwierdzić skuteczność immunoprecypitacji.</li>
</ol>
13. Izolacja RNA
<ol>
	<li>Zbierz koraliki z kroku 12.4 za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Dodać 200 μl buforu do trawienia proteinazy K (Tabela 1). Wirować kulki przez 30 minut w temperaturze 37 °C za pomocą mieszarki termicznej ustawionej na 1 200 obr./min (5 s biegu, 30 s zatrzymania). Magnetycznie odizoluj koraliki i weź supernatant do eksperymentu.</li>
	<li>Dodać 400 μl odczynnika do izolacji RNA (tabela materiałów) do supernatantu z kroku 13.1, dokładnie wymieszać i inkubować na lodzie przez 5 minut. Dodać 80 μl chloroformu i dokładnie wymieszać, a następnie inkubować na lodzie przez 5 min. Wirować z 12 000 x g przez 10 min 4 °C. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać w okapie chemicznym.</li>
	<li>Pobrać sklarat (~500 μl) i dodać dwie objętości mieszaniny izopropanolu i etanolu (1:1), 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH = 5,5) i 1 μl glikogenu. Zamrażać w temperaturze -20 °C przez 2 godziny. Wirować w temperaturze 4 °C z 12 000 x g przez 20 min.</li>
	<li>Umyj pellet 2x lodowatym 70% etanolem. Wirować granulkę w temperaturze 4 °C z 12 000 x g przez 5 minut. Usunąć sklarowany osad i wysuszyć osad. Rozpuścić RNA w 5 μl H2O wolnego od RNaz.</li>
</ol>
14. 5' Ligacja łącznika RNA
<ol>
	<li>Wykonaj mieszaninę ligacji 5' RNA z 1 μl 10x buforu ligazy T4 RNA, 0,5 μl BSA (1 μg/μL), 1 μl 10 mM ATP, 1 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl ligazy T4 RNA. Całkowita objętość wynosi 4 μL na reakcję.</li>
	<li>Dodać 1 μl łącznika RNA 5' 20 μM do RNA z kroku 13.4, zdenaturować RNA przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 2 minuty i natychmiast schłodzić na lodzie.</li>
	<li>Dodaj mieszankę ligacji 5' RNA do RNA z kroku 14.2. Inkubować w temperaturze 16 °C przez noc.</li>
</ol>
15. Odwrotna transkrypcja
<ol>
	<li>Oczyść RNA zgodnie z opisem w sekcji 13 i rozpuść RNA w 11,5 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Dodać 1 μl 10 μM startera do odwrotnej transkrypcji do oczyszczonego RNA, ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 2 minuty i natychmiast schłodzić na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę odwrotnej transkrypcji z 4 μl 5x buforu do odwrotnej transkrypcji, 1 μl 10 mM dNTP, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl odwrotnej transkryptazy (tabela materiałów). Całkowita objętość wynosi 7,5 μl na reakcję.</li>
	<li>Dodać 7,5 μl mieszaniny odwrotnej transkrypcji do RNA, inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut i zatrzymać reakcję przez inkubację w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Pozostawić w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
16. Amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę do amplifikacji PCR z 15 μl 2x głównej mieszanki PCR (tabela materiałów), 5 μl cDNA z kroku 15.4, 0,6 μl 10 μM startera do przodu 1 (tabela 2), 0,6 μl 10 μM startera odwrotnego 1 (tabela 2) i 8,8 μlH2O. Całkowita objętość wynosi 30 μL.</li>
	<li>Amplifikuj cDNA w następujących ustawieniach: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (powtórz kroki 2−4 przez 15−20 cykli), 72 °C 2 min i przytrzymaj w temperaturze 4 °C. Uruchom produkt PCR na 2-3% żelu agarozowym. Wytnij DNA o wartości ~100−150 pz, wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelem (tabela materiałów) i wymyj DNA 20 μl wody.</li>
	<li>Pobrać 3 μl oczyszczonego produktu PCR, amplifikować starterem do przodu 2 (tabela 2) i starterem odwrotnym 2 (starter indeksowy; Tabela 2) Jak opisano w kroku 16.2 dla pięciu cykli w celu wprowadzenia sekwencji indeksów. Oczyść produkt PCR zgodnie z opisem w kroku 16.2.</li>
	<li>Sekwencjonowanie biblioteki za pomocą platformy sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.</li>
</ol>
17. Analiza bioinformatyczna
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę danych za pomocą komercyjnych programów, jak opisano wcześniej8.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3%27+Ends%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li>
<li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li>
<li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034(2010).</li>
<li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li>
<li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074(2014).</li>
<li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li>
<li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090(2016).</li>
<li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li>
<li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+%28eCLIP%29+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj wprowadzamy zmodyfikowaną metodę CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq, wykorzystującą system podwójnego znakowania FLAG-biotyna do przeprowadzania tandemowego oczyszczania kompleksów białko-RNA. Wykazano, że system podwójnego znakowania FLAG-biotyna jest skuteczny w identyfikacji interakcji białko-białko i białko-DNA13,21. Tutaj pokazujemy wysoką specyficzność i wygodę tego systemu w identyfikacji RNA oddziałujących z białkami. Dzięki oczyszczaniu tand...

