Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych
3 grudnia 2020
Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Wykorzystując mikroskopię przyżyciową, protokół ten umożliwia wizualizację tkanki jelitowej w czasie rzeczywistym do rozdzielczości pojedynczej komórki oraz badanie wysoce dynamicznych procesów, takich jak złuszczanie komórek. W połączeniu ze standardowymi doświadczeniami ze znacznikami, protokół ten pozwala na identyfikację zarówno zaburzeń przepuszczalności jelit in vivo, jak i rozróżnienia między przepuszczalnością para- i transkomórkową. Protokół ten może być wykorzystany jako podstawa do opracowania dodatkowych podejść do mikroskopii przyżyciowej do wizualizacji innych wysoce dynamicznych procesów komórkowych w różnych tkankach.
Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna do zrozumienia etapów przygotowania chirurgicznego i ułożenia żywego zwierzęcia w sposób ułatwiający uzyskanie obrazu na powierzchni błony śluzowej jelita. Przed rozpoczęciem procedury włącz podstawę i skrzynkę skanera konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i naciśnij start, aby włączyć komputer. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu i wybierz odpowiednią konfigurację.
Aby ustawić odpowiednią rozdzielczość obrazu, wybierz konfigurację, sprzęt, rozdzielczość, głębię bitową i 12. W menu akwizycji wybierz XYZT jako tryb akwizycji obrazu i ustaw obiektyw na 20 lub 40X. Aby skonfigurować ustawienie akwizycji sekwencyjnej, kliknij przycisk Szukaj i dodaj, a następnie zaznaczaj między klatkami.
Aby skonfigurować sekwencję pierwszą, włącz widoczną skrzynkę laserową. Ustaw lampę fotopowielacza jeden na włączoną i zdefiniuj długość fali emisji. Aby skonfigurować sekwencję drugą, włącz widoczną skrzynkę laserową.
Ustaw lampę fotopowielacza dwa na włączoną i zdefiniuj długość fali emisji. Następnie aktywuj odpowiednie lasery. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, za pomocą wacika nałóż maść na oczy znieczulonej myszy i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w okolicy lewej komory brzucha.
Użyj kleszczy, aby zewnętrzizować odcinek jelita o długości od trzech do pięciu centymetrów. Wykonaj dwa małe nacięcia na górze i na dole odcinka jelita i wprowadź szklaną mikropipetę do światła jelita. Następnie użyj elektrokoagulacji, aby otworzyć zewnętrzny odcinek jelita wzdłużnie wzdłuż strony antykrezkowej i odsłonić błonę śluzową.
Krótko spłucz tkankę roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć zawartość kału. W celu zabarwienia powierzchni błony śluzowej jelit nanieść 100 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu akryflawiny w kropelkach na odsłoniętą powierzchnię błony śluzowej i pozostawić plamę do rozwoju przez trzy minuty przed wypłukaniem pozostałego roztworu za pomocą PBS. Następnie nałóż 100 mikrolitrów dwumiligramowego na mililitr roztworu dekstranu rodaminy w kropelkach na błonę śluzową na trzyminutową inkubację przed przemyciem PBS.
Następnie umieść znieczuloną mysz na wznak na szkiełku nakrywkowym zamontowanym na komorze przepłukanej solą fizjologiczną o temperaturze 37 stopni Celsjusza, w razie potrzeby dostosowując pozycję, i umieść preparat na odwróconym stoliku mikroskopowym. Natychmiast po umieszczeniu myszki na stoliku należy włączyć źródło światła i wyregulować pozycję XY, aż oś oświetlenia zostanie skupiona na preparacji tkankowej. W celu wybrania pola widzenia należy dobrać odpowiednią kostkę filtra.
Otwórz migawkę i użyj kółek makro i mikro, aby ustawić ostrość na powierzchni błony śluzowej jelit. Dostosuj pozycję XY, aby zlokalizować obszar, w którym można uwidocznić kilka kosmków w polu view i zmień kostkę filtra, aby sprawdzić, czy barwienie dekstranem rodaminy jest również widoczne w tym obszarze. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania rozpocznij akwizycję obrazu i wybierz sekwencję pierwszą, aby dostosować moc lasera, wzmocnienie i przesunięcie dla sekwencji pierwszej.
