Name: Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego chemotaksji makrofagów myszy w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia obserwację morfologii komórek i pomiar prędkości migracji w gradientach chemotaktycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem (HA 3271/3-2) z DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Protokoły są zgodne z wytycznymi naszej lokalnej komisji etyki badań, jak również z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje przebieg testu chemotaksji.
1. Wstępne napełnianie szkiełek chemotaksji
<ol>
	<li>Kanały łączące o szerokości 1 mm i długości 2 mm jednego lub dwóch szkiełek chemotaksji należy wstępnie napełnić zmodyfikowanym roztworem RPMI 1640 HEPES, składającym się z pożywki niezawierającej wodorowęglanów RPMI 1640 zawierającej 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz antybiotyków, takich jak penicylina (100 U/ml) i streptomycyna (100 μg/ml), przygotowany przez rozcieńczenie 100x penicyliny/streptomycyny i 1 μg/ml lipopolisacharydu (z E. coli) oraz liganda receptora Toll-podobnego 4 używanego do aktywacji komórek.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko chemotaksyjne (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) w okrągłym (10 cm średnicy) naczyniu do hodowli komórkowych, oba wstępnie podgrzane do 37 °C, i umieść naczynie na rozgrzanym (37 °C) aluminiowym bloku. Włóż wtyczki do portów 1 i 4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
		nuta: Aluminiowy blok utrzymywany w temperaturze 37 °C i umieszczony wewnątrz okapu z przepływem laminarnym jest przydatny do przygotowania komór chemotaksji. Idealnie byłoby, gdyby podgrzewany blok zapewniał płaską powierzchnię roboczą i studzienki na różne probówki, takie jak probówki 50 ml i probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Używając końcówki do pipety o pojemności 10–200 μl ze ściętą końcówką, wlej 15 μl zmodyfikowanego podłoża RPMI 1640 HEPES do portu napełniania 3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Następnie, trzymając objętość nadal ustawioną na 15 μl i wciśnięty przycisk sterujący pipety (objętość 2–20 μl), włóż końcówkę pipety do portu 2 i odsysaj 15 μl z umiarkowanie szybką szybkością (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Spowoduje to wstępne wypełnienie kanału łączącego 1 mm x 2 mm (obszar obserwacji), a także dwóch bocznych kanałów zasilających (odpowiednio między centralnym obszarem obserwacji a portami 2 i 3). Przykryj porty napełniania 2 i 3 zaślepkami.</li>
		<li>Po wstępnym napełnieniu umieścić szkiełka chemotaksji na stojaku przechowywanym w zamkniętej komorze wilgotnościowej w suchym inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C. 
		nuta: Ważne jest, aby używać odpowiedniej końcówki pipety do napełniania szkiełka chemotaksji. Skośna końcówka pipety zaklinuje się w górnej części portu napełniania, podczas gdy powszechnie stosowane spiczaste końcówki pipet mogą być włożone głębiej do portu napełniania i mogą znacznie zwiększyć opór przepływu płynu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja makrofagów otrzewnowych rezydujących u myszy
<ol>
	<li>Uświęć 3-4 miesięczną mysz za pomocą wysokiego stężenia lotnego środka znieczulającego izofluranu (>5% w powietrzu) lub dwutlenku węgla25, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Utrata odruchu prostowania u gryzoni koreluje z utratą przytomności u ludzi26. Oczyść brzuch myszy 80% etanolem w wodzie, a następnie wykonaj 1–2 cm nacięcie skóry w linii środkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych z końcówkami. Złuszcz skórę, aby odsłonić leżącą pod spodem ścianę brzucha.</li>
	<li>Wprowadzić plastikowy cewnik 24 G do jamy otrzewnej. Za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml przepłucz jamę za pomocą 2 x 4,5 ml lodowatego buforowanego roztworu soli Hanka (HBSS), bez Ca2+ i Mg2+. Pozostawić około 0,5 ml resztkowego HBSS w strzykawce, aby tkanka przypadkowo zassana na końcówkę cewnika mogła zostać wydalona.</li>
	<li>Przenieś płukane podłoże, zwykle o łącznej objętości 8–8,5 ml, do probówki z okrągłym dnem polipropylenowym o pojemności 14 ml. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 6,5 minuty w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Rurka z okrągłym dnem umożliwia pełną dekantację supernatantu i zmniejsza zbrylanie komórek.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki otrzewnej (zwykle ~4 x 10,6 komórek na mysz) w 200 μl zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 HEPES. Rozcieńczyć próbkę zawiesiny komórek w stosunku 1:20 i użyć urządzenia liczącego, takiego jak ulepszona komora licząca Neubauera, aby policzyć komórki. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek do końcowego stężenia 10 x 106 komórek/ml i utrzymać komórki w probówce do mikrowirówek polipropylenowej o okrągłym dnie o pojemności 2 ml w temperaturze 37 °C za pomocą podgrzewanego bloku aluminiowego (patrz UWAGA w kroku 1.1.1).</li>
</ol>
3. Siew komórek otrzewnej do szkiełek chemotaksji
<ol>
	<li>Po 5-krotnym pipetowaniu zawiesiny komórek w górę i w dół z objętością pipety ustawioną na 100 μl (lub na połowę objętości zawiesiny) w celu zmniejszenia zbrylania, delikatnie wlej 10 μl zawiesiny komórek do portu 3 komory chemotaksji (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2C). Umieść końcówkę pipety w porcie 2 i powoli wciągnij zawiesinę ogniwa do kanału łączącego (Rysunek 2C). Jak tylko zawiesina ogniwa zostanie wprowadzona, usuń zatyczki na portach 1 i 4, co pomoże zatrzymać przepływ zawiesiny ogniwa. Umieść zaślepki na wszystkich czterech portach napełniania.</li>
	<li>Powtórz krok 3.1 dla wszystkich komór chemotaksji. Za pomocą małego odwróconego mikroskopu i soczewki obiektywowej z 10-krotnym kontrastem fazowym sprawdź szkiełka chemotaksji pod kątem niepożądanych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Szkiełka z chemotaksją wysiane komórkami otrzewnej umieścić w komorze wilgotnościowej o temperaturze 37 °C na 2–3 godziny.</li>
</ol>
4. Napełnianie zbiorników i dodawanie chemoatraktantu
<ol>
	<li>Sprawdzić obszar obserwacji (kanał łączący dwa zbiorniki o pojemności 40 μl) za pomocą mikroskopu odwróconego. 
