Name: Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj systematyczny przesiew detergentowy dla kompleksu białkowego receptora GPCR rhodopsyny z mini-G o. Metoda obejmuje chromatografię immunoafinityczną i spektroskopię UV-Vis do oceny stabilności białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. Dr. Gebhardowi F. X. Schertlerowi za jego długoterminowe wsparcie w tym projekcie, Dr. Rogerowi J.P. Dawsonowi i Hoffmann La Roche za wsparcie w hodowli komórkowej. Praca ta była sponsorowana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty 210030_153145 i 310030B_173335 dla GFXS) oraz finansowanie dla CGT przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (EMPSI, 339995) i Radę ds. Badań Medycznych (MRC U105197215). FP uznaje ETH Zürich za pośrednictwem National Center of Competence in Research Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) oraz programów ETH Femtosecond and Attosecond Science and Technology (ETH FAST). FP, JM, AB i CJT dziękują za długoterminowe wsparcie finansowe ze strony Instytutu Paula Scherrera.

UWAGA: Ten protokół badania detergentów jest szczegółowo opisany dla 30 g granulatu komórkowego HEK293 jako materiału wyjściowego.
1. Materiały, chemikalia i odczynniki
UWAGA: Wszystkie roztwory są przygotowywane przy użyciu odczynników klasy analitycznej i ultraczystej wody, która jest oczyszczana z wody dejonizowanej do osiągnięcia rezystywności 18,2 MΩ∙cm w temperaturze 25 °C.
<ol>
	<li>Roztwory zapasów buforowych
	<ol>
		<li>Przygotować 10x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (10x PBS).</li>
		<li>Przygotować bufor HEPES: 1 M, miareczkowany do pH 7,5 za pomocą NaOH.</li>
		<li>Przygotować 5 M NaCl.</li>
		<li>Przygotować 2 M MgCl2, 
		UWAGA: Wszystkie roztwory podstawowe są przepuszczane przez filtr 0,22 μm, aby zachować ich sterylność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory podstawowe detergentów
	<ol>
		<li>Przygotować dodecylmaltozyd (DDM), 10% (w/v).</li>
		<li>Przygotować maltozyd decylu (DM), 10% (w/v).</li>
		<li>Przygotować maltozyd 6-cykloheksylo-heksylu (Cymal-6), 10% (w/v).</li>
		<li>Przygotować maltozyd 5-cykloheksylo-pentylu (Cymal-5), 10% (w/v).</li>
		<li>Przygotować glukozyd nonylowy (C9G), 10% (w/v).</li>
		<li>Przygotować glikol laurylmaltozowo-neopentylowy (LMNG), 5% (w/v).</li>
		<li>Przygotować glikol neopentylowy decylmaltozy (DMNG), 10% (w/v).</li>
		<li>Przygotować glikol neopentylowy cymal-6 (C6NG), 10% (w/v).</li>
		<li>Przygotować glikol neopentylowy cymal-5 (C5NG), 10% (w/v).</li>
		<li>Przygotować glikol oktylowo-glukozowo-neopentylowy (OGNG), 10% (w/v). 
		UWAGA: Aby uzyskać 10% roztwór podstawowy detergentu, rozpuść 1 g proszku detergentowego w ultraczystej wodzie, delikatnie kołysząc, a następnie dostosuj końcową objętość do 10 ml. Roztwór podstawowy detergentu należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania i na lodzie podczas pracy. 
		UWAGA: Detergenty w butelkach są zwykle zalecane do przechowywania w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Butelki zawierające detergent w proszku należy przed otwarciem podgrzać do temperatury pokojowej. Proszek do prania jest higroskopijny, więc wyrównanie temperatury zapobiegnie tworzeniu się kondensacji, która zwilży detergent.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inne chemikalia i odczynniki
	<ol>
		<li>Przygotować żywicę agarozową 1D4 o powinowactwie immunologicznym: 10 ml 50% gnojowicy. 
		UWAGA: Agaroza o powinowactwie immunologicznym 1D4 to kulki agarozy połączone z przeciwciałem monoklonalnym Rho1D4, które wiąże ostatnie 9 aminokwasów rodopsyny bydlęcej TETSQVAPA jako epitop. Agaroza o powinowactwie immunologicznym 1D4 działa jako materiał oczyszczający powinowactwo w celu wychwytywania białek zawierających C-końcową sekwencję 1D4. Ten materiał oczyszczający można przygotować9,11 lub kupić.</li>
		<li>Przygotować 9-cis roztwór siatkówki: 1 mM, rozpuszczony w 100% etanolu. 
		UWAGA: Unikaj ekspozycji na światło siatkówki podczas przygotowywania i przechowywania.</li>
		<li>Przygotować peptyd 1D4 (sekwencja TETSQVAPA): 800 μM, rozpuszczony w wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li> 
	UWAGA: Wszystkie są mieszane z roztworów podstawowych do pożądanego stężenia. Wszystkie są schładzane do temperatury 4 °C przed użyciem.
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor A: PBS, 0,04% DDM.</li>
		<li>Przygotuj bufor B: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,04% DDM.</li>
		<li>Przygotować bufor C: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl i detergent w ich stężeniu roboczym podanym w tabeli 1.</li>
		<li>Przygotuj bufor D: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl.</li>
		<li>Przygotować bufor elucyjny: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 80 μM peptyd 1D4 i detergent w ich stężeniu roboczym.</li>
		<li>Przygotować bufor SEC: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,025% DDM; przefiltrowany przez filtr 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuszczalnik do LC-MS
	<ol>
		<li>Przygotować rozpuszczalnik A: acetonitryl zawierający 0,1% kwasu mrówkowego.</li>
		<li>Przygotować rozpuszczalnik B: ultraczystą wodę zawierającą 0,1% kwasu mrówkowego.</li>
		<li>Przygotować rozpuszczalnik C: izopropanol.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Solubilizacja błony komórkowej i ekstrakcja białek
<ol>
	Rozmrozić 30 g HEK293 GnTI- osad komórkowy wyrażający bydlęcy mutant rodopsyny N2C/M257Y/D282C3,9 do temperatury pokojowej, dodać 120 ml 1x buforu PBS zawierającego koktajl inhibitorów proteazy i homogenizować za pomocą homogenizatora Dounce lub homogenizatora elektrycznego (13 000 obr./min przez 30 s).<li> Zebrać homogenizowaną zawiesinę komórkową do zlewki i dostosować objętość do 150 ml. 
	UWAGA: 30 g osadu komórkowego odpowiada 3 litrom hodowli komórkowej o gęstości 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 10% DDM do homogenizowanych komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 1,25%. Mieszać na lodzie przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 4 °C i 150 000 x g przez 45 minut, aby usunąć nierozpuszczone zanieczyszczenia.</li>
