Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

PBMC i próbki osocza są łatwe do pozyskania i dostarczają wielu informacji we wczesnym etapie rozwoju klinicznego. Ten solidny protokół minimalizuje zmienność przedanalityczną wprowadzaną w ośrodkach klinicznych. Protokół ten jest szybki i łatwy, wymaga podstawowego sprzętu laboratoryjnego i minimalnej wiedzy operatora w celu przetworzenia krwi na PBMC i osocze.

Jest kompatybilny z ruchliwymi dniami laboratoryjnymi w szpitalach. Dalsza analiza składników krwi wynikająca z tego protokołu może dostarczyć informacji na temat zależności farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, planowania dawek leków i dowodu zaangażowania celu, a także zapewnić wgląd w mechanizmy działania leków, wspierając zarówno analizę w czasie rzeczywistym, jak i analizę introspektywną. Używamy tego protokołu do badań onkologicznych, w szczególności do analizy mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenia DNA.

Jednak materiały zebrane za pomocą tego protokołu mogą być istotne w wielu obszarach chorobowych i wielu modalnościach terapeutycznych. Po otrzymaniu ośmiu mililitrów krwi dawcy na próbkę, zapisz czas, w którym krew została pobrana i delikatnie odwróć każdą probówkę od ośmiu do 10 razy przed przeniesieniem próbek krwi poddanych działaniu antykoagulantu do każdej z probówek oznaczonych do promieniowania. W przypadku próbek klinicznych należy odwirować probówki zaraz po ich odwróceniu.

Umieść 0,2 szarych probówek we wstępnie ogrzanej szafie rentgenowskiej, zamknij drzwi i nałóż na probówki dawkę 0,2 greja. Zastąp probówki napromieniowane o niskiej dawce siedmioma szarymi probówkami i dostosuj dawkę, aby zastosować siedmiostopniową dawkę promieniowania do próbek napromieniowania o wysokiej dawce. Po napromienieniu obu próbek należy inkubować wszystkie trzy probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Przenieś próbki do probówek do przygotowania komórek przed oddzieleniem komórek za pomocą wirowania z dużą prędkością, upewniając się, że jednostki są ustawione jako x g lub równoważny RCF. Po odwirowaniu obejrzyj probówki na ciemnym tle, aby zidentyfikować osocze, czerwone krwinki i warstwy kożucha. Za pomocą pipety serologicznej przenieś około połowy osocza do znakowanej 15-mililitrowej wirówki stożkowej bez naruszania warstwy kożucha i przechowuj probówkę z osoczem na mokrym lodzie.

Następnie za pomocą pipety pastwiskowej przenieś całą warstwę płaszcza bażowego zawierającą PBMC do nowej 15-mililitrowej probówki i dodaj PBS o temperaturze pokojowej do PBMC do końcowej objętości 15 mililitrów na próbkę. Delikatnie wymieszaj komórki przez odwrócenie pięć razy i zbierz komórki przez odwirowanie z niższą prędkością, upewniając się, że sprawdziłeś jednostki wirowania. Odessać wszystkie oprócz ostatnich 500 mikrolitrów supernatantu bez naruszania granulek.

Dodaj świeży PBS do końcowej objętości 10 mililitrów do każdej probówki i ponownie zawieś, delikatnie odwracając probówki. Do liczenia użyj 40 mikrolitrowych podwielokrotności komórek. Po zliczeniu zebrać komórki za pomocą kolejnego odwirowania i usunąć jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadów.

Aby przechowywać PBMC do późniejszego przetwarzania, ponownie zawieś granulki w 50 mikrolitrach świeżego PBS na próbkę z delikatnym pipetowaniem i przenieś każdą zawiesinę całych komórek do oznakowanego 1,5 mililitra kriowialnego na mokrym lodzie. Następnie błyskawicznie zamroź komórki preferowaną metodą i umieść je w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni. Zapisz czas, w którym komórki zostały zamrożone.

Alternatywnie, ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze lub mieszaninie do zamrażania na próbkę i przenieś zawiesiny komórek do indywidualnie oznakowanych kriowialiów. Następnie umieść probówki i wstępnie schłodzone zamrażarki do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby zamrozić osocze, dodaj do jednej mililitrowej porcji osocza do każdej z pięciu dwumililitrowych mikroprobówek bez naruszania pozostałej osadki i zapisz całkowitą objętość osocza w każdej probówce.

Następnie natychmiast zamroź porcje osocza w pozycji pionowej w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W przypadku analizy Western blot próbek, należy ponownie zawiesić osad w każdej probówce z odpowiednią objętością buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy i fosfatazy równą objętości osadu komórkowego z delikatnym pipetowaniem i inkubować próbki komórek przez 10 minut na lodzie. Pod koniec inkubacji przenieś próbki do probówek o pojemności 1,5 mililitra i poddaj je sonifikacji za pomocą trzech 30-sekundowych cykli po 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zebrać próbki przez odwirowanie i przenieść supernatanty do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie wymieszać 40 mikrogramów na próbkę z buforem ładującym i gotować próbki przez pięć minut. Załaduj 20 mikrogramów każdej próbki na linię w dwóch egzemplarzach do 4-12% żelu białkowego Bis-Tris i uruchom SDS-PAGE.

Liczba komórek uzyskanych z ośmiu mililitrów krwi różni się w zależności od pacjenta i otoczenia choroby. Ogólnie rzecz biorąc, granulka komórkowa jest mała i przezroczysta w kolorze białym. Czasami granulki mogą mieć pewne zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami, co ma negatywny wpływ na jakość preparatu.

Typowa wydajność od pacjenta z przewlekłą białaczką limfocytową przy użyciu tego protokołu waha się od 1,62 razy 10 do czwartej do 1,99 razy 10 do dziewiątej komórki na osiem mililitrów preparatu komórek jednojądrzastych z końcowym stężeniem białka w zakresie od 1,62 do 19,77 miligramów na mililitr. W tej reprezentatywnej analizie próbek pobranych od trzech pacjentów zaobserwowano wzrost modyfikacji potranslacyjnych przy wyższych dawkach promieniowania jonizującego. Co ciekawe, fosforylacja ataksji-teleangiektazji zmutowana, a RAD50 był znaczny przy niskiej dawce 0,2 greja, co sugeruje, że te potranslacyjne modyfikacje mogą być realnie badane jako biomarkery farmakodynamiczne dla leczenia obejmującego generowanie pęknięć podwójnej nici DNA z dobrym zakresem dynamicznym w guzie, a także próbki krwi obwodowej.

Aby uzyskać optymalne przygotowanie próbki, należy przetworzyć krew w ciągu godziny od pobrania w temperaturze pokojowej, prawidłowo odwirować próbki i spojrzeć na probówkę na ciemnym tle, aby móc odróżnić kożuchową powłokę.