	nuta: Na tym etapie gęstość komórek będzie wyższa niż po napełnieniu zbiorników, ponieważ słabo przylegające komórki, głównie komórki CD19+ (komórki B1), zostaną wypłukane z obszaru obserwacji podczas procedury napełniania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C–E).</li>
	<li>Umieść wtyczki w portach napełniania 1 i 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Upewnij się, że port napełniania 3 jest wypełniony do góry medium i wolny od pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby użyj sterylnej igły strzykawkowej 27 G, aby usunąć niechciane pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Za pomocą pipety mechanicznej o pojemności 10–100 μl odessać ~60 μl zmodyfikowanego podłoża RPMI 1640 HEPES i umieścić końcówkę pipety w porcie napełniania 3. Użyj pierścienia do ustawiania objętości pipety, aby powoli i równomiernie wstrzykiwać pożywkę do zbiornika, tak aby pożywka osiągnęła szczyt portu napełniania 4 po 1–2 minutach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Napełnij drugi zbiornik. Wyjmij wtyczkę z portu 1 i powoli włóż ją do portu 3 (Rysunek 2D). Następnie odessać ~50 μl zmodyfikowanego podłoża RPMI 1640 HEPES i umieścić końcówkę pipety w porcie napełniania 4. Użyj pierścienia do ustawiania objętości pipety objętościowej 10–100 μl, aby powoli i równomiernie wstrzykiwać pożywkę do drugiego zbiornika, tak aby pożywka osiągnęła górną część portu napełniania 1 po 1–2 minutach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Umieścić 495 μl zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 HEPES w (okrągłodennej) probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i dodać 5 μl błękitu patentowego V (roztwór podstawowy: 10 mg/ml w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej [PBS]), niebieskiego barwnika używanego jako wizualny wskaźnik tworzenia gradientu stężeń. Wymieszaj przez krótkie wirowanie. Dodać 5,4 μl rekombinowanego mysiego dopełniacza C5a (roztwór podstawowy: 50 μg/ml w PBS z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej) i wymieszać przez krótkie wirowanie.</li>
	<li>Wlej 15 μl niebieskiego, uzupełnionego podłoża zawierającego C5a do portu napełniania 1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A), po upewnieniu się, że płytkie wgłębienie w górnej części portu jest wolne od medium (w przeciwnym razie kropla może się rozlać).</li>
	<li>Włóż końcówkę pipety o pojemności 10–200 μl do portu napełniania 4 i powoli, równomiernie obracaj pierścieniem do ustawiania objętości pipety objętościowej o pojemności 10–100 μl, aby wciągnąć kroplę niebieskiego, uzupełnionego podłoża zawierającego C5a do przeciwległego zbiornika (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Powietrze zacznie wchodzić do krótkiej pionowej kolumny portu napełniania 1. Wciągnij powietrze, aż interfejs płyn-powietrze znajdzie się w połowie pionowej kolumny, a następnie powoli włóż wtyczkę do portu.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij pipetę z portu 4, drugą ręką upewniając się, że szkiełko pozostaje na swoim miejscu. Na koniec powoli podłącz port 4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Sprawdzić szkiełko chemotaksji pod mikroskopem odwróconym. 
	nuta: Pozostałe przylegające komórki w obszarze obserwacji powinny być głównie makrofagami. Można to potwierdzić za pomocą znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał anty-F4/80 (F4/80 jest specyficznym markerem dla makrofagów myszy). Limfocyty B można zidentyfikować za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał anty-CD19, a komórki F4 / 80- / CD19- można wykryć za pomocą niebieskiego fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym (<klasa silna = "xfig">Figura 4).</li>
</ol>
5. Obrazowanie migracji makrofagów za pomocą filmu poklatkowego, mikroskopii z kontrastem fazowym
<ol>
	<li>Umieścić szkiełko chemotaksyjne na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w inkubator stopniowy. Utrzymywać temperaturę na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Zobrazuj obszar obserwacji o wymiarach 1 mm x 2 mm za pomocą soczewki obiektywowej z 10-krotnym kontrastem fazowym i skup się na blaszkach makrofagów: cienkich, przypominających arkusze wypukłościach membrany. Rób obrazy przez 14 godzin z częstotliwością 1 klatki co 2 minuty.</li>
</ol>
6. Analiza zdjęć poklatkowych
<ol>
	<li>Analizuj obrazy poklatkowe z kontrastem fazowym za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu lub wtyczki Manual Tracking, wyprodukowanej przez Fabrice P. Cordelières, dla ImageJ. 
	nuta: Zautomatyzowane programy śledzące mogą być używane do analizy komórek obrazowanych za pomocą mikroskopii poklatkowej, kontrastu fazowego lub fluorescencji. Na przykład oprogramowanie iTrack4U oparte na Javie, stworzone przez Cordelières et al.27, może być używane do automatycznego śledzenia i analizy komórek przy użyciu obrazów poklatkowych, kontrastu fazowego lub fluorescencji jako danych wejściowych. Ręczne śledzenie jest bardziej czasochłonne, ale ścieżki generowane przez wtyczkę ImageJ Manual Tracking mogą być bezpośrednio importowane i automatycznie analizowane przez wtyczkę ImageJ Chemotaxis and Migration Tool28,29.</li>
</ol>

<ol><li>Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+faces+of+leukocyte+interstitial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The multiple faces of leukocyte interstitial migration.</a> Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).</li>
<li>Lammermann, T., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+modes+of+%27amoeboid%27+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).</li>
<li>Woodham, E. F., Machesky, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarised+cell+migration%3A+intrinsic+and+extrinsic+drivers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers.</a> Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).</li>
<li>Devreotes, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Networks+in+Directed+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).</li>
<li>Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+Regulation+of+Heterotrimeric+G+Proteins+during+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90(2016).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+patterns+organize+cellular+protrusions+and+control+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics.</a> Molecular Systems Biology. 15, 8585(2019).</li>
<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302, 1704-1709 (2003).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453, 51-55 (2008).</li>
<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+Arp2%2F3+complex+with+actin%3A+nucleation%2C+high+affinity+pointed+end+capping%2C+and+formation+of+branching+networks+of+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).</li>
<li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li>
<li>Leber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ueber+die+Entstehung+der+Entz%C3%BCndung+und+die+Wirkung+der+entz%C3%BCndungserregenden+Sch%C3%A4dlichkeiten%5BTitle%5D)+AND+%22Fortschritte+der+Medizin%22%5BJournal%5D)">Ueber die Entstehung der Entzündung und die Wirkung der entzündungserregenden Schädlichkeiten.</a> Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).</li>
<li>Tauber, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metchnikoff+and+the+phagocytosis+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metchnikoff and the phagocytosis theory.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4, 897-901 (2003).</li>
<li>Clark, E. R., Linton Clark, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+cells+in+the+tail+of+amphibian+larvae+to+injected+croton+oil+%28aseptic+inflammation%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation).</a> American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).</li>
<li>Clark, E. R., Linton Clark, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+of+living+cells+in+the+tadpole%27s+tail+toward+starch%2C+agar-agar%2C+gelatin%2C+and+gum+arabic%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic.</a> The Anatomical Record. 24, (1922).</li>
<li>Comandon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytose+in+vitro+des+H%C3%A9matozoaires+du+Calfat+%28enregistrement+cin%C3%A9matographique%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Hebdomadaires+des+S%C3%A9ances+et+M%C3%A9moires+de+la+Soci%C3%A9t%C3%A9+de+Biologie%22%5BJournal%5D)">Phagocytose in vitro des Hématozoaires du Calfat (enregistrement cinématographique).</a> Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie. 69, 314-316 (1917).</li>
<li>McCutcheon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in leukocytes.</a> Physiological Reviews. 26, 319-336 (1946).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Horwitz, D. A., Garrett, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+leukocyte+chemotaxis+in+vitro+to+assay+mediators+generated+by+immune+reactions.+I.+Quantitation+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leukocyte+chemotaxis+with+polycarbonate+%28nuclepore%29+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters.</a> Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).</li>
<li>Bignold, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+polycarbonate+%28Nuclepore%29+membrane+demonstrates+chemotaxis%2C+unaffected+by+chemokinesis%2C+of+polymorphonuclear+leukocytes+in+the+Boyden+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber.</a> Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, Pt 4 769-775 (1991).</li>