	<li>Przenieść supernatant do butelki o pojemności 500 ml i dodać 10 ml żywicy agarozowej o powinowactwie immunologicznym 1D4 (50% zawiesiny). Delikatnie mieszać rozpuszczony lizat komórkowy i żywicę przez 4 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Załaduj mieszaninę lizatu i żywicy do otwartej kolumny, aby zebrać żywicę.</li>
	<li>Przepłukać żywicę 10 objętościami kolumny (CV) buforu płuczącego A. 
	UWAGA: Objętość kolumny to objętość zapakowanej (100%) użytej żywicy agarozowej. W tym przypadku 1 CV to 5 ml.</li>
	<li>Ponownie zawiesić żywicę za pomocą 2 CV buforu A. 
	UWAGA: Począwszy od kroku 2.8, kroki, które należy wykonać w warunkach słabego światła czerwonego, są oznaczone jako "[Ciemny]" na początku opisu.</li>
	<li>[Ciemny] Dodać 9-cis retinal do zawieszonej żywicy do końcowego stężenia 50 μM. Delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C przez 4-16 godzin w ciemności. 
	UWAGA: Krótszy czas inkubacji może prowadzić do niepełnej rekonstytucji siatkówki.</li>
	<li>[Ciemny] Usuń przepływ z kolumny. Przemyć żywicę buforem A o pojemności 20 CV, a następnie buforem B o pojemności 15 CV.</li>
	<li>[Ciemny] Ponownie zawiesić żywicę w buforze B 2 CV, a następnie podzielić zawiesinę żywicy równo na 10 10-mililitrowych kolumn do usuwania.</li>
	<li>[Ciemny] Usunąć płyn z kolumny, a następnie ponownie zawiesić żywicę w 1 ml buforu C. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>[Ciemny] Powtórz krok 2.11.</li>
	<li>[Ciemny] Usunąć przepływ z kolumny, a następnie ponownie zawiesić żywicę w 0,8 ml buforu elucyjnego dla każdej kolumny. Delikatnie mieszaj przez 2 godziny.</li>
	<li>[Ciemny] Zebrać elucję z kolumny do probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>[Ciemny] Ponownie zawiesić żywicę w 0,7 ml buforu elucyjnego dla każdej kolumny. Delikatnie mieszaj przez 1 godzinę.</li>
	<li>[Ciemny] Zebrać elucję z kolumny do tej samej probówki.</li>
</ol>
3. Spektroskopia UV-VIS
<ol>
	<li>Przygotować spektrofotometr tak, aby obejmował zakres pomiarowy 250-650 nm. Zapisać linię podstawową przy użyciu wody lub buforu elucyjnego.</li>
	<li>[Ciemny] Załaduj wymyte białko do kuwety kwarcowej. Zmierzyć widmo próbki białka.</li>
	<li>[Ciemny] Oświetl białko bezpośrednio w kuwecie przez 2 minuty światłem przepuszczonym przez filtr długoprzepustowy o długości fali 495 nm.</li>
	<li>Zmierzyć widmo oświetlonej próbki.</li>
	<li>Wykonaj ten sam pomiar dla wszystkich próbek białek oczyszczonych w pozostałych 9 detergentach, zarówno w stanie ciemnym, jak i oświetlonym.</li>
	<li>Wykreśl krzywe (absorbancja w funkcji długości fali) na wykresie punktowym X-Y.</li>
</ol>
4. Zautomatyzowana chromatografia wykluczania wielkości rodopsyny i kompleksu rodopsyna-mini-Go
<ol>
	<li>[Ciemne] Koncentrat białka do 100 μl przez odwirowanie przy użyciu koncentratora wirowego z punktem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 30 kDa w temperaturze 4 °C. Nadmiernie skoncentrowane próbki można rozcieńczać, korzystając z przepływu z koncentratora lub buforu C. Aby określić stężenie próbki białka, należy zmierzyć absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru. 
	UWAGA: Począwszy od kroku 4.2, eksperyment nie wymaga ciemnego środowiska, dlatego próbki można przygotować w normalnym świetle.</li>
	<li>Przygotuj 100 μl rodopsyny w stężeniu 0,7 mg/ml dla każdego stanu detergentu.</li>
	<li>Przygotuj 100 μl mieszaniny rodopsyny (0,7 mg/ml) i mini-Go4,12 (0,2 mg/ml) mieszaniny dla każdego stanu detergentu. Uzupełnić mieszaninę o 1 mM MgCl2. Oświetlić mieszaninę światłem z filtra długoprzepustowego o długości fali 495 nm i inkubować przez 30 minut.</li>
	<li>Zamontować żelową kolumnę filtracyjną o pojemności 24 ml z zakresem frakcjonowania 10-600 kDa białka globularnego na oczyszczaczu do chromatografii cieczowej. Zrównoważono kolumnę buforem SEC. 
	UWAGA: Oczyszczacz do chromatografii cieczowej jest wyposażony w automatyczny podajnik próbek, detektor wielu długości fal oraz kolektor frakcji.</li>
	<li>Przenieść próbki do fiolek z automatycznym podajnikiem próbek i umieścić je w tacy na próbki. Zaprogramuj plik metody, aby zautomatyzować sekwencyjne przebiegi SEC dla każdej próbki, przy czym automatyczny podajnik próbek ładuje 77 μl próbki do kolumny, a oczyszczacz wymywa 24 ml buforu SEC przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min na przebieg. Zapisać absorbancję przy 280 nm i 380 nm.</li>
	<li>Zebrać frakcje szczytowe rodopsyny i kompleksu rodopsyna-mini-Go w objętości retencji około 12,9 ml.</li>
	<li>Przeanalizować lewe próbki rodopsyny z kroku 4.2 i frakcje pikowe kompleksu rodopsyna-mini-Go na 4-12% denaturujących żelach gradientowych SDS z niebieskim barwieniem Coomassie.</li>
	<li>Wykreślić chromatogram elucji (A280 lub A380 w funkcji objętości retencyjnej).</li>
</ol>
5. Badanie deglikozylacji i LC-MS
<ol>
	<li>Do badania LC-MS należy używać wyłącznie próbki rodopsyny oczyszczonej w detergencie LMNG.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę 200 μl rodopsyny w stężeniu 1 mg/ml i PNGazy F13 w stężeniu 0,01 mg/ml. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę 200 μl rodopsyny w stężeniu 1 mg/ml i Endo F113 w stężeniu 0,01 mg/ml. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przeanalizuj wynik trawienia za pomocą SDS-PAGE i barwienia na niebiesko Coomassie.</li>
	<li>Skoncentrować próbki rodopsyny poddane obróbce niepoddanej działaniu Endo F1 i poddać oczyszczaniu SEC w buforze D. 
	UWAGA: Ma to na celu przygotowanie próbki z minimalną ilością detergentu do badania LC-MS. Bufor D nie zawiera żadnego detergentu, ale ze względu na powolne tempo uwalniania LMNG z białka błonowego14, rodopsyna nie będzie agregować.</li>
	<li>Zbierz frakcję szczytową przy objętości retencji około 12,9 ml. Zagęścić do 1 mg/ml za pomocą koncentratora wirowego (MWCO 30 kDa).</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μg białka do kolumny Reprosil 200 C18-AQ i wymyć kolumnę metodą gradientu liniowego z udziałem składu rozpuszczalnika i ustawień wymienionych w tabeli 2. Przepływ jest podzielony na 25% dla spektrometru masowego i 75% dla detekcji UV.</li>
</ol>

