Name: Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj mikroskopię przyżyciową do badania przepuszczalności jelit i wydalania komórek nabłonkowych u myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania prowadzące do tych wyników otrzymały finansowanie z Programu Ludzie (działania Marie Curie) w ramach umowy o grant REA nr 302170 Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013); Interdyscyplinarnego Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Uniwersytetu Erlangen-Norymberga; Centrum Badań Klinicznych TRR241 i Grupy Badań Klinicznych KFO257 Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (DFG); oraz DFG.

Następujący protokół został zatwierdzony przez odpowiednie władze lokalne w Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Niemcy). Myszy trzymano w określonych warunkach wolnych od patogenów.
UWAGA: Hamowanie prenylacji za pośrednictwem GGTazy w obrębie IEC powoduje poważną zmianę przepuszczalności jelit u myszy Pggt1biΔIEC24. Dlatego ten mysi model został wykorzystany do zademonstrowania, w jaki sposób protokół może być przydatny do badania wad bariery jelitowej. Jednak protokół ten może być wykorzystany do badania dowolnej innej linii myszy.
1. Przygotowanie chirurgiczne i barwienie błony śluzowej jelit myszy
UWAGA: Przygotowanie chirurgiczne opiera się na wcześniej opisanych protokołach25. Podczas przygotowania chirurgicznego trzymaj znieczuloną mysz pod czerwoną lampą, aby uniknąć spadku temperatury ciała.
<ol>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (96 mg/kg ketaminy i 12,8 mg/kg ksylazyny). Sprawdź znieczulenie, sprawdzając, czy nie ma odruchu powiekowego.</li>
	<li>Nałóż krem ochronny pod oczy za pomocą wacika.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie (1 cm) w lewej okolicy brzusznej za pomocą standardowych kleszczy i prostych cienkich nożyczek.</li>
	<li>Zewnętrznij odcinek jelita (około 5-7 cm).</li>
	<li>Otworzyć zewnętrzny odcinek jelita wzdłużnie przez elektrokauteryzację po stronie antykrezkowej.</li>
	<li>Odsłoń błonę śluzową i krótko spłucz roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć zawartość kału. 
	UWAGA: Opcjonalnie nałóż ksylazynę bezpośrednio na jelito, aby uniknąć artefaktów ruchowych spowodowanych perystaltyką.</li>
	<li>Zabarwić powierzchnię błony śluzowej jelit akryflawiną i dekstranem rodaminy-B (10 kDa).
	<ol>
		<li>Nanieść 1 mg/ml roztworu akryflawiny (100 μl), pipetując kropla po kropli na błonę śluzową i inkubować przez 3 minuty. Wypłukać pozostały roztwór za pomocą PBS.</li>
		<li>Nanieść roztwór 2 mg/ml rodaminy i dekstranu (100 μl), pipetując kropla po kropli, na błonę śluzową i inkubować przez 3 minuty. Wypłukać pozostały roztwór za pomocą PBS. 
		UWAGA: Opcjonalnie należy usunąć krew z preparatu za pomocą aseptycznej bawełny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić znieczuloną mysz na wznak na szkiełku nakrywkowym zamontowanym w komorze przepłukanej wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej (37 °C). 
	UWAGA: Otwarty segment jelita jest następnie umieszczany powierzchnią światła w dół, na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Umieść preparat (znieczuloną mysz w komorze) na odwróconym stoliku mikroskopowym.</li>
	<li>Przykryj zwierzę podkładką izotermiczną (ok. 37 °C).</li>
	<li>Natychmiast należy przystąpić do mikroskopii przyżyciowej. 
	UWAGA: Preparat chirurgiczny należy przepłukać wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej, aby uniknąć odwodnienia tkanki i śmierci komórek.</li>
</ol>
2. Mikroskopia przyżyciowa
UWAGA: Wykonaj krok 2.1 przed rozpoczęciem przygotowań chirurgicznych, aby uniknąć długiego czasu oczekiwania między znieczuleniem, operacją i akwizycją obrazu. W razie potrzeby zwierzętom przygotowanym chirurgicznie można podać dodatkowe dawki środków znieczulających, aby utrzymać je w znieczuleniu do eksperymentów obrazowych.
<ol>
	<li>Skonfiguruj mikroskop CLSM.
