Name: Wykazanie liniowej zależności między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych a hormonem luteinizującym w ekstraktach z kory nerkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Poznaj metodę analizy korelacji między VEGF a LH w ekstraktach z kory nerkowej bydła i świń przy użyciu ELISA. Ta technika umożliwia badanie interakcji czynników wzrostu w fizjologii nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Scholl's Slaughterhouse (Blissfield, MI) za dostarczenie nerek bydlęcych i wieprzowych. Na to badanie nie wykorzystano żadnych dotacji.

Do tego badania nie użyto żadnych żywych ani doświadczalnych zwierząt.
1. Obchodzenie się z tkankami
<ol>
	<li>Nerki bydła i świń należy pozyskiwać w całości bezpośrednio po uboju z rzeźni. Transport na lodzie do laboratorium.</li>
	<li>Po przybyciu do laboratorium przepłucz nerki 50 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Powtórz ten krok 2 razy, aby całkowicie usunąć krew.</li>
	<li>Nerki należy przechowywać na lodzie (lub w lodówce) do czasu dalszej ekstrakcji.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie nerek
<ol>
	<li>Użyj sterylnych nożyczek, kleszczy, noża i szalek Petriego, aby wyciąć nerki i wyciąć wymaganą część tkanki.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy RIPA przed rozwarstwieniem nerki. Rozpuść 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% deoksycholanu sodu i 10% SDS w podwójnie destylowanej wodzie, a następnie dokładnie wymieszaj. Bufor do lizy RIPA należy przechowywać w lodówce, gdy nie jest używany.</li>
	<li>Delikatnie przeciąć nerkę na pół (płaszczyzna strzałkowa) i wyciąć kawałek tkanki (50-70 mm2) z obszaru kory w środku nerki (o wadze 80-100 mg mokrej masy).</li>
	<li>Zmiel blok tkanki na małe kawałki nożem, aby wspomóc proces homogenizacji.</li>
	<li>Po zmieleniu tkanek przenieś je do probówki do mikrofuge z 1 ml lodowatego buforu do ekstrakcji lizy 1x RIPA. Umieść probówki w lodzie do czasu dalszej ekstrakcji.</li>
</ol>
3. Homogenizacja tkanek
<ol>
	<li>Oznacz probówki do mikrofiltrów szczegółami próbki do pobrania supernatantu tkankowego.</li>
	<li>Za pomocą ręcznego homogenizatora ze sterylną sondą homogenizuj tkanki przez 1-2 minuty w niskich temperaturach (próbki na wiadrze z lodem), aż nie będą widoczne żadne kawałki tkanek.</li>
	<li>Ekstrakty tkankowe należy natychmiast poddać do odwirowania w wirówce z chłodzeniem o stężeniu 9 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyjmij probówki z wirówki i umieść je w pojemniku na lód.</li>
	<li>Zebrać supernatant do nowej, oznakowanej probówki do mikrofuge i przechowywać na lodzie. Wyrzuć granulkę.</li>
	<li>Przygotować oddzielne podwielokrotności supernatantów odpowiednio do testów immunoenzymatycznych LH i VEGF-A (ELISA) i analizy białka całkowitego, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
4. Test ELISA bydła i trzody chlewnej
<ol>
	<li>Przechowywać wszystkie składniki testu ELISA zawarte w dostępnym w handlu zestawie ELISA hormonu luteinizującego (LH) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 2-8 °C. Obejmuje to przeciwciało, koniugat HRP, płytkę testową (96 dołków), kalibratory, bufor do płukania (20x koncentrat), substrat A, substrat B i roztwór zatrzymujący. Przygotuj wszystkie odczynniki zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem testu doprowadzić wszystkie odczynniki i płytkę testową do temperatury pokojowej (RT). Do testu należy użyć wymaganej liczby studzienek, uszczelnić i przechowywać niewykorzystane studzienki w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Rozcieńczyć bufor do przemywania (15 ml 20x koncentratu) do 300 ml wodą podwójnie destylowaną</li>
