Name: Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Poznaj metodę znakowania dekstranem Texas Red w żywych komórkach rzęsatych myszy, umożliwiającą ocenę funkcji kanałów mechanotransdukcji w narządzie Cortiego. Technika ta pozwala wizualizować endocytozę w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Vincentowi Schramowi z centrum mikroskopii i obrazowania NICHD za pomoc w akwizycji obrazu konfokalnego, oraz Tsg-Hui Chang za nieocenioną pomoc w zarządzaniu koloniami i opiece nad myszami. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program NINDS, NIH, Bethesda, MD, do K.J.S. A.B. były wspierane przez Intramural Research Program NINDS, NIH oraz przez stypendium podoktorskie Roberta Wentholda z intramural research program NIDCD.

Procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, które zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru (Protokół dla zwierząt #1336 do KJS).
1. Myszy
<ol>
	<li>Ustaw kilka par hodowlanych typu dzikiego C57BL/6J do rozmnażania w obiekcie dla zwierząt, aby kontrolować datę narodzin miotów i śledzić wiek szczeniąt.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie ślimaka
<ol>
	<li>Ustaw czystą przestrzeń w pobliżu mikroskopu stereoskopowego, aby przeprowadzić sekcje (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Użyj 70% etanolu do oczyszczenia przestrzeni i otoczenia i umieść czystą podkładkę na ławkę. Do wyrzucenia zwłok zwierzęcych wymagana byłaby plastikowa torba na medyczne odpady patologiczne (MPW).</li>
	<li>Przygotuj kilka potraw 35 mm z niektórymi mediami L15 firmy Leibovitz. 
	UWAGA: Pożywka komórkowa L-15 firmy Leibovitz zawiera 1–2 mM Ca2+, która jest niezbędna do utrzymania integralności połączeń końcówkowych i zawiera niezbędne aminokwasy, witaminy i pirogronian sodu w celu poprawy zdrowia i przeżycia komórek. Surowicę wykluczono, aby uniknąć zmienności eksperymentalnej ze względu na jej słabo określony skład i potencjalną interferencję z dekstranem.</li>
	<li>Eutanazja myszy po porodzie 6 (P6) przez dekapitację. 
	UWAGA: 6-dniowe myszy są nieco odporne na wziewne środki znieczulające. Chociaż do eutanazji można stosować izofluran lub przedłużone narażenie na CO2 (do 50 minut), zaleca się stosowanie wtórnej metody fizycznej w celu zapewnienia śmierci.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby usunąć skórę czaszki, wykonując powierzchowne cięcie od przodu do tylnego końca i w poprzek zewnętrznych kanałów słuchowych.</li>
	<li>Złóż skórę w kierunku nosa, aby odsłonić czaszkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Wykonaj nacięcie od tyłu do przodu czaszki i w poprzek linii oczu (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B-C).</li>
	<li>Podziel czaszkę na dwie połowy i usuń mózg za pomocą małej szpatułki, aby odsłonić kości skroniowe (<silna klasa="xfig">Ryc. 2 C-D).</li>
	<li>Małymi nożyczkami przetnij kości skroniowe i wytnij tkankę.</li>
	<li>Umieść obie kości skroniowe w naczyniu o średnicy 35 mm i upewnij się, że są pokryte podłożem L15 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). 
	UWAGA: Poniższe czynności są wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym. Czarne tło zwykle pomaga uwidocznić tkankę podczas drobnych etapów sekcji.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w okular szerokokątny (10-krotne powiększenie (WF10X) i zewnętrzne halogenowe źródło światła prądu przemiennego (AC)) usuń otaczającą tkankę ślimaka, kanały półkoliste i narządy przedsionkowe za pomocą kleszczy chirurgicznych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Aby dekstran i pożywka L15 mogły dostać się do przewodu ślimakowego, wykonaj dwie granice nakłucia na wypreparowanym ślimaku, jedną na okrągłym okienku, a drugą w wierzchołkowej okolicy ślimaka.</li>
