Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR
February 8th, 2020
Opisujemy metodę immunofluorescencji i ilościowego PCR do lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach owadów. Protokół immunofluorescencji może być stosowany do kolokalizacji białek wirusowych i wektorowych. Ilościowy protokół PCR można rozszerzyć w celu ilościowego oznaczania wirusów w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem.
Wyjaśnienie przestrzenności i ilości wirusa w wektorach mączlika może pomóc w zrozumieniu interakcji między begomowirusem a mączlikiem oraz w opracowaniu nowych strategii zwalczania poważnych chorób begomowirusowych. Zaletą tej techniki jest to, że możemy szybko wyizolować tkanki mączlika, kolokalizować białka wirusa i mączlika oraz określić ilościowo wirusy w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym, po przejęciu wirusa, umieść znieczulone lodem samice mączlików w kropli PBS na szkiełku mikroskopowym i użyj cienkiej igły do akupunktury, aby otworzyć brzuch mączlika pod mikroskopem stereoskopowym.
Użyj igły, aby wyekstrahować jelito środkowe i umieść je w naczyniu zbiorczym PBS. Aby zebrać PSG, podziel ciało w klatce piersiowej od strony grzbietowej w pobliżu głowy i przymocuj mączlika igłą przez klatkę piersiową. Użyj drugiej igły, aby potrząsnąć mączlikiem, aż dwa gruczoły ślinowe zostaną oddzielone od ciała i przenieś gruczoły do nowego naczynia z PBS.
Aby zebrać jajniki, całkowicie otwórz brzuch i użyj igły, aby oddzielić jajniki od innych tkanek. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar tkanki i przenieś jajniki do nowego naczynia z PBS. Aby pobrać próbkę hemolimfy, dodaj 10 mikrolitrów PBS na nowe szkiełko mikroskopowe i umieść nowego mączlika w kropli.
Użyj cienkiej igły do akupunktury, aby delikatnie zrobić otwór w jamie brzusznej. Następnie lekko uciskaj brzuch, aby uwolnić hemolimfę do buforu i zbierz ośmiolitrową próbkę płynu. Aby uwidocznić lokalizację TYLCV w pobranych mączlikach PSG, jelitach środkowych lub tkankach jajnika, przenieś od 15 do 20 próbek na szklaną 3,5-centymetrową szalkę Petriego i odessaj nadmiar buforu.
Utrwal tkanki w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie umyj próbki trzy razy przez dwie minuty w jednym mililitrze świeżego TBS na pranie. Po ostatnim praniu należy przepuścić próbki jednym mililitrem 0,5% Triton X-100 przez 30 minut przed trzykrotnym myciem, jak właśnie wykazano przy użyciu jednego mililitra TBST na pranie. Po ostatnim przemyciu zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania jednym mililitrem 1% albuminy surowicy bydlęcej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie trzy płukania w TBST, jak pokazano.
Po ostatnim praniu oznacz komórki pierwszorzędowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza chronionej przed światłem. Następnego ranka przemyj próbki trzykrotnie TBST przed dodaniem odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez dwie godziny w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji umyj jelito środkowe trzy razy i przenieś próbki do czystego szkiełka mikroskopowego.
Usuń jak najwięcej buforu i zabarwić jądra jedną kroplą DAPI przed zamontowaniem szkiełka nakrywkowego i zbadaniem znakowanych tkanek za pomocą mikroskopii konfokalnej. W celu ilościowego określenia TYLCV należy przemyć zebrane próbki tkanek mączlika dwa do trzech razy w świeżym PBS i przenieść 20 jelit środkowych, 20 PSG lub jeden jajnik w pięciu mikrolitrach PBS do pojedynczych probówek PCR zawierających 25 mikrolitrów roztworu do lizy. Dodaj pięć do siedmiu kulek ceramicznych o średnicy dwóch milimetrów do każdej probówki i zmiel próbki w homogenizatorze.
Dodaj jedną ośmiomikrolitrową próbkę hemolimfy do nowej probówki do PCR i dodaj 10 mikrolitrów lizy do probówki po dokładnym wymieszaniu. Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze 100 stopni Celsjusza i krótkie odwirowanie. Następnie dodaj 18 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do fiolek z ilościowymi probówkami paskowymi do PCR i dodaj dwa mikrolitry każdej próbki DNA do co najmniej trzech fiolek.
Po załadowaniu wszystkich próbek zamknąć probówki i odwirować w celu osadzenia roztworu na dnie każdej fiolki. Załaduj fiolki do termocyklera w czasie rzeczywistym w celu ilościowego PCR, wybierając cyber jako barwnik fluoroforowy i nieznany jako typ próbki. Następnie wyeksportuj dane ilościowe do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy względnej ilości wirusowego DNA w każdej próbce.
