Kolejny krok: ortotopowy model przeszczepu kończyn tylnych z koaaptacją neuronalną w celu maksymalizacji powrotu do sprawności u szczura

Ten film zawiera szczegółowy opis, jak wykonać ortotopową prawą kończynę tylną, przeszczepioną w połowie uda szczura. Prawa tylna kończyna szczura dawcy jest amputowana na poziomie połowy uda, a następnie przechowywana na lodzie. Prawa tylna kończyna szczura biorcy jest również amputowana na poziomie połowy uda.

Kończyna szczura dawcy jest następnie dołączana do szczura biorcy. Opiszemy, jak ponownie przymocować układy kostne, tętnicze, żylne, nerwowe, mięśniowe i skórne. Przeszczep kończyny, a dokładniej unaczyniony allotransplant kompozytowy, VCA, ma szerokie nadzieje terapeutyczne.

Ale obecnie jest to ograniczone przez techniki, immunosupresję i słabą funkcjonalną regenerację neuromotoryczną. Nasz model kładzie nacisk na skrupulatne, sprawdzone techniki mikrochirurgiczne, takie jak ręcznie szyte zespolenia naczyniowe i koaaptacja neuronalna. W ciągu ponad roku przeprowadziliśmy ponad 200 takich operacji.

Chociaż początkujący mikrochirurg musi się trochę nauczyć, korzystając z tego filmu, aby poznać naszą metodę i zaangażować się w dedykowaną praktykę, każdy mikrochirurg będzie w stanie opanować ten model. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health, NIH i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern. Poszczególne procedury zostały wykonane na protokole 00001663.

Wybierz szczura w wieku od ośmiu do 16 tygodni o wadze od 250 do 400 gramów w momencie operacji. Wywołaj znieczulenie ogólne za pomocą 5% izofluranu przez waporyzator przed przycięciem sierści tylnych kończyn szczura. Używając stożka nosowego do utrzymania znieczulenia od dwóch do 2,5%, umieść szczura na tablicy operacyjnej z grzałką pod spodem.

Zdezynfekuj bezwłosą skórę 70% alkoholem i zabezpiecz pole operacyjne sterylną gazą. Korzystając z odpowiedniego mikroskopu mikrochirurgicznego i pokazanych tutaj narzędzi mikrochirurgicznych, wraz z łatwo dostępną elektrokoagulacją bipolarną i monopolarną, będziesz gotowy do rozpoczęcia sekcji. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie obwodowe i skórne wokół prawej kończyny tylnej.

Rozpocznij w zgięciu pachwinowym natychmiast na mniej więcej tym samym poziomie co więzadło pachwinowe i przedłuż grzbiet bocznie, aby zakończyć nacięcie obwodowe. A następnie odsłoń warstwę mięśniową bezpośrednio pod nacięciem, wypreparuj i kauteryzuj powierzchowne naczynia nadbrzusza, które prowadzą od warstwy mięśniowej do właśnie utworzonego bliższego płata skóry. Odbijaj płat proksymalny nadprzyśrodkowo do więzadła pachwinowego, a dystalny płat skóry dolno-bocznie do kolana.

Użyj zwijacza drutu lub zwiniętej gazy, aby odsłonić pole. Zaobserwowano, że anatomia pachwinowa szczura jest podobna do ludzkiej; Od bocznej do przyśrodkowej leżą nerw, tętnica i żyła. Wypreparuj nerw udowy, podziel go ostro na więzadle pachwinowym proksymalnie do rozwidlenia, jeśli to możliwe.

Cofnij podzielony nerw niżej, trzymając go bezpiecznie z dala od drogi, przykrytego wilgotną gazą. Zwracając uwagę na tętnicę i żyłę udową, użyj czterocentymetrowych jedwabnych opasek 7-0, aby atraumatycznie cofnąć naczynia, zamiast dotykać ich bezpośrednio. Zwrócenie szczególnej uwagi teraz poprawi ostateczny wynik zespolenia.