	<ol>
		<li>Uruchom mikroskop CLSM, włączając podstawę mikroskopu i skrzynkę skanera. Włącz komputer, naciskając przycisk Start.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu (np. LAS X), klikając dwukrotnie ikonę. Wybierz odpowiednią konfigurację (Konfiguracja: maszyna; Mikroskop: DMI6000) i kliknij przycisk OK.
		<ol>
			<li>Zdefiniuj odpowiednią rozdzielczość. Przejdź do punktu menu Konfiguracja | Sprzęt komputerowy | Rezolucja | Głębia bitowa. Wybierz pozycję 12.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przejdź do menu Pozyskiwanie. Wybierz xyzt jako tryb akwizycji obrazu z menu rozwijanego. Wybierz obiektyw z menu rozwijanego (20x lub 40x).</li>
		<li>Projektowanie ustawienia akwizycji sekwencyjnej. Kliknij Sekwencja. Dodaj drugą sekwencję, klikając przycisk dodawania (+). Wybierz opcję Między klatkami.
		<ol>
			<li>Konfiguracja Sekwencja 1 (wykrywanie akryflawiny; wzbudzenie 416 nm; emisja 514 nm). Włącz widoczną skrzynkę laserową. Aktywuj PMT1 (WŁ.). Określ okno długości fali emisji (490-550 nm).</li>
			<li>Konfiguracja Sekwencja 2 (wykrywanie rodaminy B-dekstran; wzbudzenie 570 nm; 590 nm, emisja). Włącz widoczną skrzynkę laserową. Aktywuj PMT2 (WŁ.). Zdefiniuj okno długości fali emisji (550-760).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aktywuj odpowiednie lasery (488 i 552). Przejdź do punktu menu Konfiguracja | Lasery. Aktywuj lasery 488 i 552 nm (włącz).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj ustawienie do konkretnych funkcji bieżącego eksperymentu.
	<ol>
		<li>Włącz źródło światła (naciśnij przycisk zasilania). Umieścić preparat (znieczuloną mysz w komorze) na stoliku mikroskopowym i zmieniać pozycję xy, aż oś oświetlenia skupi się na preparacie tkankowym.</li>
		<li>Wybierz pole zainteresowania za pomocą standardowego źródła światła i okularów.
		<ol>
			<li>Wybierz kostkę filtrującą (I3). Otwórz migawkę. Skoncentruj się na powierzchni błony śluzowej jelit za pomocą makro- i mikrokoła. Wyszukaj obszar, w którym można zwizualizować kilka kosmków w polu widzenia, zmieniając pozycję XY.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sprawdź, czy zabarwienie rodaminą i dekstranem jest również widoczne w tym obszarze. Wymień kostkę filtra (N2.1). Sprawdź obraz przez okulary.</li>
		<li>Rozpocznij pobieranie obrazu CLSM z oprogramowania. Zoptymalizuj ustawienia dla dwóch sekwencji.
		<ol>
			<li>Wybierz opcję Sekwencja 1. Dostosuj moc, wzmocnienie i przesunięcie lasera dla sekwencji 1.</li>
			<li>Wybierz opcję Sekwencja 2. Dostosuj moc, wzmocnienie i przesunięcie lasera dla sekwencji 2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zdefiniuj zakres stosu z.
		<ol>
			<li>Otwórz menu rozwijane Z-stack. Skoncentruj się na powierzchni błony śluzowej za pomocą elementu sterującego osią z. Naciśnij przycisk Start.</li>
			<li>Skoncentruj się na dolnej granicy, w której sygnał jest nadal wykrywalny. Naciśnij przycisk End.</li>
			<li>Określ liczbę stosów z (10). Unikaj upływów czasu dłuższych niż 2 minuty przez dwa kolejne punkty czasowe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zdefiniuj ustawienia czasu. Przejdź do menu Czas. Kliknij przycisk Minimalizuj. Wybierz opcję Pobieraj do momentu zatrzymania.</li>
		<li>Zdefiniuj średnią liniową. Wybierz pozycję Sekwencja 1. Wybierz opcję Średnia liniowa 2. Wybierz pozycję Sekwencja 2. Wybierz opcję Średnia liniowa 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj odpowiednie obrazy.
	<ol>
		<li>Wybierz Format (1024 x 1024) i Szybkość (400). Naciśnij przycisk Start.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Stop po żądanym czasie pobierania obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz plik. Przejdź do pozycji Project. Kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiedni plik. Naciśnij Zapisz jako.