RNA i białka wiążące RNA (RBP) kontrolują różnorodne procesy komórkowe, w tym splicing, translację, biogenezę rybosomów, regulację epigenetyczną i przejście losu komórki1,2,3,4,5,6. Delikatne mechanizmy tych procesów zależą od unikalnego przestrzennego i czasowego ułożenia RNA i RBP. Dlatego ważnym krokiem w kierunku zrozumienia regulacji RNA na poziomie molekularnym jest ujawnienie informacji o położeniu miejsc wiązania RBP.
Strategia określana jako cross-linking and immunoprecipitation (CLIP-seq) została opracowana w celu wychwytywania interakcji białko-RNA z sieciowaniem UV, a następnie immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania7. Kluczową cechą metodologii jest indukcja kowalencyjnych wiązań krzyżowych między białkiem wiążącym RNA a jego bezpośrednio związanymi cząsteczkami RNA (w obrębie ~1 A) przez promieniowanie UV8. Ślady RBP można określić za pomocą grupowania znaczników CLIP i wywoływania szczytów, które zwykle mają rozdzielczość 30−60 nt. Alternatywnie, etap odwrotnej transkrypcji CLIP może prowadzić do indeli (insercji lub delecji) lub podstawień do miejsc sieciowania, co umożliwia identyfikację miejsc wiązania białek na RNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Potoki, takie jak Novoalign i CIMS, zostały opracowane do analizy wyników sekwencjonowania o wysokiej przepustowości CLIP-seq8. Zaproponowano również kilka zmodyfikowanych metod CLIP-seq, w tym sieciowanie i immunoprecypitację z rozdzielczością poszczególnych nukleotydów (iCLIP), ulepszony CLIP (eCLIP), irCLIP oraz fotoaktywowane sieciowanie i immunoprecypitację wzmocnione rybonukleozydami (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Pomimo szerokiego zastosowania tradycyjnych metod CLIP-seq w badaniu RBP, metody CLIP mają kilka wad. Po pierwsze, żmudna elektroforeza żelu denaturowanego i procedura przenoszenia membrany może prowadzić do utraty informacji i powodować ograniczoną złożoność sekwencji. Po drugie, metoda CLIP oparta na przeciwciałach swoistych dla białka może pociągnąć za sobą kompleks białkowy zamiast pojedynczego białka docelowego, co może prowadzić do fałszywie dodatnich interakcji białko-RNA z oczyszczonych RBP. Po trzecie, strategia oparta na przeciwciałach wymaga dużej ilości wysokiej jakości przeciwciał, co sprawia, że zastosowanie tych metod jest nieodpowiednie do badania RBP bez dostępnych przeciwciał wysokiej jakości. Po czwarte, tradycyjna metoda CLIP wymaga znakowanego radioaktywnie ATP do znakowania RNA związanych z białkiem.
