Name: Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji etanolu w zarodkach Danio rerio za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy. Ta technika umożliwia szybkie i powtarzalne pomiary farmakokinetyki alkoholu podczas rozwoju embrionalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania przedstawione w tym artykule były wspierane przez poprzednie granty z National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 dla J.K.E. i National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 dla C.B.L. oraz przez obecny grant z National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 dla C.B.L. Dziękujemy firmie Rueben Gonzales za dostarczenie i pomoc w analizie metodą chromatografu gazowego. Dziękujemy Tiahnie Ontiveros i dr Ginie Nobles za pomoc w pisaniu.

Wszystkie embriony danio przeżwrotników wykorzystane w tej procedurze były hodowane i rozmnażane zgodnie z ustanowionymi protokołami IACUC27. Protokoły te zostały zatwierdzone przez University of Texas at Austin oraz University of Louisville.
UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano linię danio pręgowanego Tg(fli1:EGFP)y128. Cała woda użyta w tej procedurze to sterylna woda z odwróconej osmozy. Wszystkie analizy statystyczne wykonano przy użyciu programu Graphpad Prism v8.2.1.
1. Przygotowanie pożywki dla embrionów
<ol>
	<li>Aby przygotować 20-krotny roztwór zapasowy pożywki dla zarodków, rozpuścić 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO4, 0,142 g NA2HPO4 oraz 4,9 g MgSO4·7H2O w 1 L wody. Powstały biały osad można zignorować, gdyż nie wpłynie on na właściwości pożywki. Roztwór zapasowy należy wysterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby przygotować roboczy roztwór pożywki dla zarodków, rozpuścić 1,2 g NaHCO3 w 1 L 20-krotnego roztworu zapasowego pożywki dla zarodków i dodać 19 L wody. Roboczy roztwór pożywki dla zarodków należy utrzymać w temperaturze 28 °C.</li>
</ol>
2. Pomiar objętości zarodka metodą wypierania wody
UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano zarodki w 24 h po zapłodnieniu (hpf) (Rysunek 1). Zarodki użyte do pomiarów objętości nie są wykorzystywane w analizie etanolu.
<ol>
	<li>Umieść 10 embrionów wraz z płynem pozazarodkowym w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, oznakowanej na poziomie objętości 250 μL (Rysunek 2A). Dolej wodę do linii wypełnienia 250 μL (patrz: próbka z barwioną wodą na Rysunku 2B).</li>
	<li>Powtórz krok 2.1, aby przygotować naczynia dla embrionów, z których usunięto chorion.
	<ol>
		<li>Aby usunąć chorion, umieść embriony w chorionach w szalce Petriego 100 mm z koktajlem proteaz w stężeniu 2 mg/mL w pożywce dla embrionów w temperaturze pokojowej (RT) na 10 min. Co kilka minut delikatnie zamieszaj embriony, aby przerwać chorion.</li>
		<li>Gdy wszystkie embriony zostaną uwolnione z chorionu, usuń zdechorionowane embriony z koktajlu proteaz/pożywki dla embrionów i umieść je w nowej szalce Petriego 100 mm ze świeżą pożywką dla embrionów w celu ich przemycia. Powtórz ten etap płukania jeszcze raz (łącznie 2 płukania). Przenieś embriony do nowej szalki Petriego 100 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając jak najmniejszego końcówki i nie uszkadzając embrionów, ostrożnie usuń cały płyn z otoczenia embrionów za pomocą mikropipety p200 (Rysunek 2C) i zważ wodę na wadze o precyzji &lt;0,1 mg. Aby określić objętość próbki 10 embrionów, odejmij masę/objętość usuniętej wody (1 mL wody = 1 g wody) od 250 μL. Aby określić objętość pojedynczego embrionu, podziel różnicę między 250 μL a masą usuniętej wody przez 10.</li>
</ol>
<img alt="Wzór na obliczanie objętości zarodka: Objętość=250μL-masa usuniętej wody; analiza równania." src="/files/ftp_upload/60766/60766equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">
<img alt="Wzór na obliczenie objętości zarodka, przedstawiony jako równanie: Volume_sample/10." src="/files/ftp_upload/60766/60766equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
3. Traktowanie embrionów etanolem
<ol>
	<li>Zebrać zarodki z zbiorników tarłowych i umieścić je w standardowej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Odliczyć nie więcej niż 100 zarodków do jednej szalki Petriego i inkubować w temperaturze 28.5 °C. 
	UWAGA: Jeśli chorion ma zostać usunięty (krok 2.2), należy to zrobić przed dodaniem etanolu.</li>
	<li>W 6 hpf przenieść do 100 zarodków do nowej standardowej szalki Petriego o średnicy 100 mm z pożywką dla zarodków lub pożywką dla zarodków + 1% etanolu (v/v). Przykryć, ale NIE uszczelniać szalki Petriego. Umieścić zarodki w inkubatorze niskotemperaturowym ustawionym na 28.5 °C na 18 h lub do momentu, aż zarodki osiągną etap rozwojowy 24 hpf.</li>
</ol>
4. Przygotowanie procedury przed analizą zarodków metodą chromatografii gazowej z analizą przestrzeni nad próbką