	<li>Dodać 300 ml pożywki L15 firmy Leibovitz do każdej studzienki z 9-dołkowej szklanej płytki wgłębieniowej.</li>
	<li>Umieść co najmniej trzy wypreparowane ślimaki na każdej studzience.</li>
</ol>
3. Etykietowanie dekstranu
<ol>
	<li>Rozpuść dekstran w zrównoważonym roztworze soli Hanksa bez Ca2+ i Mg2+ (HBSS-CFM) w końcowym stężeniu 10 mg/ml. Roztwór podstawowy musi być umieszczony w nieprzezroczystych czarnych probówkach (chronionych przed światłem) i przechowywany w temperaturze -30 °C do momentu użycia><.
	UWAGA: Stosowanie dekstranu utrwalanego lizyną ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku tego protokołu.</li>
	<li>Przygotować każdy dekstran w końcowym stężeniu 2 mg/ml w 500 ml pożywki L15 firmy Leibovitz.</li>
	<li>Usunąć pożywkę ze ślimaka i dodać pożywkę L15 Leibovitz zawierającą interesujący nas dekstran w końcowym stężeniu 2 mg/ml. 
	UWAGA: Chociaż część kanałów MET jest otwarta w spoczynku41,42, inkubację dekstranu przeprowadzono z delikatnym potrząsaniem eksplantatów, aby zwiększyć prawdopodobieństwo otwarcia kanału MET.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z delikatnym wytrząsaniem (25 obr./min) przy użyciu 3-wymiarowej wytrząsarki o kącie nachylenia 25°. 
	UWAGA: Dekstran znakowany fluorescencyjnie musi być w miarę możliwości chroniony przed światłem. Aby chronić dekstran podczas 2-godzinnej inkubacji, umieść 9-dołkową szklaną płytkę w naczyniu P150 do hodowli komórkowej owiniętym folią aluminiową.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki do obrazowania
<ol>
	<li>Po inkubacji z dekstranem przemywać tkankę przez 2 minuty dwa razy pożywką i raz HBSS.</li>
	<li>Inkubować tkankę w temperaturze pokojowej przez 30 minut z 4% paraformaldehydem w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS). 
	UWAGA: Narażenie na formaldehyd może działać drażniąco na oczy, nos i górne drogi oddechowe. U niektórych osób powtarzające się narażenie skóry na formaldehyd może powodować uczulenie, które może prowadzić do alergicznego zapalenia skóry. Formaldehyd jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi i podejrzewa się, że stanowi zagrożenie dla rozrodczości.</li>
	<li>Szybko i delikatnie umyj utrwaloną chusteczkę dwukrotnie HBSS, aby usunąć paraformaldehyd. 
	UWAGA: Odwapnienie kości skroniowych nie jest konieczne na tym etapie rozwoju ślimaka.</li>
	<li>Usuń więzadło spiralne i błonę tektorialną za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, aby wypreparować narząd Cortiego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2G).</li>
	<li>Usuń wszystkie małe kawałki chusteczki i umyj chusteczkę HBSS.</li>
	<li>Przepuszczalność tkanki w 0,5% Triton X-100 w PBS zawierającym znakowaną fluorescencyjnie falloidynę (sprzężoną z kolorem zielonym lub czerwonym podczas testowania wychwytu odpowiednio dekstranu znakowanego TR lub FITC) w rozcieńczeniu 1:200 przez 30 minut, aby oznaczyć F-aktynę i uwidocznić stereocilię opartą na aktynie.</li>
	<li>Płukać tkankę 2-3 razy przez 2 minuty za każdym razem buforem HBSS w celu usunięcia nadmiaru trytonu i falloidyny oraz raz PBS w celu usunięcia soli.</li>
	<li>Zamontuj narząd tkanek Cortiego na szkiełku mikroskopowym i przykryj go pożywką montażową. 
