Name: Mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową dalekiego zasięgu neuronów wzgórka dolnego z niebieskimi i czerwonymi rodopsynami kanałowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę CRACM do mapowania dalekiego zasięgu projekcji neuronowych w pniu mózgu słuchowym przy użyciu ChrimsonR. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie połączeń neuronalnych z wykorzystaniem optycznej stymulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez stypendium badawcze Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, numer projektu 401540516, do DG) oraz grant National Institutes of Health R56 DC016880 (MTR).

Uzyskaj zgodę od lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) i przestrzegaj wytycznych NIH dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie procedury w tym protokole zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Michigan i były zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowania do zabiegu
<ol>
	<li>Wykonuj operacje w warunkach aseptycznych. Autoklaw/sterylizuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne przed zabiegiem. Nosić fartuch chirurgiczny i maskę do operacji.</li>
	<li>Zdezynfekuj obszar operacyjny (spryskaj i przetrzyj 70% etanolem) i umieść sterylne zasłony ręcznikowe, aby przykryć obszar operacji.</li>
	<li>Przygotuj klatkę rekonwalescencji. Usuń ściółkę klatki, aby ograniczyć ryzyko uduszenia. Umieść poduszkę grzewczą pod klatką. Zapewnij źródło pożywienia i wody.</li>
	<li>Pociągnij szklaną kapilarnę do nanowtryskiwacza na ściągaczu do pipet. Intensywne ciepło żarnika grzewczego podczas procesu ciągnięcia wysterylizuje szklaną kapilarę. Odetnij lub odłam końcówkę, aby uzyskać otwór o średnicy około 5 μm.</li>
	<li>Skoś końcówkę kapilary pod kątem około 30°, aby poprawić penetrację tkanki i zmniejszyć zatykanie. Zapełnij kapilarę olejem mineralnym i włóż do wtryskiwacza o pojemności nanolitrów.</li>
	<li>Otrzymać podwielokrotność pożądanego rAAV kodującego rodopsynę kanałową i rozcieńczyć do żądanego miana przy użyciu sterylnego PBS. 
	UWAGA: Odkryliśmy, że rAAV serotypu 1 działają dobrze w przypadku transfekcji słuchowych jąder pnia mózgu. W szczególności rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (rodopsyna kanałowa aktywowana niebieskim światłem) i rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (rodopsyna kanałowa z przesunięciem ku czerwieni), które są dostępne w publicznie dostępnych repozytoriach i rdzeniach wektorowych, konsekwentnie zapewniają wysokie poziomy ekspresji i dobry transport aksonalny rodopsyn kanałowych dalekiego zasięgu, potrzebny do eksperymentów CRACM.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami wtryskiwacza, aby napełnić kapilarę z przodu 1-3 μl rAAV w sterylnym PBS.</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie 3% izofluranem w tlenie dostarczanym przez skalibrowany parownik izofluranowy. Obserwuj mysz, aż oddech stanie się głęboki i powolny, a odruch szczypania palców u nóg nie będzie obecny, około 3-5 minut.</li>
	<li>Przenieś zwierzę do klatki stereotaktycznej. Zabezpiecz głowę zwierzęcia, kładąc pysk na drążku podniebienia z maską do znieczulenia gazowego i umieszczając nieperforujące paski uszne w obu kanałach słuchowych.</li>
	<li>Włóż sondę temperatury doodbytniczej i włącz homeostatyczny regulator temperatury.</li>
	<li>Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Podać zapobiegawcze leki przeciwbólowe (np. wstrzyknięcie podskórne 5 mg/kg karprofenu).</li>
	<li>Dostosuj izofluran do 1-2,5%, w zależności od głębokości znieczulenia. Podczas zabiegu należy monitorować temperaturę, oddech i kolor błon śluzowych co najmniej co 15 minut.</li>
	<li>Gol skórę głowy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia. Przygotuj skórę głowy w asepcie za pomocą trzech naprzemiennych wacików z jodonem powidonu i 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w skórze głowy wzdłuż linii środkowej, zaczynając między uszami i kontynuując rostralnie do oczu, odsłaniając szwy lambda i bregma. Popchnij skórę na bok i w razie potrzeby usuń okostną z odsłoniętej kości.</li>
	<li>Zaznacz szew lambda sterylnym markerem chirurgicznym, ustaw końcówkę nanowtryskiwacza tak, aby dotykała lambdy i wyzeruj współrzędne mikromanipulatora. Użyj końcówki nanoiniektora i mikromanipulatora, aby zmierzyć różnicę wysokości między szwami lambda i bregma. Dostosuj wysokość listwy podniebienia, aby różnica wysokości lambda i bregma wynosiła ± 100 μm.</li>
	<li>Zmapuj miejsce wstrzyknięcia za pomocą końcówki nanoiniektora i układu współrzędnych mikromanipulatora i oznacz miejsce sterylnym markerem chirurgicznym. Aby wstrzyknąć IC lub DCN myszy P21-P30, użyj współrzędnych względem szwu lambda, jak pokazano w tabeli 1. Zauważ, że głębokość Z w naszych współrzędnych jest mierzona od powierzchni czaszki przy lambdzie.</li>
	<li>Użyj wiertarki mikrosilnikowej ze sterylnym zadziorem wiertarskim 0,5 mm, aby wykonać kraniotomię w miejscu wstrzyknięcia.</li>
	<li>Aby zapewnić szeroką transfekcję neuronów w jądrze docelowym, należy wykonywać iniekcje na różnych głębokościach w głąb tkanki (Tabela 1, współrzędne Z), a w przypadku większych obszarów mózgu, takich jak IC, wykonywać zastrzyki w trakcie dwóch lub więcej penetracji na różnych współrzędnych X i Y (Tabela 1, Penetracja prawego IC 1 i Penetracja prawego IC 2).</li>
	<li>Wykonywać wstrzyknięcia. W przypadku iniekcji IC należy zdeponować 20 nL wirusa w odstępach 250 μm wzdłuż osi Z (głębokość wstrzyknięcia) między głębokością od 2 250 μm do 1750 μm. W przypadku wstrzyknięć DCN należy umieścić 20 nl wirusa na głębokości odpowiednio 4 750 μm i 4 550 μm.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu na każdej współrzędnej Z, odczekaj 2-3 minuty przed przeniesieniem wtryskiwacza do następnej współrzędnej Z. Da to czas na dyfuzję wirusa z dala od miejsca wstrzyknięcia, zmniejszając prawdopodobieństwo, że wirus zostanie zassany do drogi iniekcyjnej po zmianie położenia nanowstrzykiwacza.</li>