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 5 M NaCl w wodzie (na każdą probówkę z próbką będzie potrzebne 450 μL) w celu denaturacji wszystkich białek i zapobiegania metabolizmowi etanolu. Przygotować koktajl proteaz (Tabela materiałów) o stężeniu 2 mg/mL w pożywce do embrionów.</li>
	<li>Oznakować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL oraz fiolkę do chromatografu gazowego o pojemności 2 mL dla każdej próbki. Oznakować dodatkowe fiolki do chromatografu gazowego o pojemności 2 mL dla wzorców etanolu opisanych poniżej, a także dla próbek ślepych: powietrza, wody oraz roztworu 5 M NaCl/koktajlu proteaz.</li>
	<li>Przygotować trzy mikropipety p200 (dwie ustawione na 50 μL i trzecią na 200 μL), mikropipetę p1000 ustawioną na 450 μL oraz mikropipetę p2 ustawioną na 2 μL. W przypadku pipet szklanych używanych do przenoszenia embrionów z szalek Petri do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, należy szybko przeprowadzić końcówkę pipety przez płomień, aby wygładzić krawędzie i uniknąć uszkodzenia embrionów podczas ich pobierania do pipety.</li>
</ol>
5. Przygotowanie embrionów do chromatografii gazowej z analizą przestrzeni nad próbką
UWAGA: Zarówno embriony w błonach trofoblastycznych, jak i te wcześniej z nich usunięte, są traktowane w ten sam sposób w celu zapewnienia spójności w obliczeniach czynników rozcieńczenia.
<ol>
	<li>Używając dwóch mikropipet p200 ustawionych na 50 μL, pobierz 50 μL roztworu koktajlu proteaz do pierwszej oraz 50 μL wody do drugiej.</li>
	<li>Używając pipety szklanej i mikropipety, szybko przenieś 10 embrionów (z kroku 3.2) do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i zamknij zakrętkę (jak opisano na Rysunku 2A). Powtórz czynność dla wszystkich próbek do badania, kontroli oraz embrionów traktowanych etanolem.</li>
	<li>Używając mikropipety p200 ustawionej na 200 μL, szybko otwórz zakrętkę i usuń całe pozostałe medium do embrionów (jak opisano na Rysunku 2C). Szybko wprowadź do probówki pipetę zawierającą 50 μL wody i gwałtownie, ale delikatnie (aby nie uszkodzić embrionów), dodaj, a następnie usuń wodę. Szybko dodaj 50 μL roztworu koktajlu proteaz z oczekującej pipety i zamknij zakrętkę probówki (Rysunek 2D). 
	UWAGA: Wykonuj ten proces dla jednej próbki naraz.</li>
	<li>Pozostaw próbkę w RT przez 10 min, aby koktajl proteaz mógł zdegradować chorion. Następnie szybko dodaj 450 μL 5 M NaCl i zamknij zakrętkę probówki (Rysunek 2E). Homogenizuj próbki w wstrząsaniu wirującym (vortex) przez 10 min. Aby przyspieszyć proces, ustaw mieszadło tak, aby jednocześnie homogenizować wiele próbek. 
	UWAGA: Do każdej probówki z embrionami starszymi niż 24 hpf dodaj niewielką ilość (~100 μL) mieszaniny kulek krzemionkowych (2 rozmiary: kulki 0,5 mm i 1 mm). W starszych embrionach struna grzbietowa pozostanie nienaruszona bez względu na czas homogenizacji.</li>
	<li>Po 10 min homogenizacji szybko pobierz 2 μL supernatantu z homogenizatu embrionów i przenieś do fiolki do chromatografu gazowego. Szybko zamknij fiolkę zakrętką z politetrafluoroetylenu.</li>
</ol>
6. Przygotowanie pożywek i standardów etanolu
<ol>
	<li>Aby przygotować wzorce ośrodka, rozcieńczyć ośrodek dziesięciokrotnie za pomocą roztworu 5 M NaCl/koktajlu proteaz. Nanieść 2 μL każdej próbki do fiolki do chromatografu gazowego i zamknąć nakrętką z politetrafluoroetylenu.</li>
	<li>Aby przygotować wzorce etanolu, wykonać rozcieńczenia seryjne 100% etanolu w roztworze 5 M NaCl/koktajlu proteaz do następujących stężeń: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 mM. Nanieść 2 μL każdego wzorca do fiolki do chromatografu gazowego i zamknąć nakrętką z politetrafluoroetylenu.</li>
</ol>
7. Przygotowanie chromatografu gazowego z analizą przestrzeni nad próbką
UWAGA: Ta konfiguracja i protokół mogą wymagać modyfikacji w zależności od użytego chromatografu gazowego. Chromatografia gazowa przestrzeni nad próbką (head space) jest stosowana do ilościowego oznaczenia poziomu etanolu, a nie do separacji.
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę grzejnika autosamplera na 58 °C i włączyć. Należy poczekać, aż grzałka osiągnie 58 °Coraz otwórz dopływ powietrza i wodoru do chromatografu gazowego (wykorzystywanego do detekcji płomieniowo-jonizacyjnej w celu ilościowego oznaczenia etanolu). 
	UWAGA: Ciśnienie (psi) należy ustawić zgodnie ze specyfikacją producenta, aby zapewnić prawidłowe działanie chromatografu. Upewnij się, że linia helu jest włączona i ustawiona na odpowiednie ciśnienie (psi).</li>
	<li>W przypadku przegrody należy upewnić się, że liczba wstrzykniętych próbek nie &gt;100. W przypadku włókna do wstrzykiwania należy upewnić się, że liczba wstrzykniętych próbek nie jest &gt;500. 