Podwiązuj wszystkie gałęzie naczyń udowych za pomocą jedwabnych opasek 7-0. Podziel gałęzie między krawatami. Gałęzie tętnicze i żylne, które wymagają podziału, obejmują powierzchowne naczynia obwodowe, biodrowe i mięśniowe.

Powierzchowny obwód biodrowy jest zwykle największy i wydaje się nurkować głęboko, podobnie jak profunda kości udowej u ludzi, ale profunda jest nieobecna u szczura. Bardziej dystalne gałęzie naczyń udowych, takie jak najwyższa genikularna i odpiszczelowa, zwykle nie wymagają podziału. Teraz podwiąż tętnicę udową jedwabnymi opaskami 7-0 jak najbardziej proksymalnie do więzadła pachwinowego i podziel między wiązaniami.

Podobnie jak tętnica, podwiązują i dzielą żyłę udową. Odbijaj zarówno tętnicę, jak i żyłę niżej, bezpiecznie z drogi, przykryte wilgotną gazą wraz z wcześniej pokrytym nerwem udowym. Wypreparuj brzuszne grupy mięśni, uważając, aby kauteryzować wszelkie widoczne naczynia, które się pojawią.

Uwaga poświęcona hemostazie teraz zminimalizuje utratę krwi biorcy podczas późniejszej reprofuzji. Głęboko do brzusznych grup mięśni zidentyfikuj i ostro podziel nerw kulszowy proksymalnie do jego gałęzi. Wszystkie trzy gałęzie kulszowe są zwykle widoczne, piszczelowe, strzałkowe i łydkowe.

Wszystkie trzy powinny być zachowane w kończynie dawcy. Czwarta gałąź skórna nie jest zwykle widoczna w tym rozwarstwieniu. Zakończ dzielenie pozostałych grup mięśni brzusznych i grzbietowych na poziomie połowy uda za pomocą skrupulatnej hemostazy.

Może być konieczne cofnięcie kończyny przyśrodkowo, aby całkowicie podzielić mięśnie. Przeciąć kość udową w środku wału za pomocą ręcznej akumulatorowej piły rotacyjnej. Kończyna jest teraz wolna od dawcy.

Po usunięciu przeszczepu kończyny od dawcy, odetnij jedwabne końcówki od strony przeszczepu, tętnicy udowej i kikutów żył, ponownie otwierając w ten sposób naczynia. Wprowadzić angiocewnik o rozmiarze 24 do kikuta tętnicy przeszczepu i przepłukać przeszczep 250 jednostkami międzynarodowymi heparyny rozcieńczonymi w 5 mililitrach lodowatej normalnej soli fizjologicznej, uważając, aby obserwować, jak wypływa z otwartej żyły. Powoli, delikatnie spłukuj przeszczep przez około trzy minuty.

Nadmierne silne zaczerwienienie może uszkodzić śródbłonek. Umieść przeszczep w schłodzonym naczyniu z solą fizjologiczną umieszczonym w wiaderku z lodem do czasu przeszczepu. Poddaj szczura dawcy eutanazji za pomocą obustronnej torakotomii.

Operacja biorcy rozpoczyna się podobnie jak operacja dawcy, znieczulenie szczura, przycinanie futra, wykonanie obwodowego nacięcia w zagięciu pachwinowym, odbicie płatów skóry, wypreparowanie nerwu udowego, tętnicy i żyły. I podwiązanie tych samych naczyń rozgałęzionych, jak opisano wcześniej. Jednak podczas tej operacji należy podzielić nerw udowy bardziej dystalnie niż u dawcy, ale jeśli to możliwe, proksymalnie do rozwidlenia.

