Name: Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj metodę lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach mączlika za pomocą immunofluorescencji i ilościowego PCR. Technika umożliwia współlokalizację białek wirusowych i wektora oraz pomiar obciążenia wirusowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Key Research and Development Program (numer grantu: 2017YFD0200600), fundusz przeznaczony na Chiński System Badań Rolniczych (numer grantu: CARS-23-D07) oraz Fundację Billa i Melindy Gatesów (ID Inwestycji OPP1149777). Dziękujemy prof. Jian-Xiang Wu za dostarczenie przeciwciał przeciwko TYLCV CP.

1. Mączlik, wirus, rośliny i nabycie wirusa
<ol>
	<li>Mączliki tylne (MEAM1) na bawełnie (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) w klatkach odpornych na owady w szklarni w temperaturze 26 ± 1 °C przy cyklu 14:10 światło:ciemność i wilgotności względnej 60 ± 10%.</li>
	<li>Wykonaj konwencjonalny PCR oparty na genie mitochondrialnej oksydazy cytochromowej I mączlika, aby określić czystość populacji mączlików.
	<ol>
		<li>Zbierz 20 dorosłych mączlików i przenieś je pojedynczo do probówki PCR zawierającej 30 μl buforu do lizy (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] żelatyna, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinaza K).</li>
		<li>Dodaj 5–7 kulek ceramicznych (o średnicy 2 mm) do każdej probówki PCR i zmiel próbki, aby przeprowadzić lizę tkanek.</li>
		<li>Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, a następnie przez 10 minut w temperaturze 100 °C, a następnie krótko odwirować. Użyj tego supernatantu jako matrycy do amplifikacji PCR. 
		UWAGA: W razie potrzeby czas inkubacji w temperaturze 65 °C można wydłużyć.</li>
		<li>Przygotować reakcję PCR w następujący sposób: 1 U polimerazy DNA Taq, 2 μL 10x buforu (z Mg2+), 1,6 μL mieszaniny dNTP (2,5 mM), 0,5 μL każdego startera (po 10 μM każdy), 2 μL supernatantu lizatu tkankowego mączlika i podwójnie destylowana woda do całkowitej objętości 20 μL na reakcję. Sekwencja startera do przodu to 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3', a odwrotna sekwencja startera to 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'. 
		UWAGA: Należy uwzględnić kontrolę ujemną, w której DNA podstawia się wodą wolną od nukleaz, oraz kontrolę dodatnią uprzednio zweryfikowanym DNA mączlika MEAM1.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR przy użyciu następujących parametrów cyklicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 50–55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę, a następnie 72 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Trawić amplifikowany produkt za pomocą enzymu restrykcyjnego Taq I. W tym celu należy przygotować mieszaninę wytrawiającą zawierającą 0,1 μl (1 U) enzymu, 1 μl 10 x buforu Taq I, 1 μl BSA, 5 μl produktu amplifikowanego i podwójnie destylowaną wodę do całkowitej objętości 10 μl. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę w termocyklerze.</li>
		<li>Przeprowadzić elektroforezę próbek w żelu agarozowym, ładując 5–7 μl każdego strawionego produktu i drabinkę DNA (100-2000 pz) do studzienek 1% żelu agarozowego. Następnie obserwuj rozmiary prążków DNA poprzez barwienie żelem na czerwono w maszynie do dokumentacji żelu przy użyciu światła UV. Porównaj rozmiary prążków strawionych produktów z kontrolą pozytywną, aby określić czystość populacji mączlika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Agroinokulować zakaźny klon TYLCV (numer dostępu GenBank AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) do 3–4 sadzonek pomidora w fazie prawdziwych liści (Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
	<ol>
		<li>Zaszczepić 10 ml pożywki Luria-Bertani (LB) zawierającej kanamycynę (50 μg/ml) i ryfampicynę (50 μg/ml) pojedynczą kolonią. Inkubować w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż OD600 osiągnie ~1,5.</li>
		<li>Zbierać agrobakterie przez odwirowanie w stężeniu 4 000 x g przez 10 minut. Wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osady w 10 ml buforu infiltracyjnego, składającego się z 200 μM acetosyringonu, 10 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) i 10 mM MgCl2. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1–2 godziny.</li>
		<li>Naciekać 2-3 liście rośliny, używając mieszaniny z kroku 1.3.3 za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej. Utrzymywać rośliny w szklarni w temperaturze 26 ± 1 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Około 1 miesiąc później przeprowadź oględziny i wybierz rośliny wykazujące żółte kędzierzawe liście i objawy karłowatości.</li>
	<li>Przenieść dorosłe osobniki mączlika niezwirusowego na rośliny pomidora zakażone TYLCV na 48 godzin w celu nabycia wirusa.</li>
</ol>
2. Sekcja i zbieranie jelit środkowych, pierwszorzędowych gruczołów ślinowych (PSG), jajników i hemolimfy samic mączlików
<ol>