	UWAGA: Podczas zakładania chusteczki upewnij się, że strona tkanki, w której znajduje się stereocilia komórek rzęsatych, jest skierowana w stronę szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Usunąć wszelkie potencjalne pęcherzyki powstałe podczas dodawania podłoża montażowego i zapobiec powstawaniu nowych pęcherzyków podczas umieszczania szkiełka nakrywkowego. 
	UWAGA: Odessać pipetą wszelkie pęcherzyki powstałe podczas dodawania podłoża mocującego. Aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym, umieść krawędź szkiełka nakrywkowego blisko próbki i ostrożnie, powoli opuść szkiełko nakrywkowe na tkankę za pomocą kleszczyków lub końcówki pipety.</li>
	<li>Przykryj chusteczkę w podłożu montażowym szklanym szkiełkiem nakrywkowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H). 
	UWAGA: Obiektywy z aperturą numeryczną powyżej 0,4 są przystosowane do stosowania szkiełek nakrywkowych #1,5 (grubość 0,17 mm). Użycie niewłaściwego szkiełka nakrywkowego może mieć poważne konsekwencje dla intensywności i jakości obrazów.</li>
	<li>Inkubować zamontowaną tkankę przez noc w temperaturze pokojowej, aby podłoże montażowe wyschło, a następnie przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.</li>
</ol>
5. Akwizycja i przetwarzanie obrazu
UWAGA: Obrazy konfokalne zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego LSM 880 wyposażonego w 32-kanałowy detektor Airyscan w trybie super-resolution (SR) 43 i obiektywem 63x.
<ol>
	<li>Nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego na obiektyw.</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe zawierające zamontowaną próbkę tkanki w stoliku mikroskopowym tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę olejku immersyjnego.</li>
	<li>Skoncentruj się na próbce i ustaw parametry obrazowania za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu.</li>
	<li>Używaj identycznych ustawień akwizycji obrazu i optymalnych parametrów dla rozdzielczości x, y i z dla każdego niezależnego eksperymentu. Piezosterowany system ustawiania ostrości jest wymagany do szybkiego i precyzyjnego przesuwania obiektywu podczas rejestrowania z-stosu obrazów. 
	UWAGA: Aby zobrazować cały obszar wierzchołkowy komórek rzęsatych, zbierz stos obrazów z od stereocilii do wierzchołkowej połowy ciała komórki rzęsatej przy użyciu optymalnych ustawień. Bardzo ważne jest, aby zebrać duży stos Z wzdłuż komórki rzęsatego, aby zapewnić obrazowanie cząstek przypominających pęcherzyki.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, aby przetworzyć surowe obrazy konfokalne za pomocą algorytmu rekonstrukcji Airyscan 3D z automatycznymi domyślnymi ustawieniami filtra dekonwolucyjnego.</li>
	<li>Otwórz obrazy konfokalne w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, aby dostosować jasność i kontrast, dodać pasek skali i wyeksportować obrazy dla ostatecznych figur.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty z wychwytem w mysim narządzie eksplantatów Cortiego z dekstranem 3 kDa Texas Red. Celem tej metody jest sprawdzenie, czy cząsteczki większe niż inne wcześniej testowane były również w stanie specyficznie znakować słuchowe komórki rzęsate i przenikać przez kanał MET. Podobne protokoły eksperymentalne były wcześniej stosowane do oceny przepuszczalności komórek rzęsatych dla innych barwników fluorescencyjnych, takich jak FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 i aminoglikozydy znakowan...

