Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Tradycyjnie, makrofagi były trudne do zbadania w testach chemotaksji w czasie rzeczywistym, ponieważ komórki poruszają się powoli. Protokół ten umożliwia obrazowanie makrofagów migrujących w gradiencie chemotaktycznym przez okres do sześciu godzin lub dłużej. W porównaniu z testami implantologicznymi, takimi jak testy transferu, technika ta ma tę zaletę, że można obserwować morfologię makrofagów i mierzyć parametry, takie jak prędkość komórki i wydajność chemotaktyczna.

Makrofagi biorą udział w wielu chorobach zapalnych, a technika ta może być przydatna do badania leków mających na celu hamowanie chemotaksji. Może być również stosowany do innych typów komórek, takich jak ludzkie monocyty. Próbując tej techniki po raz pierwszy, najlepiej jest poćwiczyć napełnianie komór chemotaksji przed rozpoczęciem pracy z komórkami.

Jednym z najważniejszych aspektów tej techniki jest unikanie pęcherzyków powietrza. Zacznij od wstępnego napełnienia kanałów łączących jedną lub dwie szkiełka chemotaksji zmodyfikowanym RPMI 1640 HEPES Medium przygotowanym zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Umieść szkiełko w naczyniu do hodowli komórkowych i umieść naczynie na aluminiowym bloku rozgrzanym do 37 stopni Celsjusza.

Następnie włóż wtyczki do portów pierwszego i czwartego. Użyj końcówki pipety ze skosem o pojemności 200 mikrolitrów, aby umieścić 15 mikrolitrów zmodyfikowanego medium RPMI 1640 HEPES Medium w trzecim porcie napełniania. Następnie włóż końcówkę pipety do portu drugiego i zasysaj 15 mikrolitrów z umiarkowanie dużą szybkością, co wstępnie wypełni kanał łączący, a także dwa boczne kanały zasilające.

Przykryj porty napełniania numer dwa i trzy nakrętkami i umieść szkiełko chemotaksji na stojaku w zamkniętej komorze wilgotnościowej w suchym i wolnym od dwutlenku węgla inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wyizolować makrofagi, wprowadź plastikowy cewnik o rozmiarze 24 do jamy otrzewnej ofiarowanej myszy w wieku od trzech do czterech miesięcy i użyj pięciomililitrowej plastikowej strzykawki do przepłukania jamy lodowatym roztworem soli Hanka bez wapnia i magnezu. Po zebraniu płukanego podłoża do probówki, odwirować je w temperaturze 300 razy G przez 6,5 minuty.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640. Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny komórek od 1 do 20. Następnie użyj urządzenia liczącego, aby policzyć komórki.

Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 10 razy 10 do sześciu komórek na mililitr i utrzymywać je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w podgrzewanym bloku aluminiowym. Odpipetuj zawiesinę komórek pięć razy w górę iw dół, aby zmniejszyć zbrylanie, i delikatnie umieść 10 mikrolitrów na trzecim porcie komory chemotaksji. Umieść końcówkę pipety w porcie drugim i powoli wciągnij zawiesinę ogniwa do kanału łączącego.

Jak tylko zawiesina ogniw zostanie wprowadzona, wyjmij korki na portach pierwszym i czwartym, aby zatrzymać przepływ, i umieść zaślepki na wszystkich czterech portach napełniania. Następnie umieść szkiełka chemotaksyjne w komorze wilgotności 37 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin. Sprawdź obszar obserwacji za pomocą odwróconego mikroskopu.

Następnie umieść korki w pierwszym i drugim porcie napełniania i sprawdź, czy port trzeci jest wypełniony do góry medium i wolny od pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby użyj sterylnej igły strzykawkowej o rozmiarze 27, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie odessać 60 mikrolitrów pożywki za pomocą pipety mechanicznej o pojemności 100 mikrolitrów i umieścić końcówkę w trzecim porcie napełniania.

Użyj pierścienia do ustawiania głośności, aby powoli i równomiernie wstrzykiwać medium do zbiornika, aż po jednej do dwóch minut dotrze do górnej części czwartego portu napełniania. Aby napełnić drugi zbiornik, wyjmij wtyczkę z portu pierwszego i powoli włóż ją do portu trzeciego. Zassać 50 mikrolitrów pożywki i umieścić końcówkę pipety w porcie czwartym i powoli wstrzyknąć pożywkę do drugiego zbiornika, tak aby po jednej do dwóch minut dotarła do górnej części pierwszego portu napełniania.

Dodaj 495 mikrolitrów pożywki do dwumililitrowej probówki wirówkowej i dodaj pięć mikrolitrów niebieskiej piątki. Krótko zmieszaj mieszaninę, a następnie dodaj 5,4 mikrolitra rekombinowanego dopełniacza myszy C5a i ponownie zmieszaj, aby wymieszać. Upewnij się, że płytkie wgłębienie w górnej części pierwszego portu jest wolne od podłoża i zdeponuj 15 mikrolitrów niebieskiego dopełniacza C5a zawierającego podłoże.

Następnie włóż końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do czwartego portu napełniania i powoli obracaj pierścieniem do ustawiania objętości, aby wciągnąć medium do przeciwległego zbiornika. Wciągaj powietrze do krótkiej pionowej kolumny pierwszego portu napełniania, aż interfejs płyn-powietrze znajdzie się w połowie kolumny. Następnie zatkaj port pierwszy, a następnie delikatnie wyjmij pipetę z portu czwartego, upewniając się, że suwak pozostaje na swoim miejscu, i powoli podłącz port czwarty.

Aby wykonać obrazowanie poklatkowe, umieść szkiełko chemotaksji na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w inkubator stopniowy i zobrazuj obszar obserwacji za pomocą soczewki obiektywu z 10-krotnym kontrastem fazowym, skupiając się na blaszkach makrofagów. Szkiełko chemotaksyjne używane do poklatkowej mikroskopii wideo makrofagów otrzewnowej myszy ma trzy komory chemotaksji, z których każda ma cztery porty napełniające. Komórki rozsiano w obszarze obserwacji każdej komory.

Po dwu-trzygodzinnej inkubacji komory powoli wypełniały się podłożem. Kiedy komórki w obszarze obserwacji zostały sprawdzone, do dwóch trzecich komórek zostało wypłukanych. Ogólnie rzecz biorąc, słabo przylegające komórki B-1 zostały wypłukane, a pozostałe komórki były głównie makrofagami.

Aby odróżnić makrofagi od limfocytów B, świeżo wyizolowane komórki znakowano specyficznymi przeciwciałami. Makrofagi oznaczono zieloną fluorescencją, limfocyty B kolorem czerwonym, a jądra komórkowe kolorem niebieskim. Migrację makrofagów badano poprzez wprowadzenie dopełniacza C5a, chemoatraktantu, do jednego z dwóch zbiorników.

Zarejestrowano ślady migracji makrofagów migrujących w gradiacji dopełniacza C5. Punkt początkowy każdej ścieżki migracji został znormalizowany do X równa się zero i Y jest równe zero w celu utworzenia wykresu migracji. Następnie obliczono prędkość komórek i wydajność chemotaktyczną poszczególnych makrofagów.

Technika ta okazała się przydatna do badania roli podjednostek białka G i GTPaz Rho oraz ruchliwości makrofagów w chemotaksji.