	<ol>
		<li>Nazwij plik odpowiednio. Wybierz odpowiedni folder. Naciśnij Zapisz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji (zwichnięcie szyjki macicy) i w razie potrzeby pobierz tkanki do dalszej analizy.</li>
</ol>
3. Analiza obrazu: Określ szybkość wydalania komórek i nabłonek jelitowy
<ol>
	<li>Szybkość zrzucania komórek
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.</li>
		<li>Przejdź do pozycji Otwarte projekty. Wybierz odpowiedni plik.</li>
		<li>Określ całkowity czas pozyskiwania obrazu.
		<ol>
			<li>Wybierz ostatni pełny stos z. Wybierz ostatnią pozycję Z z poprzednio wybranego punktu czasu. Odczytaj czas w prawym dolnym rogu ekranu (całkowity czas akwizycji obrazu).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz kosmki.
		<ol>
			<li>Wybierz odpowiednią pozycję stosu Z (powierzchnia kosmków, ale wystarczająco głęboka, aby uniknąć interferencji z już zrzuconymi komórkami i innymi składnikami obecnymi w świetle światła).</li>
			<li>Zmierz długość błony podstawnej. Wybierz narzędzie linijki. Podziel kosmki na kilka linii, aby zakryć lub narysować cały obwód kosmków. Dodaj różne wartości (całkowita długość błony podstawnej). Usuń segmenty narzędzia Miarka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Policz liczbę zdarzeń występujących w ciągu całego czasu trwania akwizycji obrazu.
		<ol>
			<li>Podziel kosmki na segmenty o odpowiedniej wielkości. Analizuj sekwencję zdarzeń/segmentu, przesuwając pasek przez różne punkty czasowe. Dodawanie adnotacji do zidentyfikowanych zdarzeń zrzucania komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oblicz liczbę zdarzeń zrzucania/czas/długość błony podstawnej, która wskazuje szybkość zrzucania komórek. Policz do 5 kosmków / wideo i co najmniej dwa filmy / mysz. Oblicz średnią z tych 10 pomiarów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciek
	<ol>
		<li>Wybierz kosmki.</li>
		<li>Wybierz odpowiednią pozycję stosu Z (powierzchnia kosmków, ale wystarczająco głęboka, aby uniknąć interferencji z już zrzuconymi komórkami i innymi składnikami obecnymi w świetle światła). Policz całkowitą liczbę komórek nabłonka/kosmków.</li>
		<li>Policz liczbę punktów wycieku (parakomórkowa obecność dekstranu rodaminy. Zdarzenie to ma charakter przejściowy, co można potwierdzić sprawdzając wcześniejsze i później pozyskane zdjęcia).</li>
		<li>Oblicz liczbę przecieków/całkowitą liczbę komórek nabłonka. Przeanalizuj 10 różnych kosmków/próbek/wideo i oblicz średnią liczbę przecieków i przepuszczalnych komórek/kosmków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn%27s+disease%3A+role+of+CARD15+3020insC+mutation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li>
<li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation%3A+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280(2013).</li>
<li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li>
<li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li>
<li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li>
<li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li>
<li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li>
<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li>
<li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li>
<li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+endomicroscopy+%28CEM%29+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interventional+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li>
<li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+Endoscopy+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li>
<li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li>
<li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li>
<li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li>
<li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li>
<li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
<li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li>
<li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA%2C+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li>
</ol>

Chociaż jest to wyzwanie techniczne, metodologia oparta na mikroskopii przyżyciowej stanowi unikalne eksperymentalne podejście do wizualizacji wysoce dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym, takich jak wydajność wydalania komórek. Jak dotąd nie ma alternatywnego podejścia eksperymentalnego do wizualizacji ekstruzji komórek in vivo. Wierzymy, że protokół ten może przyczynić się do opisu różnych procesów komórkowych odgrywających rolę w utrzymaniu homeostazy jelit.
Prezentowana m...