	<li>Po ostatnim wstrzyknięciu w penetrację należy odczekać 3-5 minut przed wycofaniem nanowstrzykiwacza z mózgu.</li>
	<li>Po usunięciu nanowstrzykiwacza z mózgu między penetracjami i między zwierzętami, wyrzuć niewielką objętość wirusa z końcówki, aby sprawdzić, czy końcówka nie jest zatkana.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu użyj sterylnego PBS, aby zwilżyć przycięte krawędzie skóry głowy, a następnie delikatnie przesuń skórę z powrotem w kierunku linii środkowej. Zamknij ranę prostymi szwami przerywanymi za pomocą szwów nylonowych 6-0 (0,7 metra).</li>
	<li>Nałóż 0,5-1 ml 2% żelu lidokainowego na ranę.</li>
	<li>Zdejmij nauszniki i sondę temperatury, wyłącz izofluran, wyjmij mysz z paska podniebienia i przenieś ją do klatki odzyskiwania.</li>
	<li>Uważnie monitoruj odzyskiwanie. Gdy zwierzę jest w pełni przytomne, porusza się i nie wykazuje żadnych oznak bólu lub niepokoju, przenieś je z powrotem do klatki i zwróć klatkę do wiwarium.</li>
	<li>Jeśli operacje będą wykonywane na wielu zwierzętach w ciągu jednego dnia, użyj gorącego sterylizatora do kulek, aby zdezynfekować narzędzia chirurgiczne i wiertło przed następną operacją.</li>
</ol>
3. Obserwacja chirurgiczna
<ol>
	<li>Codziennie sprawdzaj zwierzęta pod kątem zamknięcia rany, infekcji lub oznak bólu lub niepokoju przez następne 10 dni, przestrzegając wytycznych instytucji dotyczących opieki nad zwierzętami.</li>
	<li>Należy odczekać 3-4 tygodnie przed wykorzystaniem zwierząt w eksperymentach, aby umożliwić optymalną ekspresję rodopsyn kanałowych.</li>
</ol>
4. Przygotowanie wycinka mózgu i potwierdzenie celu wstrzyknięcia
<ol>
	<li>W przypadku CRACM należy użyć ostro przygotowanych wycinków mózgu od transfekowanych zwierząt w standardowych eksperymentach elektrofizjologicznych in vitro, opisanych tutaj tylko pokrótce (bardziej szczegółowy opis można znaleźć w Goyer et al. 201927).</li>
	<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) zawierający (w mM): 125 NaCl, 12,5 D-glukozy, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 CaCl2, 1MgSO4. Pęcherzyk ACSF do pH 7,4 z 5% CO2 w 95% O2 .</li>
	<li>Wykonaj wszystkie poniższe czynności, w tym elektrofizjologię in vitro, w bliskiej ciemności lub w czerwonym świetle, aby ograniczyć aktywację rodopsyn kanałowych.</li>
	<li>Głęboko znieczul mysz izofluranem i szybko ją zdekapituj. Szybko wypreparuj mózg w temperaturze ~34 °C ACSF.</li>
	<li>Pociąć plastry koronalne (200-250 μm) zawierające IC w ~34 °C ACSF za pomocą wibrującego mikrotomu i inkubować plastry w temperaturze 34 °C przez 30 minut w komorze wypełnionej ACSF z pęcherzykami 5% CO2 w 95% O2 . Po inkubacji przechowuj plastry w temperaturze pokojowej do czasu wykorzystania ich do nagrań.</li>
	<li>Jeśli celem wstrzyknięcia nie był IC, wytnij dodatkowe wycinki koronalne wstrzykniętego obszaru mózgu i sprawdź transfekcję jądra docelowego pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jeśli nie ma transfekcji w jądrze docelowym lub dodatkowa transfekcja w różnych obszarach mózgu, nie kontynuuj eksperymentu.</li>
</ol>
5. Zapis in vitro i eksperyment CRACM
UWAGA: Aby zapewnić optyczną stymulację Chronosa i ChrimsonR, używamy diod LED sprzężonych z portem epifluorescencji mikroskopu. Jednak zamiast diod LED można używać laserów. W przypadku korzystania z laserów należy uzyskać uprzednią zgodę instytucjonalnych urzędników ds. bezpieczeństwa i postępować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpiecznego użytkowania lasera.
<ol>
	<li>Wyciągnij elektrody ze szkła borokrzemianowego do rezystancji 3,5-4,5 MΩ. Roztwór wewnętrzny elektrody powinien zawierać (w mM): 115 K-glukonianu, 7,73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 fosfokreatynę, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, uzupełniony 0,1% biocytyną (w/v), pH dostosowane do 7,3 z KOH i osmolalność do 290 mOsm/kg z sacharozą.</li>
	<li>Aby dokonać nagrań, użyj standardowych metod zacisku krosowego. Umieść plasterek w komorze nagraniowej pod mikroskopem pionowym o stałym stopniu i kontynuuj perfuzję z ACSF z prędkością ~ 2 ml / min. Prowadź nagrania w temperaturze zbliżonej do fizjologicznej (~34-36 °C).</li>
	<li>Łataj neurony pod kontrolą wizualną za pomocą odpowiedniego wzmacniacza z zaciskiem krosowym. Skorygowana rezystancja szeregowa, pojemność pipety i potencjał złącza cieczy.</li>
	<li>Podczas nagrań całych komórek aktywuj Chronos, dostarczając krótkie impulsy (1-5 ms) światła 470 nm lub ChrimsonR poprzez krótkie impulsy światła 580 nm przez dostępne na rynku diody LED. Określ próg aktywacji opsyny i użyj protokołu minimalnej stymulacji, aby wywołać potencjały postsynaptyczne. Ogólnie rzecz biorąc, należy użyć najkrótszego czasu trwania bodźca, który wywołuje PSP, i ustawić moc optyczną na 120% mocy progowej wymaganej do uruchomienia PSP.</li>
	<li>Aby potwierdzić, że zarejestrowane zmiany potencjału błonowego są rzeczywiście synaptycznymi wejściami do neuronu, podczas eksperymentu można przemyć standardowych antagonistów pobudzających/hamujących receptorów postsynaptycznych. Aby zbadać różne wkłady receptorów w PSP (np. receptory NMDA i AMPA), można wprowadzić odpowiednich antagonistów receptorów. Dla każdego antagonisty receptora działanie leku powinno się odwrócić po wypłukaniu.</li>
	<li>Wykorzystaj opóźnienie, fluktuację i niezawodność PSP, aby potwierdzić, że aktywowane światłem wejścia synaptyczne pochodzą z bezpośredniej, optycznej aktywacji synaps na zarejestrowanym neuronie, w przeciwieństwie do aktywacji synaps eksprymujących rodopsynę kanałową na neuronze pośrednim, który synapsuje na zarejestrowanym neuronie. Ogólnie rzecz biorąc, niskie opóźnienie (<2 ms), niski jitter (odchylenie standardowe opóźnienia <1 ms) i wysoka niezawodność (>50%) wskazują na bezpośrednie połączenie synaptyczne od neuronu presynaptycznego eksprymującego rodopsynę kanałową do zarejestrowanego neuronu.</li>
</ol>