	UWAGA: Jeśli którakolwiek z wartości przekrocza dopuszczalną liczbę wstrzyknięć, konieczna będzie ich wymiana przed analizą próbek testowych.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie analityczne i upewnij się, że stacja robocza jest odpowiednio skonfigurowana. Przechowuj wszystkie dane zgodnie ze standardami laboratorium lub wydziału. Utwórz nową listę próbek dla analizowanych materiałów.</li>
	<li>Uruchom metodę startową i odczekaj do momentu stabilizacji detektora jonizacji płomieniowej przed analizą próbek. Po uzyskaniu stabilizacji uruchom programową metodę startową w celu oczyszczenia włókna.</li>
</ol>
8. Pomiary próbek przy użyciu chromatografii gazowej z analizą przestrzeni nad próbką
<ol>
	<li>Po zakończeniu metody startowej utwórz w liście próbek jedną nową linię dla każdej próbki. Z menu metod w oprogramowaniu analitycznym załaduj 436 Current spme ethanol 2013 3min absorb 2_5min rg run.METH dla każdej próbki na liście.
	<ol>
		<li>Wypełnij listę próbek, zaczynając od ślepych prób powietrza, wody oraz koktajlu 5 M NaCl/proteaza. Następnie wprowadź kolejno wzorce w zakresie od 0,3125 do 40 mM. Po wzorcach wprowadź drugą serię ślepych prób powietrza, wody i koktajlu 5 M NaCl/proteaza.</li>
		<li>Wprowadź wszystkie próbki supernatantu z homogenizowanych embrionów przeznaczone do analizy, od najniższego do najwyższego przewidywanego stężenia etanolu. Zakończ wprowadzając trzecią i ostatnią serię ślepych prób powietrza, wody i koktajlu 5 M NaCl/proteaza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść fiolki do chromatografu gazowego w autosamplerze w kolejności, w jakiej próbki zostały wprowadzone do listy. Pozostaw próbki do ogrzania przez 10–15 min. Uruchom analizę próbek w oprogramowaniu.</li>
	<li>Po przeanalizowaniu wszystkich próbek i końcowych prób ślepych aktywuj metodę wyłączania w oprogramowaniu, dodając ostatnią próbkę do listy i uruchamiając standby.METH. Wykonaj kopię zapasową wszystkich danych pozyskanych podczas analizy próbek. Wyłącz urządzenie w następującej kolejności: grzałka autosamplera, zbiornik z wodorem i dopiero po osiągnięciu przez chromatograf temperatury 30 °C – zbiornik z powietrzem. Pozostaw włączony zbiornik z helem, aby zachować kolumnę woskową.</li>
</ol>
9. Integracja piku etanolu w próbce i analiza stężenia próbki
UWAGA: Wszystkie wartości od punktu 9.3 wzwyż zostały obliczone w pliku Excel, w którym wszystkie równania zostały wypełnione automatycznie.
<ol>
	<li>Po zakończeniu procedury wyłączania kliknij Open chromatogram. Otwórz folder zawierający wyniki. Próbki są automatycznie integrowane w tym programie.</li>
	<li>W wynikach upewnij się, że zintegrowano odpowiednie piki (piki etanolu pomiędzy 2 a 2,5). Po potwierdzeniu wszystkich próbek wydrukuj lub wyeksportuj wyniki.</li>
	<li>Nanieś wysokość pików standardów etanolu na wykres. Oblicz nachylenie, punkt przecięcia z osią Y oraz wartości R2 dla standardów etanolu (R2 powinno być &gt;0,99). 
	UWAGA: Wartości te zostaną wykorzystane do wyznaczenia stężenia etanolu na podstawie wysokości piku próbki.</li>
	<li>Dla każdej próbki odejmij wysokość piku próbki od punktu przecięcia z osią Y standardów etanolu. Podziel tę wartość przez nachylenie standardów etanolu, aby uzyskać wartość etanolu dla każdej próbki w fiolkach do GC.</li>
</ol>
<img alt="Równanie wzoru na stężenie etanolu, obliczanie przykładowej wartości etanolu, chemia analityczna." src="/files/ftp_upload/60766/60766equ03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3">
<ol start="5">
	<li>Aby obliczyć stężenie etanolu w embrionach, najpierw oblicz czynnik rozcieńczenia dla każdej próbki. Podziel wartość objętości obliczoną w kroku 2.3 niniejszego protokołu przez sumę tej objętości oraz 500 μL. Wartość ta reprezentuje roztwór 5 M NaCl/koktajl proteaz dodany do każdej próbki podczas przetwarzania embrionów (kroki 5.3 i 5.4).</li>
</ol>
<img alt="Wzór na współczynnik rozcieńczenia próbki; obliczanie objętości zarodka; obraz równania edukacyjnego." src="/files/ftp_upload/60766/60766equ04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4">
<ol start="6">
	<li>Wykorzystując ten współczynnik rozcieńczenia próbki, pomnóż go przez wartość etanolu dla każdej próbki. Wyniki zostaną otrzymane w stężeniu mM. Oblicz wartości dla próbek referencyjnych medium, mnożąc wartość etanolu w medium przez współczynnik rozcieńczenia wynoszący 10.</li>
</ol>
<img alt="Wzór na stężenia etanolu w embrionach (Stężenia etanolu w embrionach = wartość etanolu w próbce × czynnik rozcieńczenia próbki)." src="/files/ftp_upload/60766/60766equ05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5">
<img alt="Równanie stężenia medianowego: Stężenie medianowe = medianowa wartość etanolu × 10; wykres formuły." src="/files/ftp_upload/60766/60766equ06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6">