<li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5, 15309(2010).</li>
<li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mu-Slide+Chemotaxis%3A+a+new+chamber+for+long-term+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biology. 12, 21(2011).</li>
<li>Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia+using+gaseous+agents+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents.</a> Lab Animal. 50, 241-253 (2016).</li>
<li>Franks, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anaesthesia%3A+from+molecular+targets+to+neuronal+pathways+of+sleep+and+arousal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).</li>
<li>Cordelieres, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+tracking+and+analysis+in+phase-contrast+videos+%28iTrack4U%29%3A+development+of+Java+software+based+on+combined+mean-shift+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes.</a> PLoS One. 8, 81266(2013).</li>
<li>Zantl, R., Horn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+slow+migrating+mammalian+cells+analysed+by+video+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).</li>
<li>Biswenger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EGF-guided+MDA-MB-231+cell+chemotaxis+in+vitro+using+a+physiological+and+highly+sensitive+assay+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system.</a> PLoS One. 13, 0203040(2018).</li>
<li>Austyn, J. M., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F4%2F80%2C+a+monoclonal+antibody+directed+specifically+against+the+mouse+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage.</a> European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).</li>
<li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motorized+RhoGAP+myosin+IXb+%28Myo9b%29+controls+cell+shape+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).</li>
<li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Locomotion+and+Chemotaxis%3A+Basic+Concepts+and+Methodological+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches.</a> Methods. 10, 74-81 (1996).</li>
<li>Pfeffer, W. Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPfeffer%2C+W+%22Untersuchungen+aus+dem+Botanischen+Institut+zu+Tu%CC%88bingen%22">Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tübingen</a>. 1, 363(1884).</li>
<li>Konigs, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+macrophages+completely+lacking+Rho+subfamily+GTPases+%28RhoA%2C+RhoB%2C+and+RhoC%29+have+severe+lamellipodial+retraction+defects%2C+but+robust+chemotactic+navigation+and+altered+motility%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).</li>
<li>Horsthemke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+filopodial+dynamics+in+particle+capture+and+phagocytosis+and+phenotypes+of+Cdc42+and+Myo10+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).</li>
<li>Bachg, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+Myo10+knockout+%28Myo10%28tm2%2Ftm2%29%29+mice+lacking+full-length+%28motorized%29+but+not+brain-specific+headless+myosin+X%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X.</a> Scientific Reports. 9, 597(2019).</li>
<li>Horsthemke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isoform+of+myosin+18A+%28Myo18Agamma%29+is+an+essential+sarcomeric+protein+in+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).</li>
<li>Bzymek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+two-+and+three-dimensional+imaging+of+monocyte+motility+and+navigation+on+planar+surfaces+and+in+collagen+matrices%3A+roles+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho.</a> Scientific Reports. 6, 25016(2016).</li>
<li>Wang, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+production+of+macrophages+or+neutrophils+ex+vivo+using+conditional+Hoxb8%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8.</a> Nature Methods. 3, 287-293 (2006).</li>
<li>Gran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging%2C+myeloid+precursor+immortalization%2C+and+genome+editing+for+defining+mechanisms+of+leukocyte+recruitment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo.</a> Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+News+and+Reviews+in+Molecular%2C+Cellular+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003(2017).</li>
<li>Isfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+that+P2Y2+and+P2Y12+receptor+agonists+are+not+chemoattractants+and+macrophage+chemotaxis+to+complement+C5a+is+phosphatidylinositol+3-kinase+%28PI3K%29-+and+p38+mitogen-activated+protein+kinase+%28MAPK%29-independent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie przyżyciowe sięga XIX wieku i zapewnia środki do badania zachowania żywych komórek odpornościowych w ich naturalnym środowisku. Jednak nawet przy dzisiejszej zaawansowanej mikroskopii i technikach genetycznych trudno jest badać reakcję komórek na określone chemoatraktanty in vivo. Aby obejść ten problem, Boyden18 opracował testy Transwell w latach sześćdziesiątych XX wieku, ale te testy punktu końcowego nie dostarczyły wizualizacji tego, w jaki sposób komórki faktycznie migrowały w kierunku chemoatraktantów, co utrudniało rozróżnienie chemokinezy, stymulowanej losowej migracji przez wskazówkę chemiczną32 i chemotaksji, migracji w kierunku wyższych stężeń bodźców chemicznych od siebie33. Problem ten został rozwiązany poprzez zaprojektowanie różnych otwartych komór z mostkiem, zwykle o szerokości 1 mm, umieszczonym między dwoma zbiornikami i dostępnym przez soczewkę obiektywu 21,22,23. Nałożenie odwróconego szkiełka nakrywkowego, wysianego przylegającymi komórkami, zamyka komory, a chemoatraktant dodany do jednego ze zbiorników dyfunduje przez most do przeciwległego zbiornika, tworząc gradient stężeń. Tutaj opisujemy test chemotaksji przy użyciu tej samej zasady, ale przy użyciu zamkniętej komory z czterema portami napełniania. Korzystając z tego systemu i poklatkowej mikroskopii z kontrastem fazowym, opracowaliśmy test do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących u myszy migrujących w chemotaktycznym gradiencie C5a dopełniacza 31,34,35,36. Test ten, w połączeniu z mysimi modelami nokautowymi, okazał się zasadniczy w badaniu roli różnych GTPaz Rho i białek motorycznych w morfologii, ruchliwości i chemotaksji makrofagów 31,34,35,36,37. Zastosowaliśmy również to podejście do obrazowania ludzkich monocytów krwi obwodowej migrujących na powierzchni 2D lub w matrycy 3D kolagenu typu I38. Ponadto test jest odpowiedni dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy lub makrofagów pochodzących z warunkowo unieśmiertelnionych komórek prekursorowych szpiku39,40. Wcześniej używaliśmy worków z politetrafluoroetylenu (PTFE) z adapterami luer do hodowli komórek szpiku kostnego i otrzymywania makrofagów34. Zaletą worków PTFE jest to, że ogniwa można łatwo zawiesić i przygotować do użycia po umieszczeniu worka na lodzie na 20–30 minut. Zwróć uwagę, że przed wprowadzeniem komórek wstępnie wypełniamy obszar obserwacji szkiełka chemotaksji. Takie podejście ma tę zaletę, że niepożądane pęcherzyki powietrza mogą być następnie wypłukiwane (ze zmiennym skutkiem), a wstępnie namoczony obszar obserwacji umożliwia powolne wprowadzanie zawiesiny komórek przez pipetowanie. Wstępne napełnianie zwiększa jednak prawdopodobieństwo, że pożywka częściowo spłynie do jednego lub obu zbiorników bocznych, co będzie sprzyjać wysiewaniu komórek poza obszar obserwacji. Alternatywnie, zawiesinę komórek można bezpośrednio pipetować do suchego obszaru obserwacji, ale nie można później usunąć niepożądanych pęcherzyków powietrza.
Jama otrzewnowa myszy zawiera dwie główne populacje komórek: makrofagi F4 / 80 + i (mniejsze) komórki B CD19 + w stosunku około 1: 2 (ryc. 4A). Te dwie populacje komórek stanowią ponad 95% komórek jamy otrzewnej, podczas gdy pozostałe komórki F4 / 80 / CD19- można zwykle zidentyfikować jako komórki CD11c + (komórki dendrytyczne) lub komórki CD3 + (limfocyty T). Słabo przylegające limfocyty B są wypłukiwane z obszaru obserwacji podczas napełniania zbiorników pożywką (ryc. 2). Po dodaniu chemoatraktantu do jednego z dwóch zbiorników, można użyć poklatkowej mikroskopii z kontrastem fazowym do zobrazowania pozostałych komórek (makrofagów) migrujących w ewoluującym gradicie chemoatraktantu. Tworzenie gradientu C5a dopełniacza w obszarze obserwacji, poprzez dyfuzję z jednego zbiornika do drugiego, można symulować przy użyciu barwnika fluorescencyjnego o podobnej masie cząsteczkowej. Dobrym substytutem rekombinowanego mysiego dopełniacza C5a (przewidywana masa cząsteczkowa, 9,0 kDa) jest znakowany fluorescencyjnie dekstran (10 kDa)31. Za pomocą mikroskopii konfokalnej można zmierzyć gradient fluorescencji w wąskim kanale (obszarze obserwacji) łączącym dwa zbiorniki szkiełka chemotaksji w stałych odstępach czasu i wykreślić profile stężeń w różnych punktach czasowych24,31. Rutynowo dodajemy niefluorescencyjny, niebieski barwnik (Patent Blue V) do pożywki chemoatraktantowej, aby zapewnić wygodny wizualny wskaźnik dyfuzji i tworzenia gradientu. W ciągu 1 godziny od wprowadzenia 15 μl niebieskiej pożywki zawierającej chemoatraktant do zbiornika, zbiornik wydaje się jednolicie niebieski i, zgodnie z prawami dyfuzji Ficka, w poprzek wąskiego obszaru obserwacyjnego łączącego zbiorniki utworzy się gradient (ryc. 3B). Potrzeba kilku dni, aby substancja rozpuszczona (niebieski barwnik lub chemoatraktant) została równomiernie rozprowadzona.