Następnie wybierz sekwencję drugą i dostosuj moc lasera, wzmocnienie i przesunięcie dla sekwencji drugiej. Aby zdefiniować zakres stosu Z, otwórz menu rozwijane Stos Z. Użyj kontrolki dostępu Z, aby skupić się na powierzchni błony śluzowej i kliknij przycisk Rozpocznij.
Skoncentruj się na dolnej granicy, w której sygnał jest nadal wykrywalny, i kliknij koniec. Zdefiniuj liczbę stosów Z, unikając poklatków dłuższych niż dwie minuty przez dwa kolejne punkty czasowe i otwórz menu czasu, aby wybrać opcję minimalizuj i zbieraj do zatrzymania. Aby zdefiniować średnią liniową, wybierz opcję Szukaj jednej, Średnia liniowa druga, Szukaj dwie i Średnia liniowa dwójka.
Następnie, aby uzyskać obrazy, ustaw format na 1024 x 1024 pikseli, a prędkość na 400 i kliknij start. U myszy warunkowych z niedoborem GGTazy specyficznej dla komórek nabłonka jelitowego rozwinęła się ciężka patologia jelit, o czym świadczy wzrost oceny uszkodzenia histologicznego jelita cienkiego, a zwiększoną przepuszczalność nabłonka jelitowego można również wykryć za pomocą znacznika w eksperymentach in vivo przy użyciu doustnie podawanego dekstranu FITC. Zdarzenia wydalania komórek można zidentyfikować jako komórki przemieszczające się z monowarstwy nabłonka do światła, co prowadzi do tymczasowych szczelin w suficie nabłonka, które są ostatecznie zamykane przez kontakt między sąsiednimi komórkami, tak zwany efekt zamka błyskawicznego.
Luki te obserwuje się zarówno u myszy kontrolnych, jak i myszy z niedoborem GGTazy, chociaż częstotliwość tych zjawisk jest wyższa w tych ostatnich. Co ciekawe, inne komórki również wydają się wychwytywać dekstran. Te tak zwane zdarzenia przepuszczalnych komórek występują również głównie u myszy z warunkowym nokautem.
Barwienie immunologiczne białek związanych z cytoszkieletem i białkami połączeń ścisłych można przeprowadzić w celu zidentyfikowania określonych celów, które przyczyniają się do potencjalnych zakłóceń przepuszczalności nabłonka, określonych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Metoda ta może być stosowana do analizy innych zjawisk zachodzących na powierzchni błony śluzowej jelit, takich jak nieszczelność śródbłonka czy komunikacja nabłonka immunologicznego w kontekście infekcji jelitowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wykorzystuje mikroskopię intravitalną do wizualizacji złuszczania komórek nabłonka jelitowego w czasie rzeczywistym w żywych organizmach. Metoda ta umożliwia obrazowanie błony śluzowej jelit z rozdzielczością pojedynczej komórki, co ułatwia badanie dynamicznych procesów komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Mikroskopia intravitalna pozwala na wgląd w dynamikę żywych tkanek.
- Zrozumienie przepuszczalności jelitowej jest kluczowe dla wielu badań biologicznych.
- złuszczanie komórek jest istotnym procesem w kontekście zdrowia i chorób jelit.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym usprawnia badanie zachowań komórkowych.
Cel badania
- W celu wizualizacji złuszczania komórek nabłonka jelitowego in vivo.
- W celu zidentyfikowania zaburzeń przepuszczalności bariery jelitowej.
- W celu odróżnienia parakomórkowych od transkomórkowych mechanizmów przepuszczalności.
Zastosowane metody
- Mikroskopia intravitalna do obrazowania w czasie rzeczywistym.
- Barwienie miejscowe błony śluzowej jelita akryflawiną i dekstranem z rodaminą B.
- Mikroskopia konfokalna w celu uzyskania rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek.
- Standardowe doświadczenia z użyciem znaczników w celu oceny przepuszczalności.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja złuszczania komórek w żywej tkance jelitowej.
- Identyfikacja dynamicznych procesów wpływających na przepuszczalność jelit.
- Wykazanie możliwości zastosowania tej metody w innych tkankach.
- Pogłębienie wiedzy na temat przygotowania chirurgicznego do obrazowania.
Wnioski
- Protokół ten stanowi cenne narzędzie do badania dynamiki jelit.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym może dostarczyć nowej wiedzy na temat procesów komórkowych.
