Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Protokół ten jest istotny, ponieważ pomaga w zrozumieniu farmakokinetyki etanolu w rozwoju zarodków danio pręgowanego, a to pomoże ustandaryzować reżimy ekspozycji na etanol w badaniach nad danio pręgowanym. Główną zaletą naszej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom na szybki i powtarzalny pomiar poziomu etanolu podczas rozwoju embrionalnego, szczególnie w przypadku zarodków, w których nie ma dostępu do krwi. Metodę tę można łatwo zastosować do innych systemów modelowych, a także innych czynników środowiskowych, zakładając odpowiednią technikę i konfigurację sprzętu.

Spodziewałbym się, że osoby wykonujące ten protokół po raz pierwszy będą zmagać się z szybkością niezbędną do zapobieżenia parowaniu etanolu podczas przetwarzania zarodków. Zacznij od przeniesienia 10 zarodków z dodatkowym płynem embrionalnym do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych oznaczonych linią o objętości 250 mikrolitrów. Dodaj wodę do linii napełniania.

Przygotować dodatkowe probówki do mikrowirówek do próbek odkoryzowanych. Aby usunąć kosmówkę, inkubuj zarodki na 100-milimetrowej szalce Petriego z dwoma miligramami na mililitr koktajlu proteazy w pożywce zarodkowej przez 10 minut. Delikatnie obracaj naczynie co kilka minut, aby przełamać kosmówkę.

Gdy wszystkie zarodki są wolne od kosmówki, usuń je z koktajlu proteazy i umyj je dwukrotnie świeżą pożywką. Następnie przenieś zarodki do świeżej 100-milimetrowej naczynia. Gdy wszystkie próbki są gotowe do pomiaru objętości, użyj mikropipety P200 z najmniejszą możliwą końcówką, aby ostrożnie usunąć cały płyn z okolic zarodków.

Zważ wodę wagą z dokładnością mniejszą niż 0,1 miligrama, a następnie określ objętość 10 zarodków, odejmując wagę usuniętej wody od 250 mikrolitrów. Aby określić objętość pojedynczego zarodka, podziel różnicę przez 10. Zbierz zarodki ze zbiorników kryjących i umieść je na standardowej 100-milimetrowej szalce Petriego, a następnie inkubuj szalkę w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.

Po sześciu godzinach od zapłodnienia przenieś do 100 zarodków do nowej pożywki z pożywką dla zarodków i 1% etanolem lub samą pożywką. Przykryj, ale tak, aby nie zamykać szalek Petriego i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza na 18 godzin lub do momentu, gdy osiągną 24 godziny po zapłodnieniu. Użyj dwóch mikropipet P200 ustawionych na 50 mikrolitrów i odessaj roztwór koktajlu proteazy do jednej, a wody do drugiej.

Następnie szybko umieść 10 zarodków w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej za pomocą szklanej pipety i zamknij nakrętkę. Powtórzyć ten proces dla wszystkich próbek, które mają być badane, próbek kontrolnych i zarodków poddanych działaniu etanolu. Pracując z jedną próbką na raz, szybko otwórz nakrętkę i odessaj wszystkie resztki pożywki zarodkowej za pomocą mikropipety P200 ustawionej na 200 mikrolitrów.

Szybko, ale delikatnie dodaj i usuń 50 mikrolitrów wody, a następnie dodaj 50 mikrolitrów koktajlu proteazy i zamknij nakrętkę tubki. Pozostaw próbkę na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie szybko dodaj 450 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i zamknij nakrętkę probówki. Homogenizować próbkę przez wirowanie przez 10 minut i przenieść dwa mikrolitry supernatantu do fiolki do chromatografii gazowej.

Uszczelnić fiolkę kapslem z politetrafluoroetylenu. Po zakończeniu metody uruchamiania załaduj 436 prądowy etanol SPME od dwóch do pięciu minut RG. metamfetaminy z menu metod w oprogramowaniu do analizy dla każdej próbki z listy próbek.