<ol><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li>
<li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Progress+and+Prospects%3A+Recombinant+adeno-associated+virus+%28rAAV%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li>
<li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+%28rAAV%29+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li>
<li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li>
<li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReaChR%3A+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li>
<li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52(2018).</li>
<li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li>
<li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li>
<li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485(2018).</li>
<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li>
<li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat%3A+A+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li>
<li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat%3A+Possible+substrates+for+binaural+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li>
<li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+chiasm%3A+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li>
<li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li>
<li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li>
<li>Saldaña, E., Merchań, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li>
<li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li>
<li>Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcortical+pathways%3A+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li>
<li>Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWiner%2C+JA+%22The+inferior+colliculus%3A+with+168+illustrations%22">The inferior colliculus: with 168 illustrations</a>. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).</li>
<li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Odkryliśmy, że CRACM jest potężną techniką identyfikacji i charakterystyki sygnałów synaptycznych dalekiego zasięgu do neuronów w układzie scalonym myszy. Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, osiągnęliśmy solidną transfekcję neuronów w DCN i IC, a także niezawodny transport aksonalny Chronosa i ChrimsonR do zakończeń synaptycznych w IC. Dodatkowo wykazaliśmy, że technika ta umożliwia pomiar i analizę zdarzeń postsynaptycznych, w tym amplitudy PSP, połowy szerokości, czasu zaniku i farmakologii receptorów. Nasz...