	<li>Ustaw puste studzienki bez żadnego rozwiązania.</li>
	<li>Dodać 50 μl wzorca lub próbki do każdej studzienki (n = 2), a następnie dodać kolejne 50 μl koniugatu peroksydazy chrzanowej (hrp) do każdej studzienki. Natychmiast dodaj kolejne 50 μl roztworu przeciwciał do każdej studzienki. Zamknąć płytkę, dobrze wymieszać i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć studzienki 1x buforem do płukania (200 μL/studzienkę) i powtórzyć 4x.</li>
	<li>Dodać 50 μl substratu A i 50 μl substratu B do każdej studzienki i dobrze wymieszać, delikatnie stukając płytką z boku. Szczelnie zamknąć płytkę i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, delikatnie postukać w płytkę i odczytać płytkę za pomocą spektrofotometru ustawionego na długość fali 450 nm.</li>
	<li>Znormalizować stężenie LH u bydła i świń do białka całkowitego (patrz punkt 6).</li>
</ol>
5. Test ELISA VEGF-A dla bydła i trzody chlewnej
<ol>
	<li>Przechowuj wszystkie składniki testu ELISA zawarte w dostępnych na rynku zestawach ELISA z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego A (patrz tabela materiałów) w temperaturze 2-8 °C. Obejmuje to przeciwciało, koniugat HRP, płytkę testową (96 dołków), kalibratory, bufor do płukania (20x koncentrat), substrat A, substrat B i roztwór zatrzymujący. Przygotuj wszystkie odczynniki zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem testu przynieś wszystkie odczynniki i płytkę testową do RT. Użyj wymaganej liczby studzienek do testu, uszczelnij i utrzymuj niewykorzystane studzienki w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Rozcieńczyć bufor do przemywania (15 ml 20x koncentratu) do 300 ml wodą podwójnie destylowaną</li>
	<li>Dodać 100 μl wzorca lub próbki do każdego dołka (n = 2). Zamknąć płytkę, dobrze wymieszać i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć ciecz z każdej studzienki i dodać 100 μl odczynnika wykrywającego A do każdej studzienki, uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć studzienki 1x buforem do płukania (400 μL/studzienkę) i powtórzyć 4x.</li>
	<li>Dodaj 100 μl odczynnika wykrywającego B do każdej studzienki i dobrze wymieszaj, delikatnie stukając w płytkę z boku. Uszczelnić płytkę i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć studzienki 1x buforem do płukania (400 μL/studzienkę) i powtórzyć 4x.</li>
	<li>Dodać 90 μl roztworu substratu do każdej studzienki, delikatnie postukać w płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, delikatnie postukać w płytkę i odczytać płytkę za pomocą spektrofotometru ustawionego na długość fali 450 nm.</li>
	<li>Znormalizować poziom VEGF-A u bydła i świń do białka całkowitego (sekcja 6).</li>
</ol>
6. Oszacowanie białka całkowitego
<ol>
	<li>Oszacować zawartość białka całkowitego w ekstraktach z nerek bydlęcych i świńskich za pomocą standardowego testu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przy użyciu zestawu handlowego (patrz tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
</ol>
7. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Obliczyć średnią, medianę i odchylenie standardowe każdego analitu.</li>
	<li>Przetestuj rozbieżność rozkładu próbki od normalnej, korzystając z testu Kołmogorowa-Smirnowa, aby zdecydować, po użyciu, między parametrycznymi i nieparametrycznymi testami statystycznymi. Jeśli dane mają rozkład normalny, należy przeprowadzić testy statystyczne za pomocą testów parametrycznych.</li>
	<li>W odpowiednich okolicznościach (takich jak normalny rozkład danych) wykorzystaj modele regresji do zbadania liniowej zależności między LH i VEGF-A.</li>
</ol>