Mikroskopia fluorescencyjna może być zastąpiona mikroskopią z kontrastem fazowym, co oferuje korzyści w automatycznym śledzeniu komórek, ponieważ komórki znakowane fluorescencyjnie można łatwo odróżnić od tła. Kolejną zaletą jest to, że określone populacje komórek odpornościowych mogą być selektywnie śledzone po znakowaniu markerów powierzchniowych przeciwciałami fluorescencyjnymi. Zastosowaliśmy to podejście do obrazowania ludzkich komórek CD14 + krwi obwodowej (monocytów) migrujących w chemotaktycznym gradientzie fMLP (N-formylometionina-leucylo-fenyloalanina)38. Podobnie, fluorescencyjne przeciwciała anty-F4/80 można wykorzystać do obrazowania makrofagów myszy migrujących w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Fototoksyczność jest potencjalną wadą stosowania obrazowania fluorescencyjnego41. Można to zmniejszyćna różne sposoby42, w tym za pomocą fluoroforów wzbudzonych dłuższymi falami i dodając przeciwutleniacze do podłoża. Alternatywnie, znakowane komórki można początkowo zidentyfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a następnie zobrazować za pomocą mikroskopii poklatkowej z kontrastem fazowym. Jednak w praktyce komórki poruszające się z umiarkowanie niskimi prędkościami, takimi jak ~1 μm/min (makrofagi) lub ~4 μm/min (monocyty), mogą być sporadycznie obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w odstępach minutowych, co jest dobrzetolerowane. Wcześniej używaliśmy mikroskopii fluorescencyjnej i szkiełka chemotaksji opisanego tutaj do testów chemotaksji3D 38,43. W tym przypadku oba zbiorniki zostały wstępnie napełnione pożywką i 15 μl pożywki zawierającej chemoatraktant została wciągnięta do jednego ze zbiorników bezpośrednio przed powolnym pipetowaniem fluorescencyjnie znakowanych komórek zawieszonych w pożywce zawierającej kolagen typu I do obszaru obserwacji. Najtrudniejszą częścią tej procedury jest obchodzenie się z kolagenem typu I, który jest skoncentrowany w kwaśnym roztworze. pH roztworu kolagenu należy zneutralizować przez dodanie roztworu alkalicznego przed zmieszaniem lodowatego roztworu kolagenu z zawiesiną komórkową. Przeniesienie mieszaniny kolagen-komórka do inkubatora w temperaturze 37 °C zainicjuje polimeryzację kolagenu. Podczas inkubacji szkiełko należy powoli obracać wokół jego długiej osi, tak aby komórki pozostały równomiernie rozmieszczone w kierunkach osi X, Y i Z, podczas gdy kolagen polimeryzuje w żel. Niedawno opisano pokrewny zamknięty szkiełko chemotaksyjne odpowiednie do testów chemotaksji 3D, z sześcioma czopkami zamiast czterech,29. System ten pozwala na wprowadzenie mieszaniny kolagenu i komórek do obszaru obserwacji przed niezależnym napełnieniem każdego z bocznych zbiorników, ponieważ każdy zbiornik ma dwa porty napełniania, a nie jeden port.
Podsumowując, opisujemy test chemotaksji w czasie rzeczywistym, który umożliwia wizualizację komórek poruszających się w gradiencie chemotaktycznym przez okres 6 lub więcej godzin. W tym artykule skupiamy się na makrofagach, które odgrywają główną rolę w chorobach zapalnych, ale są niedostatecznie reprezentowane w testach chemotaksji w czasie rzeczywistym w porównaniu z szybciej poruszającymi się komórkami, takimi jak neutrofile i ameba Dictyostelium .

Komórki odpornościowe zazwyczaj migrują pojedynczo na powierzchni 2D w sposób ameboidalny1,2, co obejmuje powtarzające się cykle wysunięcia przodu, adhezji komórek za pośrednictwem integryny i wycofania tyłu. Niezbędnym krokiem jest polaryzacja komórek, w której komórki tworzą przednie i tylne końce3. Chemotaksja rozpoczyna się od wykrycia chemoatraktantów przez receptory sprzężone z białkiem G i złożoną sieć sygnalizacyjną, w której pośredniczą zakotwiczone w błonie heterotrimeryczne białka G i małe monomeryczne białka G, a także czynniki wymiany nukleotydów guaninowych związane z fosfolipidami (GEF)4,5. Aktywacja GTPaz Rho z podrodzin Cdc42 i Rac indukuje wypukłości w klasie front<sup="xref">6, a członkowie podrodziny Rho, zwłaszcza RhoA, aktywują skurcz podrodziny rear<sup="xref">5,7. W środowisku trójwymiarowym (3D) integryny są w dużej mierze zbędne do migracji leukocytów, a RhoA staje się ważniejsze dla przeciskania komórek przez wąskie przejścia8, podczas gdy indukowana przez Cdc42 lub Rac aktywacja Arp2/3 pozostaje ważna dla sterowania chemotaktycznego9,10.
Komórki odpornościowe mogą stawić czoła różnym chemoatraktantom, szczególnie w przypadku uszkodzenia tkanek, inwazji patogenów i stanu zapalnego. Endogenne chemoatraktanty ulegające ekspresji na fagocytach dopełniacza C3a i C5a są szybko generowane przez aktywację kaskady dopełniacza i są rozpoznawane przez receptory dopełniacza C3a i C5a. Podobnie, komórki martwicze rekrutują fagocyty za pośrednictwem receptorów peptydów formylowych, które rozpoznają peptydy formylowe pochodzące z mitochondriów, a także pochodzące z bakterii11. Komórki odpornościowe wyrażają również receptory sprzężone z białkiem G dla chemokin, dużej rodziny peptydów chemoatraktantowych zaangażowanych w regulację transportu komórek odpornościowych zarówno podczas homeostazy, jak i stanu zapalnego. Chemokiny dzielą się na cztery grupy w zależności od rozmieszczenia pierwszych dwóch reszt cysteiny (C): cytokinów C, CC, CXC i CX3C, gdzie X jest aminokwasem. W związku z tym komórki odpornościowe in vivo muszą odpowiednio reagować na bardzo złożone sygnały przestrzenne i czasowe, co sprawia, że badanie chemotaksji jest trudnym zadaniem. Poniżej przedstawiamy krótką historię chemotaksji, która rozpoczęła się od obrazowania przyżyciowego.