	<li>Zbieraj mączliki za pomocą aspiracji, a następnie umieść je na lodzie, aby wprowadzić je w śpiączkę. Dodaj 1x PBS (bufor soli fizjologicznej) na szkiełko mikroskopowe, a następnie umieść mączliki w buforze 1x PBS w celu rozbioru pod mikroskopem stereoskopowym.
	<ol>
		<li>W celu rozwarstwienia jelita środkowego przełam brzuch mączlika i wyciągnij jelito środkowe za pomocą cienkiej igły do akupunktury (o średnicy 0,25 mm). Przenieś jelito środkowe do czystego, 1x PBS.</li>
		<li>W przypadku rozwarstwienia PSG rozbij ciało mączlika w klatce piersiowej w pobliżu głowy od strony grzbietowej. Następnie wbij igłę w klatkę piersiową, aby przymocować mączlika, i użyj innej igły, aby potrząsnąć mączlikiem, aż dwa gruczoły ślinowe zostaną oddzielone od ciała. Następnie przenieś PSG do czystego, 1x PBS.</li>
		<li>W celu wycięcia jajnika całkowicie przełam brzuch mączlika i użyj igły, aby oddzielić jajniki od innych tkanek. Następnie usuń nadmiar tkanek za pomocą pipetowania.</li>
		<li>W przypadku kolekcji hemolimfy dodaj 10 μl buforu 1x PBS na szkiełko mikroskopowe, a następnie umieść mączlika w buforze. Aby uzyskać hemolimfę, delikatnie wyrwij otwór w jamie brzusznej za pomocą cienkiej igły do akupunktury i lekko naciśnij brzuch, aby uwolnić hemolimfę do bufora. Zebrać 8 μl cieczy jako próbkę hemolimfy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Lokalizacja TYLCV w jelicie środkowym mączlika, pierwotnych gruczołach ślinowych i jajnikach metodą immunofluorescencji
UWAGA: Procedura lokalizacji TYLCV w jelitach środkowych jest przedstawiona jako przykład. Metoda może być stosowana w przypadku PSG i jajników.
<ol>
	<li>Rozciąć jelito środkowe w buforze TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM chlorek sodu, pH = 7,5) zgodnie z opisem w kroku 2.2.1. Zbierz 15–20 mączlików śródjelitowych, przenieś je na szklaną szalkę Petriego (o średnicy 3,5 cm), a następnie usuń nadmiar buforu TBS.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu, aby utrwalić jelita środkowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie usuń roztwór utrwalający. Powoli pipetować, aby umyć jelita środkowe 3 razy w TBS po 2 minuty każdy.</li>
	<li>Inkubuj jelita środkowe w 1 ml 0,5% Triton X-100 przez 30 minut, aby przepuszczalność. Następnie usuń roztwór permeabilizacyjny i przemyj jelito środkowe 3x TBST (1x TBS z 0,05% Tween 20), jak opisano w kroku 3.2.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 1% BSA (albumina surowicy bydlęcej przygotowana w TBST), aby zablokować jelita środkowe. Wykonuj etap blokowania w RT przez 2 godziny, a następnie usuń roztwór blokujący i umyj jelita środkowe 3x w TBST.</li>
	<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała (MAb 1C4 przeciwko białku płaszcza TYLCV) w stosunku 1:400 za pomocą TBST24 i dodać roztwór do szalki Petriego, aby zanurzyć jelito środkowe. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w ciemności. Wyrzucić pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć 3x w TBST.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (anty-mysie) w stosunku 1:400 za pomocą TBST i dodać roztwór do szalki Petriego, aby zanurzyć jelito środkowe. Inkubuj naczynie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Wyrzuć roztwór przeciwciał drugorzędowych i umyj jelita środkowe 3x w TBST.</li>
	<li>Przenieś jelito środkowe na przezroczyste szkiełko mikroskopowe. Odessać jak najwięcej TBST ze szkiełka. Dodaj 1 kroplę DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek), aby zabarwić jądro, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij lakierem do paznokci. Zbadaj pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja TYLCV w mączliku środkowym, pierwotnych gruczołach ślinowych, hemolimfie i jajnikach za pomocą qPCR
<ol>
	<li>Wypreparuj jelita środkowe mączlika, PSG, hemolimfę i jajniki w 1x PBS, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Wyodrębnij DNA jelit środkowych, PSG, hemolimfy i jajników.
	<ol>
		<li>Po rozbiorzeniu umyj jelita środkowe, PSG i jajniki w czystym, 1x buforze PBS 2-3x.</li>
		<li>Zbierz 20 jelit środkowych lub 20 PSG w 5 μl 1x PBS i przenieś je do 25 μl roztworu do lizy. Przenieś każdy jajnik w 5 μl 1x PBS, a następnie przenieś indywidualnie do 25 μl roztworu do lizy</li>.
		<li>Zmiel próbki jelita środkowego, PSG i jajników zgodnie z opisem w kroku 1.2.2.</li>
		<li>Zebrać 8 μl hemolimfy z 1x PBS do probówki PCR, a następnie dodać 10 μl roztworu do lizy. Dokładnie wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrahować DNA ze wszystkich próbek, jak opisano w ppkt 1.2.3.</li>
	<li>Przygotować dwie oddzielne mieszaniny wzorcowe qPCR (po 18 μl każda) dla TYLCV i kontroli wewnętrznej (gen β-aktyny) w następujący sposób: 10 μl mieszanki SYBR Green, 0,8 μl każdego startera (po 10 μM każdy) i 6,4 μl podwójnie destylowanej wody na reakcję. W przypadku TYLCV sekwencja startera do przodu to 5′-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3′, a odwrotna sekwencja startera to 5′-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3′. W przypadku β-aktyny sekwencja startera do przodu to 5′-TCTTCCAGCCATCCTTCTTG-3′, a odwrotna sekwencja startera to 5′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3′.</li>