<ol><li>Advani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+VEGF+in+maintaining+renal+structure+and+function+under+normotensive+and+hypertensive+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).</li>
<li>Majumder, S., Advani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+the+diabetic+kidney%3A+More+than+too+much+of+a+good+thing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).</li>
<li>Liu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+kidney+leads+to+progressive+impairment+of+glomerular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).</li>
<li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%3A+basic+science+and+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress.</a> Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+Levels+of+Luteinizing+Hormone+and+VEGF+are+Strongly+Correlated+in+Healthy+Mammalian+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes.</a> Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).</li>
<li>Babitha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone%2C+insulin+like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor+stimulate+vascular+endothelial+growth+factor+production+in+cultured+bubaline+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).</li>
<li>Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+Primate+Ovulatory+Follicle+Is+Stimulated+by+Luteinizing+Hormone+via+Prostaglandin+E2%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2.</a> Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).</li>
<li>Movsas, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Luteinizing+Hormone+%28LH%29+in+Living+Human+Vitreous+and+the+Effect+of+LH+Receptor+Reduction+on+Murine+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram.</a> Neuroscience. 385, 1-10 (2018).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+Signaling+by+the+Luteinizing+Hormone+Receptor+Reduces+Ocular+VEGF+and+Retinal+Vascularization+during+Mouse+Eye+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development.</a> Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).</li>
<li>Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+luteinizing+hormone%2Fchorionic+gonadotropin+%28LH%2FCG%29+receptor+precursor+in+a+human+kidney+cell+line+stably+transfected+with+the+rat+luteal+LH%2FCG+receptor+complementary+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA.</a> Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).</li>
<li>Lei, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+luteinizing+hormone%2Fhuman+chorionic+gonadotropin+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene.</a> Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).</li>
<li>Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29+in+renal+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology.</a> Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).</li>
<li>Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mature+luteinizing+hormone+receptor+in+rodent+urogenital+and+adrenal+tissues+is+developmentally+regulated+at+a+posttranslational+level%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level.</a> Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).</li>
<li>Ondruschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-mortem+in+situ+stability+of+serum+markers+of+cerebral+damage+and+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response.</a> International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).</li>
<li>Swain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+post-mortem+interval%3A+A+comparison+between+cerebrospinal+fluid+and+vitreous+humour+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+and+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry.</a> Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).</li>
<li>Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+method+for+the+detection+of+residues+of+amphenicol+antibiotics+in+bovine%2C+ovine+and+porcine+kidney+by+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor.</a> Talanta. 172, 120-125 (2017).</li>
<li>Konstantinou, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+%28ELISA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).</a> Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).</li>
<li>Levesque, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+urine+vascular+endothelial+growth+factor+levels+are+associated+with+mechanical+ventilation%2C+bronchopulmonary+dysplasia+and+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity.</a> Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).</li>
<li>Leviton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antecedents+and+early+correlates+of+high+and+low+concentrations+of+angiogenic+proteins+in+extremely+preterm+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns.</a> Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).</li>
<li>Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+vitreous+fluid+analysis+in+the+translational+research+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy.</a> Mediators of Inflammation. , 872978(2012).</li>
<li>Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+molecular+and+genomic+biomarkers+of+retinal+drug+efficacy%3A+use+of+ocular+fluid+sampling+to+evaluate+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF.</a> Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).</li>
</ol>

Zietchick Research Institute (ZRI) jest prywatnym (nastawionym na zysk) instytutem badawczym, a dr Tammy Movsas (założycielka i dyrektor ZRI) ma oczekujące zgłoszenia patentowe i zatwierdzone patenty na stosowanie antagonistów gonadotropin w leczeniu chorób oczu i cukrzycy. Poza tym, że jest pracownikiem (biochemikiem) w ZRI, dr A. Muthusamy nie ma żadnych innych konfliktów finansowych do zgłoszenia. A. Arivalagan (letni stażysta w ZRI, student studiów licencjackich na Uniwersytecie Michigan) nie ma innych konfliktów finansowych do zgłoszenia.