Komórki rzęsate ucha wewnętrznego to komórki czuciowe, które wykrywają dźwięk i ukrywają bodźce mechaniczne w sygnałach elektrycznych, które ostatecznie są interpretowane przez nasz mózg. Komórki te mają wiązkę w kształcie schodów składającą się z trzech rzędów włókien na bazie aktyny, znanych jako stereocilia, które wystają z ich obszaru wierzchołkowego1,2. Bodźce mechaniczne odchylają włókna stereocilii w kierunku najdłuższego rzędu i powodują otwarcie kanałów mechanotransdukcji (MET)3. Otwarcie kanałów MET prowadzi do napływu kationów, które depolaryzują komórkę, a w konsekwencji sygnalizują uwolnienie pęcherzyków synapsowych w obszarze podstawy komórki rzęsatego.
Biofizyczne właściwości kanału MET, niezbędnego do słyszenia, zostały szczegółowo scharakteryzowane. Wśród innych właściwości, kanały te są selektywne kationowo i mają stosunkowo dużą przewodność (150–300 pS przy niskim Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Co ciekawe, duże cząsteczki fluorescencyjne, takie jak FM1-43 i aminoglikozydy znakowane Texas Red, są permodalnymi blokerami kanału MET, co powoduje ich akumulację w ciele komórki włosa, co można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej11,12,13,14. I odwrotnie, tożsamość molekularna i struktura kanału MET oraz jego szlaku przenikania pozostały nieuchwytne. Coraz więcej dowodów eksperymentalnych wskazuje, że białko kanału transbłonopodobnego 1 (TMC1) jest składnikiem kanału MET w dojrzałych komórkach rzęsatych15,16,17,18,19. Mutacje w transbłonopodobnym kanale 1 (TMC1) zmieniają właściwości kanału MET19,20,21,22 i powodują głuchotę. Ponadto TMC1 lokalizuje się w miejscu kanału MET18,23 i wchodzi w interakcję z ogniwem końcówki odpowiedzialnym za przesyłanie siły mechanicznej do kanału MET24,25. Co więcej, niedawna analiza bioinformatyczna zidentyfikowała białka TMC jako ewolucyjnie związane z mechanowrażliwymi kanałami białek TMEM63/OSCA i białkami TMEM16, rodziną kanałów chlorkowych aktywowanych wapniem i scramblazów lipidowych26,27,28. Model strukturalny TMC1 oparty na relacji między tymi białkami ujawnił obecność dużej wnęki na granicy faz białko-lipid27. Ta jama jest siedliskiem dwóch mutacji TMC1, które powodują autosomalny dominujący ubytek słuchu (DFNA36)27,29,30,31,32, oraz selektywna modyfikacja mutantów cysteiny pod kątem reszt w jamie zmienia właściwości kanału MET28, co wskazuje, że może on funkcjonować jako szlak przenikania kanału MET. Duży rozmiar tej przewidywanej wnęki w białkach TMC może wyjaśniać zdolność dużych cząsteczek do przenikania przez kanał MET. Aby przetestować przewidywanie, że kanał MET zawiera niezwykle duży szlak przenikania i przesunąć granice wielkości ubytku obserwowanego w TMC1, opracowaliśmy protokół przeprowadzania eksperymentów wychwytu w narządzie eksplantatów Cortiego z większą cząsteczką, dekstranem 3 kDa fluorescencyjnie znakowanym czerwienią teksańską.
Dekstran to złożony, rozgałęziony polisacharyd złożony z wielu cząsteczek D-glukozy połączonych wiązaniami alfa-1,6 glikozydowymi. Jego wysoka rozpuszczalność w wodzie, niska toksyczność komórek i bioobojętność sprawiają, że jest to wszechstronne narzędzie do badania kilku procesów komórkowych. Ponadto dekstran jest dostępny w szerokiej gamie rozmiarów i znakowany fluorescencyjnie fluoroforami w kilku kolorach. Znakowane fluorescencyjnie dektransy są powszechnie stosowane w badaniach przepuszczalności komórek i tkanek33,34, do badania endocytozy w wielu układach komórkowych35,36, oraz do śledzenia neuronów37,38. W dziedzinie słuchu cząsteczki dekstranu zostały również wykorzystane do oceny przerwania połączenia komórka-komórka i utraty integralności nabłonka czuciowego słuchowego po ekspozycji na intensywny hałas w narządzie szynszyli Corti39,40.
W tej pracy wykorzystaliśmy właściwości niektórych z najmniejszych (3 i 10 kDa) fluorescencyjnego dektransu, aby przeprowadzić eksperymenty z wychwytem w mysich komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego i zbadać wielkość szlaku przenikania kanału MET komórek rzęsatych ucha wewnętrznego. Ponadto użyliśmy laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSM) 880 wyposażonego w detektor Airyscan do wizualizacji i lokalizacji fluorescencyjnego dekstranu w stereorzęskach i ciele komórkowym słuchowych komórek rzęsatych.