<ol><li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome%3A+a+prospective+national+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archive+of+Diseases+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li>
<li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li>
<li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+%28PAE%29%3A+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li>
<li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+Alcohol+Consumption%3A+Studies+with+Mutant+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li>
<li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social%2C+cognitive+and+affective+behavioral+domains%3A+Insights+from+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li>
<li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li>
<li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067(2012).</li>
<li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li>
<li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse%3A+a+minireview%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li>
<li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li>
<li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li>
<li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSGenetics%22%5BJournal%5D)">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999(2012).</li>
<li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li>
<li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li>
<li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li>
<li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II%3A+microencephaly+and+neuronal+losses%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li>
<li>Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects%3A+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li>
<li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+%28nNOS%29+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research.+Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li>
<li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li>
<li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li>
<li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li>
<li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol%27s+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+Danio+%28Brachydanio%29+rerio%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li>
<li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemia+Medica%22%5BJournal%5D)">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li>
<li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+%28HS-GC-FID%29%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Testing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li>
<li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li>
<li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li>
<li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+methanol%2C+acetaldehyde%2C+acetone%2C+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Human+and+Experimental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li>
<li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142(2012).</li>
<li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li>
<li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats%3A+effects+of+dose+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li>
<li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li>
<li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin%2C+Fgf%2C+and+sonic+hedgehog+function%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jako system modelowy danio pręgowany idealnie nadaje się do badania wpływu czynników środowiskowych na rozwój. Produkują one dużą liczbę zapłodnionych zewnętrznie zarodków, co pozwala na precyzyjne określenie czasu i dawkowania w badaniach nad etanolem. To, w połączeniu z możliwościami obrazowania na żywo oraz ochroną genetyczną i rozwojową u ludzi, sprawia, że danio pręgowany jest potężnym systemem modelowym do badań teratologicznych. Opisano protokół pomiaru embrionalnych stężeń etanolu w rozwijających się zarodkach da...