Pozyskanie nerek z rzeźni natychmiast po śmierci zwierzęcia jest kluczem do sukcesu w tej metodologii. Jest to główna zaleta wykorzystywania narządów od krów i świń zamiast ludzkich zwłok. Zwykle od momentu śmierci do pozyskania narządów ze zwłok ludzkich występuje co najmniej 12-24 godzinne opóźnienie. Ze względu na to, że skład chemiczny narządów ciała zmienia się znacząco w ciągu 2 godzin po sekcji zwłok 15,16, badania VEGF na nerkach ludzkich zwłok mogą nie o...

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych A (VEGF-A), pomaga regulować angiogenezę i przepuszczalność naczyń w nerkach i innych narządach1,2 (dalej VEGF-A będzie określany jako VEGF). Poziom VEGF w nerkach jest pod ścisłą kontrolą homeostatyczną. Gdy poziom VEGF w nerkach jest podwyższony lub obniżony, nerki mogą działać nieprawidłowo. Na przykład w ciągu 3 tygodni po urodzeniu myszy z heterozygotycznością specyficzną dla podocytów dla VEGF rozwijają śródbłonek i bezkrwiste kłębuszki nerkowe (tj. zmiany w nerkach obserwowane w ludzkim stanie przedrzucawkowym), a schyłkowa niewydolność nerek występuje u tych heterozygot w wieku 3 miesięcy. Homozygotyczne nokauty specyficzne dla podocytów umierają z powodu wodniaka i niewydolności nerek w ciągu 1 dnia od urodzenia3,4.
Z drugiej strony, nadekspresja nerkowego VEGF powoduje białkomocz i przerost kłębuszków nerkowych3,4. Na przykład transgeniczne króliki, które wykazują nadekspresję VEGF, wykazują postępujący białkomocz ze zwiększonymi wskaźnikami filtracji kłębuszkowej we wczesnych stadiach nefropatii, a następnie zmniejszonymi wskaźnikami filtracji kłębuszkowej w późniejszych stadiach3. Nefropatia cukrzycowa, główna przyczyna schyłkowej niewydolności nerek u dorosłych chorych na cukrzycę, jest silnie związana z rozregulowaniem VEGF2,5. Dużo uwagi poświęcono roli hipoksji w indukowaniu ekspresji VEGF w warunkach patologicznych5. Jednak czynniki rządzące VEGF w warunkach fizjologicznych (zarówno w nerkach, jak i innych narządach) nie są dobrze poznane2,6. Zidentyfikowanie tych czynników (z wyjątkiem tlenu), które są zaangażowane w fizjologiczną i patologiczną regulację VEGF, jest ważnym przedsięwzięciem.
Hormon luteinizujący (LH), hormon pro-angiogenny, pomaga regulować fizjologiczną ekspresję VEGF w narządach rozrodczych, takich jak jajnik i jądra7,8. Wcześniejsze badania dostarczyły dowodów na to, że LH pomaga również regulować VEGF w narządach nierozrodczych, takich jak oczy6,9,10. Receptory LH znajdują się w rdzeniu i korze nerki11,12. Warto zauważyć, że komórki nabłonka kanalików nerkowych, a także receptor LH, wyrażają VEGF11,12,13,14. Biorąc pod uwagę te dwie obserwacje, postawiliśmy hipotezę, że LH pomaga również regulować ekspresję VEGF w nerkach13,14. Aby dostarczyć dowodów na ten związek LH/VEGF, przedstawiony protokół ma na celu wykazanie, że poziomy LH są w stanie przewidzieć poziom VEGF w nerkach. Wiele wcześniejszych badań związanych z VEGF dotyczących nerek wykorzystywało modele ssaków niższego rzędu (tj. gryzoni i królików)2. Aby przełożyć tę pracę na ludzkie ciało, w badaniu zbadano związek między VEGF i LH u ssaków wyższego rzędu (w tym przypadku modele bydlęce i wieprzowe). Aby zrealizować ten cel, przygotowano całkowity lizat białkowy z obszaru kory nerek bydła i świni.