Badania nad chemotaksją leukocytów sięgają 1888 roku12, kiedy to okulista Theodor Karl Gustav Leber wyraźnie opisał ukierunkowaną migrację leukocytów do miejsc zapalenia i akumulację w nich w modelu grzybiczego (grzybiczego) zapalenia rogówki. Leber podkreślił, że przyciąganie nadmiaru leukocytów przez substancje pochodzące z patogenów jest ważne dla eliminacji szkodliwych mikroorganizmów poprzez fagocytozę, która została opisana przez Metchnikoffa (znanego również jako Metschnikoff) wcześniej w tej samej dekadzie13. Eksperymenty in vivo zostały również przeprowadzone w latach dwudziestych XX wieku przez Clarka i Clarka14,15, którzy wykorzystali przezroczystość kijanek i wykazali, że sterylny stan zapalny wywołany przez olej krotonowy14 lub inne czynniki drażniące15 spowodował przyleganie leukocytów do naczyń krwionośnych, a następnie diapedezę (migrację przezśródbłonkową) i szybką migrację przez przestrzenie tkankowe w kierunku substancji drażniącej. Eksperymenty in vitro z wykorzystaniem metody mikrokinematografii opracowanej przez Jeana Comandana16 wykazały, że leukocyty migrowały w kierunku źródła chemoatraktantu w postaci cząstek stałych, takiego jak bakterie17. W tym czasie tożsamość molekularna czynników chemotaktycznych była nieznana. W latach sześćdziesiątych Stephen Boyden18 uznał, że brakuje technik badania aktywności chemotaktycznej substancji rozpuszczalnych. Opracował komorę, znaną później jako komora Boydena, z dwiema komorami oddzielonymi membraną z bibuły filtracyjnej. Zawiesinę komórek dodaje się do górnej komory, a substancję badaną dodaje się albo do obu komór, albo tylko do dolnej komory. Po okresie inkubacji membrana filtracyjna jest usuwana, a komórki są utrwalane i barwione. Porównując, ile komórek migruje przez membranę filtracyjną w kierunku dolnej studzienki z substancją badaną w obu przedziałach, w żadnym z nich lub tylko w dolnym przedziale, można określić aktywność chemotaktyczną. Testy Transwell są nadal popularne i zostały zmodyfikowane na różne sposoby, w tym przy użyciu różnych membran poliwęglanowych o określonych rozmiarach porów i gęstościach19,20. Główną wadą testów Transwell jest to, że bezpośrednia wizualizacja migrujących komórek jest niepraktyczna, a ścieżka migracji przez błonę zazwyczaj nie przekracza średnicy komórki odpornościowej.
Sally H. Zigmond opracowała komorę chemotaksji21, która umożliwiła wizualizację zarówno tworzenia gradientów, jak i morfologii komórek za pomocą barwników fluorescencyjnych. Komora składa się ze szkiełka z pleksi (akrylu) z dwoma równoległymi studzienkami liniowymi, każdy o objętości ~100 μL, oddzielonymi mostkiem o szerokości 1 mm 3–10 μm poniżej górnej płaszczyzny szkiełka. Szkiełko nakrywkowe wysiane komórkami jest odwracane i umieszczane na szkiełku tak, aby obejmowało dwie studzienki. Po dodaniu chemoatraktantu do jednego ze studzienek, w poprzek mostu tworzy się stromy gradient chemoatraktantu, zwykle w ciągu 30–90 minut. Obserwuje się, jak ludzkie leukocyty wielojądrzaste (granulocyty) w komorze Zigmonda orientują się w kierunku chemoatraktantu. Opisano różne warianty komory Zigmonda, w tym komory Dunn22 i Insall23, z których obie wykorzystują szkiełko nakrywkowe wysiane komórkami umieszczonymi w dwóch studzienkach oddzielonych mostkiem o szerokości 1 mm. Komora Dunna składa się z koncentrycznych studzienek oddzielonych okrągłym mostkiem, podczas gdy komora Insall jest bliżej związana z komorą Zigmonda, ale zapewnia mostki o dwóch różnych szerokościach, 0,5 mm i 1 mm. Nowatorska komora chemotaksji, nazwana μ-Slide Chemotaxis i wytwarzana metodą formowania wtryskowego tworzyw sztucznych, została opisana przez Zemgel et al.24. Komora chemotaksji składa się z dwóch zbiorników o pojemności 40 μl oddzielonych kanałem o szerokości 1 mm i długości 2 mm i wysokości 70 μm. Dno komory jest utworzone przez przepuszczający gaz, cienki arkusz z tworzywa sztucznego o tej samej grubości i właściwościach optycznych, co szkiełko nakrywkowe nr 1,5 klasy <sup="xref">24. Tutaj opisujemy test chemotaksji przy użyciu komory chemotaksji μ-Slide do wizualizacji migracji makrofagów otrzewnowych rezydujących u myszy przez okres do 14 godzin w gradiencie chemotaktycznym (dopełniacz C5a).

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide (anodowane aluminium)</td><td>stojak Ibidi, Martinsried, Niemcy</td><td>80003</td><td>Autoklawowalny stojak do układania w stos do prowadnic kanałowych</td></tr><tr><td>&mikro;-Slide Chemotaxis 2D (szkiełko chemotaksyjne)</td><td>Ibidi, Martinsried, Niemcy</td><td>80306</td><td>Szkiełko zawierające komory chemotaksji (hodowla tkankowa)</td></tr><tr><td>100x penicylina/streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Stosowany jako uzupełnienie do mediów RPMI 1640</td></tr><tr><td>10-100 i mikro; Pipeta L z pierścieniem regulacji objętości</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td>Eppendorf Research plus pipeta</td></tr><tr><td>10-200 &micro; L końcówki do pipet</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>739261</td><td>Końcówki do pipet ze ściętymi końcówkami (96 sztuk w stojaku: sterylne)</td></tr><tr><td>14 ml polipropylenowe probówki z okrągłym dnem</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td>Służy do zbierania komórek otrzewnej</td></tr><tr><td>14-bitowe Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) aparat chłodzony peltierem</td><td>Hamamatsu Photonics Inc., Japonia</td><td></td><td>Kamera EM-CCD systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>2-20 i mikro; Pipeta L z pierścieniem regulacji objętości</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td>Eppendorf Research plus pipeta</td></tr><tr><td>24 G Cewnik z tworzywa sztucznego</td><td>B Braun Mesungen AG, Niemcy</td><td>4254503-01</td><td>Używany do płukania otrzewnej</td></tr><tr><td>Laser półprzewodnikowy 405 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Niemcy</td><td></td><td>Laser (405 nm) źródło systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>Laser półprzewodnikowy 488 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Niemcy</td><td></td><td>Laser (488 nm) źródło systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>Laser na ciele stałym 561 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Niemcy</td><td></td><td>Laserowe (561 nm) źródło systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężone szczurze (IgG2a) monoklonalne (klon BM8) przeciwciało przeciw myszom F4/80</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MF48020</td><td>Znacznik makrofagów myszy i etykieta</td></tr> <tr><td>błony plazmatycznejAlexa Fluor 594-sprzężone szczurze (IgG2a) monoklonalne (klon 6D5) przeciwciało anty-mysie CD19</td><td>BioLegend</td><td>115552</td><td>Mysi marker komórek B</td></tr><tr><td>C-Chip jednorazowy (ulepszony) hemocytometr</td><td>NanoEnTek (dystrybuowany przez VWR International)</td><td>631-1098</td><td>Służy do zliczania komórek</td></tr><tr><td>Skaner wirujących dysków CSU-X1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Japonia</td><td></td><td>Jednostka</td></tr> <tr><td>wirującego dysku NipkowHank' s buforowany roztwór soli bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170120</td><td>Stosowany do płukania otrzewnowej</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082139</td><td>Stosowany jako suplement do RPMI 1640 media</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21486</td><td>Przepuszczalne