Wysokie powinowactwo streptawidyny do biotynylowanych białek sprawia, że jest to bardzo skuteczne podejście do oczyszczania określonych białek lub kompleksów białkowych. Efektywna biotynylacja białek przenoszących sztuczną sekwencję peptydową przez ektopowo eksprymowaną bakteryjną ligazę biotyny BirA w komórkach ssaków sprawia, że jest to skuteczna strategia przeprowadzania oczyszczania biotyny in vivo13. Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq (F LAG-Biotin-mediated Cross-l inking and I mmunoprecipitation and Immuno p recipitation, a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości) przy użyciu tandemowego oczyszczania znacznika FLAG-biotyna14 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dzięki oczyszczaniu tandemowemu i rygorystycznym warunkom mycia, prawie wszystkie oddziałujące RBP są usuwane (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Rygorystyczne warunki prania pozwalają również na obejście SDS-PAGE i transferu membranowego, co jest pracochłonne i stanowi wyzwanie techniczne. Podobnie jak w przypadku eCLIP i irCLIP, metoda FbioCLIP-seq nie zawiera izotopów. Pominięcie etapów działania i transferu żelu pozwala uniknąć utraty informacji, utrzymuje autentyczne interakcje białko-RNA w stanie nienaruszonym i zwiększa złożoność biblioteki. Co więcej, wysoka skuteczność systemu znakowania sprawia, że jest to dobry wybór dla RBP bez dostępnych przeciwciał wysokiej jakości.
Tutaj podajemy krok po kroku opis protokołu FbioCLIP-seq dla komórek ssaków. Krótko mówiąc, komórki są sieciowane przez promieniowanie UV o długości 254 nm, a następnie następuje liza komórek i immunoprecypitacja FLAG (FLAG-IP). Następnie kompleksy białko-RNA są dalej oczyszczane przez wychwytywanie powinowactwa do biotyny, a RNA są fragmentowane przez częściowe trawienie MNazą. Następnie RNA związane z białkiem jest defosforylowane i ligowane łącznikiem 3'. Łącznik 5' RNA dodaje się po fosforylacji RNA za pomocą PNK i elucji przez trawienie proteinazy K. Po odwrotnej transkrypcji sygnały RNA związane z białkami są amplifikowane przez PCR i oczyszczane przez oczyszczanie w żelu agarozowym. Wybrano dwa RBP jako przykład wyniku FbioCLIP-seq. LIN28 jest dobrze scharakteryzowanym białkiem wiążącym RNA, zaangażowanym w dojrzewanie mikroRNA, translację białek i przeprogramowywanie komórek15,16,17. WDR43 to białko zawierające domenę WD40, które koordynuje biogenezę rybosomów, transkrypcję eukariotyczną i kontrolę pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych14,18. Zgodnie z wcześniej zgłoszonymi wynikami dla LIN28 z CLIP-seq, FbioCLIP-seq ujawnia miejsca wiązania LIN28 na motywach "GGAG" w mikroRNA mir-let7g i mRNAs16,19 (Rysunek 3). WDR43 FbioCLIP-seq zidentyfikował również preferencję wiązania WDR43 z 5' zewnętrznymi transkrybowanymi przekładkami (5'-ETS) pre-rRNAs20 (Rysunek 4). Wyniki te potwierdzają wiarygodność metody FbioCLIP-seq.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>UVP</td><td>HL-2000 HybrilLinker</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki oczyszczające affinity</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG Koraliki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>3 x peptyd FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td>Bufor <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>NEB</td><td></td><td>M0290S</td><td>znajduje się w tym samym pakiecie.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania żelu</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>MNaza</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Porteinase K</td><td>TAKARA</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>0492S</td><td></td></tr><tr><td>odwrócona trankryptotaza ( SupperScriptIII)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do izolacji RNA (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Bufor PNK znajduje się w tym samym opakowaniu.</td></tr><tr><td>Ligi RNA T4</td><td>Bufor</td> ligazy RNA ThermoFisher <td>EL0021</td><td>T4 i BSA znajdują się w tym samym opakowaniu.</td></tr><tr><td>Ligaza RNA T42, obcięty</td> bufor ligazy RNA <td>NEB</td><td>M0242S</td><td>T4 i 50% PEG są w tym samym pakiecie.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mESC pożywka hodowlana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (80%)</td><td>Gibco</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>FCS (15%)</td><td>Hyclon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1%)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td></td><td></td><td>oczyszczone białko rekombinowane; 10 000-krotne rozcieńczenie</td></tr><tr><td>NEAA (1%)</td><td></td>Mieszanka nukleozydów <td>Gibco</td> 11140050 <td></td></tr> (<tr><td>1%)</td><td>Milipor</td><td>ES-008-D</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (1%)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie interakcji białko-rna w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania flag-biotyna