<table><tbody><tr><td>#1.5 szkiełka nakrywkowe 18mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0714</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27</td> obiektyw <td>Carl Zeiss</td><td>420780-9970-000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek amilorydu</td><td>EMD MILIPOR</td><td></td><td></td>129876</tr><tr><td>Benchwaver 3-wymiarowy Rocker</td><td>Benchmarks naukowy</td><td>B3D5000</td><td></td></tr><tr>Szczep<td>myszy typu dzikiego C57BL/6J</td><td>000664</td><td>Komórka</td><td></td>laboratoryjna</tr><tr><td>Jacksona nieprzepuszczalna Sól tetrapotasowa BAPTA</td><td>ThermoFisher</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Fluoresceina, 10 000 MW, Anionowa, Lizyna Utrwalana ThermoFisher</td><td></td><td>D1820</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, czerwień teksana, 10 000 MW, lizyna utrwalana</td><td>ThermoFisher</td><td>D1863</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, czerwień teksacka, 3000 MW, utrwalana lizyna</td><td>ThermoFisher</td><td>D3328</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodny formaldehydu klasy EM</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Image J lub FIJI</td><td>NIH</td><<td>a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F media immersyjne z olejem</td><td>Carl Zeiss</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, suplement GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>hydrat soli trisiarczanu neomycyny</td><td>Sigma</td><td>N6386</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7,4</td><td>ThermoFisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-CF405M</td><td>Biotium</td><td>00034</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamentowe media montażowe zapobiegające blaknięciu</td><td>ThermoFisher</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zen Black 2.3 SP1</td><td>Carl Zeiss</td><td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Kanał mechanotransdukcji komórek rzęsatych (MET) odgrywa ważną rolę w słyszeniu. Jednak tożsamość molekularna i informacje strukturalne MET pozostają nieznane. Badania elektrofizjologiczne komórek rzęsatych wykazały, że kanał MET ma dużą przewodność i jest przepuszczalny dla stosunkowo dużych fluorescencyjnych cząsteczek kationowych, w tym niektórych barwników styrylowych i antybiotyków aminoglikozydowych znakowanych na czerwono w Teksasie. W tym protokole opisujemy metodę wizualizacji i oceny wychwytu dektransu fluorescencyjnego w komórkach rzęsatych narządu eksplantatów Cortiego, którą można wykorzystać do oznaczenia funkcjonalnych kanałów MET. Odkryliśmy, że 3 kDa Texas znakowany na czerwono dekstran specyficznie znakuje funkcjonalne słuchowe komórki rzęsate po 1-2 godzinach inkubacji. W szczególności dekstran o masie 3 kDa znakuje dwa krótsze rzędy stereorzęsek i gromadzi się w ciele komórki w postaci rozproszonej, gdy obecne są funkcjonalne kanały MET. Dodatkowy pęcherzykowaty wzór znakowania zaobserwowano w ciele komórkowym komórek rzęsatych i otaczających komórkach podporowych. Nasze dane sugerują, że dekstran Texas-Red o stężeniu 3 kDa może być wykorzystany do wizualizacji i badania dwóch szlaków wychwytu barwnika komórkowego; specyficzna dla komórek rzęsatych droga wejściowa przez funkcjonalne kanały MET i endocytozę, wzór dostępny również dla większego dekstranu.