Połączenia synaptyczne są kluczowe dla funkcjonowania obwodów neuronowych, ale dokładna topologia i fizjologia synaps w obwodach neuronowych są często trudne do zbadania eksperymentalnie. Dzieje się tak, ponieważ stymulacja elektryczna, tradycyjne narzędzie elektrofizjologii komórkowej, bezkrytycznie aktywuje aksony w pobliżu miejsca stymulacji, aw większości obszarów mózgu aksony z różnych źródeł (lokalnych, wstępujących i/lub opadających) przeplatają się. Jednak dzięki zastosowaniu mapowania obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową (CRACM)1,2, to ograniczenie można teraz przezwyciężyć3. Rodopsyna kanałowa (ChR2) jest aktywowanym światłem, selektywnym kationowo kanałem jonowym, pierwotnie występującym w zielonej aldze Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 może być aktywowany przez niebieskie światło o długości fali około 450-490 nm, depolaryzując komórkę poprzez napływ kationów. ChR2 został po raz pierwszy opisany i poddany ekspresji w oocytach Xenopus przez Nagela i współpracowników4. Krótko po tym, Boyden i współpracownicy5 wyrazili ChR2 w neuronach ssaków i wykazali, że mogą użyć impulsów świetlnych do niezawodnego kontrolowania skoków w milisekundowej skali czasowej, indukując potencjały czynnościowe ~10 ms po aktywacji ChR2 niebieskim światłem. Ostatnio odkryto kanały optogenetyczne o jeszcze szybszej kinetyce (np. Chronos6).
Podstawowym podejściem do eksperymentu CRACM jest transfekcja populacji przypuszczalnych neuronów presynaptycznych za pomocą rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV), który przenosi informację genetyczną dla rodopsyny kanałowej. Transfekcja neuronów za pomocą rAAV prowadzi do ekspresji kodowanej rodopsyny kanałowej. Zazwyczaj rodopsyna kanałowa jest znakowana białkiem fluorescencyjnym, takim jak GFP (zielone białko fluorescencyjne) lub tdTomato (czerwone białko fluorescencyjne), dzięki czemu transfekcję neuronów w regionie docelowym można łatwo potwierdzić za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Ponieważ rAAV są niepatogenne, mają niski potencjał zapalny i długotrwałą ekspresję genów7,8, stały się standardową techniką dostarczania rodopsyn kanałowych do neuronów. Jeśli po transfekcji przypuszczalnej presynaptycznej populacji neuronów, aktywacja rodopsyny kanałowej poprzez błyski świetlne wywołuje potencjały postsynaptyczne lub prądy w docelowych neuronach, jest to dowód na połączenie aksonalne między transfekowanym jądrem a zarejestrowaną komórką. Ponieważ odcięte aksony w eksperymentach z wycinkami mózgu mogą być napędzane do uwalniania neuroprzekaźnika poprzez aktywację rodopsyny kanałowej, jądra, które leżą poza ostrym wycinkiem, ale wysyłają aksony do postsynaptycznego regionu mózgu, można zidentyfikować za pomocą CRACM. Siła tej techniki polega na tym, że łączność i fizjologia zidentyfikowanych wejść synaptycznych dalekiego zasięgu może być bezpośrednio badana.
Oprócz rodopsyn kanałowych, które są pobudzane przez niebieskie światło, badacze zidentyfikowali ostatnio kilka przesuniętych ku czerwieni rodopsynów kanałowych9,10, w tym Chrimson i jego szybszy odpowiednik ChrimsonR, które są wzbudzane czerwonym światłem o długości ~660 nm6. Opsyny z przesunięciem ku czerwieni są interesujące, ponieważ światło czerwone przenika przez tkankę lepiej niż światło niebieskie, a światło czerwone może mieć niższą cytotoksyczność niż światło niebieskie10,11,12. Rodofotosyny kanałowe z przesunięciem ku czerwieni otwierają również możliwość dwukolorowych eksperymentów CRACM, w których zbieżność aksonów z różnych jąder na tym samym neuronie może być testowana w jednym eksperymencie6,13,14. Jednak obecne opsyny z przesunięciem ku czerwieni często wykazują niepożądaną aktywację krzyżową ze światłem niebieskim15,16,17, co utrudnia przeprowadzenie dwóch eksperymentów kolorystycznych. Ponadto niektóre raporty wskazują, że ChrimsonR ulega ograniczonemu transportowi aksonalnemu, co może utrudnić korzystanie z ChrimsonR w eksperymentach CRACM16,17.
Prawie wszystkie wznoszące się projekcje z dolnego jądra słuchowego pnia mózgu zbiegają się w wzgórku dolnym (IC), śródmózgowiu centralnym szlaku słuchowym. Obejmuje to projekcje z jądra ślimaka (CN)18,19, większość górnego kompleksu oliwkowego (SOC)20 oraz jądra grzbietowe (DNLL) i brzuszne (VNLL) bocznego lemniscus21. Dodatkowo, duża opadająca projekcja z kory słuchowej kończy się w IC18,19,20,21,22, a same neurony IC synapsują szeroko w lokalnych i przeciwległych płatach IC23. Przenikanie się aksonów z wielu źródeł utrudniło sondowanie obwodów IC za pomocą stymulacji elektrycznej24. W rezultacie, mimo że neurony w IC wykonują obliczenia ważne dla lokalizacji dźwięku i identyfikacji mowy i innych dźwięków komunikacyjnych25,26, organizacja obwodów neuronalnych w IC jest w dużej mierze nieznana. Niedawno zidentyfikowaliśmy neurony VIP jako pierwszą molekularnie identyfikowalną klasę neuronów w klasie IC<sup="xref">27. Neurony VIP to gwiaździste neurony glutaminergowe, które rzutują na kilka celów dalekiego zasięgu, w tym wzgórze słuchowe i wzgórek górny. Jesteśmy teraz w stanie określić źródła i funkcję lokalnych i dalekiego zasięgu sygnałów wejściowych do neuronów VIP oraz określić, w jaki sposób te połączenia obwodów przyczyniają się do przetwarzania dźwięku.
Przedstawiony tutaj protokół jest dostosowany do badania wejść synaptycznych do neuronów VIP w IC myszy, szczególnie z przeciwległego IC i DCN (Rysunek 1). Protokół można łatwo dostosować do różnych źródeł danych wejściowych, innego typu neuronu lub zupełnie innego obszaru mózgu. Pokazujemy również, że ChrimsonR jest skuteczną rodopsyną kanałową przesuniętą ku czerwieni do mapowania obwodów dalekiego zasięgu w słuchowym pniu mózgu. Wykazaliśmy jednak, że ChrimsonR jest silnie aktywowany przez niebieskie światło, nawet przy niskich intensywnościach, a zatem, aby połączyć ChrimsonR z Chronosem w dwukolorowych eksperymentach CRACM, należy zastosować staranne kontrole, aby zapobiec krzyżowej aktywacji ChrimsonR.