- Metoda ta może zainspirować dalsze badania w różnych kontekstach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia intravitalna umożliwia wizualizację dynamiki nabłonka jelitowego w czasie rzeczywistym, zapewniając bezpośrednią obserwację funkcji bariery oraz złuszczania komórek in vivo. Podejście to wspomaga mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów terapeutycznych w obrębie przewodu pokarmowego poprzez powiązanie zaburzeń molekularnych z funkcjonalnymi wynikami przepuszczalności. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając ilościowych, rozdzielczych przestrzennie danych na temat integralności nabłonka oraz procesów naprawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez korelację interwencji genetycznych lub farmakologicznych z procesami złuszczania nabłonka i zdarzeniami związanymi z nieszczelnością bariery w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią wizualizację zaburzeń przepuszczalności jelitowej w żywych systemach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez rozróżnienie między mechanizmami przepuszczalności paracelularnej a transcelularną, co pozwala na ocenę ryzyka w oparciu o mechanizm działania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie podstawowych fenotypów uwalniania i przepuszczalności w modelach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki ilościowemu obrazowaniu przepływu znacznika oraz zdarzeń ekstruzji komórkowej.
- Wartość platformy: Wykazanie gotowości do przesiewu i skalowalności poprzez umożliwienie długotrwałego monitorowania dynamicznych procesów jelitowych w preparatach znieczulonych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia znaczenie choroby i zgodność biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie obserwacji intravitalnych z histologicznymi wskaźnikami uszkodzeń oraz testami przepuszczalności opartymi na znacznikach.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając podłużną ocenę naprawy nabłonka i przywracania funkcji bariery.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Koncentruje się na wartości predykcyjnego ograniczania ryzyka poprzez identyfikację zdarzeń związanych z przepuszczalnością komórek oraz tzw. restitution (zamknięcie rany przez przesuwanie się komórek) jako funkcjonalnych wskaźników odporności nabłonka.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkrywania – od testowania hipotez dotyczących celu, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, wspierając iteracyjne doprecyzowanie celów żołądkowo-jelitowych na podstawie wyników dotyczących funkcjonalnej bariery.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda wspiera weryfikację hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych lub ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie korelacji w czasie rzeczywistym modyfikacji molekularnych z złuszczaniem nabłonka i funkcją barierową.
- Screening: Opisuje gotowość testu, powtarzalność lub wyniki ilościowe, o ile artykuł potwierdza je poprzez znormalizowane dostarczanie znacznika i obrazowanie konfokalne przepływu dekstranu przez błonę śluzową jelita.
- Analityka: Wskazuje pomiary, odczyty lub wyniki statystyczne pomagające zespołom w porównywaniu warunków, w tym akwizycję stosów Z (Z-stack), uśrednianie linii oraz obrazowanie time-lapse częstotliwości złuszczania i tworzenia się szczelin.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną lub dopasowaniem biomarkerów tylko wtedy, gdy źródło to wspiera, wiążąc zdarzenia złuszczania in vivo ze zwiększonym uszkodzeniem histologicznym i przepuszczalnością FITC-dextran w modelach kondycjonalnego nokautu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako powtarzalną kompetencję, a nie technikę jednorazową, podkreślając jej przydatność w badaniu innych wysoce dynamicznych procesów komórkowych w różnych tkankach poza błoną śluzową jelita.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne w późnej fazie.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana wiedza naukowa w zakresie mikroskopii intravitalnej, preparatyki chirurgicznej oraz obrazowania konfokalnego.
- Potrzeby w zakresie instrumentacji i infrastruktury analitycznej, w tym konfokalny skaningowy mikroskop laserowy, odpowiednie obiektywy (20X/40X) oraz możliwości sekwencyjnego pozyskiwania obrazów.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej dla protokołów barwienia (akryflawina i dekstran z rodamyną B), konfiguracji stosu Z (Z-stack) oraz parametrów time-lapse.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych, w tym szczepach reporterowych transgenicznych i modelach kondycjonalnego nokautu dla analizy specyficznej dla typu komórek.
- Ograniczenia praktyczne potwierdzone w materiale źródłowym: właściwości optyczne tkanki, technologia obrazowania oraz konfiguracja mikroskopu określają odległość roboczą i rozdzielczość.