dla komórek, niebieskie fluorescencyjne barwienie</td></tr> <tr><td>kwasem nukleinowymImageJ (przetwarzanie i analiza obrazu w Javie)</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Escherichia coliO111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391-1MG</td><td>Ligand receptora toll-podobnego</td></tr> 4 <tr><td>Mikroskop odwrotny Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon, Japonia</td><td></td><td>Mikroskop odwrócony</td></tr><tr><td>Patent Blue V, sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21605-10G</td><td>Barwnik w kolorze niebieskim stosowany jako wizualny wskaźnik tworzenia gradientu</td></tr><tr><td>Rekombinowany dopełniacz myszy C5a białko</td><td>R& D Systems</td><td>2150-C5-025</td><td>Chemoatraktant dla makrofagów</td></tr><tr><td>myszy Pożywka RPMI 1640 zawierająca 20 mM Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388</td><td>Pożywka bazowa do testów</td></tr><tr><td>System obrazowania żywych komórek UltraVIEW Vox 3D + oprogramowanie Volocity</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Niemcy</td><td></td><td>System mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 + oprogramowanie Axiovision</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (LSM) przystosowany do mikroskopii z kontrastem fazowym</td></tr></tbody></table>

obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaksja to kierowanie komórek wzdłuż gradientu chemicznego za pośrednictwem receptora, podczas gdy chemokineza to stymulacja losowej ruchliwości komórek przez substancję chemiczną. Chemokineza i chemotaksja mają zasadnicze znaczenie dla mobilizacji i rozmieszczenia komórek odpornościowych. Na przykład chemokiny (cytokiny chemotaktyczne) mogą szybko rekrutować krążące neutrofile i monocyty do pozanaczyniowych miejsc zapalenia. Receptory chemoatraktantu należą do dużej rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G. Sposób, w jaki gradienty chemoatraktantu (tj. liganda) kierują migrację komórek poprzez sygnalizację receptora sprzężonego z białkiem G, nie jest jeszcze w pełni zrozumiały. W dziedzinie immunologii neutrofile są popularnymi komórkami modelowymi do badania chemotaksji in vitro. Tutaj opisujemy dwuwymiarowy (2D) test chemotaksji w czasie rzeczywistym dostosowany do makrofagów przebywających u myszy, które tradycyjnie były trudniejsze do zbadania. Makrofagi poruszają się w wolnym tempie ~1 μm/min na powierzchni 2D i gorzej nadają się do testów migracji ze źródłem punktowym (np. migracja w kierunku końcówki mikropipety wypełnionej chemoatraktantem) niż neutrofile lub Dictyostelium discoideum, które poruszają się o rząd wielkości szybciej. Szeroko stosowane testy Transwell są przydatne do badania aktywności chemotaktycznej różnych substancji, ale nie dostarczają informacji na temat morfologii komórek, prędkości ani nawigacji chemotaktycznej. Tutaj opisujemy test chemotaksji makrofagów oparty na mikroskopii poklatkowej, który umożliwia ilościowe określenie prędkości komórki i wydajności chemotaktycznej oraz stanowi platformę do wyznaczenia przetworników, ścieżek sygnałowych i efektorów chemotaksji.

Schematyczny rysunek szkiełka do chemotaksji użytego do mikroskopii wideo time-lapse makrofagów otrzewnowych myszy migrujących w gradiencie chemotaktycznym przedstawiono na Ryc. 2A. Szkiełko zawiera trzy komory do chemotaksji, z których każda posiada cztery porty napełniające. Porty można zamykać indywidualnie za pomocą korków pokazanych powyżej szkiełka. Alternatywnie, nad niezakorkowanym portem można umieścić niedomykającą nasadkę w celu zachowania sterylności. Po zakorkowaniu portów 1 i 4, obszar obserwacyjny (kanał o wymiarach 1 mm szerokości x 2 mm długości x 70 µm wysokości łączący dwa zbiorniki) między portami 2 i 3 można wypełnić wcześniej pożywką, umieszczając kroplę 15 µL w porcie 3 i odsysając ją pipetą o objętości 2–20 µL w porcie 2 (Ryc. 2B). Zawiesinę rezydujących komórek otrzewnowych myszy (10 x 106 komórek/mL) zasiano w obszarze obserwacyjnym, umieszczając kroplę 10 µL zawiesiny w porcie 3 i powoli odsysając ją w porcie 2 (Ryc. 2C). Typowy obraz komórek zasianych w obszarze obserwacyjnym, wykonany za pomocą mikroskopii kontrastowej przy użyciu obiektywu 10x, przedstawiono na Ryc. 2C. Po inkubacji przez 2–3 h szkiełko do chemotaksji powoli napełniono pożywką (Ryc. 2D). Po zakorkowaniu portów 1 i 2, pożywkę powoli wstrzykiwano przez port 3, aż pojawiła się w porcie 4. Następnie korek przeniesiono z portu 1 do portu 3, a drugi zbiornik napełniono, powoli wstrzykując pożywkę przez port 4, aż pojawiła się w porcie 1. Na tym etapie ponownie sprawdzono komórki w obszarze obserwacyjnym za pomocą mikroskopu odwróconego (Ryc. 2E). Porównując obrazy wykonane tuż przed (Ryc. 2C) i po (Ryc. 2E) napełnieniu zbiorników, stwierdzono, że do dwóch trzecich komórek zostało wypłukanych z obszaru obserwacyjnego. Zazwyczaj wypłukiwane były słabo przylegające komórki CD19+ (komórki B1), a pozostałe komórki były głównie komórkami F4/80+ (makrofagami). Wykazano to za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po oznakowaniu każdego typu komórek specyficznymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie (Ryc. 4). Na Ryc. 4A świeżo wyizolowane rezydujące komórki otrzewnowe myszy oznakowano przeciwciałami anty-F4/80 sprzężonymi z zielonym fluoroforem oraz przeciwciałami anty-CD19 sprzężonymi z czerwonym fluoroforem, a jądra komórkowe oznakowano niebieskim barwnikiem kwasów nukleinowych. F4/80 jest specyficznym markerem makrofagów myszy30, natomiast CD19 jest markerem limfocytów B. Ryc. 4B przedstawia komórki F4/80+ obrazowane za pomocą konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym w obszarze obserwacyjnym komory do chemotaksji. Komórki oznakowano po całonocnym teście chemotaksji rejestrowanym za pomocą mikroskopii kontrastowej time-lapse.
Komplement C5a (chemoatraktant) wprowadzono do jednego z dwóch zbiorników, umieszczając 15 µL kroplę medium zawierającego 0,54 µg/mL (rekombinowany mysi) komplement C5a oraz 10 µg/mL Patent Blue V do otworu napełniającego 1 (Rysunek 3A) po zamknięciu otworów 2 i 3. Medium z chemoatraktantem zostało powoli wciągnięte do zbiornika poprzez powolną aspirację pipetą przez otwór 4. Rysunek 3B przedstawia dyfuzję niebieskiego barwnika po wciągnięciu 15 µL kropli do zbiornika. Patent Blue V posłużył jako pośredni wskaźnik wizualny dyfuzji chemoatraktanta. Cząsteczki komplementu C5a są znacznie większe niż cząsteczki Patent Blue V (9,0 kDa względem 0,57 kDa) i dyfundują wolniej. Po dyfuzji komplementu C5a w zbiorniku jego stężenie wynosiło ~0,2 µg/mL (15 µL/40 µL [objętość zbiornika] x 0,54 µg/mL = 0,2 µg/mL), co odpowiada ~22,5 nM. Po 3 h w obszarze obserwacji utworzył się umiarkowanie stromy gradient, który nadal rósł, osiągając maksimum około 12 h31. Rysunek 3C przedstawia ścieżki migracji makrofagów przemieszczających się w gradiencie komplementu C5a między 6. a 12. godziną po dodaniu chemoatraktanta. Prędkość komórek i wydajność chemotaktyczna poszczególnych makrofagów, indeksowane jako y-FMI (y-forward migration index; zakres: -1 do +1) oraz x-FMI, zostały obliczone na podstawie wykresów migracji (Rysunek 3D). Rysunek 3D przedstawia również, poniżej wykresów pudełkowych, wykres migracji sporządzony po normalizacji punktu startowego każdej ścieżki migracji do X = 0 i Y = 0. Wstawka na wykresie migracji pokazuje, w jaki sposób obliczano y-FMI dla każdej ścieżki migracji.