<table><tbody><tr><td>AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td><td>Addgene</td><td>59171-AAV1</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td><td>Addgene</td><td>59170-AAV1</td><td></td></tr><tr><td>Myszy reporterowe Ai14 (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock #007914</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynowy (590nm) LUXEON Rebel LED</td><td>Luxeon Star LED</td><td>SP-01-A8</td><td></td></tr><tr><td>Niebieskie (470nm) LUXEON Rebel LED</td><td>Luxeon Star LED</td><td>SP-01-B4</td><td></td></tr><tr><td>Carproject (carprofen)</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>59149</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane Drummond</td><td>Firma Naukowa Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject 3</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-300-207</td><td></td></tr><tr><td>Ukosowanie elektrod</td><td>Sutter Instrument</td><td>FG-BV10-D</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 6-0 (0,8 metra) nici nylonowe Etikon</td><td></td><td>lokalna apteka Stała mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>stage</td><td>dowolna</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt głowicy do znieczulenia gazowego</td><td>David Kopf Instrumenty</td><td>933-B</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do chirurgii ogólnej</td><td>Narzędzia do nauki o naczyniu</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Złota maszynka do strzyżenia zwierząt</td><td>A5 Oster</td><td>078005-010-003</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Niestandardowa konstrukcja</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Komora indukcyjna z kapturem z systemem próżniowym</td><td>Patterson Scientific</td><td>78917760</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator gorących kulek Steri 250</td><td>Inotech</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu 10%</td><td>MedChoice</td><td>lokalna apteka</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranu</td><td>Patterson Scientific</td><td>07-8703592</td><td></td></tr><tr><td>Galaretka do stosowania miejscowego lidokainy 2%</td><td>Akorn</td><td>lokalna apteka</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka mikrosilnikowa 1050</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>7094351</td><td></td></tr><tr><td>Wiertła z mikrosilnikiem 0,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/R</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Sztuczne łzy</td><td>Akorn</td><td>lokalna apteka</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod P-1000</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz zaciskowy krosowy wraz z oprogramowaniem do akwizycji danych</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Przenośna maszyna do znieczulania</td><td>Patterson Naukowy</td><td>07-8914724</td><td></td></tr><tr><td>Rama steroetyczna, dla małych zwierząt</td><td>, David Kopf Instrumenty</td><td>, 930-B</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe chemikalia</td><td>, lokalni sprzedawcy,</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe rozwiązania</td><td></td><td></td><td></td>do obrazowania</tr><tr><td>Sterylne zasłony ręcznikowe</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Marker chirurgiczny</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Niestandardowa konstrukcja</td><td>Nie dotyczy Wibratom</td><td></td></tr><tr><td></td><td>dowolny</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Myszy VIP-IRES-Cre (Viptm1(cre)Zjh/J)</td><td>Jackson</td><td>Laboratory stock #010908</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową dalekiego zasięgu neuronów wzgórka dolnego z niebieskimi i czerwonymi rodopsynami kanałowymi