<ol><li>Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+of+membrane+protein+instability+during+purification+and+crystallisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Practical considerations of membrane protein instability during purification and crystallisation.</a> Methods in Molecular Biology. 601, Clifton, N.J. 187-203 (2010).</li>
<li>Lebon, G., Bennett, K., Jazayeri, A., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilisation+of+an+agonist-bound+conformation+of+the+human+adenosine+A%282A%29+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermostabilisation of an agonist-bound conformation of the human adenosine A(2A) receptor.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (3), 298-310 (2011).</li>
<li>Deupi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+G+protein+binding+site+in+the+structure+of+constitutively+active+metarhodopsin-II%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stabilized G protein binding site in the structure of constitutively active metarhodopsin-II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (1), 119-124 (2012).</li>
<li>Tsai, C. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin+in+complex+with+a+mini-G+o+sheds+light+on+the+principles+of+G+protein+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin in complex with a mini-G o sheds light on the principles of G protein selectivity.</a> Science Advances. 4 (9), (2018).</li>
<li>Carpenter, B., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+minimal+G+protein+to+facilitate+crystallisation+of+G+protein-coupled+receptors+in+their+active+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Engineering a minimal G protein to facilitate crystallisation of G protein-coupled receptors in their active conformation.</a> Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 583-594 (2016).</li>
<li>Chae, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maltose-neopentyl+glycol+%28MNG%29+amphiphiles+for+solubilization%2C+stabilization+and+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins.</a> Nature Methods. 7 (12), 1003-1008 (2010).</li>
<li>Loll, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+detergents+and+crystals%3A+what+is+the+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, detergents and crystals: what is the state of the art.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (12), 1576-1583 (2014).</li>
<li>Chae, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-neopentyl+glycol+%28GNG%29+amphiphiles+for+membrane+protein+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications%22%5BJournal%5D)">Glucose-neopentyl glycol (GNG) amphiphiles for membrane protein study.</a> Chemical communications. 49 (23), Cambridge, England. 2287-2289 (2013).</li>
<li>Standfuss, J., Xie, G., Edwards, P. C., Burghammer, M., Oprian, D. D., Schertler, G. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+thermally+stable+rhodopsin+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a thermally stable rhodopsin mutant.</a> Journal of Molecular Biology. 372 (5), 1179-1188 (2007).</li>
<li>Kaushal, S., Ridge, K. D., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin%3A+the+role+of+asparagine-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin: the role of asparagine-linked glycosylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (9), 4024-4028 (1994).</li>
<li>Molday, L. L., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D4%3A+a+versatile+epitope+tag+for+the+purification+and+characterization+of+expressed+membrane+and+soluble+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">1D4: a versatile epitope tag for the purification and characterization of expressed membrane and soluble proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1177 (604), Clifton, N.J. 1-15 (2014).</li>
<li>Carpenter, B., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Mini+G+Proteins+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Mini G Proteins from Escherichia coli.</a> Bio-Protocol. 7 (8), (2017).</li>
<li>Grueninger-Leitch, F., D'Arcy, A., D'Arcy, B., Chène, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deglycosylation+of+proteins+for+crystallization+using+recombinant+fusion+protein+glycosidases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Deglycosylation of proteins for crystallization using recombinant fusion protein glycosidases.</a> Protein Science. 5 (12), 2617-2622 (1996).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).</li>
<li>Loginova, M. Y., Rostovtseva, Y. V., Feldman, T. B., Ostrovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+damaging+action+of+all-trans-retinal+and+its+derivatives+on+rhodopsin+molecules+in+the+photoreceptor+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Light damaging action of all-trans-retinal and its derivatives on rhodopsin molecules in the photoreceptor membrane.</a> Biochemistry (Moscow). 73 (2), 130-138 (2008).</li>
<li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+Fluorescent+Thermal+Stability+Assay+for+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li>
<li>Sonoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+Membrane+Protein+Detergent+Stability+for+Improving+Throughput+of+High-Resolution+X-ray+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Benchmarking Membrane Protein Detergent Stability for Improving Throughput of High-Resolution X-ray Structures.</a> Structure. 19 (1), 17-25 (2011).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+scale+preparation+of+a+stable+GPCR+signaling+complex+between+constitutively+active+rhodopsin+and+G-protein%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Crystallization scale preparation of a stable GPCR signaling complex between constitutively active rhodopsin and G-protein.</a> PloS One. 9 (6), 98714(2014).</li>
<li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening%3A+BRET+versus+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).</li>
<li>Singhal, A., Guo, Y., Matkovic, M., Schertler, G., Deupi, X., Yan, E. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+role+of+the+T+94+I+rhodopsin+mutation+in+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Report%22%5BJournal%5D)">Structural role of the T 94 I rhodopsin mutation in congenital stationary night blindness.</a> EMBO Report. 17 (10), 1-10 (2016).</li>
<li>Choe, H. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+metarhodopsin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of metarhodopsin II.</a> Nature. 471 (7340), 651-655 (2011).</li>
<li>Mattle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+channel+in+pharmacologically+stabilized+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ligand channel in pharmacologically stabilized rhodopsin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3640-3645 (2018).</li>
<li>Okada, T., Fujiyoshi, Y., Silow, M., Navarro, J., Landau, E. M., Shichida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+internal+water+molecules+in+rhodopsin+revealed+by+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed by X-ray crystallography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 5982-5987 (2002).</li>
<li>Blankenship, E., Vahedi-Faridi, A., Lodowski, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+High-Resolution+Structure+of+Activated+Opsin+Reveals+a+Conserved+Solvent+Network+in+the+Transmembrane+Region+Essential+for+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The High-Resolution Structure of Activated Opsin Reveals a Conserved Solvent Network in the Transmembrane Region Essential for Activation.</a> Structure. 23 (12), 2358-2364 (2015).</li>
<li>Magnani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutagenesis+and+screening+strategy+to+generate+optimally+thermostabilized+membrane+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A mutagenesis and screening strategy to generate optimally thermostabilized membrane proteins for structural studies.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1554-1571 (2016).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), London, England: 1993 673-681 (2006).</li>
<li>Standfuss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+agonist-induced+activation+in+constitutively+active+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin.</a> Nature. 471 (7340), 656-660 (2011).</li>
<li>Singhal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+congenital+stationary+night+blindness+based+on+the+structure+of+G90D+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Insights into congenital stationary night blindness based on the structure of G90D rhodopsin.</a> EMBO reports. 14 (6), 520-526 (2013).</li>
<li>Carpenter, B., Nehmé, R., Warne, T., Leslie, A. G. W., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+adenosine+A%282A%29+receptor+bound+to+an+engineered+G+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the adenosine A(2A) receptor bound to an engineered G protein.</a> Nature. 536 (7614), 104-107 (2016).</li>
</ol>