Podziel i uwolnij tętnicę udową i żyłę i zaciśnij je odpowiednio na poziomie więzadła pachwinowego za pomocą mikrochirurgicznych zacisków buldoga. Kontynuuj operację zgodnie z wcześniejszym opisem, dzieląc brzuszne mięśnie podtrzymujące uda na poziomie połowy uda za pomocą skrupulatnej hemostazy, jednocześnie cofając kończynę przyśrodkowo, jeśli to konieczne. Zidentyfikuj i podziel nerw kulszowy proksymalnie do punktu rozgałęzienia i przeciąć kość udową w środkowej części trzonu za pomocą piły obrotowej.

Usuń rodzimą prawą tylną kończynę biorcy i zutylizuj ją zgodnie z lokalnymi wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby zmniejszyć stężenie izofluranu do 1,5% przez stożek nosowy. Zbyt dużo znieczulenia podczas tej mniej bolesnej części zabiegu doprowadzi do śmierci szczura.

Nadszedł czas, aby połączyć kości razem. Za pomocą ręcznej piły obrotowej ogol wszelkie nierówności zarówno z końców kości udowej dawcy, jak i biorcy. Odetnij koniec piasty igły o rozmiarze 18, który stanie się prętem śródszpikowym kości udowej.

Przed manipulacją kością nałóż niewielką ilość wosku kostnego na odcięty koniec kości udowej biorcy, aby zmniejszyć krwawienie ze szpiku podczas procesu rozwiercania. Zwiąż kości udowe dawcy i biorcy za pomocą igły o rozmiarze 18 jako pręta śródszpikowego. Potrzebna jest pewna siła, ale nie rozwiercaj żadnej kości tak daleko, aby złamać korę.

W razie potrzeby wyjąć igłę i przyciąć ją do nieodpowiedniej długości, tak aby obie kości gładko przylegały do igły, bez wystającej igły między kośćmi. Umieść małą podporę, taką jak gaza lub mały kamień lub modelina, pod kończyną dawcy, aby utrzymać ją w napięciu. Ponownie przybliżyć brzuszne grupy mięśniowe za pomocą ośmiu do 10 prostych, przerywanych szwów poliglaktynowych 5-0, tak aby przeszczep nie obracał się wokół igły kości udowej.

Daje to kończynie stabilność zespoleń. Teraz rozpocznij zespolenia. Okresowo przepłukuj przeszczep i pole operacyjne lodowatą solą fizjologiczną, aby uzyskać lepszą wizualizację i zmniejszyć niedokrwienne uszkodzenie reperfuzyjne.

Wyrównaj tętnice udowe i zespolenie dawcy i biorcy w sposób kompleksowy za pomocą prostego, przerywanego szwu nylonowego 10-0, unikając zarówno naprężenia, jak i zapętlenia. Tętnica wymaga średnio sześciu szwów. Podobnie jak w przypadku tętnicy, należy zespoleć żyły udowe dawcy i biorcy w sposób kompleksowy.

Żyła wymaga od sześciu do ośmiu szwów. Obfite irygowanie zimną solą fizjologiczną, atraumatyczna technika obsługi naczyń i pozostawianie długich ogonów, które służą jako szwy podtrzymujące do cofania naczyń, są ważnymi narzędziami do skutecznych zespoleń mikrochirurgicznych. Umieść umiarkowaną ilość hemostatycznego proszku celulozowego na obu zespoleniach, a następnie usuń proksymalne mikrochirurgiczne zaciski buldoga na żyle i tętnicy.

Sprawdzić oba zespolenia pod kątem dobrej drożności i przepływu. Użyj bawełnianych patyczków, aby delikatnie szturchnąć żyłę i sprawdzić, czy obie zespolenia mają dobrą hemostazę. Gdy oba zespolenia okażą się zadowalające, przyciąć pozostałe ogonki szwów długotrwałych, aby pasowały do pozostałych.

Zmieniając pozycję szczura do lewej bocznej pozycji odleżynowa, użyj liberalnej elektrokoagulacji, aby uzyskać skrupulatną hemostazę dowolnego krwawienia mięśni reperfuzyjnych. Zwraca się uwagę na zespolenia nerwowe, gdy zapewniona jest hemostaza mięśniowa. Zreagtymuj grupy mięśni grzbietowych, które leżą bezpośrednio pod nerwem kulszowym, za pomocą prostych, przerywanych szwów poliglaktynowych 5-0.