<table><tbody><tr><td>Bydlęcy zestaw LH ELISA</td><td>MyBiosource, San Diego, Kalifornia.</td><td></td><td></td>MBS700951</tr><tr><td>Bydlęcy zestaw VEGF-A ELISA</td><td>MyBiosource, San Diego, Kalifornia.</td><td></td><td></td>MBS2887434</tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA dla świń LH</td><td>MyBiosource, San Diego, Kalifornia.</td><td></td><td></td>MBS009739</tr><tr><td>Świnia VEGF-A ELISA</td><td>Ray Biotech, Norcross, GA.</td><td>ELP-VEGFA-1</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Bufor do lizy i ekstrakcji</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.</td><td>Numer katalogowy: 89901</td><td></td></tr></tbody></table>

wykazanie liniowej zależności między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych a hormonem luteinizującym w ekstraktach z kory nerkowej

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) pomaga kontrolować angiogenezę i przepuszczalność naczyń w nerkach. Zaburzenia nerek, takie jak nefropatia cukrzycowa, są związane z rozregulowaniem VEGF w nerkach. Czynniki, które rządzą VEGF w warunkach fizjologicznych w nerkach, nie są dobrze poznane. Hormon luteinizujący (LH), hormon proangiogenny, pomaga regulować fizjologiczną ekspresję VEGF w narządach rozrodczych. Biorąc pod uwagę, że receptory LH znajdują się w nerkach, my w Instytucie Badawczym Zietchick postawiliśmy hipotezę, że LH pomaga również regulować ekspresję VEGF w nerkach. Aby dostarczyć dowodów, naszym celem było wykazanie, że poziomy LH są w stanie przewidzieć poziomy VEGF w nerkach ssaków. W większości badań związanych z VEGF dotyczących nerek jako modeli wykorzystywano ssaki niższego rzędu (tj. gryzonie i króliki). Aby przełożyć tę pracę na ludzkie ciało, zdecydowano się zbadać związek między VEGF i LH u ssaków wyższego rzędu (tj. modeli bydlęcych i wieprzowych). Protokół ten wykorzystuje całkowity lizat białka z kory nerkowej. Kluczem do sukcesu tej metody jest pobranie nerek od zwierząt rzeźnych bezpośrednio po śmierci, a także normalizacja poziomu analitu (w ekstrakcie nerkowym) przez białko całkowite. Badanie to z powodzeniem wykazało istotną liniową zależność między LH i VEGF zarówno w nerkach bydła, jak i świń. Wyniki są powtarzalne u dwóch różnych gatunków. Badanie dostarcza dowodów potwierdzających, że stosowanie ekstraktów nerkowych od krów i świń jest doskonałym, ekonomicznym i obfitym źródłem do badania fizjologii nerek, w szczególności do badania korelacji między VEGF a innymi analitami.

Średnie i medianowe poziomy LH oraz VEGF w zależności od gatunku zwierzęcia i płci przedstawiono w Tabeli 1. Po zweryfikowaniu normalności rozkładu danych za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, wykorzystano modele regresji liniowej do zbadania zależności między LH a VEGF. Stwierdzono, że LH jest silnym i istotnym predyktorem VEGF zarówno w nerkach bydlęcych, jak i świńskich (model nerki bydlęcej: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; model nerki świńskiej: n = 7; R2...

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystania preparatu z ekstraktu z kory nerkowej i normalizacji białka całkowitego w celu wykazania korelacji między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego a hormonem luteinizującym w nerkach ssaków.