CGT jest konsultantem i członkiem Naukowej Rady Doradczej Sosei Heptares. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sukces w krystalizacji białek w dużym stopniu zależy od próbki białka, zwłaszcza białek błonowych i ich kompleksów ze względu na powikłania spowodowane przez detergenty. Niniejszy raport przedstawia badania przesiewowe detergentów i ocenę jakości próbki pod kątem kompleksów sygnalizacyjnych białka GPCR-mini-G. Do badania właściwości biochemicznych białek błonowych szeroko stosuje się różne metody, na przykład test termostabilności przy użyciu barwników fluorescencyjnych16,17, test wiązania w celu wykrycia tworzenia kompleksów poprzez pomiar zmiany sygnału fluorescencji tryptofanu18 lub transfer energii rezonansowej za pomocą bioczujników19. Jednak środowiska chemiczne stosowane w tych metodach są zupełnie inne niż te używane do przygotowania próbki krystalicznej, albo białka mają tysiąc razy niższe stężenie do pomiaru opartego na fluorescencji, albo białka są osadzone w dwuwarstwach lipidowych lub w jednym ustalonym stanie detergentu. W tym protokole stosowane metody są również ustandaryzowane w przygotowaniu próbek na dużą skalę przed krystalizacją. Dzięki temu zoptymalizowane parametry można łatwo przenieść w celu przygotowania skali krystalizacyjnej bez dalszego większego przesiewania i optymalizacji.
Celem tego protokołu jest optymalizacja przygotowania stabilnego i jednorodnego kompleksu białkowego GPCR–mini-G do krystalizacji dyfuzji parowej i określania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Protokół integruje zestaw metod do jakościowej oceny wpływu detergentu i deglikozylacji podczas przygotowywania kompleksu rodopsyna-mini-Go. Rodopsyna w stanie nieaktywnym i aktywowanym światłem, związana z peptydem transducyny i bez niego, uległa krystalizacji po oczyszczeniu w detergentach glukozydu oktylu (C8G)20,21,22 i C9G23,24. Ponieważ kompleks rodopsyna-mini-Go oczyszczony w C8G i C9G nie dawał kryształów (dane nie pokazane), następnie zbadaliśmy szerszą gamę innych detergentów, stosując opisaną strategię (ryc. 1). Wykorzystując wrażliwość rodopsyny na światło, możemy bardzo dobrze śledzić rekonstytucję siatkówki przy długościach fal innych niż 280 nm. Zarówno w spektroskopii UV-VIS, jak i w SEC, wykryliśmy siatkówkę przy 380 nm lub 488 nm. Jednak większość białek błonowych nie ma tak wygodnego chromoforu, aby śledzić funkcjonalność podczas oczyszczania. Inne opcje to uczynienie liganda wykrywalnym przez dodanie wykrywalnego w świetle chromoforu lub za pomocą testów wiązania radioligandów i przesunięcia termicznego25.
Rodopsyna ma masę cząsteczkową 40 kDa. Ze względu na masę detergentu, który wiąże, jego pozorna masa cząsteczkowa na SEC wynosi około 120 kDa. Nie jest więc niespodzianką, że wiązanie mini-Go (24 kDa) nie było łatwe do wykrycia na SEC, ponieważ wymagałoby to różnicowania białek o pozornych masach 120 kDa i 144 kDa. Analiza frakcji SEC za pomocą SDS-PAGE została zatem wykorzystana do potwierdzenia czystości próbki i tworzenia kompleksu. Nawet jeśli profile SEC wykazują wyraźną zmianę po tworzeniu kompleksu, nadal zaleca się przeprowadzenie analizy SDS-PAGE w celu potwierdzenia tworzenia kompleksu z odpowiednimi partnerami wiążącymi, a nie innymi współoczyszczonymi zanieczyszczeniami białkowymi.
Zarówno rodopsyna, jak i mini-Go zostały oczyszczone w ilościach miligramowych, co pozwoliło na zastosowanie detekcji kompleksów o niskiej czułości, takiej jak absorpcja UV-VIS podczas SEC i barwienie Commassie Blue żeli SDS-PAGE. Tam, gdzie próbki są ograniczone, należy zastosować bardziej czułe wykrywanie, takie jak oczyszczacz LC wyposażony w detektor fluorescencyjny do śledzenia sygnałów tryptofanu z białka (wzbudzenie 280 nm, emisja 350 nm) oraz barwienie srebrem w przypadku żeli SDS-PAGE. Innym podejściem byłoby połączenie białka fluorescencyjnego, takiego jak białko zielonej fluorescencji (GFP) z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, co również umożliwiłoby wykrycie nawet podczas ekspresji białka26 , ale powinno zostać usunięte przed krystalizacją.
Konieczne jest zapewnienie, aby oczyszczone białko było również wolne od niejednorodności wynikającej ze zmiennych PTM. W opisanym tutaj przypadku dwie populacje rodopsyny obserwowane na żelach SDS-PAGE zostały scharakteryzowane jako zawierające jeden lub dwa N-glikany. Zmienna modyfikacja białka potencjalnie zapobiegłaby tworzeniu się dobrze dyfrakcyjnych kryształów, dlatego deglikozylujemy rodopsynę. Endoglikozydaza Endo F1 była najbardziej efektywną endoglikozydazą testowaną i leczenie doprowadziło do powstania pojedynczego gatunku receptora nieglikozylowanego, podczas gdy PNGaza F tylko częściowo usunęła glikany na rodopsynę i spowodowała mieszaninę rodopsyny w pełni niezluzylowaną lub z jednym N-glikanem pozostał. Rodopsyna bez leczenia deglikozylazą została pomyślnie skrystalizowana 3,27,28, a N-glikan na rodopsynie Asn15 jest ważny dla utworzenia kontaktu kryształów w tych przypadkach. W przypadku rodopsyny-mini-Go konieczne jest usunięcie N-glikanów za pomocą Endo F1 w celu uzyskania kryształów. Nie ma ustandaryzowanej zasady deglikozylacji białek będących przedmiotem zainteresowania przed krystalizacją, ale usunięcie heterogenicznych PTM powinno być brane pod uwagę, gdy białka nie krystalizują po szeroko zakrojonych próbach krystalizacji.
Opisane tutaj dane i metodologia skłoniły nas do wyboru OGNG jako najbardziej preferowanego detergentu do krystalizacji kompleksu rodopsyna-mini-Go ze względu na mały rozmiar miceli i zdolność do stabilizacji kompleksu. Użyliśmy również Endo F1, aby upewnić się, że oczyszczona rodopsyna jest jednorodnym gatunkiem. Następnie uzyskano kryształy i określiliśmy strukturę krystaliczną na ~3,1 A4, co było dopiero trzecią strukturą krystaliczną kompleksu sygnalizacyjnego białka GPCR-G14,29.
W przypadku białek błonowych związanych z białkiem partnerskim i bez niego, należy je traktować jako dwa różne białka. Białko w różnych stanach funkcjonalnych ma różne konformacje i znajduje się na różnym poziomie energetycznym. Dlatego zaleca się optymalizację protokołu przygotowania dla każdego stanu funkcjonalnego, ponieważ parametr dla stanu nieaktywnego może nie być w pełni przeniesiony do stanu aktywowanego. Nie wspominając już o zmianie właściwości białka skomplikowanej przez wiązanie białka partnerskiego. W protokole wykorzystano metody, które są znormalizowane do przygotowania próbki krystalizacji w celu przygotowania nieaktywnego białka błonowego w różnych detergentach, a następnie aktywacji białka i tworzenia kompleksu oraz scharakteryzowania jakości białka. W związku z tym protokół ten można łatwo uogólnić na inne białka błonowe i ich kompleksy do badań strukturalnych z niewielkimi modyfikacjami.