	<li>Dozować 18 μl mieszanki wzorcowej do fiolek z probówkami paskowymi qPCR lub na płytce 96-dołkowej. Następnie dodać 2 μl próbek DNA do każdej fiolki. Wszystkie reakcje należy przeprowadzić z co najmniej trzema kontrpróbami technicznymi i trzema kontrpróbami biologicznymi. 
	UWAGA: Krok 4.5 należy wykonać na lodzie.</li>
	<li>Zamknąć probówki qPCR lub uszczelnić 96-dołkowe płytki samoprzylepną uszczelką płytkową.</li>
	<li>Odwirować w celu zebrania cieczy na dnie probówek qPCR lub płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Umieść probówki lub płytkę w termocyklerze czasu rzeczywistego i wykonaj qPCR.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić qPCR, stosując następujące parametry cykliczne: 95 °C przez 30 s, następnie 40 cykli 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 34 s dla wyżarzania i wydłużania startera, 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 15 s, kończąc na kroku krzywej topnienia od 60 °C do 95 °C ze wzrostem o 0,5 °C na 15 s.</li>
		<li>Wybierz SYBR jako barwnik fluoroforowy i nieznany jako typ próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyeksportuj dane ilościowe do formatu arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj względną ilość wirusowego DNA metodą 2−ΔΔCT 28.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+management+of+geminiviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li>
<li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci%3A+a+statement+of+species+status%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li>
<li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University-Science+B%22%5BJournal%5D)">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li>
<li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector%2C+Bemisia+tabaci%2C+and+implications+for+epidemics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114(2015).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876(2013).</li>
<li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432(2015).</li>
<li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China-Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li>
<li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotton+leaf+curl+disease%3A+which+whitefly+is+the+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li>
<li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFiallo-Olive%2C+E+%22Phytopathology%22">Phytopathology</a>. , (2019).</li>
<li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li>
<li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+yellow+leaf+curl+virus%2C+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li>
<li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+%28Geminiviridae%3B+Begomovirus%29+by+its+whitefly+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li>
<li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li>
<li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+yellow+leaf+curl+virus%3A+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942(2016).</li>
<li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector%2C+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li>
<li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438(2014).</li>
<li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li>
<li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li>
<li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+%28Gennadius%29+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neotropical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li>
<li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273(2017).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector%2C+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142(2013).</li>
<li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li>
<li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li>
<li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+2%28-Delta+Delta+Ct%29+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly%2C+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisujemy protokół lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusa w tkankach jego wektora mączlika za pomocą immunofluorescencji i qPCR. Sekcja stanowi pierwszy krok do lokalizacji i ilościowego określenia wirusa w tkankach mączlika. Ciało mączlika ma około 1 mm długości, co oznacza, że tkanki są niezwykle małe i trudno je wypreparować. Poza tym istnieją silne połączenia między tkankami. Na przykład jajniki są ściśle połączone z bakteriocytami, co utrudnia ich izolację. Tutaj, biorąc pod uwagę charakterystykę i lokalizac...