Wykazanie liniowej zależności między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych a hormonem luteinizującym w ekstraktach z kory nerkowej

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

W naszym protokole zaobserwowano, że stosowanie ekstraktów nerkowych od krów i świń jest doskonałym i ekonomicznym źródłem do badania fizjologii nerek, w szczególności badania korelacji między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego a innymi analitami. Skorelowanie VEGF, niezbędnego czynnika wzrostu w angiogenezie narządów, z innymi białkami zawsze było wyzwaniem. Ta technika pozwala nam zbadać związek między VEGF a analitami, takimi jak hormony.To z pewnością poszerzy naszą bazę wiedzy na temat tego ważnego czynnika wzrostu. Ta metoda może być przydatna do korelacji innych analitów w ekstraktach kory nerkowej oprócz tych wymienionych w tym filmie. Demonstracja wizualna pomoże innym uzyskać powtarzalne wyniki bez żadnych błędów próbkowania.Użycie świeżej tkanki ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tej techniki. Ważne jest, aby natychmiast po uboju pozyskać ze zwierzęcia świeże całe nerki. Tkankę należy zawsze przenosić do laboratorium na lodzie.Użyj sterylnych nożyczek, kleszczy, noża i szalek Petriego, aby wyciąć nerki i wyciąć wymaganą część tkanki. Delikatnie przeciąć nerkę na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej i wyciąć kawałek tkanki z obszaru kory w środku nerki. Zmiel tkankę na małe kawałki nożem i przenieś ją do probówki do mikrofuge z jednym mililitrem lodowatego buforu ekstrakcyjnego do lizy 1X RIPA.Oznacz probówkę konkretnymi szczegółami próbki i umieść ją na lodzie. Użyj ręcznego homogenizatora ze sterylną sondą, aby homogenizować tkankę przez jedną do dwóch minut, aż nie będą widoczne żadne kawałki, a następnie natychmiast odwiruj probówkę przy 9 600 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu należy przygotować oddzielne podwielokrotności próbki do analizy ELISA i całkowitej analizy białka, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania.Przed rozpoczęciem testu należy doprowadzić wszystkie odczynniki i płytkę testową do temperatury pokojowej, usuwając nadmiar studzienek i przechowując je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Rozcieńczyć 20-krotny bufor płuczący do 300 mililitrów wodą podwójnie destylowaną i ustawić ślepe studzienki bez żadnego roztworu. Dodać 50 mikrolitrów wzorca lub próbki i kolejne 50 mikrolitrów koniugatu peroksydazy chrzanowej do każdej studzienki, a następnie natychmiast dodać 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdej studzienki i zamknąć płytkę.Wymieszaj płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji przemyć każdą studzienkę 200 mikrolitrami buforu do płukania. Dodaj 50 mikrolitrów substratu A i substratu B do każdej studzienki, delikatnie wymieszaj płytkę, stukając w bok, a następnie zamknij i inkubuj w ciemności przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę i odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Przygotować odczynniki i przepłukać bufor zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie dodać 100 mikrolitrów wzorca lub próbki do każdej studzienki, uszczelnić płytkę, dobrze wymieszać i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Usuń płyn z każdej studzienki i dodaj 100 mikrolitrów odczynnika detekcyjnego A. Zamknij płytkę i inkubuj ją przez kolejną godzinę. Następnie umyj każdą studzienkę 400 mikrolitrami buforu do mycia, a następnie dodaj 90 mikrolitrów roztworu substratu do każdej studzienki, delikatnie postukaj w płytkę i inkubuj ją przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ostatniej inkubacji dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, delikatnie postukaj w płytkę i odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą spektrofotometru.Oszacuj całkowite białko w ekstraktach z nerek bydlęcych i świńskich za pomocą standardowego testu BSA i wykorzystaj to oszacowanie do normalizacji wyników LH i VEGF-A-ELISA. Średnie i mediany poziomów LH i VEGF obliczono zarówno dla zwierząt, jak i płci. Po zweryfikowaniu normalności danych wykorzystano modele regresji liniowej do zbadania zależności między LH i VEGF.Stwierdzono, że LH jest silnym i znaczącym predyktorem VEGF zarówno w nerkach bydła, jak i świń. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o pobraniu próbek z identycznych obszarów w każdej tkance. Podobną procedurę można zastosować do ekstrakcji dowolnego rodzaju tkanki.Pamiętaj, aby znormalizować anality za pomocą całkowitego ekstraktu białkowego z dowolnej tkanki, której używasz.