Określanie struktur krystalicznych białek błonowych i ich kompleksów zawsze było wyzwaniem ze względu na trudności w uzyskaniu dobrze dyfrakcyjnych kryształów. W przeciwieństwie do białek rozpuszczalnych, integralne białka błonowe składają się z hydrofobowego rdzenia, który obejmuje błonę komórkową. Aby usunąć białka błonowe z błony komórkowej do buforu wodnego, należy użyć detergentów, aby utworzyć micelię detergentowo-białkową, zastępując w ten sposób lipidy wokół hydrofobowego rdzenia białek błonowych. Stabilność, aktywność i integralność białek błonowych są bezpośrednio zależne od właściwości chemicznych i strukturalnych detergentu1, a właściwości detergentu określają również wielkość miceli. Duża micela detergentowa może zasłaniać hydrofilowe powierzchnie małego białka błonowego, zapobiegając w ten sposób krystalizacji z powodu braku kontaktów kryształów podczas stosowania metody dyfuzji parowej. Mała micela detergentu jest korzystna dla krystalografii, ale detergenty o krótkich łańcuchach są zwykle ostrzejsze i dlatego prowadzą do destabilizacji i agregacji białka błonowego. Dlatego przed krystalizacją niezbędna jest dodatkowa procedura przesiewania detergentów, zwykle ukierunkowana na krótsze detergenty, które nadal zachowują stabilność białka.
G receptory sprzężone z białkiem (GPCRs) są integralnymi białkami błonowymi zawierającymi siedem transbłonowych a-helis. GPCR występują w dwóch głównych stanach, albo stanie nieaktywnym stabilizowanym przez odwrotnych agonistów lub antagonistów, albo w stanie aktywnym związanym z agonistą i stabilizowanym przez białko G, chociaż jest prawdopodobne, że między tymi dwoma skrajnościami istnieje wiele podstanów. Określanie struktury GPCR początkowo koncentrowało się na stanach nieaktywnych związanych z odwrotnymi agonistami i antagonistami ze względu na ich wyższą stabilność niż stany aktywne2. Kiedy GPCR są aktywowane po związaniu agonisty, receptory są bardzo dynamiczne, a szczelina tworzy się przejściowo na cytoplazmatycznej powierzchni receptora dla sprzężenia białka G. Uważa się, że ta dynamika jest powodem, dla którego GPCR związane z agonistą są często bardziej niestabilne niż stan nieaktywny. W związku z tym konieczne staje się przeprowadzenie badań przesiewowych w poszukiwaniu detergentów odpowiednich dla stanu konformacyjnego badanego receptora, ponieważ jest prawdopodobne, że do badania stanu aktywnego wymagane będą łagodniejsze detergenty w porównaniu ze stanem nieaktywnym.
W tym raporcie używamy wizualnego GPCR, rodopsyny bydlęcej3, oraz jej kompleksu z białkiem mini-Go4,5 dla eksperymentów z kontrolą detergentów, reprezentujących odpowiednio stan nieaktywny i aktywny. Badania przesiewowe detergentów koncentrowały się na klasycznych detergentach alkilomaltozydowych i glukozydowych oraz detergentach z glikolem neopentylowym (NPG). W tym kontekście, klasyczny detergent jest zbudowany z grupy głowicy cukrowej i łańcucha alkilowego, podczas gdy detergenty typu NPG zawierają dwa identyczne klasyczne detergenty, które są stopione przez czwartorzędowy węgiel na granicy między cukrami a łańcuchami alkilowymi6,7,8.
Zaprojektowano eksperymentalny przepływ pracy, zaczynając od oczyszczania rodopsyny w różnych detergentach, następnie tworzenia kompleksu rodopsyna-mini-Go, a kończąc na charakterystyce kompleksu przy użyciu kilku metod (Rysunek 1). W przypadku stanu nieaktywnego rodopsyny rekonstytucję światłoczułego liganda 9-cis siatkówki monitorowano za pomocą spektroskopii w ultrafiolecie widzialnym (UV-VIS). Widmo ujawnia stan fizykochemiczny siatkówki i wskazuje na jej środowisko w kieszeni wiążącej siatkówkę rodopsyny. Chromatografię wykluczania wielkości (SEC) zastosowano do oceny monodyspersyjności oczyszczonej rodopsyny, a także tworzenia kompleksu rodopsyna-mini-Go. Ponieważ SEC różnicuje cząsteczki białek na podstawie ich wielkości i kształtu, zagregowaną populację białek można zidentyfikować, gdy eluują w pustej przestrzeni. Aby potwierdzić tworzenie kompleksu, frakcje z SEC oceniano za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) w celu potwierdzenia obecności zarówno rodopsyny, jak i mini-Go.
Kolejnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, są modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek błonowych. PTM, takie jak N-glikozylacja, są często obserwowane na eukariotycznych białkach błonowych wytwarzanych w systemach ekspresji komórek ssaków i owadów. Ograniczony szczep N-glikozylacji ludzkich embrionalnych komórek nerki 293 (HEK293) został opracowany przez delecję genu kodującego N-acetyloglukozaminylotransferazę I (GnTI), co spowodowało jednorodną N-glikozylację przez GlcNAc2Man5 w miejscu konsensusu Asn-X-Ser/Thr. Chociaż N-glikozylacji można zapobiec poprzez mutację reszty aminokwasowej w miejscu konsensusu, może to również zmienić funkcję białka lub wydajność fałdowania. U rodopsyny bydlęcej mutacja N-glikozylowanej reszty Asn15 prowadzi do nieprawidłowego fałdowania i zmniejszonej aktywacji białka G9,10. Rodopsyna użyta w tym raporcie uległa ekspresji w linii komórkowej z niedoborem HEK 293 GnTI. Jednak SDS-PAGE wykazał obecność dwóch gatunków rodopsyny. Ta niejednorodność może zapobiec tworzeniu się kryształów i dlatego przetestowano deglikozylację przy użyciu peptyd-N-glikozydazy F (PNGazy F) i endoglikozydazy F1 (Endo F1). Deglikozylowany produkt scharakteryzowano za pomocą SDS-PAGE i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) w celu określenia poziomu glikozylacji i jej jednorodności.

