Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie wychwytu regularnego dekstranu znakowanego fluorescencyjnie czerwienią Texas w żywych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że trzykilodaltonowy dekstran Texas Red może być wykorzystany do oceny funkcji kanału mechanotransdukcji w żywych komórkach rzęsatych. Aby pobrać ślimak, umieść czaszkę myszy w szóstym dniu po urodzeniu w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym pożywkę L-15 Leibovitza i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać powierzchowne cięcie od przedniego końca do tylnego końca czaszki i przez zewnętrzne kanały słuchowe.

Złóż skórę w kierunku nosa, aby odsłonić czaszkę i wykonaj nacięcie od tyłu do przodu czaszki i w poprzek linii oczu. Podziel czaszkę na dwie połowy i użyj małej szpatułki, aby usunąć mózg. Kiedy można zaobserwować kości skroniowe, użyj małych nożyczek, aby przeciąć te kości, aby wyciąć tkankę.

Zanurz kości skroniowe w 35-milimetrowej czaszy zawierającej świeżą pożywkę L-15 i umieść czaszę pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w okular o szerokim polu widzenia i zewnętrzne halogenowe źródło światła prądu przemiennego. Użyj kleszczy, aby usunąć otaczającą tkankę ślimaka, kanały półkoliste i narządy przedsionkowe. Po wycięciu ślimaka i umieszczeniu go w nowym naczyniu ze świeżą pożywką L-15, za pomocą kleszczy chirurgicznych wykonaj jedną ranę kłutą na okrągłym okienku i jedno nakłucie w wierzchołkowej okolicy ślimaka.

Po zebraniu wszystkich ślimaków należy umieścić tkankę w studzience dziewięciodołkowej szklanej płytki wgłębieniowej zawierającej 200 mikrolitrów świeżej pożywki L-15. W celu znakowania dekstranem izolowanych tkanek, zastąp pożywkę z każdej próbki studzienką 200 mikrolitrami świeżej pożywki L-15 uzupełnionej dwoma miligramami na mililitr fluorescencyjnie sprzężonego dekstranu będącego przedmiotem zainteresowania. Próbki inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i 25 obrotach na minutę w trójwymiarowej wytrząsarce pod kątem 25 stopni, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji przemyć tkanki raz pożywką, a drugi raz HBSS przez dwie minuty na pranie. Po drugim praniu utrwal próbki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj dwa szybkie i delikatne mycia w HBSS. Po drugim płukaniu za pomocą kleszczyków z cienką końcówką usuń kość ślimaka, więzadło spiralne i błonę tektoralną, a następnie umyj izolowany narząd Cortiego w HBSS.

Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania przezroczystej błony ochronnej, ponieważ tkanka na komórkach rzęsatych może zostać łatwo uszkodzona na tym etapie. Aby oznaczyć F-aktynę, należy przepuścić próbki w 0,5% Triton X-100 w PBS uzupełnionym 100 do 200 rozcieńczeniem fluorescencyjnie znakowanej falloidyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć tkanki dwa do trzech razy w świeżym HBSS na jedno przemycie, jak pokazano, a następnie przemyć je pojedynczym płuczkiem w PBS.

Użyj odpowiedniego podłoża montażowego, aby zamontować narząd tkanek Cortiego na szklanych szkiełkach mikroskopowych, włosach stereociliach stroną do góry i zobrazuj próbki pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym za pomocą obiektywu zanurzeniowego 63X. Po dwugodzinnej inkubacji z trzema kilodaltonami dekstranu fluorescencyjnie sprzężonymi z Texas Red, organ eksplantatu Cortiego od myszy po urodzeniu typu dzikiego w szóstym dniu wykazuje solidne i specyficzne znakowanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych komórek rzęsatych. Obrazowanie stereocilii komórek rzęsatych i ciał komórkowych ujawnia, że tylko te komórki, które włączyły do swojego ciała trzykilodaltonowy dekstran Texas Red, wykazały również fluorescencyjne znakowanie stereocilii.

Co ważne, wzdłuż stereocilii obserwuje się jednolity sygnał fluorescencyjny ze wzbogaceniem na końcach krótszych rzędów stereocilii, gdzie znajduje się kanał mechanotransdukcji. Obserwuje się również struktury przypominające pęcherzyki w ciele komórkowym komórek rzęsatych i sąsiednich komórkach podporowych, co sugeruje, że dekstran Texas Red może być również pobierany przez endocytozę. Większy, 10-kilodaltonowy dektrans również wytwarzał pęcherzykowaty wzór w ciele komórkowym komórek rzęsatych i komórek podporowych.

Warto zauważyć, że obecność chelatora wapnia lub blokerów kanału mechanotransdukcji zapobiega znakowaniu stereocilii i wychwytowi trzech kilodaltonów dekstranu Texas Red w komórkach rzęsatych. Wzór podobny do pęcherzyka jest nadal obserwowany w obecności blokady kanału mechanotransdukcji, co jednak wskazuje, że ten wzorzec wychwytu jest niezależny od funkcjonalnych kanałów MET. Bardzo ważne jest, aby dokładnie przeanalizować narząd tkanki Cortiego i potwierdzić prawidłową orientację komórek rzęsatych przed zamontowaniem tkanki do obrazowania.

Po znakowaniu dekstranem żywych i funkcjonalnych komórek rzęsatych można przeprowadzić barwienie immunologiczne utrwalonej tkanki w celu zidentyfikowania określonych typów komórek białek będących przedmiotem zainteresowania.