Tutaj pokazano reprezentatywne obrazy TYLCV w barwieniu DAPI w PSG mączlika, jelicie środkowym i jajnikach. Jak zaobserwowano, TVLCV wykazuje większą akumulację w PSG i jelicie środkowym niż w jajnikach. Kwantyfikacja wirusa w PSG mączlika, jelicie środkowym, hemolimfie i jajnikach po karmieniu pomidorem zakażonym TYLCV przez 24, 48 i 72 godziny wskazuje, że ilość wirusa wzrasta w różnych tkankach mączlika w bezpośredniej korelacji ze wzrostem okresu dostępu do nabycia.
Najlepiej używać świeżych mączlików, ponieważ martwe owady zwiększą trudność sekcji. Po tej procedurze można przeprowadzić inne analizy, takie jak western blotting i koimmunoprecypitacja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji białek wirusowych oraz interakcji między wirusem a białkiem wektorowym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę lokalizacji i ilościowego określania begomowirusów w wektorach mszyc białaczków z wykorzystaniem immunofluorescencji i ilościowej PCR. Zrozumienie przestrzenności i ilości tych wirusów może pomóc w opracowywaniu strategii kontroli chorób wywoływanych przez begomovirusy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirologia
- Entomologia
- Biologia molekularna
Tło
- Begomovirusy są istotnymi patogenami atakującymi rośliny.
- Mszyce białaczki pełnią funkcję wektorów tych wirusów.
- Zrozumienie interakcji wirus-wektor jest kluczowe dla zarządzania chorobami.
- Obecne metody badania tych interakcji są ograniczone.
Cel badania
- Opracowanie techniki izolacji i ilościowego określania begomowirusów w tkankach mszyc białaczków.
- Kolokalizacja białek wirusowych i wektorowych.
- Rozszerzenie metod ilościowych na całe ciała mszyc białaczków i rośliny zarażone wirusem.
Zastosowane metody
- Imunofluorescencja do lokalizacji białek.
- Ilościowa PCR do ilościowego określania wirusów.
- Izolacja tkanek mszyc białaczków za pomocą drobnych igieł akupunkturowych.
- Mikroskopowe badanie wyciągniętych tkanek.
Główne wyniki
- Udane zlokalizowanie begomowirusów w tkankach mszyc białaczków.
- Ilościowe określenie wirusów w całych ciałach mszyc białaczków.
- Osiągnięta kolokalizacja białek wirusowych i mszyc białaczków.
- Metoda stosowalna dla roślin zarażonych wirusem.
Wnioski
- Opracowanie metod poprawia zrozumienie interakcji begomovirus-mszyca białaczka.
- Te techniki mogą informować o strategiach kontroli chorób wywoływanych przez begomovirusy.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach dla szerszych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding virus-vector interactions is critical for developing targeted interventions against plant pathogens that threaten global crop yields. This method enables precise spatial and quantitative analysis of begomoviruses in whitefly tissues, supporting mechanistic de-risking in early-stage antiviral or vector control target validation. By providing reproducible localization and quantification data, it enhances predictive confidence in target selection and pathway interrogation for agrochemical or biologics discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral tissue tropism and vector protein interactions to clarify mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Provides standardized tissue dissection and labeling workflows for consistent target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral load data across tissues to support assay readout standardization and reproducibility.
- Operational Value: Establishes a scalable sample preparation pipeline for high-throughput screening of antiviral compounds or vector-targeting agents.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling correlation of viral accumulation with transmission potential.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between virology, entomology, and molecular biology teams through standardized outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing tissue-specific viral quantification and co-localization data that inform target selection and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral protein function and vector interaction pathways through direct tissue localization.
- Screening: Enables assay readiness by providing quantified viral DNA inputs for compound efficacy screening in vector-based models.
- Analytics: Delivers quantitative PCR readouts that allow statistical comparison of viral burden across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling viral load correlation with transmission efficiency in whitefly populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing and detection platform applicable to multiple virus-vector systems beyond begomoviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virus-vector interaction models through direct tissue-level visualization and quantification.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized tissue isolation, fixation, and detection protocols across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing quantitative thresholds for viral accumulation in key tissues.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral or vector control strategies based on tissue-specific viral dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, immunofluorescence microscopy, and qPCR assay design.
- Dependent on access to confocal microscopes, thermal cyclers, and tissue homogenization equipment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue collection timing and fixation procedures.
- Adaptation to other vector systems may require optimization of antibody penetration and tissue permeability steps.
- Practical limitations include tissue degradation risk with delayed processing and variability in whitefly infection efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Female Whitefly Midgut, Primary Salivary Gland (PSG), Ovary, and Hemolymph Dissection
2:03
Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) Localization
3:40
TYLCV Quantification
5:04
Results: Representative TYLCV Detection and Quantification
5:46
Conclusion