<table><tbody><tr><td>Peptyd 1D4</td><td>Peptide2.0</td><td>Na żądanie</td><td></td></tr><tr><td>9-cis siatkówka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler A-900</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Wycofano</td></tr><tr><td>C9G</td><td>Anatrace</td><td>N324</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, koktajl inhibitora proteazy wolny od EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Cymal-5</td><td>Anatrace</td><td>C325</td><td></td></tr><tr><td>Cymal-5NG</td><td>Anatrace</td><td>NG325</td><td></td></tr><tr><td>Cymal-6</td><td>Anatrace</td><td>C326</td><td></td></tr><tr><td>Cymal-6NG</td><td>Anatrace</td><td>NG326</td><td></td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>DM</td><td>Anatrace</td><td>D322</td><td></td></tr><tr><td>DMNG</td><td>Anatrace</td><td>NG322</td><td></td></tr><tr><td>Econo kolumna</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>7372512</tr><tr><td>Ettan LC</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>wycofane</td></tr><tr><td>FRAC-950</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>wycofane</td></tr><tr><td>z produkcji Moduł separacji HPLC Water 2795</td><td>Waters AG</td><td>720000358EN</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue Protein Stain</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LCT Premier spektrometr masowy (ESI-TOF)</td><td>Waters AG</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>LMNG</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td></td></tr><tr><td>Monitor UV-900</td><td>GE Healthcare</td><td>18110835</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Witec AG/ThermoFisher</td><td></td><td>Wycofane</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris żel 1,0 mm, 15 dołków</td><td>Bufor ThermoFisher</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS (20x)</td><td>ThermoFisher</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>OGNG</td><td>Anatrace</td><td>NG311</td><td></td></tr><tr><td>PAGEr Komora Miniżelowa</td><td>Lonza</td><td>59905</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil 200 Kolumna C18-AQ</td><td>Morvay Analytik GmbH</td><td>#s1503</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Zwiększ kolumnę GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa 5424R</td><td>Ultrawirówka Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-100</td><td>Redlica Beckmann</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr>Spektrofotometr <td>UV-VIS ULTRA-TURRAX T25</td><td>IKA WERKE</td><td>0003725003</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shimadzu</td><td>UV-2401PC</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2487 Dual &lambda; Detektor absorbancji</td><td>Waters AG-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej gpcr-mini-g w celu pomyślnej krystalizacji

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Kluczem do określenia struktur krystalicznych kompleksów białek błonowych jest jakość próbki przed krystalizacją. W szczególności wybór detergentu ma kluczowe znaczenie, ponieważ wpływa on zarówno na stabilność, jak i monodyspersyjność kompleksu. Niedawno określiliśmy strukturę krystaliczną stanu aktywnego rodopsyny bydlęcej sprzężonej ze zmodyfikowanym białkiem G, mini-Go, w rozdzielczości 3,1 A. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę optymalizacji przygotowania kompleksu rodopsyna-mini-Go. Rodopsynę w stanie ciemnym przygotowano w detergentach klasycznych i glikolu neopentylowego (NPG), a następnie w wyniku seansu złożonego z mini-Go pod wpływem światła. Stabilność rodopsyny oceniano za pomocą spektroskopii w ultrafiolecie widzialnym (UV-VIS), która monitoruje rekonstytucję w rodopsynę światłoczułego liganda 9-cis retinala. Zautomatyzowaną chromatografię wykluczania wielkości (SEC) wykorzystano do scharakteryzowania monodyspersyjności rodopsyny i kompleksu rodopsyna-mini-Go. Elektroforeza poliakryloamidowa SDS (SDS-PAGE) potwierdziła powstanie kompleksu, identyfikując stosunek molowy 1:1 między rodopsyną a mini-Go po zabarwieniu żelu błękitem Coomassie. Po przekrojowej walidacji wszystkich tych danych analitycznych wyeliminowaliśmy nieodpowiednie detergenty i kontynuowaliśmy prace nad najlepszym kandydatem na detergent do przygotowania i krystalizacji na dużą skalę. Dodatkowym problemem była niejednorodność N-glikozylacji. Na SDS-PAGE zaobserwowano, że rodopsyna o niejednorodnej ekspresji ma dwie różne populacje N-glikozylowane, co prawdopodobnie utrudniałoby krystalogenezę. W związku z tym testowano różne enzymy deglikozylacji, a endoglikozydaza F1 (EndoF1) wytwarzała rodopsynę z jednym gatunkiem N-glikozylacji. Dzięki temu strategicznemu procesowi charakteryzowania jakości białek, przygotowanie kompleksu rodopsyna-mini-Go zostało zoptymalizowane w celu uzyskania struktury krystalicznej. Była to dopiero trzecia struktura krystaliczna kompleksu sygnalizacyjnego białka GPCR-G. Podejście to można również uogólnić na inne białka błonowe i ich kompleksy, aby ułatwić przygotowanie próbki i określenie struktury.