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

Podczas badania obwodów neuronowych, standardowym ograniczeniem metody in vitro jest to, że aksony z wielu źródeł są często mieszane, co utrudnia odizolowanie sygnałów wejściowych od poszczególnych źródeł za pomocą stymulacji elektrycznej. Jednak dzięki zastosowaniu mapowania obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową (CRACM) można teraz przezwyciężyć to ograniczenie. W tym miejscu przedstawiamy metodę wykorzystania CRACM do mapowania wstępujących danych wejściowych z dolnych jąder słuchowych pnia mózgu i danych wejściowych spoidła do zidentyfikowanej klasy neuronów w wzgórku dolnym (IC), jądrze śródmózgowia układu słuchowego. W IC aksony lokalne, spoidłowe, wstępujące i opadające są silnie splecione, a zatem nie do odróżnienia od stymulacji elektrycznej. Poprzez wstrzyknięcie konstruktu wirusowego w celu wywołania ekspresji rodopsyny kanałowej w jądrze presynaptycznym, a następnie zapis klamry łatowej w celu scharakteryzowania obecności i fizjologii wejść synaptycznych eksprymujących rodopsynę kanałową, projekcje z określonego źródła do określonej populacji neuronów IC można mapować z dokładnością specyficzną dla typu komórki. Pokazujemy, że to podejście działa zarówno z Chronosem, rodopsyną kanałową aktywowaną niebieskim światłem, jak i ChrimsonR, rodopsyną kanałową przesuniętą ku czerwieni. W przeciwieństwie do poprzednich doniesień z przodomózgowia, stwierdzamy, że ChrimsonR jest silnie transportowany przez aksony głównych neuronów grzbietowego jądra ślimakowego, co wskazuje, że ChrimsonR może być użytecznym narzędziem do eksperymentów CRACM w pniu mózgu. Przedstawiony tutaj protokół zawiera szczegółowe opisy operacji iniekcji wirusa wewnątrzczaszkowego, w tym współrzędne stereotaktyczne do celowania w iniekcje do grzbietowego jądra ślimaka i IC myszy, a także sposób łączenia zapisu klamry z całych komórek z aktywacją rodopsyny kanałowej w celu zbadania projekcji dalekiego zasięgu do neuronów IC. Chociaż protokół ten jest dostosowany do charakteryzowania sygnałów słuchowych do IC, można go łatwo dostosować do badania innych projekcji dalekiego zasięgu w słuchowym pniu mózgu i poza nim.

Skrzyżowano myszy VIP-IRES-Cre (Viptm1(cre)Zjh/J) i myszy z reporterem Cre Ai14 (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J), aby uzyskać potomstwo F1, w którym neurony VIP wykazują ekspresję białka fluorescencyjnego tdTomato. Wykorzystano potomstwo F1 obu płci w wieku od 21. do 70. dnia postnatalnego (P). W badaniu wykorzystano łącznie 22 zwierzęta.
Stereotaksyczne wstrzyknięcie AAV1.Syn....

Mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową (CRACM) to precyzyjna technika funkcjonalnego mapowania projekcji neuronalnych dalekiego zasięgu pomiędzy anatomicznie i/lub genetycznie zidentyfikowanymi grupami neuronów. Tutaj opisujemy, jak wykorzystać CRACM do mapowania słuchowych połączeń pnia mózgu, w tym za pomocą opsyny przesuniętej ku czerwieni, ChrimsonR.

Mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową dalekiego zasięgu neuronów wzgórka dolnego z niebieskimi i czerwonymi rodopsynami kanałowymi

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

Mapowanie obwodów wspomagane rodopsyną kanałową jest precyzyjną techniką funkcjonalnego mapowania projekcji neuronowych dalekiego zasięgu. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać to podejście do badania obwodów w słuchowym pniu mózgu. W wycinkach mózgu aksony z wielu źródeł są często mieszane, co utrudnia wyizolowanie poszczególnych danych wejściowych za pomocą stymulacji elektrycznej.Korzystając z CRACM, to ograniczenie można pokonać. Znalezienie lambda i konsekwentne zdefiniowanie stereotaktycznego układu współrzędnych jest wyzwaniem, podobnie jak utrzymanie krótkiego czasu trwania procedury. Dokładne zaplanowanie wszystkich kroków zwiększy Twój wskaźnik sukcesu.Zacznij od spryskania obszaru operacyjnego 70% etanolem w celu odkażenia i umieść sterylne zasłony ręcznikowe, aby przykryć obszar operacji. Usuń ściółkę klatki, aby ograniczyć ryzyko uduszenia się z klatki ratunkowej. Następnie umieść poduszkę grzewczą pod klatką i zapewnij źródło pożywienia i wody.Następnie przenieś zwierzę do ramy stereotaktycznej i kontynuuj znieczulenie. Włóż sondę temperatury doodbytniczej i włącz homeostatyczny regulator temperatury. Następnie nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.Podawać prewencyjne leki przeciwbólowe. Na koniec ogol skórę głowy elektrycznymi maszynkami do strzyżenia. Zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi wacikami jodu powidonu i 70% etanolu.Rozpocznij operację od wykonania nacięcia w skórze głowy wzdłuż linii środkowej, zaczynając między uszami i kontynuując rostralnie do oczu, odsłaniając szwy lambda i bregma. Popchnij skórę na bok i w razie potrzeby usuń okostną z odsłoniętej kości. Następnie należy oznaczyć szew lambda markerem chirurgicznym, ustawić końcówkę nanowtryskiwacza tak, aby dotykała tylko lambdy i wyzerować współrzędne mikromanipulatora.Użyj końcówki nano-iniektora i mikromanipulatora, aby zmierzyć różnicę wysokości między szwami lambda i bregma. Dostosuj wysokość paska palety, aby różnica wysokości lambda i bregma wynosiła plus minus 100 mikrometrów. Zmapuj miejsce wstrzyknięcia za pomocą końcówki nanoiniektora i układu współrzędnych mikromanipulatora i oznacz miejsce markerem chirurgicznym.Następnie użyj wiertarki mikrosilnikowej z 0,5-milimetrowym zadziorem, aby wykonać kraniotomię w miejscu wstrzyknięcia. Aby zapewnić szeroką transfekcję neuronów w jądrze docelowym, użyj nano-wstrzykiwacza do wykonywania iniekcji na różnych głębokościach w tkance, a w przypadku większych obszarów mózgu, takich jak wzgórek dolny, wykonaj zastrzyki w ciągu dwóch lub więcej penetracji w różnych współrzędnych X i Y. Aby wstrzyknąć wzgórek dolny, należy zdeponować 20 nanolitrów wirusa w odstępach 250 mikrometrów wzdłuż osi Z między 2 250 mikrometrów a 1 750 mikrometrów głębokości.W przypadku wstrzyknięć w grzbietowe jądro ślimaka należy zdeponować 20 nanolitrów wirusa na głębokości odpowiednio 4 750 mikrometrów i 4 550 mikrometrów. Po wstrzyknięciu na każdej współrzędnej Z należy odczekać dwie do trzech minut przed przeniesieniem wtryskiwacza do następnej współrzędnej Z, aby dać czas na dyfuzję wirusa z dala od miejsca wstrzyknięcia, zmniejszając prawdopodobieństwo, że wirus zostanie zassany do drogi iniekcyjnej po zmianie położenia nanoiniektora. Następnie, po ostatnim wstrzyknięciu, odczekaj od trzech do pięciu minut przed wycofaniem nano-wstrzykiwacza z mózgu.Gdy nanowstrzykiwacz zostanie usunięty z mózgu między penetracjami i między zwierzętami, wyrzuć niewielką objętość wirusa z końcówki, aby sprawdzić, czy końcówka nie jest zatkana. Po wstrzyknięciu użyj sterylnego PBS, aby zwilżyć przycięte krawędzie skóry głowy, a następnie delikatnie przesuń skórę z powrotem w kierunku linii środkowej. Zamknij ranę prostymi szwami przerywanymi za pomocą szwów nylonowych 6-0.Następnie nałóż 0,5 na jeden mililitr 2% galaretki lidokainowej na ranę. Zdejmij nauszniki i sondę temperatury, włącz izofluran, wyjmij zwierzę z palety i przenieś je do klatki rekonwalescencji. Na koniec uważnie monitoruj odzyskiwanie.Gdy zwierzę jest w pełni przytomne, porusza się i nie wykazuje żadnych oznak bólu lub niepokoju, przenieś je z powrotem do klatki i zwróć klatkę do wiwarium. Użyj standardowych metod zaciskania krosowego, aby nagrywać. Zacznij od umieszczenia plastra w komorze rejestracyjnej pod mikroskopem pionowym o stałym stopniu i stale obficie obficie ze sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym w ilości dwóch mililitrów na minutę.Następnie załataj neurony pod kontrolą wzrokową za pomocą odpowiedniego wzmacniacza patch clamp. Wreszcie, podczas nagrań hurtowych, aktywuj Chronos, dostarczając krótkie impulsy światła o długości 470 nanometrów lub ChrimsonR poprzez krótkie impulsy światła o długości 580 nanometrów przez dostępne na rynku diody LED. Wyniki wskazały, że wstrzyknięcie ChrimsonR doprowadziło do silnej ekspresji w DCN z fluorescencją tdTomato widoczną w komórkach i włóknach.W przeciwległym ICC włókna silnie znakowane tdTomato były wyraźnie widoczne po trzech tygodniach, co wykazało zdolność konstruktu ChrimsonR-tdTomato do transportu dalekiego zasięgu po wstrzyknięciu do jąder słuchowych pnia mózgu. Aktywacja optyczna ChrimsonR wywołała EPSP w neuronach IC VIP, co wskazuje, że ChrimsonR jest użytecznym narzędziem do eksperymentów CRACM na dużą odległość, gdy parametry eksperymentalne wymagają użycia światła czerwonego zamiast niebieskiego. Odkryliśmy jednak, że ChrimsonR był łatwo aktywowany niebieskim światłem, wykazując ten sam próg aktywacji niebieskiego światła, co Chronos.W przypadku tego protokołu najważniejsze jest, aby upewnić się, że współrzędne stereotaktyczne są prawidłowe i potwierdzić, że wirus uległ ekspresji tylko w docelowym obszarze mózgu. Wymieniając wirus Chronos ChrimsonR na inny wirus, na przykład wirus Flex specyficzny dla komórek, możesz odpowiedzieć na kilka pytań anatomicznych lub fizjologicznych bez zmiany protokołu operacji.