<img alt="Schemat izolacji komórek; mikroskopia, diagram śledzenia komórek; analiza chemotaksji za pomocą obrazowania time-lapse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat badania chemotaksji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja urządzenia mikrofluidycznego: etapy wysiewania komórek i procesu obrazowania żywych komórek wraz ze schematem i wynikami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obsługa szkiełek do chemotaksji. (A) Widok 3D szkiełka do chemotaksji z czterema zatyczkami i czterema nakrętkami. Szkiełko zawiera trzy komory chemotaktyczne, z których każda składa się z dwóch zbiorników o pojemności 40 µL połączonych kanałem o wymiarach 1 mm x 2 mm i wysokości 70 µm, zwanym obszarem obserwacji. (B) Kanał łączący rozciąga się na obu końcach do portów napełniających 2 i 3. Po włożeniu zatyczek do portów napełniających 1 i 4, obszar obserwacji został wstępnie wypełniony medium (kolor czerwony) poprzez naniesienie kropli medium do portu 3 i aspirację w porcie 2 za pomocą końcówki pipety 10–200 µL. Następnie na portach 2 i 3 umieszczono nakrętki przed inkubacją szkiełka w temperaturze 37 °C i przygotowaniem zawiesiny komórkowej. (C) W obszarze obserwacji, w którym utworzył się gradient chemoatraktanta, wysiano makrofagi poprzez naniesienie 10 µL kropli rezydentnych komórek otrzewnej myszy do portu 3 i powolną aspirację w porcie 2. Szkiełko inkubowano następnie w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 2–3 h. Obraz w kontraście fazowym pokazany po prawej stronie, uzyskany za pomocą obiektywu 10x, przedstawia komórki otrzewnej po wysiewaniu i inkubacji w 37 °C przez 2 h. Pasek skali = 500 µm. (D) Komory chemotaktyczne wypełniono medium poprzez zatkanie portów 1 i 2, a następnie powolne wstrzykiwanie medium przez port 3, aż pojawiło się ono w porcie 4. Powolne i stabilne napełnianie można osiągnąć poprzez obracanie pierścienia ustawiania objętości pipety 20–100 µL. Po napełnieniu pierwszego zbiornika, drugi zbiornik można napełnić, zatykając porty 2 i 3, a następnie powoli wstrzykując medium w porcie 4, aż pojawi się ono w porcie 1. (E) Obraz w kontraście fazowym tego samego obszaru obserwacji pokazanego powyżej (C) po napełnieniu dwóch zbiorników. Pasek skali = 500 µm. Elementy graficzne dostarczył Elias Horn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza migracji komórek; schematy A-B, dopełniacz C5a, ścieżki śledzenia; podrysunki C-D, wykres prędkości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Test chemotaksji. (A) Chemoatraktant wprowadzono do jednego z dwóch zbiorników komory chemotaksyjnej poprzez naniesienie 15 µL kropli medium zawierającego 0,54 µg/mL dopełniacza C5a oraz 10 µg/mL Patent Blue V do otworu napełniającego 1, a następnie powolną aspirację przez otwór 4. (B) Początkowo, po wciągnięciu do zbiornika, niebieskie medium zawierające chemoatraktant miało kształt zbliżony do odwróconej kropli, a następnie powoli dyfundowało w całym zbiorniku. (C) Ścieżki migracji makrofagów przemieszczających się w gradiencie chemoatraktanta (dopełniacza C5a) między 6–12 h po wprowadzeniu chemoatraktanta do jednego ze zbiorników. Kierunek gradientu zaznaczono po prawej stronie. Koniec każdej ścieżki migracji oznaczono wypełnionym kołem. (D) Wykresy pudełkowe prędkości, x-FMI (indeks migracji w przód w osi x) oraz y-FMI (indeks migracji w przód w osi y), będącego wskaźnikiem wydajności chemotaktycznej w zakresie od -1 do +1. Dane uzyskano poprzez analizę 25 ścieżek migracji makrofagów. Do analizy losowo wybrano makrofagi znajdujące się w dolnej połowie obszaru obserwacji, które wykazały przemieszczenie o co najmniej jedną szerokość komórki w ciągu 6 h. Poniżej znajduje się wykres ścieżek migracji po normalizacji punktu startowego do X = 0 i Y = 0. Indeks chemotaksji (y-FMI) obliczono, dzieląc wypadkowe przemieszczenie wzdłuż osi Y (d) przez skumulowaną długość (l) ścieżki migracji, zgodnie ze schematem. Elementy graficzne w panelach A i B dostarczył Elias Horn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki testu chemotaksji komórek otrzewnej; mikroskopia fluorescencyjna wykazująca markery komórkowe F4/80, CD19." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazy fluorescencyjne żywych rezydentnych komórek otrzewnej myszy uzyskane za pomocą konfokalnej mikroskopii dyskowej. (A) Obraz o rozszerzonym polu ostrości (scalenie najjaśniejszych punktów ze wszystkich płaszczyzn Z) świeżo wyizolowanych komórek otrzewnej myszy znakowanych zielonymi fluorescencyjnymi przeciwciałami anty-F4/80 (marker makrofagów), czerwonymi fluorescencyjnymi przeciwciałami anty-CD19 (marker limfocytów B) oraz niebieskim fluorescencyjnym barwnikiem kwasów nukleinowych. Pasek skali = 10 µm. (B) Migawka (pojedyncza płaszczyzna Z) komórek F4/80+ (makrofagów) w obszarze obserwacyjnym komory chemotaksji wykonana po całonocnym teście chemotaksji. Komórki znakowano zielonymi fluorescencyjnymi przeciwciałami anty-F4/80 oraz niebieskim fluorescencyjnym barwnikiem kwasów nukleinowych. Gradienty dopełniacza C5a i Patent Blue V zostały wypłukane podczas procedury znakowania komórek, co wyjaśnia, dlaczego górny zbiornik na schemacie komory chemotaksji nie jest niebieski. Pasek skali = 10 µm. Element graficzny dostarczony przez Eliasa Horna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Tradycyjnie, makrofagi były trudne do zbadania w testach chemotaksji w czasie rzeczywistym, ponieważ komórki poruszają się powoli. Protokół ten umożliwia obrazowanie makrofagów migrujących w gradiencie chemotaktycznym przez okres do sześciu godzin lub dłużej. W porównaniu z testami implantologicznymi, takimi jak testy transferu, technika ta ma tę zaletę, że można obserwować morfologię makrofagów i mierzyć parametry, takie jak prędkość komórki i wydajność chemotaktyczna.Makrofagi biorą udział w wielu chorobach zapalnych, a technika ta może być przydatna do badania leków mających na celu hamowanie chemotaksji. Może być również stosowany do innych typów komórek, takich jak ludzkie monocyty. Próbując tej techniki po raz pierwszy, najlepiej jest poćwiczyć napełnianie komór chemotaksji przed rozpoczęciem pracy z komórkami.Jednym z najważniejszych aspektów tej techniki jest unikanie pęcherzyków powietrza. Zacznij od wstępnego napełnienia kanałów łączących jedną lub dwie szkiełka chemotaksji zmodyfikowanym RPMI 1640 HEPES Medium przygotowanym zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Umieść szkiełko w naczyniu do hodowli komórkowych i umieść naczynie na aluminiowym bloku rozgrzanym do 37 stopni Celsjusza.Następnie włóż wtyczki do portów pierwszego i czwartego. Użyj końcówki pipety ze skosem o pojemności 200 mikrolitrów, aby umieścić 15 mikrolitrów zmodyfikowanego medium RPMI 1640 HEPES Medium w trzecim porcie napełniania. Następnie włóż końcówkę pipety do portu drugiego i zasysaj 15 mikrolitrów z umiarkowanie dużą szybkością, co wstępnie wypełni kanał łączący, a także dwa boczne kanały zasilające.Przykryj porty napełniania numer dwa i trzy nakrętkami i umieść szkiełko chemotaksji na stojaku w zamkniętej komorze wilgotnościowej w suchym i wolnym od dwutlenku węgla inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wyizolować makrofagi, wprowadź plastikowy cewnik o rozmiarze 24 do jamy otrzewnej ofiarowanej myszy w wieku od trzech do czterech miesięcy i użyj pięciomililitrowej plastikowej strzykawki do przepłukania jamy lodowatym roztworem soli Hanka bez wapnia i magnezu. Po zebraniu płukanego podłoża do probówki, odwirować je w temperaturze 300 razy G przez 6,5 minuty.