Przebieg eksperymentalny przygotowania i analizy próbek został podsumowany na Rysunku 1. Wykorzystanie otwartych kolumn do małoscale'owej oczyszczania powinowactwem pozwoliło nam na równoległe przygotowanie próbek w wielu różnych warunkach detergentowych (Rysunek 1A). Taki układ oczyszczania w małej skali dostarczył wystarczającej ilości białka do dalszych analiz z wykorzystaniem spektroskopii UV-VIS, SEC oraz SDS-PAGE (Rysunek 1B-C).
Spektroskopia UV-VIS ujawniła stabilność rodopsyny 
Stabilność rodopsyny zrekonstytuowanej z retinalem oceniono na podstawie jej absorbancji optycznej (Rysunek 2). W stanie ciemnym 9-cis-retinal jest kowalencyjnie związany z Lys296 w formie protonowanej zasady Schiffa. Po naświetleniu 9-cis-retinal ulega izomeryzacji do izoformy all-trans, a wiązanie zasady Schiffa ulega deprotonowaniu. Protonowany 9-cis-retinal daje pik absorpcji przy 488 nm, podczas gdy deprotonowany all-trans-retinal ma pik przy 380 nm. Widma UV-VIS rodopsyny w DDM wykazały typową absorpcję rodopsyny związanej z 9-cis-retinalem oraz rodopsyny aktywowanej światłem, gdzie wyraźnie zaobserwowano przesunięcie w stronę niebieską o 108 nm przy zbliżonej gęstości optycznej (Rysunek 2A, górny lewy panel). Gdy rodopsyna ulega destabilizacji, kieszeń wiążąca retinal ulega zmianie, co prowadzi do deprotonowania, a być może również do dysocjacji retinalu. Jeśli tak się stanie, widmo wykazuje wkład wynikający z deprotonowania, a także obecność wolnej formy retinalu15. W związku z tym wydajność rekonstytucji retinalu w rodopsynie określono na podstawie stosunku absorbancji białka (280 nm) do absorbancji retinalu (488 nm dla protonowanego 9-cis-retinalu, 380 nm dla deprotonowanego all-trans-retinalu) (Rysunek 2B). Próbki rodopsyny oczyszczone w klasycznych detergentach (DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, C9G) wykazują taki sam profil optyczny. Jednak próbki oczyszczone w detergentach NPG (LMNG, DMNG, Cymal-6NG, Cymal-5NG) wykazują profile optyczne sugerujące suboptymalne środowisko wiązania retinalu, z wyjątkiem próbki OGNG, która dała taki sam profil optyczny jak próbka DDM.
Chromatografia wykluczania oceniła czystość próbek i monodyspersyjność białka. 
SEC jest wydajnym i niezawodnym narzędziem analitycznym do oceny próbek białek podczas przygotowania i przesiewania. Pozwala ona zweryfikować czystość próbek z poprzedniego etapu oczyszczania, a także monodyspersyjność cząsteczek białka. W przypadku rodopsyny i jej kompleksu z mini-Go jakość próbek interpretowano na podstawie krzywych absorpcji przy 280 nm i 380 nm (Rysunek 3A). Sygnały przy 280 nm wskazywały na obecność białka, a sygnał przy 380 nm na obecność retinalu. Wszelkie sygnały pojawiające się w objętości martwej (około 8 mL przy zastosowaniu tej kolumny) przypisano agregatom białkowym. Wyniki wykazały zatem, że próbki przygotowane w klasycznych detergentach znajdowały się w stanie monodyspersyjnym, z wyjątkiem C9G, w której pojawiła się pewna frakcja agregatów. W przeciwieństwie do nich, próbki przygotowane przy użyciu detergentów typu NPG zawierały znacznie więcej agregatów niż próbka C9G; LMNG i Cymal-6NG prowadziły do największego tworzenia agregatów, natomiast mniej agregatów zaobserwowano w DMNG i Cymal-5NG. Wyjątek stanowił OGNG, który wykazał profil podobny do DDM. Agregaty białkowe eluujące w objętości martwej charakteryzowały się również gorszym stopniem nasycenia retinalem, co wykazał stosunek A280/A380, który wzrósł w porównaniu do piku przy objętości retencyjnej ~12,9 mL odpowiadającego 135 kDa. Inną zaobserwowaną cechą było to, że zarówno rodopsyna, jak i kompleks rodopsyna–mini-Go eluowały przy zbliżonej objętości retencyjnej (Rysunek 3B). Jest to spodziewane, ponieważ pozorna masa cząsteczkowa rodopsyny związanej z detergentem wynosiła 120 kDa, a kompleksu rodopsyna–mini-Go 144 kDa. W związku z tym nie mogliśmy stwierdzić tworzenia kompleksu wyłącznie na podstawie danych SEC, dlatego do dalszej analizy próbek oczyszczonych metodą SEC wykorzystano SDS-PAGE.
Potwierdzenie tworzenia kompleksu za pomocą SDS-PAGE 
SDS-PAGE jest standardową metodą identyfikacji komponentów białkowych w próbce. Skoncentrowana rodopsyna (przed oczyszczaniem metodą SEC) została poddana analizie SDS-PAGE w celu potwierdzenia jej czystości, co wykazało dwa prążki w okolicach 37 kDa oraz rozmazany prążek powyżej 50 kDa (Rysunek 4A). Później potwierdzono, że dwa dolne prążki odpowiadają różnym stanom N-glikozylacji. Prążek powyżej 50 kDa zinterpretowano jako agregaty oligomerów rodopsyny wywołane przez bufor do próbek SDS-PAGE, ponieważ agregatów tych nie zaobserwowano w SEC ani w żadnych innych metodach detekcji. Ponieważ dane z SEC nie mogły potwierdzić tworzenia kompleksu, analizie SDS-PAGE poddano frakcje elucyjne z próbek rodopsyna–mini-Go. SDS-PAGE wykazała prążki białkowe zarówno rodopsyny, jak i mini-Go we wszystkich zastosowanych warunkach detergentowych, co sugeruje, że kompleks tworzył się niezależnie od wyboru detergentu (Rysunek 4B).
Spektrometria LC-MS zidentyfikowała wzór N-glikozylacji rodopsyny 
Próbki rodopsyny uzyskane zarówno poprzez oczyszczanie powinowactwem, jak i SEC, wykazały dwa prążki białkowe o pozornej masie cząsteczkowej około 37 kDa w żelu SDS-PAGE, których nie udało się rozdzielić za pomocą SEC przy użyciu kolumny o objętości 24 mL. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem były różne wzorce N-glikozylacji heterologicznie ekspresowanej rodopsyny z komórek HEK 293 GnTI-. W związku z tym przetestowano dwa enzymy, PNGazę F oraz Endo F1, pod kątem ich zdolności do deglikozylacji rodopsyny. Dane z SDS-PAGE wykazały, że Endo F1 zredukowała masę cząsteczkową obu prążków białkowych do pojedynczego produktu, podczas gdy trawienie PNGazą F nadal dawało dwie populacje (Rycina 5A). Próbki nietrawione oraz traktowane Endo F1 przeanalizowano za pomocą spektrometrii LC-MS w celu zidentyfikowania mas różnych gatunków. Dane wykazały, że rodopsyna produkowana w komórkach HEK 293 GnTI- zawierała jeden lub dwa N-glikany, z różnicą masy wynoszącą 1014±1 Da. Rodopsyna traktowana Endo F1 nie zawierała żadnych N-glikanów i wykazywała różnicę masy 2027±1 Da w porównaniu do rodopsyny zawierającej dwa N-glikany. Wyniki te są spójne z brakiem enzymu N-acetyloglukozaminylotransferazy I w linii komórkowej użytej do ekspresji rodopsyny, co skutkuje tym, że wszystkie N-glikany mają strukturę GlcNAc2Man5 (masa 1014 Da).
<img alt="Schemat procesu przygotowania i analizy próbek rodopsyny za pomocą UV-VIS, SEC, LC-MS i SDS-PAGE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60747/60747fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie i charakterystyka próbek do eksperymentu z przesiewaniem detergentów. (A) Przygotowanie próbek rodopsyny w różnych detergentach podczas oczyszczania. (B) Metody zastosowane w protokole: spektroskopia UV-VIS, chromatografia wykluczania (SEC), SDS-PAGE oraz chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas (LC-MS). (C) Schemat eksperymentalny charakterystyki rodopsyny, kompleksu rodopsyna–mini-Go oraz produktu deglikozylacji rodopsyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60747/60747fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza spektroskopowa, widma absorbancji detergentów, schemat porównujący detergenty klasyczne i typu NPG." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60747/60747fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Spektroskopia UV-VIS rodopsyny. (A) Widma UV-VIS rodopsyny. Widma rodopsyny związanej z 9-cis-retinalem w stanie ciemnym przedstawiono niebieskimi krzywymi. Po naświetleniu 9-cis-retinal ulega deprotonowaniu i izomeryzacji do all-trans-retinalu; widma naświetlonej rodopsyny przedstawiono czerwonymi krzywymi. Wstawki prezentują strukturę chemiczną każdego z detergentów. (B) Stosunki A280/A488 (niebieski słupek) oraz A280/A380 (czerwony słupek) obrazują odpowiednio stabilność rodopsyny w stanie ciemnym i stanie jasnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60747/60747fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Solubilizacja detergentem na chromatogramach absorpcyjnych UV; kompleksy rodopsyny, klasyczne vs. NPG." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60747/60747fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Profile chromatografii wykluczania molekularnego rodopsyny i kompleksu rodopsyna–mini-Go oczyszczonych w 10 różnych detergentach. (A) Panel lewy przedstawia profile SEC próbek oczyszczonych w detergentach klasycznych. Panel prawy przedstawia profile SEC próbek oczyszczonych w detergentach typu NPG. Profil standardowych białek markerowych pokazano jako nałożony na próbkę z DDM. Interpretacja profili piku została przedstawiona dla DMNG, przy czym idealny scenariusz (brak agregatów) widoczny jest dla DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 i OGNG. (B) Powiększony profil próbki z OGNG w czasie retencji 12-14 mL. Wszystkie próbki analizowano przy użyciu kolumny Superdex200 Increase 10/300 GL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60747/60747fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Elektroforeza żelu rodopsyny oczyszczonej metodą powinowactwa; prążki oznaczone rodopsyną/mini-Go oczyszczoną metodą SEC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60747/60747fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza SDS-PAGE rodopsyny i kompleksu rodopsyna/mini-Go. (A) Próbki rodopsyny oczyszczone w detergentach. Rozmyty prążek powyżej 50 kDa przypisuje się oligomerom rodopsyny zagregowanym pod wpływem buforu do próbek SDS-PAGE. (B) Próbki kompleksu rodopsyna/mini-Go oczyszczone metodą SEC. Przedstawiono rodopsynę z 1 i 2 N-glikanami oraz mini-Go. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60747/60747fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="SDS-PAGE i spektrometria mas rhodopsyny; analiza glikozylacji, wyniki oczyszczania białka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60747/60747fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Identyfikacja glikozylacji w rhodopsynie. (A) Analiza SDS-PAGE odglikozylowanej rhodopsyny przy użyciu PNGase F i Endo F1. (B) Widma LC-MS rhodopsyny bez (panel górny) i po odglikozylowaniu przez Endo F1 (panel dolny). W celu przygotowania kompleksu rhodopsyna–mini-Go do krystalizacji wybrano Endo F1 zamiast PNGase F, ponieważ Endo F1 pozwoliło na uzyskanie jednego, jednorodnego gatunku rhodopsyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60747/60747fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Stężenie robocze (%)</td>
			<td>Krytyczne stężenie micelarne (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>0.025</td>
			<td>0.0087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cymal-6</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cymal-5</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C9G</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMNG</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.0034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cymal-6NG</td>
			<td>0.015</td>
			<td>Brak danych; powinno być niższe niż 0,056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cymal-5NG</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.0056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OGNG</td>
			<td>0.15</td>
			<td>0.058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Stężenia detergentów w buforze C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>Rozpuszczalnik A (%)</td>
			<td>Rozpuszczalnik B (%)</td>
			<td>Rozpuszczalnik C (%)</td>
			<td>Szybkość przepływu (ml/min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>95</td>
			<td>5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>95</td>
			<td>5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>75</td>
			<td>5</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>85</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26</td>
			<td>90</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>90</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Parametry elucji z kolumny.