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

RNA i białka wiążące RNA (RBP) kontrolują wiele procesów biologicznych. Przestrzenne i czasowe ułożenie RNA i RBP leży u podstaw delikatnej regulacji tych procesów. Opracowano strategię o nazwie CLIP-seq (cross-linking and immunoprecipitation) w celu wychwytywania endogennych interakcji białko-RNA z sieciowaniem UV, a następnie immunoprecypitacją. Pomimo szerokiego zastosowania konwencjonalnej metody CLIP-seq w badaniu RBP, metoda CLIP jest ograniczona dostępnością wysokiej jakości przeciwciał, potencjalnymi zanieczyszczeniami z oczyszczonych RBP, wymogiem manipulacji izotopami oraz potencjalną utratą informacji podczas żmudnej procedury eksperymentalnej. Tutaj opisujemy zmodyfikowaną metodę CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq wykorzystującą tandemowe oczyszczanie znacznika FLAG-biotyna. Dzięki oczyszczaniu tandemowemu i rygorystycznym warunkom mycia prawie wszystkie oddziałujące białka wiążące RNA są usuwane. W ten sposób RNA oddziałujące pośrednio, w których pośredniczą te oczyszczone RBP, są również redukowane. Nasza metoda FbioCLIP-seq umożliwia skuteczne wykrywanie bezpośrednich RNA związanych z białkami bez SDS-PAGE i procedur transferu błonowego w sposób wolny od izotopów i przeciwciał specyficznych dla białka.

Schematyczna reprezentacja procedury FbioCLIP-seq przedstawiona jest na Rysunku 1. W porównaniu z jednokrokowym oczyszczaniem powinowactwa za pośrednictwem FLAG lub streptawidyny, tandemowe oczyszczanie FLAG-biotyna usunęło niemal wszystkie białka współoczyszczane, zapobiegając zanieczyszczeniu pośrednimi oddziaływaniami białko-RNA (Rysunek 2). Reprezentatywne wyniki FbioCLIP-seq dla LIN28 i WDR43 przedstawiono na Rysun...

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Tylko i wyłącznie białka wiążące kontrolują wiele procesów biologicznych. Ta metoda FLAG-Biotin CLIP-seq pozwala na globalne profilowanie specjalnego i czasowego układu RNA i RBP w komórkach ssaków. Metoda ta pozwala na skuteczne wykrywanie bezpośrednich RNA związanych z białkami bez SDS-PAGE i procedur transferu błonowego.W porównaniu z tradycyjnym CLIP-seq nie zawiera izotopów i nie wymaga przeciwciał specyficznych dla białka. Zacznij od posiewu około 3 milionów embrionalnych komórek macierzystych myszy na 10-centymetrowej płytce i inkubacji przez noc. Następnego dnia usuń pożywkę za pomocą próżni i potraktuj komórki dwoma mililitrami 0,25% trypsyny EDTA przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Ugasić trypsynę czterema mililitrami świeżej pożywki MESC i przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie odwiruj je w temperaturze 300 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usuń supernatant. Zawieś komórki w czterech mililitrach zimnego PBS i przenieś je z powrotem na 10-centymetrową płytkę w celu usieciowania.Naświetl komórki światłem UV o długości 254 nanometrów, a następnie przenieś usieciowane komórki do 15-mililitrowej probówki. Wirować te komórki w temperaturze 300 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, następnie usunąć supernatant i poddać komórki lizie za pomocą 500 mikrolitrów buforu A przygotowanego zgodnie z instrukcjami manuskryptu. Przenieś komórki do wolnej od RNAzy probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem przez 30 do 60 minut.Potraktuj lizat 30 mikrolitrami DNAzy 1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając cztery mikrolitry 0,5 molowego EDTA. Odwiruj nierozpuszczalny osad przez odwirowanie w temperaturze 12 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieś supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Przenieś lizat komórkowy do wstępnie zrównoważonych kulek FLAG i inkubuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji odwirować kulki przez dwie minuty w temperaturze 3000 razy G i usunąć supernatant. Dodać 500 mikrolitrów buforu A do próbki i inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie odwirować kulki i usunąć supernatant.Powtórzyć płukanie buforem A, a następnie dwa przemycia wstępnie schłodzonym buforem B.To wymyć peptydem trzy X FLAG, przygotować roztwór elucji zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i odwirować kulki FLAG. Usunąć supernatant za pomocą wąskiej końcówki pipety końcowej i dodać 200 mikrolitrów trzech roztworów elucyjnych X FLAG do każdej próbki. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie obracając je.Następnie wiruj kulki przez dwie minuty po 3000 razy G. Przenieś supernat do nowej probówki i powtórz elucję dwukrotnie. Zaoszczędź 5% eluentów do analizy Western blot lub barwienia srebrem, aby sprawdzić skuteczność immunoprecypitacji FLAG. Przenieść pobrane eluenty do przygotowanych kulek streptawidyny i delikatnie obracać próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do trzech godzin lub przez noc.Następnie zbierz koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu C z delikatnymi obrotami przez pięć minut na pranie. Następnie umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu D i dwukrotnie 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK, zbierając kulki na stojaku magnetycznym i usuwając supernatant między myciami.Aby przeprowadzić częściowe trawienie RNA, dodaj 100 mikrolitrów roztworu MNA do każdej próbki i wiruj w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika termicznego przez 10 minut. Zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 sekund i usuń supernatant. Następnie umyj je buforem PNK-EDTA, buforem C i buforem PNK zgodnie ze wskazówkami rękopisu.Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Następnie dodaj mieszankę reakcyjną i wiruj kulki w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika termicznego przez 10 minut. Szybko umyj kulki dwukrotnie 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK EDTA, a następnie dwukrotnie przepłucz 500 mikrolitrami lodowatego buforu PNK.Po umyciu dodaj 40 mikrolitrów trzech głównych mieszanek ligacyjnych do kulek i wiruj je w temperaturze 16 stopni Celsjusza za pomocą miksera termicznego przez trzy godziny lub przez noc. Skuteczne podwiązanie łącznika ze sprzymierzeńcami ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu. Od czasu do czasu sprawdzaj rurkę reakcyjną, aby upewnić się, że nie wytrącają się one podczas podwiązywania.Po inkubacji powtórzyć płukanie PNK EDTA i PNK, dodać 40 mikrolitrów PNK zmieszanych z kulkami i wirować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą miksera termicznego przez 10 minut. Umyj koraliki PNK EDTA i PNK, a następnie przystąp do izolacji RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. W porównaniu z jednoetapowym oczyszczaniem powinowactwa za pośrednictwem FLAG lub streptawidyny, oczyszczanie tandemowe FLAG-Biotin usunęło prawie wszystkie oczyszczone białka rdzeniowe, unikając zanieczyszczenia pośrednich interakcji białkowych RNA.LIN28 i WDR43, Fbio CLIP-seq przeprowadzono przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy. W sumie pobrano około 7,7 miliona i 2,2 miliona unikalnych odczytów odpowiednio dla LIN28 i WDR43. Porównanie widoków ścieżek pokazuje różne wzorce wiązania w locus pre-rRNA RN45.Miejsca usieciowane na motywie GGA G pre-let7-g RNA przez LIN28, Fbio CLIP-seq lub zidentyfikowane. Ponadto określono wzbogacone motywy RNA w miejscach wiązania oraz odsetek zmutowanych nukleotydów w różnych typach mutacji. Pokazuje, że LIN28 woli wiązać się z nukleotydem genu.Cóż, o godzinie 22:00, ten protokół, ważne jest, aby potwierdzić skuteczność immunoprecypitacji, aby upewnić się, że kompleksy tylko białkowe zostały pomyślnie oczyszczone.

transcriptome-wide-profiling-protein-rna-interactions-cross-linking

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA na transkrypcie jest kluczowym czynnikiem regulacji potranskrypcyjnej. Opracowaliśmy zatem metodę sieciowania promieniami UV i immunoprecypitacji z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu (iCLIP), która umożliwia precyzyjne mapowanie w całym genomie miejsc wiązania białka wiążącego RNA.

iCLIP – Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj metodę Fbio CLIP-seq do profilowania interakcji białko-RNA w komórkach ssaków. Technika ta umożliwia wykrywanie bezpośrednich wiązań RNA z białkami bez izotopów i specyficznych przeciwciał.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Przeglądaj więcej filmów