Jelito jest wysoce wyspecjalizowanym organem o ściśle regulowanej funkcji, umożliwiającej sprzeczne procesy, a mianowicie odżywianie i ochronę przed szkodliwymi substancjami świetlnymi. Nabłonek jelitowy, znajdujący się pomiędzy ludzkim ciałem a środowiskiem, działa jako bariera fizyczna i immunologiczna oraz przyczynia się do utrzymania homeostazy błony śluzowej w jelitach1,2. Utrata integralności nabłonka i zwiększona przepuszczalność połączeń ścisłych jest dobrze znana jako związana z nieswoistym zapaleniem jelit (IBD)3,4,5,6. Zmiany nabłonkowe są następnie uważane za przyczyny i wtórne wzmacniacze przewlekłego zapalenia jelit w IBD. W związku z tym lepsze zrozumienie wczesnych zmian nabłonkowych w jelitach pacjentów z IBD miałoby ogromną wartość dla opracowania nowych strategii przywracania integralności nabłonka w celu wiarygodnego przewidywania i późniejszego zapobiegania nawrotom IBD.
Nabłonek jelitowy podlega złożonemu i ściśle regulowanemu procesowi obrotu. Z dna krypty terminalnie zróżnicowane komórki nabłonka jelitowego (IEC) pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych migrują w górę do końca kosmków, gdzie stare/uszkodzone komórki są zrzucane do lumen7. Równowaga między podziałem a ekstruzją komórek umożliwia utrzymanie liczby komórek nabłonka jelitowego, unikając tworzenia się luk i wycieków, a także akumulacji komórek nabłonkowych, co może prowadzić do powstania mas komórkowych i nowotworzenia8,9,10. Pomimo kluczowej roli złuszczania komórek nabłonkowych w fizjologicznej odnowie nabłonka jelitowego, wiedza na temat mechanizmów molekularnych kierujących ekstruzją komórek na końcu kosmków jest ograniczona. W związku z tym istnieje potrzeba badań podstawowych zapewniających precyzyjny opis sekwencji zdarzeń molekularnych związanych z złuszczaniem komórek nabłonkowych.
Złożone interakcje między różnymi typami komórek w błonie śluzowej jelit są kluczowe dla zrozumienia molekularnych mechanizmów regulujących obrót nabłonkowy i homeostazę jelit. W związku z tym badania in vivo oferują w tym kontekście duże korzyści w porównaniu z podejściami in vitro i ex vivo. Co więcej, techniki obrazowania w czasie rzeczywistym pozwalają na opisanie sekwencji zdarzeń sterujących określonymi zjawiskami. W tym kontekście badanie wysoce dynamicznych procesów wymaga zastosowania zoptymalizowanych technik o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej obserwacji tkanki. Techniki obrazowania przyżyciowego wydają się być wyjątkowymi odpowiednimi narzędziami do badania złuszczania komórek nabłonkowych w jelitach.
Termin "mikroskopia przyżyciowe" odnosi się do podejść eksperymentalnych wykorzystujących techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości (mikroskopia wielofotonowa lub konfokalna) do bezpośredniej wizualizacji komórek i tkanek w ich naturalnym otoczeniu w obrębie żywego zwierzęcia11. Umożliwia pozyskiwanie informacji in vivo w czasie rzeczywistym do rozdzielczości pojedynczej komórki i zapewnia wyraźną przewagę nad metodami statycznymi lub o niskiej rozdzielczości. Mikroskopia przyżyciowa dostarcza informacji uzupełniających i pozwala przezwyciężyć pewne ograniczenia wynikające z technik klasycznych i/lub zaawansowanych technik, takich jak artefakty wynikające z przetwarzania tkanek. Natomiast głównym ograniczeniem mikroskopii przyżyciowej jest to, że tkanka powinna być bezpośrednio wystawiona na działanie mikroskopu, co w większości przypadków wymaga operacji. Chociaż wyrafinowane podejścia zachowują witalność i minimalizują wpływ obrazowanej tkanki (komory fałdów skórnych i okna obrazowania)12,13, w większości przypadków wykonuje się proste nacięcie skóry w celu eksternalizacji tkanki (płaty skóry)14. W ciągu ostatniej dekady podejścia te dostarczyły kluczowych dowodów na istnienie wysoce dynamicznych procesów, które wcześniej były nieodgadnione. Pod względem translacyjnym obrazowanie w czasie rzeczywistym dostarczyło nowych informacji biologicznych na temat komórek macierzystych i leukocytów homing15, a także rozprzestrzeniania się raka i tworzenia przerzutów13,16. W kontekście klinicznym endomikroskopia jest obecnie wykorzystywana jako narzędzie diagnostyczne raka17 oraz chorób przewodu pokarmowego, takich jak IBD18,19; podczas gdy konfokalna mikroskopia mozaikowa stała się szybkim narzędziem patologii podczas operacji20. Mikroskopia przyżyciowa stała się ostatnio cennym i wszechstronnym narzędziem do badań biomedycznych i przyszłego zastosowania w klinice.