W ostatnich dziesięcioleciach begomowirusy (rodzaj Begomovirus, rodzina Geminiviridae) spowodowały poważne szkody w produkcji wielu roślin warzywnych, włóknistych i ozdobnych na całym świecie1. Begomowirusy są przenoszone w sposób trwały przez mączlika Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), który jest złożonym gatunkiem zawierającym ponad 35 gatunków kryptycznych2,3. Begomowirusy mogą bezpośrednio lub pośrednio wpływać na fizjologię i zachowanie mączlików, takich jak płodność4, długowieczność4 i preferencje gospodarza5,6. Co więcej, skuteczność transmisji danego gatunku/szczepu begomowirusa różni się dla różnych gatunków mączlików nawet w tych samych warunkach eksperymentalnych7,8,9,10, co wskazuje, że istnieje złożona interakcja między begomowirusami a mączlikami. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw interakcji między mączlikiem a begomowirusem, niezbędna jest lokalizacja i kwantyfikacja wirusa w tkankach mączlika.
Wirus żółtej kędzierzawości liści pomidora (TYLCV) to begomowirus, który został po raz pierwszy zgłoszony w Izraelu, ale obecnie powoduje poważne szkody w produkcji pomidorów na całym świecie11,12. Ze względu na swoje znaczenie gospodarcze jest to jeden z najlepiej przebadanych begomowirusów13. Podobnie jak inne jednoczęściowe begomowirusy, TYLCV jest jednoniciowym wirusem kolistego DNA o rozmiarze genomu około 2,800 nukleotydów14. Chociaż wciąż jest to przedmiotem dyskusji, kilka linii dowodowych potwierdza replikację TYLCV u mączlików15,16,17. Ponadto opisano interakcję cząstek TYLCV i białek mączlika6,18,19,20. W celu przeniesienia wirusa mączliki nabywają TYLCV, żerując na roślinach zakażonych wirusem, wiriony przechodzą wzdłuż kanału pokarmowego, aby dotrzeć do przełyku, przenikają przez ścianę jelita środkowego, aby dotrzeć do hemolimfy, a następnie przemieszczają się do pierwotnych gruczołów ślinowych (PSG). Na koniec wiriony są wydzielane ze śliną wzdłuż przewodu ślinowego do łyka roślinnego21. Co więcej, kilka badań pokazuje, że TYLCV może być przenoszony przezjajnie z samic mączlików na ich potomstwo22,23. Innymi słowy, aby osiągnąć produktywną transmisję, wirus musi pokonać bariery komórkowe w mączliku, aby przemieścić się z jednej tkanki do drugiej. Podczas przekraczania tych barier prawdopodobnie dojdzie do interakcji między białkami mączlika i wirusa, co prawdopodobnie określi skuteczność, z jaką wirusy są przenoszone.
Immunofluorescencja jest powszechnie używaną techniką analizy rozkładu białek. Swoistość przeciwciał wiążących się z ich antygenem stanowi podstawę immunofluorescencji. Ze względu na ekonomiczne znaczenie TYLCV, opracowano przeciwciała monoklonalne przeciwko białku płaszcza TYLCV, oferując bardzo czuły sposób lokalizacji wirusa24. Ilościowy PCR (qPCR) umożliwia czułą i specyficzną kwantyfikację kwasów nukleinowych. Technika ta najczęściej opiera się na wykorzystaniu sondy hydrolizy (np. TaqMan) lub detekcji barwnika fluorescencyjnego (np. SYBR Green). W przypadku qPCR opartego na sondzie hydrolizy potrzebne są specjalne sondy, co w konsekwencji zwiększa koszty. QPCR na bazie barwnika fluorescencyjnego jest prostszy i bardziej opłacalny, ponieważ znakowane sondy hybrydyzacyjne specyficzne dla amplikonu nie są wymagane25. Do tej pory w kilku badaniach wykorzystano immunofluorescencję i qPCR wraz z innymi metodami w celu zbadania złożonych interakcji begomowirusa i mączlika. Na przykład Pan i wsp. przeprowadzili analizę qPCR i immunofluorescencyjną wirusa w tkankach mączlika i stwierdzili, że różnica w zdolności do przenoszenia wirusa kędzierzawych pędów tytoniu (TbCSV) między gatunkami mączlików AsiaII 1 i Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) wynikała z tego, że wirus był w stanie skutecznie przekroczyć ścianę jelita środkowego AsiaII1, ale nie MEAM18. Podobnie, podczas gdy mączliki śródziemnomorskie (MED) mogą łatwo przenosić TYLCV, nie przenoszą wirusa żółtej kędzierzawości żółtych liści pomidora (TYLCCNV). Selektywna transmisja została zbadana przy użyciu immunofluorescencyjnego wykrywania wirusa w PSG, co wykazało, że TYLCCNV nie przenikają łatwo przez PSG mączlików MED26. Kolokalizacja immunofluorescencyjna TYLCV CP i białka markera autofagii ATG8-II w jelicie środkowym mączlika pokazuje, że autofagia odgrywa kluczową rolę w tłumieniu infekcji TYLCV w klasie mączlików<sup="xref">27.
Tutaj, używając TYLCV jako przykładu, opisujemy protokół lokalizacji begomowirusów w jelicie środkowym mączlika, PSG i jajnikach za pomocą techniki immunofluorescencji. Technika obejmuje preparację, utrwalanie i inkubację z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi znakowanymi barwnikiem. Sygnały fluorescencyjne pokazujące lokalizację białek wirusowych w tkankach mączlika można następnie wykryć pod mikroskopem konfokalnym. Co ważniejsze, protokół ten może być stosowany do kolokalizacji białek begomowirusa i mączlika. Dalej opisujemy protokół oznaczania ilościowego TYLCV za pomocą qPCR na bazie SYBR Green w jelicie środkowym mączlików, PSG, hemolimfie i jajnikach, który można wykorzystać do porównania ilości wirusa w różnych próbkach tkanek mączlika.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>MultiSciences</td><td>F0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyno-2-ph&eacute; nyindol (DAPI)</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>MultiSciences</td><td>A3828</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-RAD</td><td>185-5201</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549-koza anty-mysia</td><td>Earthox</td><td>E032310-02</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało (MAb 1C4)</td><td></td><td></td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B548119-0500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>TB zielony premiks Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td><td>TaKaRa</td><td>RR820A</td><td>qPCR master mix</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Thermofisher</td><td>A41182</td><td></td></tr><tr><td>Tissuelyzer</td><td>Shaghai jingxin</td><td>Tissuelyser-48</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>BBI nauki przyrodnicze</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI nauki przyrodnicze</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego pcr