Alkoholowe Zaburzenia Płodowe (FASD) opisują szeroki wachlarz zaburzeń neurologicznych i dysmorfologii twarzoczaszki związanych z ekspozycją na embrionalny etanol1. Wiele czynników, w tym czas i dawka ekspozycji na etanol oraz tło genetyczne, przyczynia się do zmienności FASD2,3. U ludzi złożony związek tych zmiennych sprawia, że badanie i zrozumienie etiologii FASD jest trudne. Modele zwierzęce okazały się kluczowe dla pogłębienia naszej wiedzy na temat mechanistycznych podstaw teratogenności etanolu. Do badania wielu aspektów FASD wykorzystano szeroką gamę systemów modeli zwierzęcych, a wyniki były niezwykle zgodne z tym, co stwierdzono w ekspozycji u ludzi4. Systemy modeli gryzoni są używane do badania wielu aspektów FASD, przy czym myszy są najczęstsze5,6,7. Większość tej pracy skupiała się na wadach rozwojowych spowodowanych wczesną ekspozycją na etanol8, chociaż wykazano, że późniejsze narażenie na etanol również powoduje anomalie rozwojowe9. Co więcej, genetyczne zdolności myszy znacznie pomogły nam w badaniu genetycznych podstaw FASD10,11. Te badania na myszach silnie sugerują, że istnieją interakcje gen-etanol ze szlakiem sonic hedgehog, sygnalizacją kwasu retinowego, dysmutazą ponadtlenkową, syntazą tlenku azotu I, Aldh2 i Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Badania te pokazują, że modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat FASD i jego mechanizmów leżących u podstaw.
Danio pręgowany stał się potężnym modelowym systemem do badania wielu aspektów teratogenezy etanolu22,23. Ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie, wysoką płodność, podatność genetyczną i możliwości obrazowania na żywo, danio pręgowany idealnie nadaje się do badania takich czynników, jak czas, dawkowanie i genetyka teratogenezy etanolu. Etanol może być podawany do precyzyjnie zaawansowanych zarodków, a zarodki mogą być następnie obrazowane w celu zbadania bezpośredniego wpływu etanolu na procesy rozwojowe. Ta praca może być bezpośrednio związana z ludźmi, ponieważ genetyczne programy rozwoju są wysoce konserwatywne między danio pręgowanym a ludźmi i dlatego mogą pomóc w prowadzeniu badań FASD na ludziach24. Podczas gdy danio pręgowany był używany do badania teratogenezy etanolu, brak konsensusu w raportowaniu embrionalnych stężeń etanolu utrudnia porównanie z ludźmi25. W układach ssaków poziom alkoholu we krwi koreluje bezpośrednio z poziomem etanolu w tkankach26. Wiele badań nad danio pręgowanym traktuje zarodki przed całkowitym utworzeniem ich układu krążenia. Ponieważ nie ma próbki matki do zbadania, wymagany jest proces oceny stężeń etanolu w celu ilościowego określenia poziomu etanolu w zarodku. W tym miejscu opisujemy proces ilościowego określania stężeń etanolu w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowowej.