Mikroskopia przyżyciowe jest tutaj zaimplementowana do wizualizacji w czasie rzeczywistym przecieku nabłonka jelitowego i obserwacji zdarzeń złuszczania komórek nabłonkowych. Nieszczelność przepuszczalności jelit można zidentyfikować za pomocą innych nieinwazyjnych technik in vivo, takich jak kwantyfikacja doustnego podawania znaczników fluorescencyjnych w surowicy21. Jednak technika ta nie pozwala na bezpośrednią obserwację wydajności linienia ani na segregację między przepuszczalnością para- i transkomórkową. Połączenie standardowych eksperymentów ze znacznikami i mikroskopii przyżyciowej stanowi odpowiednie podejście do: i) identyfikacji zaburzeń przepuszczalności jelit oraz ii) segregacji między przepuszczalnością nabłonka przy- i transkomórkowego. Oprócz wydalania komórek, mikroskopia przyżyteczna w połączeniu ze znakowaniem fluorescencyjnym in vivo umożliwia badanie innych mechanizmów komórkowych i molekularnych (np. redystrybucja połączeń ścisłych podczas wydalania komórek przy użyciu fluorescencyjnych myszy reporterowych22 lub interakcje między IEC a innymi komórkami w błonie śluzowej jelit23).
Przedstawiona tutaj metoda stanowi adaptację mikroskopii przyżyciowej do obserwacji błony śluzowej jelit w czasie rzeczywistym, przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Dlatego używamy myszy z warunkowym nokautem GGTazy (geranylgeranylotransferazy) w komórkach nabłonka jelitowego (IEC) u myszy (Pggt1biΔIEC), ponieważ cierpią one na ciężką chorobę jelit i zwiększoną przepuszczalność nabłonka24. Opisano chirurgiczne przygotowanie myszy i barwienie błony śluzowej jelit, a także odpowiednie ustawienia stosowane do akwizycji obrazowej i analizy po nabyciu. Protokół ten może umożliwić przyszłe badania przyczyniające się do poszerzenia obecnej wiedzy na temat dynamiki i kinetyki złuszczania komórek nabłonka jelitowego. Co więcej, protokół może służyć jako podstawa do różnych adaptacji do badania innych zjawisk zachodzących na powierzchni błony śluzowej jelit, a nawet w innych tkankach.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek akryflawiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8251</td><td>1 mg/ml roztwór w podkładce</td></tr><tr><td>izotermicznej PBS Deltaphase</td><td>BrainTree</td><td>B-DP-PAD-Gemini</td><td></td></tr> <tr><td>System kauteryzacji</td><td>BrainTree</td><td>B-GEM-5917-Ketamin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>WDT</td><td>9089.01.00</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>LSM mikroskop SP8</td><td>Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L182</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina B dekstran</td><td>Invitrogen</td><td>D1824</td><td>10 000 kDa MW; roztwór 2 mg / ml</td></tr><tr><td>Standardowe kleszcze (Dumont SS)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11203-23-Proste</td><td></td></tr> <tr><td>drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10-Tamoksyfen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td>50 mg / ml w etanol</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer</td><td>1320422</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Mikroskopia przyżyciowych jelit za pomocą obrazowania konfokalnego pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym złuszczania komórek nabłonkowych i przeciekania bariery u żywych zwierząt. Dlatego błona śluzowa jelit znieczulonych myszy jest miejscowo barwiona niespecyficznym barwnikiem (akryflawina) i znacznikiem fluorescencyjnym (dekstran rodaminy-B), zamontowana na płytce płukanej roztworem soli fizjologicznej i bezpośrednio obrazowana za pomocą mikroskopu konfokalnego. Technika ta może uzupełniać inne nieinwazyjne techniki identyfikacji nieszczelności przepuszczalności jelit, takie jak przezśluzówkowe znaczniki podawane doustnie. Poza tym przedstawione tutaj podejście pozwala na bezpośrednią obserwację zdarzeń wydalania komórek w czasie rzeczywistym. W połączeniu z