Mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową dalekiego zasięgu neuronów wzgórka dolnego z niebieskimi i czerwonymi rodopsynami kanałowymi

Mapowanie obwodów wspomagane rodopsyną kanałową jest precyzyjną techniką funkcjonalnego mapowania projekcji neuronowych dalekiego zasięgu. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać to podejście do badania obwodów w słuchowym pniu mózgu. W wycinkach mózgu aksony z wielu źródeł są często mieszane, co utrudnia wyizolowanie poszczególnych danych wejściowych za pomocą stymulacji elektrycznej.

Korzystając z CRACM, to ograniczenie można pokonać. Znalezienie lambda i konsekwentne zdefiniowanie stereotaktycznego układu współrzędnych jest wyzwaniem, podobnie jak utrzymanie krótkiego czasu trwania procedury. Dokładne zaplanowanie wszystkich kroków zwiększy Twój wskaźnik sukcesu.

Zacznij od spryskania obszaru operacyjnego 70% etanolem w celu odkażenia i umieść sterylne zasłony ręcznikowe, aby przykryć obszar operacji. Usuń ściółkę klatki, aby ograniczyć ryzyko uduszenia się z klatki ratunkowej. Następnie umieść poduszkę grzewczą pod klatką i zapewnij źródło pożywienia i wody.

Następnie przenieś zwierzę do ramy stereotaktycznej i kontynuuj znieczulenie. Włóż sondę temperatury doodbytniczej i włącz homeostatyczny regulator temperatury. Następnie nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.

Podawać prewencyjne leki przeciwbólowe. Na koniec ogol skórę głowy elektrycznymi maszynkami do strzyżenia. Zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi wacikami jodu powidonu i 70% etanolu.

Rozpocznij operację od wykonania nacięcia w skórze głowy wzdłuż linii środkowej, zaczynając między uszami i kontynuując rostralnie do oczu, odsłaniając szwy lambda i bregma. Popchnij skórę na bok i w razie potrzeby usuń okostną z odsłoniętej kości. Następnie należy oznaczyć szew lambda markerem chirurgicznym, ustawić końcówkę nanowtryskiwacza tak, aby dotykała tylko lambdy i wyzerować współrzędne mikromanipulatora.

Użyj końcówki nano-iniektora i mikromanipulatora, aby zmierzyć różnicę wysokości między szwami lambda i bregma. Dostosuj wysokość paska palety, aby różnica wysokości lambda i bregma wynosiła plus minus 100 mikrometrów. Zmapuj miejsce wstrzyknięcia za pomocą końcówki nanoiniektora i układu współrzędnych mikromanipulatora i oznacz miejsce markerem chirurgicznym.

Następnie użyj wiertarki mikrosilnikowej z 0,5-milimetrowym zadziorem, aby wykonać kraniotomię w miejscu wstrzyknięcia. Aby zapewnić szeroką transfekcję neuronów w jądrze docelowym, użyj nano-wstrzykiwacza do wykonywania iniekcji na różnych głębokościach w tkance, a w przypadku większych obszarów mózgu, takich jak wzgórek dolny, wykonaj zastrzyki w ciągu dwóch lub więcej penetracji w różnych współrzędnych X i Y. Aby wstrzyknąć wzgórek dolny, należy zdeponować 20 nanolitrów wirusa w odstępach 250 mikrometrów wzdłuż osi Z między 2 250 mikrometrów a 1 750 mikrometrów głębokości.

W przypadku wstrzyknięć w grzbietowe jądro ślimaka należy zdeponować 20 nanolitrów wirusa na głębokości odpowiednio 4 750 mikrometrów i 4 550 mikrometrów. Po wstrzyknięciu na każdej współrzędnej Z należy odczekać dwie do trzech minut przed przeniesieniem wtryskiwacza do następnej współrzędnej Z, aby dać czas na dyfuzję wirusa z dala od miejsca wstrzyknięcia, zmniejszając prawdopodobieństwo, że wirus zostanie zassany do drogi iniekcyjnej po zmianie położenia nanoiniektora. Następnie, po ostatnim wstrzyknięciu, odczekaj od trzech do pięciu minut przed wycofaniem nano-wstrzykiwacza z mózgu.

Gdy nanowstrzykiwacz zostanie usunięty z mózgu między penetracjami i między zwierzętami, wyrzuć niewielką objętość wirusa z końcówki, aby sprawdzić, czy końcówka nie jest zatkana. Po wstrzyknięciu użyj sterylnego PBS, aby zwilżyć przycięte krawędzie skóry głowy, a następnie delikatnie przesuń skórę z powrotem w kierunku linii środkowej. Zamknij ranę prostymi szwami przerywanymi za pomocą szwów nylonowych 6-0.

Następnie nałóż 0,5 na jeden mililitr 2% galaretki lidokainowej na ranę. Zdejmij nauszniki i sondę temperatury, włącz izofluran, wyjmij zwierzę z palety i przenieś je do klatki rekonwalescencji. Na koniec uważnie monitoruj odzyskiwanie.

Gdy zwierzę jest w pełni przytomne, porusza się i nie wykazuje żadnych oznak bólu lub niepokoju, przenieś je z powrotem do klatki i zwróć klatkę do wiwarium. Użyj standardowych metod zaciskania krosowego, aby nagrywać. Zacznij od umieszczenia plastra w komorze rejestracyjnej pod mikroskopem pionowym o stałym stopniu i stale obficie obficie ze sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym w ilości dwóch mililitrów na minutę.

Następnie załataj neurony pod kontrolą wzrokową za pomocą odpowiedniego wzmacniacza patch clamp. Wreszcie, podczas nagrań hurtowych, aktywuj Chronos, dostarczając krótkie impulsy światła o długości 470 nanometrów lub ChrimsonR poprzez krótkie impulsy światła o długości 580 nanometrów przez dostępne na rynku diody LED. Wyniki wskazały, że wstrzyknięcie ChrimsonR doprowadziło do silnej ekspresji w DCN z fluorescencją tdTomato widoczną w komórkach i włóknach.

W przeciwległym ICC włókna silnie znakowane tdTomato były wyraźnie widoczne po trzech tygodniach, co wykazało zdolność konstruktu ChrimsonR-tdTomato do transportu dalekiego zasięgu po wstrzyknięciu do jąder słuchowych pnia mózgu. Aktywacja optyczna ChrimsonR wywołała EPSP w neuronach IC VIP, co wskazuje, że ChrimsonR jest użytecznym narzędziem do eksperymentów CRACM na dużą odległość, gdy parametry eksperymentalne wymagają użycia światła czerwonego zamiast niebieskiego. Odkryliśmy jednak, że ChrimsonR był łatwo aktywowany niebieskim światłem, wykazując ten sam próg aktywacji niebieskiego światła, co Chronos.

W przypadku tego protokołu najważniejsze jest, aby upewnić się, że współrzędne stereotaktyczne są prawidłowe i potwierdzić, że wirus uległ ekspresji tylko w docelowym obszarze mózgu. Wymieniając wirus Chronos ChrimsonR na inny wirus, na przykład wirus Flex specyficzny dla komórek, możesz odpowiedzieć na kilka pytań anatomicznych lub fizjologicznych bez zmiany protokołu operacji.