Zaobserwowaliśmy silne i swoiste znakowanie komórek rzęsnych po 2-godzinnej inkubacji eksplantów ślimaka (organu Corti) myszy szczepu dzikiego w 6. dobie postnatalnej (P6) z 3 kDa dekstranem znakowanym fluorescencyjnie Texas Red (dextran-TR) (Rycina 2A-B). Znakowanie dekstranem zaobserwowano zarówno w wewnętrznych, jak i zewnętrznych komórkach rzęsnych (IHC i OHC) w obszarach podstawowym, środkowym i szczytowym ślimaka (Rycina 2B</strong...

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji wychwytu 3 kDa Texas Red-labeled dextranu w słuchowych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Ponadto dektrans o stężeniu 3–10 kDa może być stosowany do badania endocytozy we włosach i komórkach podporowych narządu Cortiego.

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie wychwytu regularnego dekstranu znakowanego fluorescencyjnie czerwienią Texas w żywych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że trzykilodaltonowy dekstran Texas Red może być wykorzystany do oceny funkcji kanału mechanotransdukcji w żywych komórkach rzęsatych. Aby pobrać ślimak, umieść czaszkę myszy w szóstym dniu po urodzeniu w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym pożywkę L-15 Leibovitza i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać powierzchowne cięcie od przedniego końca do tylnego końca czaszki i przez zewnętrzne kanały słuchowe.Złóż skórę w kierunku nosa, aby odsłonić czaszkę i wykonaj nacięcie od tyłu do przodu czaszki i w poprzek linii oczu. Podziel czaszkę na dwie połowy i użyj małej szpatułki, aby usunąć mózg. Kiedy można zaobserwować kości skroniowe, użyj małych nożyczek, aby przeciąć te kości, aby wyciąć tkankę.Zanurz kości skroniowe w 35-milimetrowej czaszy zawierającej świeżą pożywkę L-15 i umieść czaszę pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w okular o szerokim polu widzenia i zewnętrzne halogenowe źródło światła prądu przemiennego. Użyj kleszczy, aby usunąć otaczającą tkankę ślimaka, kanały półkoliste i narządy przedsionkowe. Po wycięciu ślimaka i umieszczeniu go w nowym naczyniu ze świeżą pożywką L-15, za pomocą kleszczy chirurgicznych wykonaj jedną ranę kłutą na okrągłym okienku i jedno nakłucie w wierzchołkowej okolicy ślimaka.Po zebraniu wszystkich ślimaków należy umieścić tkankę w studzience dziewięciodołkowej szklanej płytki wgłębieniowej zawierającej 200 mikrolitrów świeżej pożywki L-15. W celu znakowania dekstranem izolowanych tkanek, zastąp pożywkę z każdej próbki studzienką 200 mikrolitrami świeżej pożywki L-15 uzupełnionej dwoma miligramami na mililitr fluorescencyjnie sprzężonego dekstranu będącego przedmiotem zainteresowania. Próbki inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i 25 obrotach na minutę w trójwymiarowej wytrząsarce pod kątem 25 stopni, chroniąc przed światłem.Pod koniec inkubacji przemyć tkanki raz pożywką, a drugi raz HBSS przez dwie minuty na pranie. Po drugim praniu utrwal próbki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj dwa szybkie i delikatne mycia w HBSS. Po drugim płukaniu za pomocą kleszczyków z cienką końcówką usuń kość ślimaka, więzadło spiralne i błonę tektoralną, a następnie umyj izolowany narząd Cortiego w HBSS.Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania przezroczystej błony ochronnej, ponieważ tkanka na komórkach rzęsatych może zostać łatwo uszkodzona na tym etapie. Aby oznaczyć F-aktynę, należy przepuścić próbki w 0,5% Triton X-100 w PBS uzupełnionym 100 do 200 rozcieńczeniem fluorescencyjnie znakowanej falloidyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć tkanki dwa do trzech razy w świeżym HBSS na jedno przemycie, jak pokazano, a następnie przemyć je pojedynczym płuczkiem w PBS.Użyj odpowiedniego podłoża montażowego, aby zamontować narząd tkanek Cortiego na szklanych szkiełkach mikroskopowych, włosach stereociliach stroną do góry i zobrazuj próbki pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym za pomocą obiektywu zanurzeniowego 63X. Po dwugodzinnej inkubacji z trzema kilodaltonami dekstranu fluorescencyjnie sprzężonymi z Texas Red, organ eksplantatu Cortiego od myszy po urodzeniu typu dzikiego w szóstym dniu wykazuje solidne i specyficzne znakowanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych komórek rzęsatych. Obrazowanie stereocilii komórek rzęsatych i ciał komórkowych ujawnia, że tylko te komórki, które włączyły do swojego ciała trzykilodaltonowy dekstran Texas Red, wykazały również fluorescencyjne znakowanie stereocilii.Co ważne, wzdłuż stereocilii obserwuje się jednolity sygnał fluorescencyjny ze wzbogaceniem na końcach krótszych rzędów stereocilii, gdzie znajduje się kanał mechanotransdukcji. Obserwuje się również struktury przypominające pęcherzyki w ciele komórkowym komórek rzęsatych i sąsiednich komórkach podporowych, co sugeruje, że dekstran Texas Red może być również pobierany przez endocytozę. Większy, 10-kilodaltonowy dektrans również wytwarzał pęcherzykowaty wzór w ciele komórkowym komórek rzęsatych i komórek podporowych.Warto zauważyć, że obecność chelatora wapnia lub blokerów kanału mechanotransdukcji zapobiega znakowaniu stereocilii i wychwytowi trzech kilodaltonów dekstranu Texas Red w komórkach rzęsatych. Wzór podobny do pęcherzyka jest nadal obserwowany w obecności blokady kanału mechanotransdukcji, co jednak wskazuje, że ten wzorzec wychwytu jest niezależny od funkcjonalnych kanałów MET. Bardzo ważne jest, aby dokładnie przeanalizować narząd tkanki Cortiego i potwierdzić prawidłową orientację komórek rzęsatych przed zamontowaniem tkanki do obrazowania.Po znakowaniu dekstranem żywych i funkcjonalnych komórek rzęsatych można przeprowadzić barwienie immunologiczne utrwalonej tkanki w celu zidentyfikowania określonych typów komórek białek będących przedmiotem zainteresowania.