<table><tbody><tr><td>Powietrze</td><td></td><td></td><td>dostarczane na podstawie umowy z uniwersytetem</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>AutoSampler, CP-8400 Autosampler</td><td>chromatografu gazowego</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka do chromatografu gazowego z przegrodą politetrafluoroetylenową/silikonową i plastikową nasadką 2 ml</td><td>Agilent</td><td>8010-0198</td><td>Można ponownie użyć fiolek po oczyszczeniu, ale nie nakrętek/przegród</td></tr><tr><td>Chromatograf gazowy, CP-3800</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helium</td><td></td><td></td><td>Dostarczony na podstawie umowy z uniwersytetem</td></tr><tr><td>Kolumna kapilarna HP Innowax</td><td>Agilent</td><td>19095N-123I</td><td>30 m x 0,53 mm x 1,0 &mu; m gruba folia</td></tr><tr><td>Hyrdogen</td><td></td><td></td><td>Dostarczony na podstawie umowy z uniwersytetem</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (heptahydrat)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682002</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 10 i mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 1000 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 200 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Przegroda politetrafluoroetylenowa/silikonowa oraz plastikowa nasadka</td><td>Agilent</td><td>5190-7021</td><td>Wymienne nakrętki/przegrody do fiolek do chromatografu gazowego</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu (dwuzasadowy)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>VWR</td><td>97062-916</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki krzemionkowe 5 mm</td><td>Produkty Biospec</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki krzemionkowe 1,0 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (dwuzasadowy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Zespół włókien do mikroekstrakcji do fazy stałej Karboksen/Polidimetylosiloksan</td><td>Millipore Sigma</td><td>57343-U</td><td>Włókna zamienne</td></tr><tr><td>Stacja robocza do chromatografii gwiaździstej</td><td>Oprogramowanie do chromatografii</td><td>varianowej</td><td></td></tr><tr><td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td><td>Millipore Sigma</td><td>23154</td><td>Wymienna przegroda wlotowa</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Alkoholowe Zaburzenia Płodowe (FASD) opisują bardzo zmienne kontinuum wad rozwojowych wywołanych etanolem, w tym dysmorfologii twarzy i zaburzeń neurologicznych. Ze złożoną patologią FASD dotyka około 1 na 100 dzieci urodzonych w Stanach Zjednoczonych każdego roku. Ze względu na bardzo zmienny charakter FASD, modele zwierzęce okazały się kluczowe w naszym obecnym mechanistycznym rozumieniu wad rozwojowych wywołanych etanolem. Coraz więcej laboratoriów koncentruje się na wykorzystaniu danio pręgowanego do badania wad rozwojowych wywołanych etanolem. Danio pręgowany wytwarza dużą liczbę zewnętrznie zapłodnionych, genetycznie podatnych, półprzezroczystych zarodków. Pozwala to naukowcom precyzyjnie kontrolować czas i dawkę ekspozycji na etanol w wielu kontekstach genetycznych oraz określić ilościowo wpływ ekspozycji na etanol w zarodku za pomocą technik obrazowania na żywo. To, w połączeniu z wysokim stopniem zachowania zarówno genetyki, jak i rozwoju z ludźmi, dowiodło, że danio pręgowany jest potężnym modelem do badania mechanistycznych podstaw teratogenności etanolu. Jednak schematy ekspozycji na etanol różniły się w różnych badaniach nad danio pręgowanym, co zakłóciło interpretację danych z danio pręgowanego w tych badaniach. Oto protokół ilościowego oznaczania stężeń etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy.