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Begomowirusy (rodzaj Begomovirus, rodzina Geminiviridae) są przenoszone przez mączliki z kompleksu Bemisia tabaci w sposób trwały, krążący. Biorąc pod uwagę rozległe szkody wyrządzane przez begomowirusy w produkcji roślinnej na całym świecie, konieczne jest zrozumienie interakcji między begomowirusami a ich wektorem mączlika. W tym celu kluczowe znaczenie ma lokalizacja i kwantyfikacja wirusa w tkankach wektora. Tutaj, używając jako przykładu wirusa żółtej kędzierzawości liści pomidora (TYLCV), opisujemy szczegółowy protokół lokalizacji begomowirusów w jelicie środkowym mączlika, pierwotnych gruczołach ślinowych i jajnikach za pomocą immunofluorescencji. Metoda opiera się na zastosowaniu specyficznych przeciwciał przeciwko białku płaszcza wirusowego, przeciwciał drugorzędowych znakowanych barwnikiem oraz mikroskopu konfokalnego. Protokół może być również stosowany do kolokalizacji białek begomowirusa i mączlika. Dalej opisujemy protokół oznaczania ilościowego TYLCV w jelicie środkowym mączlika, pierwotnych gruczołach ślinowych, hemolimfie i jajnikach za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Stosując startery specjalnie zaprojektowane dla TYLCV, protokoły oznaczania ilościowego pozwalają na porównanie ilości TYLCV w różnych tkankach mączlika. Opisany protokół jest potencjalnie przydatny do ilościowego oznaczania begomowirusów w ciele mączlika i rośliny zakażonej wirusem. Protokoły te mogą być wykorzystywane do analizy szlaku krążenia begomowirusów w mączliku lub jako uzupełnienie innych metod badania interakcji mączlik-begomowirus.