Wypełnij listę próbek, zaczynając od powietrza, wody i pięciu ślepych półfabrykatów koktajlu z proteazą molowo-chlorkowo-sodową. Następnie wprowadź wzorce etanolu w kolejności od 0,3125 do 40 milimolów. Postępuj zgodnie ze standardami z drugą rundą półfabrykatów.

Wprowadzić wszystkie homogenizowane próbki supernatantu zarodka do badania od najniższego do najwyższego przewidywanego stężenia etanolu i zakończyć wprowadzaniem trzeciej rundy ślepych prób. Dodać fiolki do chromatografii gazowej do automatycznego podajnika próbek w kolejności, w jakiej próbki zostały wprowadzone, i pozostawić je do ogrzania przez 10 do 15 minut. Następnie rozpocznij przykładowe przebiegi za pomocą oprogramowania.

Po zakończeniu wszystkich przebiegów aktywuj metodę zamykania, dodając końcową próbkę do listy przykładów i uruchamiając polecenie standby.meth. Utwórz kopię zapasową wszystkich danych uzyskanych podczas przykładowego przebiegu. Po zakończeniu metody wyłączania kliknij otwórz chromatogram i otwórz folder z wynikami.

Próbki są automatycznie integrowane z tym programem. W wynikach upewnij się, że zostały zintegrowane właściwe szczyty. Po potwierdzeniu wszystkich próbek wydrukuj lub wyeksportuj wyniki.

Wykreśl wysokość piku wzorców etanolu na wykresie, a następnie oblicz nachylenie, punkt przecięcia z osią y i wartości r kwadrat. Wartość alkoholu etylowego dla każdej próbki należy uzyskać, odejmując wysokość piku próbki od punktu przecięcia z osią y wzorców i dzieląc tę wartość przez nachylenie wzorców. Aby obliczyć stężenie etanolu w zarodkach, należy obliczyć współczynnik rozcieńczenia dla każdej próbki i pomnożyć wartość próbki alkoholu etylowego przez ten współczynnik rozcieńczenia.

Na koniec należy obliczyć próbki referencyjne podłoża, mnożąc wartość alkoholu etylowego w pożywce przez współczynnik rozcieńczenia równy 10. Aby prawidłowo obliczyć embrionalne stężenia etanolu, zmierzono objętość zarodków zarówno w ich kosmówce, jak i usuniętych z kosmówki. W tej analizie zarodek stanowił 56% całkowitej objętości wewnątrz kosmówki.

Na podstawie wcześniej opublikowanych prac, 73,6% wykorzystano jako zawartość wody w zarodku we wszystkich prezentowanych analizach. W ten sposób powstała woda składająca się z 0,82 mikrolitra z 1,1 mikrolitra objętości embrionalnej. Z całkowitej objętości wody 49% znajduje się w zarodku, a 51% w płynie pozazarodkowym.

Do analizy metodą chromatografii gazowej analizowano dwie grupy po 15 próbek oraz pożywki, którymi je traktowano, mierzone pięć razy na grupę. Poziomy etanolu w pożywce wynosiły 143,6 milimola dla grupy pierwszej i 133,6 milimola dla grupy drugiej. Stężenia etanolu w zarodkach wynosiły średnio 63,5 milimola i 53,1 milimola odpowiednio dla grupy pierwszej i drugiej.

Obliczono stosunek stężenia etanolu w zarodku do poziomów etanolu w pożywkach dla każdej próbki. Grupa pierwsza miała 44% poziomów etanolu w pożywce, podczas gdy grupa miała 40% poziomów etanolu w pożywce. Nieleczone zarodki kontrolne mierzono przy zerowym stężeniu etanolu w pożywce milimolowej.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest to, że prawidłowe przetwarzanie zarodków do analizy GC ma kluczowe znaczenie, ponieważ etanol jest lotny i szybko odparowuje. Opisano najlepszy sposób wykonania tego kroku, ale należy go ćwiczyć, aby rozwinąć prawidłową pamięć mięśniową. Procedura ta pomoże ustandaryzować schematy leczenia etanolem u danio pręgowanego i umożliwi przyszłe prace mające na celu analizę genetycznych i komórkowych mechanizmów teratogenności etanalnej.