demonstrating-linear-relationship-between-vascular-endothelial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy prosty test biologiczny oparty na komórkach do wykrywania, ilościowego określania i monitorowania aktywności członków rodziny ligandów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Test wykorzystuje receptory chimeryczne ulegające ekspresji w linii komórkowej zależnej od czynnika, aby zapewnić półilościową lub ilościową ocenę wiązania receptora i sieciowania przez ligand.

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Podawanie leków na przywrócenie funkcji nerek wymaga kontroli lokalizacji i dystrybucji związku terapeutycznego. Tutaj szczegółowo opisujemy prostą technikę donerkowego podawania leków szczurom. Procedura ta może być łatwo wykonana bez śmiertelności i z wysoką odtwarzalnością.

Donaczyniowe podawanie leków biologicznych do nerki szczura

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Tutaj prezentujemy protokół pobierania próbek krwi z końcówki ogona do częstego pobierania próbek u nieskrępowanych myszy. Metoda ta jest przydatna do oceny wzorców pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego i może być dostosowana do analizy innych krążących czynników.

Częste pobieranie próbek krwi na końcówce ogona u myszy w celu oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego

Hormon folikulotropowy (FSH) w różnych tkankach i organach pozagonadalnych jest związany z patogenezą wielu chorób. Mysi model owariektomii i leczony FSH (OVF) może być wykorzystany do zbadania pozagonowego działania FSH.

Badanie niezależnych efektów hormonu folikulotropowego in vivo w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

W niniejszym filmie zaprezentowano dwie metody przygotowania i umieszczania kuleczek pokrytych czynnikiem wzrostu na eksplantach rozwijającej się kory mózgu. Kuleczki te mogą być wykorzystywane do indukcji przestrzennie ograniczonej ekspresji genów w rozwijającej się tkance nerwowej, takiej jak eksplanty przedmózgowia. Przedstawiono metody wykorzystujące zarówno kuleczki Affi-Gel, jak i akrylowe kuleczki heparynowe.

Umieszczanie kuleczek pokrytych czynnikami wzrostu w eksplantach grzbietowej części przedmózgowia

Różnorodne czynniki wzrostu i białka oddziałują na siebie, indukując komórki do przyjmowania różnych przeznaczeń komórkowych podczas rozwoju. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie preparacji in ovo w celu zbadania możliwych oddziaływań między różnymi białkami w rozwoju, poprzez umieszczanie kulek w embrionach kurzych w stadium E2.5.

Umieszczanie kulek powlekanych czynnikami wzrostu w zarodkach kurczat we wczesnym stadium rozwoju

Opisujemy przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T, stosowanego do ekspansji in vitro linii limfocytów T szczura specyficznych dla antygenu.

Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczura

Poznaj metodę analizy korelacji między VEGF a LH w ekstraktach z kory nerkowej bydła i świń przy użyciu ELISA. Ta technika umożliwia badanie interakcji czynników wzrostu w fizjologii nerek.

Wykazanie liniowej zależności między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych a hormonem luteinizującym w ekstraktach z kory nerkowej (Wideo) | JoVE Journal

Wykazanie liniowej zależności między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych a hormonem luteinizującym w ekstraktach z kory nerkowej

Przeglądaj więcej filmów