Ten raport opisuje badanie przesiewowe różnych detergentów do przygotowania wizualnego GPCR, rodopsyny i jej kompleksu z mini-Go. Przedstawiono metody biochemiczne charakteryzujące jakość kompleksu na różnych etapach oczyszczania. Protokół ten można uogólnić na inne kompleksy białek błonowych dla ich przyszłych badań strukturalnych.

Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Transdukcja sygnału jest jednym z najważniejszych tematów w badaniach biologicznych i farmaceutycznych. Wymaga białek błonowych do przekazywania sygnałów do białka partnera sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Protokół ten ma na celu przeprowadzanie systematycznego badania przesiewowego detergentów w celu przygotowania kompleksu sygnalizacyjnego mającego na celu określenie struktury.Protokół ten wykorzystuje powszechnie dostępne techniki w uznanym laboratorium biologicznym i może być łatwo wykonany przez początkujących w tej dziedzinie. Skomponowaliśmy te metody, aby znaleźć najbardziej krytyczny parametr w przygotowaniu kompleksu białek błonowych. Na początek rozmrozić 30 gramów HEK293 GNT z niedoborem komórek do temperatury pokojowej i przenieść do zlewki.Dodać 120 mililitrów buforu PBS zawierającego koktajl inhibitorów proteazy i homogenicznych za pomocą homogenizatora Dounce lub homogenizatora elektrycznego przy 13 000 obr./min przez 30 sekund. Dostosuj głośność do 150 mililitrów za pomocą bufora PBS. Delikatnie dodaj 10% DDM do homogenizowanych komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 1,25%Mieszaj na lodzie przez godzinę.Po rozpuszczeniu odwiruj lizat komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 150 000 razy G przez 45 minut, aby usunąć nierozpuszczone zanieczyszczenia. Przenieś supernatant do 500-mililitrowej butelki i dodaj 10 mililitrów żywicy agarozowej o powinowactwie immunologicznym 50%1D4. Delikatnie mieszaj rozpuszczony lizat komórkowy i żywicę przez cztery godziny lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić wiązanie białek.Załaduj mieszaninę żywicy lizatu do otwartej kolumny, aby zebrać żywicę. Przepłukać żywicę 10 objętościami kolumny buforu płuczącego A w celu usunięcia zanieczyszczenia białkowego. Zamknąć zawór i ponownie zawiesić żywicę z dwiema objętościami buforu A. Następnie, w warunkach przyćmionego czerwonego światła, dodać 9-cis Retinal do zawieszonej żywicy do końcowego stężenia 50 mikromolowych.Delikatnie mieszaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery do 16 godzin w ciemności, aby związać siatkówkę. Następnie otwórz wartość i usuń bufor z kolumny. Przemyj żywicę 20 objętościami buforu A, a następnie 15 objętościami buforu B w celu usunięcia niezwiązanego Retinalu.Ponownie zawiesić żywicę w dwóch objętościach kolumny buforu B, a następnie podzielić zawiesinę żywicy równo na 10 10-mililitrowych kolumn do utylizacji. Usuń bufor z 10 kolumn, a następnie ponownie zawieś żywicę w jednym mililitrze buforu C w celu wymiany detergentu. Inkubować przez godzinę na lodzie.Powtórzyć płukanie i inkubację w buforze C jeszcze raz. Usuń bufor z kolumn, a następnie ponownie zawieś żywicę w 0,8 mililitra buforu elucyjnego na każdą kolumnę. Delikatnie mieszaj przez dwie godziny.Zebrać elucję z każdej kolumny do probówki. Zawiesić żywicę w 0,7 mililitra buforu elucyjnego na każdą kolumnę. Delikatnie mieszaj przez godzinę.Zebrać elucję z każdej kolumny do tych samych probówek. W ciemności załaduj wymykające się białko do kuwety kwarcowej. Zmierzyć widmo próbki białka.Oświetl białko bezpośrednio w kuwecie przez dwie minuty światłem przechodzącym przez filtr przepustowy o długości 495 nanometrów. Zmierzyć widmo oświetlonej próbki. Wykonać ten sam pomiar dla wszystkich próbek białka oczyszczonych w pozostałych dziewięciu detergentach.Zarówno stany ciemne, jak i oświetlone. W normalnym świetle dla każdego detergentu przygotuj 100 mikrolitrów rodopsyny w stężeniu 0,7 miligrama na mililitr. W przyćmionym czerwonym świetle przygotuj 100 mikrolitrów mieszaniny rodopsyny w stężeniu 0,7 miligrama na mililitr i mini-GO w stężeniu 0,2 miligrama na mililitr.Uzupełnij mieszaninę jednym milimolowym chlorkiem magnezu. Oświetlić mieszaninę światłem z filtra przepustowego o długości 495 nanometrów i inkubować przez 30 minut. Przenieść próbki do fiolek z automatycznym samplerem i umieścić je w tacy na próbki.Zaprogramuj plik metody, aby zautomatyzować sekwencyjne przebiegi SEC dla każdej próbki, przy czym automatyczny próbnik ładuje 77 mikrolitrów próbki do kolumny, a oczyszczacz unika 25 mililitrów bufora SEC na przebieg. Zapisz absorbancję przy 280 nanometrach i 380 nanometrach. Zbierz frakcje szczytowe rodopsyny i kompleksu rodopsyny-mini-GO w objętości retencji około 12,9 mililitra.Analizuj lewe próbki rodopsyny i frakcje szczytowe kompleksu rodopsyna-mini-GO na czterech do 12% denaturujących żelach gradientowych SDS z niebieskim barwieniem Coomassie. Przygotuj mieszaninę 200 mikrolitrów rodopsyny w ilości jednego miligrama na mililitr i PNGazy F w ilości 0,01 miligrama na mililitr. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez noc.Przygotuj 200 mikrolitrową mieszaninę rodopsyny w ilości jednego miligrama na mililitr i Endo F1-13 w ilości 0,01 miligrama na mililitr. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez noc. Przeanalizuj wynik trawienia za pomocą SDS-Page i barwienia na niebiesko Coomassie.W tym badaniu konfiguracja oczyszczania na małą skalę dostarczyła wystarczającą ilość białka do dalszych analiz. Widma rodopsyny w ultrafiolecie w świetle widzialnym pokazują ciemny stan 9-cis rodopsyny związanej z siatkówką na niebieskich krzywych. Po rozświetleniu 9-cis Retinal ulega deproteinizacji i izomeryzuje do wszystkich trans-retinalów.Proporcje absorbentów o długości 280 nanometrów nad absorbentami o długości 488 nanometrów i absorbentów o długości 280 nanometrów nad absorbentami o długości 380 nanometrów obrazują stabilność rodopsyny oczyszczonej w każdym detergencie. Przedstawiono profile chromatografii wykluczającej wielkość rodopsyny i kompleksu rodopsyny-mini-GO oczyszczonych w 10 różnych detergentach. Profil standardowych białek markerowych jest przedstawiony jako nakładka wraz z próbką DDM.Interpretacja profili pików jest pokazana dla DMNG z idealnym scenariuszem widzianym dla DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 i OGNG. Powiększony profil próbki OGNG pokazuje, że zarówno rodopsyna, jak i kompleks rodopsyna-mini-GO wymykają się mniej więcej tej samej objętości retencji. Analiza SDS-Page rodopsyny i oczyszczonych przez SEC próbek kompleksu rodopsyny-mini-GO jest pokazana tutaj.Rysunek ten przedstawia analizę deglikozylacji rodopsyny za pomocą enzymów Endo F1 i PNGazy F. Bardzo ważne jest, aby przeprowadzać badania przesiewowe detergentów w sposób systematyczny, tak aby można było wyraźnie i jednoznacznie porównać wpływ każdego detergentu z osobna. W przypadku białek o różnej ilości test przesunięcia termicznego można również zastosować do zbadania wpływu detergentu na stabilność białka.Dzięki tej metodzie jesteśmy w stanie przygotować stabilny kompleks białkowy i ostatecznie rozwiązać strukturę krystaliczną utraconą w geomontażu. Dostarczyło to ważnych informacji na temat swoistości interakcji białka GPCR-G.

strategic-screening-characterization-visual-gpcr-mini-g-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Tutaj opisujemy ogólną metodę losowego przesiewania matryc mikronasion. Wykazano, że technika ta znacznie zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentów przesiewowych krystalizacji białek, zmniejsza potrzebę optymalizacji i zapewnia niezawodne dostarczanie kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem ligandów.

Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

W artykule przedstawiono metodę generowania kryształów białek pochodzonych z I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) za pomocą mikrozasiewania do generowania nowych warunków krystalizacji w rzadkich przesiewach matrycowych. Tacy można ustawić za pomocą robotów do dyspensowania płynów lub ręcznie.

Deriwatyzacja kryształów białek za pomocą I3C za pomocą losowego przesiewania macierzy mikronasion

Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.

Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Ten artykuł opisuje cały proces XChem do badania fragmentów na bazie kryształów, począwszy od złożenia wniosku o dostęp i wszystkich kolejnych kroków do rozpowszechniania danych.

Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source

Ten protokół szczegółowo opisuje wysokoprzepustowe badanie przesiewowe krystalizacji, począwszy od przygotowania 1 536 mikropróbek do końca 6-tygodniowego okna eksperymentalnego. Znajdują się tam szczegółowe informacje na temat konfiguracji próbki, uzyskanego obrazowania oraz sposobu, w jaki użytkownicy mogą wykonywać analizy za pomocą graficznego interfejsu użytkownika opartego na sztucznej inteligencji, aby szybko i skutecznie zidentyfikować warunki krystalizacji makromolekularnej.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek

Poznaj systematyczny przesiew detergentowy dla kompleksu białkowego receptora GPCR rhodopsyny z mini-G o. Metoda obejmuje chromatografię immunoafinityczną i spektroskopię UV-Vis do oceny stabilności białka.

Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji (Wideo) | JoVE Journal

Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji

Przeglądaj więcej filmów