Wykazanie liniowej zależności między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych a hormonem luteinizującym w ekstraktach z kory nerkowej

W naszym protokole zaobserwowano, że stosowanie ekstraktów nerkowych od krów i świń jest doskonałym i ekonomicznym źródłem do badania fizjologii nerek, w szczególności badania korelacji między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego a innymi analitami. Skorelowanie VEGF, niezbędnego czynnika wzrostu w angiogenezie narządów, z innymi białkami zawsze było wyzwaniem. Ta technika pozwala nam zbadać związek między VEGF a analitami, takimi jak hormony.

To z pewnością poszerzy naszą bazę wiedzy na temat tego ważnego czynnika wzrostu. Ta metoda może być przydatna do korelacji innych analitów w ekstraktach kory nerkowej oprócz tych wymienionych w tym filmie. Demonstracja wizualna pomoże innym uzyskać powtarzalne wyniki bez żadnych błędów próbkowania.

Użycie świeżej tkanki ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tej techniki. Ważne jest, aby natychmiast po uboju pozyskać ze zwierzęcia świeże całe nerki. Tkankę należy zawsze przenosić do laboratorium na lodzie.

Użyj sterylnych nożyczek, kleszczy, noża i szalek Petriego, aby wyciąć nerki i wyciąć wymaganą część tkanki. Delikatnie przeciąć nerkę na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej i wyciąć kawałek tkanki z obszaru kory w środku nerki. Zmiel tkankę na małe kawałki nożem i przenieś ją do probówki do mikrofuge z jednym mililitrem lodowatego buforu ekstrakcyjnego do lizy 1X RIPA.

Oznacz probówkę konkretnymi szczegółami próbki i umieść ją na lodzie. Użyj ręcznego homogenizatora ze sterylną sondą, aby homogenizować tkankę przez jedną do dwóch minut, aż nie będą widoczne żadne kawałki, a następnie natychmiast odwiruj probówkę przy 9 600 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu należy przygotować oddzielne podwielokrotności próbki do analizy ELISA i całkowitej analizy białka, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania.

Przed rozpoczęciem testu należy doprowadzić wszystkie odczynniki i płytkę testową do temperatury pokojowej, usuwając nadmiar studzienek i przechowując je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Rozcieńczyć 20-krotny bufor płuczący do 300 mililitrów wodą podwójnie destylowaną i ustawić ślepe studzienki bez żadnego roztworu. Dodać 50 mikrolitrów wzorca lub próbki i kolejne 50 mikrolitrów koniugatu peroksydazy chrzanowej do każdej studzienki, a następnie natychmiast dodać 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdej studzienki i zamknąć płytkę.

Wymieszaj płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji przemyć każdą studzienkę 200 mikrolitrami buforu do płukania. Dodaj 50 mikrolitrów substratu A i substratu B do każdej studzienki, delikatnie wymieszaj płytkę, stukając w bok, a następnie zamknij i inkubuj w ciemności przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę i odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Przygotować odczynniki i przepłukać bufor zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie dodać 100 mikrolitrów wzorca lub próbki do każdej studzienki, uszczelnić płytkę, dobrze wymieszać i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Usuń płyn z każdej studzienki i dodaj 100 mikrolitrów odczynnika detekcyjnego A. Zamknij płytkę i inkubuj ją przez kolejną godzinę. Następnie umyj każdą studzienkę 400 mikrolitrami buforu do mycia, a następnie dodaj 90 mikrolitrów roztworu substratu do każdej studzienki, delikatnie postukaj w płytkę i inkubuj ją przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ostatniej inkubacji dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, delikatnie postukaj w płytkę i odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą spektrofotometru.

Oszacuj całkowite białko w ekstraktach z nerek bydlęcych i świńskich za pomocą standardowego testu BSA i wykorzystaj to oszacowanie do normalizacji wyników LH i VEGF-A-ELISA. Średnie i mediany poziomów LH i VEGF obliczono zarówno dla zwierząt, jak i płci. Po zweryfikowaniu normalności danych wykorzystano modele regresji liniowej do zbadania zależności między LH i VEGF.

Stwierdzono, że LH jest silnym i znaczącym predyktorem VEGF zarówno w nerkach bydła, jak i świń. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o pobraniu próbek z identycznych obszarów w każdej tkance. Podobną procedurę można zastosować do ekstrakcji dowolnego rodzaju tkanki.

Pamiętaj, aby znormalizować anality za pomocą całkowitego ekstraktu białkowego z dowolnej tkanki, której używasz.