W celu opisania procedur wykorzystano tutaj jako przykład mączliki MEAM1 z kompleksu B. tabaci oraz TYLCV. Przegląd procedur immunofluorescencji i kwantyfikacji wirusa opisanych w niniejszym manuskrypcie przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki detekcji immunofluorescencyjnej TYLCV oraz barwienia DAPI w PSGs, jelitach środkowych i jajnikach, co wskazuje, że TYLCV kumulował się bardziej w PSGs i jelitach środkowych, a w mn...

Opisujemy metodę immunofluorescencji i ilościowego PCR do lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach owadów. Protokół immunofluorescencji może być stosowany do kolokalizacji białek wirusowych i wektorowych. Ilościowy protokół PCR można rozszerzyć w celu ilościowego oznaczania wirusów w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem.

Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Wyjaśnienie przestrzenności i ilości wirusa w wektorach mączlika może pomóc w zrozumieniu interakcji między begomowirusem a mączlikiem oraz w opracowaniu nowych strategii zwalczania poważnych chorób begomowirusowych. Zaletą tej techniki jest to, że możemy szybko wyizolować tkanki mączlika, kolokalizować białka wirusa i mączlika oraz określić ilościowo wirusy w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym, po przejęciu wirusa, umieść znieczulone lodem samice mączlików w kropli PBS na szkiełku mikroskopowym i użyj cienkiej igły do akupunktury, aby otworzyć brzuch mączlika pod mikroskopem stereoskopowym.Użyj igły, aby wyekstrahować jelito środkowe i umieść je w naczyniu zbiorczym PBS. Aby zebrać PSG, podziel ciało w klatce piersiowej od strony grzbietowej w pobliżu głowy i przymocuj mączlika igłą przez klatkę piersiową. Użyj drugiej igły, aby potrząsnąć mączlikiem, aż dwa gruczoły ślinowe zostaną oddzielone od ciała i przenieś gruczoły do nowego naczynia z PBS.Aby zebrać jajniki, całkowicie otwórz brzuch i użyj igły, aby oddzielić jajniki od innych tkanek. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar tkanki i przenieś jajniki do nowego nac

localization-quantification-begomoviruses-whitefly-tissues

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Poprawa naszego zrozumienia i zdolności do zwalczania wielu wirusów roślin przenoszonych przez owady wymaga wykorzystania wektorów. Przenoszenie wirusów roślin przez owady jest interakcją tritroficzną, a zatem wymaga manipulacji owadami, wirusem i rośliną. Wektory muszą być hodowane w dużych ilościach i manipulowane w taki sposób, aby zapewnić wysoką skuteczność przenoszenia na rośliny testowe. Przedstawiono podstawy hodowli i manipulacji mączczykiem, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae),...

Przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Tutaj prezentujemy protokół izolacji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci poprzez preparację i filtrację. Po amplifikacji próbki DNA nadają się do późniejszego sekwencjonowania i badania mutualizmu między endosymbiontami a mączlikiem.

Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Prezentujemy prostą technikę cytogenetyczną z użyciem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do określenia wskaźnika zapłodnienia i pierwotnego stosunku płci haplodifidowego szkodnika inwazyjnego Bemisia tabaci.

Określanie szybkości zapłodnienia jaj Bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej

Ten protokół immunofluorescencyjnego znakowania zarówno białek wirusa roślinnego, jak i białek wektorów owadów w wyciętych jelitach owadów może być używany do badania interakcji między wirusem a owadami-wektorami, funkcji białek owadów i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transmisji wirusa.

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Do wykrywania wewnątrzkomórkowej Wolbachii użyto czterech metod, które wzajemnie się uzupełniały i poprawiały dokładność wykrywania infekcji Wolbachia Aa23 pochodzącej z Aedes albopictus i Aa23-T wyleczonej z rodzimej infekcji Wolbachia za pomocą antybiotyków.

Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.

Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Poznaj metodę lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach mączlika za pomocą immunofluorescencji i ilościowego PCR. Technika umożliwia współlokalizację białek wirusowych i wektora oraz pomiar obciążenia wirusowego.

Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR

Przeglądaj więcej filmów