Poziom etanolu we krwi nie może być oznaczony u wczesnych zarodków danio pręgowanego, ponieważ nie posiadają one jeszcze pełnoprawnie uformowanego układu krążenia. Aby określić stężenie etanolu w zarodkach danio pręgowanego, poziom etanolu mierzy się bezpośrednio w homogenizowanych tkankach zarodkowych. Aby poprawnie zmierzyć stężenie etanolu w zarodkach, należy uwzględnić objętość zarodka. Zarodek (z dołączonym żółtkiem) znajduje się wewnątrz cieśni (skorupki jaja), otoczony płynem pozazarodkowym (R...

Ta praca opisuje protokół ilościowego oznaczania poziomu etanolu w zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy, od właściwych metod ekspozycji do przetwarzania zarodków i analizy etanolu.

Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pomaga w zrozumieniu farmakokinetyki etanolu w rozwoju zarodków danio pręgowanego, a to pomoże ustandaryzować reżimy ekspozycji na etanol w badaniach nad danio pręgowanym. Główną zaletą naszej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom na szybki i powtarzalny pomiar poziomu etanolu podczas rozwoju embrionalnego, szczególnie w przypadku zarodków, w których nie ma dostępu do krwi. Metodę tę można łatwo zastosować do innych systemów modelowych, a także innych czynników środowiskowych, zakładając odpowiednią technikę i konfigurację sprzętu.Spodziewałbym się, że osoby wykonujące ten protokół po raz pierwszy będą zmagać się z szybkością niezbędną do zapobieżenia parowaniu etanolu podczas przetwarzania zarodków. Zacznij od przeniesienia 10 zarodków z dodatkowym płynem embrionalnym do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych oznaczonych linią o objętości 250 mikrolitrów. Dodaj wodę do linii napełniania.Przygotować dodatkowe probówki do mikrowirówek do próbek odkoryzowanych. Aby usunąć kosmówkę, inkubuj zarodki na 100-milimetrowej szalce Petriego z dwoma miligramami na mililitr koktajlu proteazy w pożywce zarodkowej przez 10 minut. Delikatnie obracaj naczynie co kilka minut, aby przełamać kosmówkę.Gdy wszystkie zarodki są wolne od kosmówki, usuń je z koktajlu proteazy i umyj je dwukrotnie świeżą pożywką. Następnie przenieś zarodki do świeżej 100-milimetrowej naczynia. Gdy wszystkie próbki są gotowe do pomiaru objętości, użyj mikropipety P200 z najmniejszą możliwą końcówką, aby ostrożnie usunąć cały płyn z okolic zarodków.Zważ wodę wagą z dokładnością mniejszą niż 0,1 miligrama, a następnie określ objętość 10 zarodków, odejmując wagę usuniętej wody od 250 mikrolitrów. Aby określić objętość pojedynczego zarodka, podziel różnicę przez 10. Zbierz zarodki ze zbiorników kryjących i umieść je na standardowej 100-milimetrowej szalce Petriego, a następnie inkubuj szalkę w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.Po sześciu godzinach od zapłodnienia przenieś do 100 zarodków do nowej pożywki z pożywką dla zarodków i 1% etanolem lub samą pożywką. Przykryj, ale tak, aby nie zamykać szalek Petriego i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza na 18 godzin lub do momentu, gdy osiągną 24 godziny po zapłodnieniu. Użyj dwóch mikropipet P200 ustawionych na 50 mikrolitrów i odessaj roztwór koktajlu proteazy do jednej, a wody do drugiej.Następnie szybko umieść 10 zarodków w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej za pomocą szklanej pipety i zamknij nakrętkę. Powtórzyć ten proces dla wszystkich próbek, które mają być badane, próbek kontrolnych i zarodków poddanych działaniu etanolu. Pracując z jedną próbką na raz, szybko otwórz nakrętkę i odessaj wszystkie resztki pożywki zarodkowej za pomocą mikropipety P200 ustawionej na 200 mikrolitrów.Szybko, ale delikatnie dodaj i usuń 50 mikrolitrów wody, a następnie dodaj 50 mikrolitrów koktajlu proteazy i zamknij nakrętkę tubki. Pozostaw próbkę na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie szybko dodaj 450 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i zamknij nakrętkę probówki. Homogenizować próbkę przez wirowanie przez 10 minut i przenieść dwa mikrolitry supernatantu do fiolki do chromatografii gazowej.Uszczelnić fiolkę kapslem z politetrafluoroetylenu. Po zakończeniu metody uruchamiania załaduj 436 prądowy etanol SPME od dwóch do pięciu minut RG. metamfetaminy z menu metod w oprogramowaniu do analizy dla każdej próbki z listy próbek.Wypełnij listę próbek, zaczynając od powietrza, wody i pięciu ślepych półfabrykatów koktajlu z proteazą molowo-chlorkowo-sodową. Następnie wprowadź wzorce etanolu w kolejności od 0,3125 do 40 milimolów. Postępuj zgodnie ze standardami z drugą rundą półfabrykatów.Wprowadzić wszystkie homogenizowane próbki supernatantu zarodka do badania od najniższego do najwyższego przewidywanego stężenia etanolu i zakończyć wprowadzaniem trzeciej rundy ślepych prób. Dodać fiolki do chromatografii gazowej do automatycznego podajnika próbek w kolejności, w jakiej próbki zostały wprowadzone, i pozostawić je do ogrzania przez 10 do 15 minut. Następnie rozpocznij przykładowe przebiegi za pomocą oprogramowania.Po zakończeniu wszystkich przebiegów aktywuj metodę zamykania, dodając końcową próbkę do listy przykładów i uruchamiając polecenie standby.meth. Utwórz kopię zapasową wszystkich danych uzyskanych podczas przykładowego przebiegu. Po zakończeniu metody wyłączania kliknij otwórz chromatogram i otwórz folder z wynikami.Próbki są automatycznie integrowane z tym programem. W wynikach upewnij się, że zostały zintegrowane właściwe szczyty. Po potwierdzeniu wszystkich próbek wydrukuj lub wyeksportuj wyniki.Wykreśl wysokość piku wzorców etanolu na wykresie, a następnie oblicz nachylenie, punkt przecięcia z osią y i wartości r kwadrat. Wartość alkoholu etylowego dla każdej próbki należy uzyskać, odejmując wysokość piku próbki od punktu przecięcia z osią y wzorców i dzieląc tę wartość przez nachylenie wzorców. Aby obliczyć stężenie etanolu w zarodkach, należy obliczyć współczynnik rozcieńczenia dla każdej próbki i pomnożyć wartość próbki alkoholu etylowego przez ten współczynnik rozcieńczenia.Na koniec należy obliczyć próbki referencyjne podłoża, mnożąc wartość alkoholu etylowego w pożywce przez współczynnik rozcieńczenia równy 10. Aby prawidłowo obliczyć embrionalne stężenia etanolu, zmierzono objętość zarodków zarówno w ich kosmówce, jak i usuniętych z kosmówki. W tej analizie zarodek stanowił 56% całkowitej objętości wewnątrz kosmówki.Na podstawie wcześniej opublikowanych prac, 73,6% wykorzystano jako zawartość wody w zarodku we wszystkich prezentowanych analizach. W ten sposób powstała woda składająca się z 0,82 mikrolitra z 1,1 mikrolitra objętości embrionalnej. Z całkowitej objętości wody 49% znajduje się w zarodku, a 51% w płynie pozazarodkowym.Do analizy metodą chromatografii gazowej analizowano dwie grupy po 15 próbek oraz pożywki, którymi je traktowano, mierzone pięć razy na grupę. Poziomy etanolu w pożywce wynosiły 143,6 milimola dla grupy pierwszej i 133,6 milimola dla grupy drugiej. Stężenia etanolu w zarodkach wynosiły średnio 63,5 milimola i 53,1 milimola odpowiednio dla grupy pierwszej i drugiej.Obliczono stosunek stężenia etanolu w zarodku do poziomów etanolu w pożywkach dla każdej próbki. Grupa pierwsza miała 44% poziomów etanolu w pożywce, podczas gdy grupa miała 40% poziomów etanolu w pożywce. Nieleczone zarodki kontrolne mierzono przy zerowym stężeniu etanolu w pożywce milimolowej.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest to, że prawidłowe przetwarzanie zarodków do analizy GC ma kluczowe znaczenie, ponieważ etanol jest lotny i szybko odparowuje. Opisano najlepszy sposób wykonania tego kroku, ale należy go ćwiczyć, aby rozwinąć prawidłową pamięć mięśniową. Procedura ta pomoże ustandaryzować schematy leczenia etanolem u danio pręgowanego i umożliwi przyszłe prace mające na celu analizę genetycznych i komórkowych mechanizmów teratogenności etanalnej.