dextran-labeling-uptake-live-functional-murine-cochlear-hair

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Ten film demonstruje połączone nagrywanie mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych małżowiny usznej myszy. Przedstawiono w nim etapy mechanicznej stymulacji zakończeń nerwowych mieszków włosowych przed i po ekspozycji na barwnik z membrany fluorescencyjnej, elektrofizjologię rejestrującą generowane potencjały czynnościowe oraz wizualizację znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych myszy

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Przedstawiono prostą i nowatorską technikę rejestrowania wyładowań doprowadzających z powodu mechanicznej stymulacji lancetowatych końcówek końcówek palisadowych, unerwiających mysie, skóry uszu, mieszków włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

Tutaj opisujemy nowatorskie przygotowanie do obrazowania żywych lancetowatych końcówek czuciowych końcówek palisadowych, które unerwiają mieszki włosowe skóry uszu myszy podczas barwienia i odbarwiania barwnikami styrylowo-pirydyniowymi.

Monitorowanie optyczne znakowania żywych zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych skóry ucha myszy ex vivo

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie przygotowania, hodowli, leczenia i barwienia immunologicznego eksplantatów ślimakowych u noworodków myszy. Technika ta może być wykorzystana jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu.

Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Poznaj metodę znakowania dekstranem Texas Red w żywych komórkach rzęsatych myszy, umożliwiającą ocenę funkcji kanałów mechanotransdukcji w narządzie Cortiego. Technika ta pozwala wizualizować endocytozę w czasie rzeczywistym.

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

Przeglądaj więcej filmów