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640. Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny komórek od 1 do 20. Następnie użyj urządzenia liczącego, aby policzyć komórki.Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 10 razy 10 do sześciu komórek na mililitr i utrzymywać je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w podgrzewanym bloku aluminiowym. Odpipetuj zawiesinę komórek pięć razy w górę iw dół, aby zmniejszyć zbrylanie, i delikatnie umieść 10 mikrolitrów na trzecim porcie komory chemotaksji. Umieść końcówkę pipety w porcie drugim i powoli wciągnij zawiesinę ogniwa do kanału łączącego.Jak tylko zawiesina ogniw zostanie wprowadzona, wyjmij korki na portach pierwszym i czwartym, aby zatrzymać przepływ, i umieść zaślepki na wszystkich czterech portach napełniania. Następnie umieść szkiełka chemotaksyjne w komorze wilgotności 37 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin. Sprawdź obszar obserwacji za pomocą odwróconego mikroskopu.Następnie umieść korki w pierwszym i drugim porcie napełniania i sprawdź, czy port trzeci jest wypełniony do góry medium i wolny od pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby użyj sterylnej igły strzykawkowej o rozmiarze 27, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie odessać 60 mikrolitrów pożywki za pomocą pipety mechanicznej o pojemności 100 mikrolitrów i umieścić końcówkę w trzecim porcie napełniania.Użyj pierścienia do ustawiania głośności, aby powoli i równomiernie wstrzykiwać medium do zbiornika, aż po jednej do dwóch minut dotrze do górnej części czwartego portu napełniania. Aby napełnić drugi zbiornik, wyjmij wtyczkę z portu pierwszego i powoli włóż ją do portu trzeciego. Zassać 50 mikrolitrów pożywki i umieścić końcówkę pipety w porcie czwartym i powoli wstrzyknąć pożywkę do drugiego zbiornika, tak aby po jednej do dwóch minut dotarła do górnej części pierwszego portu napełniania.Dodaj 495 mikrolitrów pożywki do dwumililitrowej probówki wirówkowej i dodaj pięć mikrolitrów niebieskiej piątki. Krótko zmieszaj mieszaninę, a następnie dodaj 5,4 mikrolitra rekombinowanego dopełniacza myszy C5a i ponownie zmieszaj, aby wymieszać. Upewnij się, że płytkie wgłębienie w górnej części pierwszego portu jest wolne od podłoża i zdeponuj 15 mikrolitrów niebieskiego dopełniacza C5a zawierającego podłoże.Następnie włóż końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do czwartego portu napełniania i powoli obracaj pierścieniem do ustawiania objętości, aby wciągnąć medium do przeciwległego zbiornika. Wciągaj powietrze do krótkiej pionowej kolumny pierwszego portu napełniania, aż interfejs płyn-powietrze znajdzie się w połowie kolumny. Następnie zatkaj port pierwszy, a następnie delikatnie wyjmij pipetę z portu czwartego, upewniając się, że suwak pozostaje na swoim miejscu, i powoli podłącz port czwarty.Aby wykonać obrazowanie poklatkowe, umieść szkiełko chemotaksji na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w inkubator stopniowy i zobrazuj obszar obserwacji za pomocą soczewki obiektywu z 10-krotnym kontrastem fazowym, skupiając się na blaszkach makrofagów. Szkiełko chemotaksyjne używane do poklatkowej mikroskopii wideo makrofagów otrzewnowej myszy ma trzy komory chemotaksji, z których każda ma cztery porty napełniające. Komórki rozsiano w obszarze obserwacji każdej komory.Po dwu-trzygodzinnej inkubacji komory powoli wypełniały się podłożem. Kiedy komórki w obszarze obserwacji zostały sprawdzone, do dwóch trzecich komórek zostało wypłukanych. Ogólnie rzecz biorąc, słabo przylegające komórki B-1 zostały wypłukane, a pozostałe komórki były głównie makrofagami.Aby odróżnić makrofagi od limfocytów B, świeżo wyizolowane komórki znakowano specyficznymi przeciwciałami. Makrofagi oznaczono zieloną fluorescencją, limfocyty B kolorem czerwonym, a jądra komórkowe kolorem niebieskim. Migrację makrofagów badano poprzez wprowadzenie dopełniacza C5a, chemoatraktantu, do jednego z dwóch zbiorników.Zarejestrowano ślady migracji makrofagów migrujących w gradiacji dopełniacza C5. Punkt początkowy każdej ścieżki migracji został znormalizowany do X równa się zero i Y jest równe zero w celu utworzenia wykresu migracji. Następnie obliczono prędkość komórek i wydajność chemotaktyczną poszczególnych makrofagów.Technika ta okazała się przydatna do badania roli podjednostek białka G i GTPaz Rho oraz ruchliwości makrofagów w chemotaksji.

time-lapse-imaging-of-mouse-macrophage-chemotaxis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ten film demonstruje test do monitorowania niezależnych zdarzeń fagocytozy krwinek czerwonych (RBC) za pośrednictwem makrofagów. Mysie immunoglobuliny G (IgG) opsonizowane ludzkie erytrocyty są inkubowane z mysimi makrofagami i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Erytrocyty są pochłaniane przez makrofagi poprzez tworzenie miseczki fagocytarnej i ukierunkowane na degradację lizosomalną.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy makrofagów krwinek czerwonych z opsonizowanymi IgG

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Aby przetestować wpływ chemokiny na rekrutację makrofagów in vivo, do wykrycia ektopowej ekspresji chemokiny użyto całej hybrydyzacji in situ, a do oznaczania makrofagów użyto barwienia immunologicznego. Obrazowanie na żywo wykorzystano do obserwacji migracji makrofagów w czasie rzeczywistym.

Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego chemotaksji makrofagów myszy w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia obserwację morfologii komórek i pomiar prędkości migracji w gradientach chemotaktycznych.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Przeglądaj więcej filmów