Przytnij wszelkie przecięte nerwy końcówki, które wydają się postrzępione. Zbliż nerw kulszowy za pomocą nylonowych szwów 10-0, dążąc do ugryzienia nausznego. Zwykle wystarcza od ośmiu do 10 prostych przerwanych szwów.

Dokonaj reaproksymacji pozostałych grup mięśni grzbietowych za pomocą szwów poliglaktynowych 5-0. Następnie zamknij skórę grzbietową za pomocą ciągłego szwu 4-0 poliglaktyny. Zmieniając pozycję szczura do pozycji leżącej, ponownie przybliż nerw udowy za pomocą nylonowego szwu 10-0, ponownie, dążąc do ugryzienia w płuca.

Zwykle wystarczą dwa do trzech prostych szwów przerywanych. Zamknij pozostałą skórę brzuszną w taki sam sposób, jak skórę grzbietową. Unikaj nadmiaru ogona szwowego, który może być drażniący dla szczura po przebudzeniu.

Gdy zwierzęta wyjdą z bezpośredniego okna pooperacyjnego, mogą zostać przetestowane pod kątem powrotu do zdrowia neuromotorycznego. Test Hargreavesa służy do badania odczuć termicznych. Umieść szczura w pojemniku testowym i pozwól mu się zaaklimatyzować przez 20 minut.

Szkło aparatu jest potwierdzone, że jest czyste, a źródło ciepła działa z palcem badacza. Przed badaniem upewnij się, że szczur nie śpi, a badana łapa jest umieszczona nad czujnikiem ruchu na podczerwień. Przesyła energię cieplną na poziomie intensywności 90.

Rejestrowane jest opóźnienie czasowe w odsuwaniu łapy zwierzęcia od źródła ciepła. Jeśli w ciągu 20 sekund nie nastąpi żaden ruch, test zostaje przerwany, aby zapobiec obrażeniom. Wykonaj pięć prób dla każdej badanej kończyny, wykluczając najwyższą i najniższą wartość przed obliczeniem średniego czasu opóźnienia wycofania dla każdego zwierzęcia.

Oto przedstawiony projekt operacyjny w formacie kreskówki. Prawa tylna kończyna zarówno szczurów dawcy, jak i biorcy jest amputowana na poziomie połowy uda jako przekrój kulszowy. Tętnica udowa, żyła i nerw, a także nerw kulszowy i kość udowa muszą zostać ponownie połączone w operacji biorcy.

Model ten może być wykorzystany do pokazania zróżnicowanych efektów supresji immunologicznej i strategii przeszczepu na przeżycie. Dzięki tej technice możliwe jest osiągnięcie długoterminowego przeżycia. Model może być wykorzystany do zbadania regeneracji nerwów czuciowych, które mogą być widoczne do czterech tygodni po operacji.

Funkcje motoryczne można również badać za pomocą platformy do analizy chodu. Tutaj przedstawiliśmy platformę modelu szczura o korzystnych cechach przeżycia, którą wykorzystujemy do badania regeneracji sensorycznej i motorycznej, jak widać na kolejnych rysunkach. Przeszczep kończyny w ramach szerszej kategorii VCA, allotransplantacja składników unaczynionych ma szerokie zastosowanie, obietnica terapeutyczna jest jeszcze niespełniona.

Głównymi przeszkodami są obecne techniki immunosupresji i odzyskiwania neuromotorycznego. Rozwój nowych technik będzie zależał od elastycznego, solidnego i powtarzalnego modelowania zwierząt. Mamy nadzieję, że korzystając z tej platformy, badacze będą w stanie posunąć naprzód wiele aspektów przeszczepu kończyn.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w kolejnych krokach.