long-range-channelrhodopsin-assisted-circuit-mapping-inferior

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej procedurze wykorzystano aktywowany niebieskim światłem kanał glonowy oraz narzędzia do specyficznej dla komórek ekspresji genetycznej w celu wywołania potencjałów synaptycznych za pomocą impulsów świetlnych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta stanowi niedrogą i łatwą w użyciu alternatywę dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach nad fizjologią synaptyczną w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

Niniejszy artykuł przedstawia podejście łączące fotostymulację za pomocą skanowania laserowego z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta umożliwia szerokie mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów kory mózgowej.

Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Neurony powstałe w wieku dorosłym wykazujące ekspresję ChR2 mogą być manipulowane w preparatach elektrofizjologicznych w plastrach tkankowych w celu zbadania ich wkładu w funkcjonowanie węchowych obwodów neuronalnych.

Wykorzystanie przystępnych cenowo mat LED do fotostymulacji neuronów

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Ten artykuł opisuje, jak selektywność jonowa rodopsyny kanałowej jest określana za pomocą elektrofizjologicznych zapisów całokomórkowych z użyciem komórek HEK293. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalną procedurę badania selektywności chlorkowej selektywnej dla anionów rodopsyny kanałowej. Procedura ta może być jednak przenoszona na inne rodopsyny kanałowe o wyraźnej selektywności.

Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Poznaj metodę CRACM do mapowania dalekiego zasięgu projekcji neuronowych w pniu mózgu słuchowym przy użyciu ChrimsonR. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie połączeń neuronalnych z wykorzystaniem optycznej stymulacji.

Mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową dalekiego zasięgu neuronów wzgórka dolnego z niebieskimi i czerwonymi rodopsynami kanałowymi (Wideo) | JoVE Journal

Mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową dalekiego zasięgu neuronów wzgórka dolnego z niebieskimi i czerwonymi rodopsynami kanałowymi

Przeglądaj więcej filmów