quantification-ethanol-levels-zebrafish-embryos-using-head-space-gas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji1. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Danio pręgowany stanowi potężny model kręgowców, który był niewystarczająco wykorzystywany w badaniach metabolicznych. W niniejszej pracy opisujemy szybką metodę pomiaru profilu metabolicznego in vivo rozwijających się rybek danio, która umożliwia porównanie różnych parametrów funkcji mitochondriów między zarodkami manipulowanymi genetycznie lub farmakologicznie, zwiększając tym samym możliwości zastosowania tego organizmu.

Analiza profilu metabolicznego embrionów rybki danio-ostrogona

Ten film demonstruje użycie chromatografii gazowej w przestrzeni czołowej do określenia stężenia etanolu w zarodkach ryb danio pręgowanych. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do jakościowej i ilościowej analizy lotnych związków organicznych.

Chromatografia gazowa w przestrzeni nadpowierzchniowej: technika oceny stężenia etanolu w zarodkach danio pręgowanego

Wyjaśniono nowatorską metodę zmniejszania zmienności podczas wystawiania ryb na działanie narkotyków.  Stwierdzono, że ryby wystawione na różne wzorce ekspozycji na etanol miały zmieniony poziom lęku podczas odstawienia w teście skotoksji jasnej/ciemnej.

Nowa metoda podawania leków wielu danio pręgowanemu (Danio rerio) i kwantyfikacja odstawienia

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Ten protokół opisuje analizy histologiczne wątroby larw danio pręgowanego, które były leczone 2% etanolem przez 24 godziny. Takie ostre leczenie etanolem powoduje stłuszczenie wątroby i obrzęk naczyń krwionośnych wątroby.

Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Celem obecnego protokołu jest nakreślenie kroków niezbędnych do ustanowienia i użycia testu preferencji społecznych dla dorosłych ryb danio pręgowanego i pokazanie, że można go użyć do scharakteryzowania wad społecznych wywołanych etanolem.

Modelowanie płodowych zaburzeń alkoholowych u danio pręgowanego w celu scharakteryzowania wpływu niekorzystnego środowiska embrionalnego na zachowania społeczne dorosłych

Tutaj prezentujemy metodę wyrównywania i kriosekcji wielu próbek larw danio pręgowanego (Danio rerio) i zbierania ich na jednym szkiełku do przestrzennej analizy transkryptomicznej.

Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego.

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

Poznaj metodę kwantyfikacji etanolu w zarodkach Danio rerio za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy. Ta technika umożliwia szybkie i powtarzalne pomiary farmakokinetyki alkoholu podczas rozwoju embrionalnego.

Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Przeglądaj więcej filmów