odpowiednimi fluorescencyjnymi myszami reporterowymi, podejście to nadaje się do rzucania światła na mechanizmy komórkowe i molekularne kontrolujące wytłaczanie komórek nabłonka jelitowego, a także na inne procesy biologiczne. W ostatnich dziesięcioleciach interesujące badania z wykorzystaniem mikroskopii przyżyciowej przyczyniły się do poszerzenia wiedzy na temat m.in. przepuszczalności śródbłonka, naprowadzania jelit komórek odpornościowych, komunikacji immunologiczno-nabłonkowej i inwazji składników świetlnych. Przedstawiony tutaj protokół nie tylko pomógłby lepiej zrozumieć mechanizmy kontrolujące wytłaczanie komórek nabłonka, ale mógłby również stanowić podstawę do opracowania innych podejść, które mogłyby być wykorzystywane jako instrumenty do wizualizacji innych wysoce dynamicznych procesów komórkowych, nawet w innych tkankach. Wśród ograniczeń technicznych, właściwości optyczne konkretnej tkanki, a także wybrana technologia obrazowania i konfiguracja mikroskopu, decydowałyby z kolei o odległości roboczej obrazowania i rozdzielczości pozyskiwanych obrazów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje podejście oparte na mikroskopii intravitalnej w celu wizualizacji przecieków nabłonka jelitowego oraz obserwacji procesu złuszczania komórek w jelitach w czasie rzeczywistym. W skrócie, myszy są znieczulane i poddawane przygotowaniu chirurgicznemu w celu odsłonięcia powierzchni błony śluzowej jelita cienkiego. Następnie komórki nabłonka jelitowego (IECs) są barwione poprzez miejscowe zastosowanie akryflawiny, podczas gdy luminalny dekstran z rodamyną B...

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Wykorzystując mikroskopię przyżyciową, protokół ten umożliwia wizualizację tkanki jelitowej w czasie rzeczywistym do rozdzielczości pojedynczej komórki oraz badanie wysoce dynamicznych procesów, takich jak złuszczanie komórek. W połączeniu ze standardowymi doświadczeniami ze znacznikami, protokół ten pozwala na identyfikację zarówno zaburzeń przepuszczalności jelit in vivo, jak i rozróżnienia między przepuszczalnością para- i transkomórkową. Protokół ten może być wykorzystany jako podstawa do opracowania dodatkowych podejść do mikroskopii przyżyciowej do wizualizacji innych wysoce dynamicznych procesów komórkowych w różnych tkankach.Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna do zrozumienia etapów przygotowania chirurgicznego i ułożenia żywego zwierzęcia w sposób ułatwiający uzyskanie obrazu na powierzchni błony śluzowej jelita. Przed rozpoczęciem procedury włącz podstawę i skrzynkę skanera konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i naciśnij start, aby włączyć komputer. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu i wybierz odpowiednią konfigurację.Aby ustawić odpowiednią rozdzielczość obrazu, wybierz konfigurację, sprzęt, rozdzielczość, głębię bitową i 12. W menu akwizycji wybierz XYZT jako tryb akwizycji obrazu i ustaw obiektyw na 20 lub 40X. Aby skonfigurować ustawienie akwizycji sekwencyjnej, kliknij przycisk Szukaj i dodaj, a następnie zaznaczaj między klatkami.Aby skonfigurować sekwencję pierwszą, włącz widoczną skrzynkę laserową. Ustaw lampę fotopowielacza jeden na włączoną i zdefiniuj długość fali emisji. Aby skonfigurować sekwencję drugą, włącz widoczną skrzynkę laserową.Ustaw lampę fotopowielacza dwa na włączoną i zdefiniuj długość fali emisji. Następnie aktywuj odpowiednie lasery. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, za pomocą wacika nałóż maść na oczy znieczulonej myszy i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w okolicy lewej komory brzucha.Użyj kleszczy, aby zewnętrzizować odcinek jelita o długości od trzech do pięciu centymetrów. Wykonaj dwa małe nacięcia na górze i na dole odcinka jelita i wprowadź szklaną mikropipetę do światła jelita. Następnie użyj elektrokoagulacji, aby otworzyć zewnętrzny odcinek jelita wzdłużnie wzdłuż strony antykrezkowej i odsłonić błonę śluzową.Krótko spłucz tkankę roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć zawartość kału. W celu zabarwienia powierzchni błony śluzowej jelit nanieść 100 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu akryflawiny w kropelkach na odsłoniętą powierzchnię błony śluzowej i pozostawić plamę do rozwoju przez trzy minuty przed wypłukaniem pozostałego roztworu za pomocą PBS. Następnie nałóż 100 mikrolitrów dwumiligramowego na mililitr roztworu dekstranu rodaminy w kropelkach na błonę śluzową na trzyminutową inkubację przed przemyciem PBS.Następnie umieść znieczuloną mysz na wznak na szkiełku nakrywkowym zamontowanym na komorze przepłukanej solą fizjologiczną o temperaturze 37 stopni Celsjusza, w razie potrzeby dostosowując pozycję, i umieść preparat na odwróconym stoliku mikroskopowym. Natychmiast po umieszczeniu myszki na stoliku należy włączyć źródło światła i wyregulować pozycję XY, aż oś oświetlenia zostanie skupiona na preparacji tkankowej. W celu wybrania pola widzenia należy dobrać odpowiednią kostkę filtra.Otwórz migawkę i użyj kółek makro i mikro, aby ustawić ostrość na powierzchni błony śluzowej jelit. Dostosuj pozycję XY, aby zlokalizować obszar, w którym można uwidocznić kilka kosmków w polu view i zmień kostkę filtra, aby sprawdzić, czy barwienie dekstranem rodaminy jest również widoczne w tym obszarze. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania rozpocznij akwizycję obrazu i wybierz sekwencję pierwszą, aby dostosować moc lasera, wzmocnienie i przesunięcie dla sekwencji pierwszej.Następnie wybierz sekwencję drugą i dostosuj moc lasera, wzmocnienie i przesunięcie dla sekwencji drugiej. Aby zdefiniować zakres stosu Z, otwórz menu rozwijane Stos Z. Użyj kontrolki dostępu Z, aby skupić się na powierzchni błony śluzowej i kliknij przycisk Rozpocznij.Skoncentruj się na dolnej granicy, w której sygnał jest nadal wykrywalny, i kliknij koniec. Zdefiniuj liczbę stosów Z, unikając poklatków dłuższych niż dwie minuty przez dwa kolejne punkty czasowe i otwórz menu czasu, aby wybrać opcję minimalizuj i zbieraj do zatrzymania. Aby zdefiniować średnią liniową, wybierz opcję Szukaj jednej, Średnia liniowa druga, Szukaj dwie i Średnia liniowa dwójka.Następnie, aby uzyskać obrazy, ustaw format na 1024 x 1024 pikseli, a prędkość na 400 i kliknij start. U myszy warunkowych z niedoborem GGTazy specyficznej dla komórek nabłonka jelitowego rozwinęła się ciężka patologia jelit, o czym świadczy wzrost oceny uszkodzenia histologicznego jelita cienkiego, a zwiększoną przepuszczalność nabłonka jelitowego można również wykryć za pomocą znacznika w eksperymentach in vivo przy użyciu doustnie podawanego dekstranu FITC. Zdarzenia wydalania komórek można zidentyfikować jako komórki przemieszczające się z monowarstwy nabłonka do światła, co prowadzi do tymczasowych szczelin w suficie nabłonka, które są ostatecznie zamykane przez kontakt między sąsiednimi komórkami, tak zwany efekt zamka błyskawicznego.Luki te obserwuje się zarówno u myszy kontrolnych, jak i myszy z niedoborem GGTazy, chociaż częstotliwość tych zjawisk jest wyższa w tych ostatnich. Co ciekawe, inne komórki również wydają się wychwytywać dekstran. Te tak zwane zdarzenia przepuszczalnych komórek występują również głównie u myszy z warunkowym nokautem.Barwienie immunologiczne białek związanych z cytoszkieletem i białkami połączeń ścisłych można przeprowadzić w celu zidentyfikowania określonych celów, które przyczyniają się do potencjalnych zakłóceń przepuszczalności nabłonka, określonych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Metoda ta może być stosowana do analizy innych zjawisk zachodzących na powierzchni błony śluzowej jelit, takich jak nieszczelność śródbłonka czy komunikacja nabłonka immunologicznego w kontekście infekcji jelitowej.

an-intravital-microscopy-based-approach-to-assess-intestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Obecny protokół przedstawia metodę, która wykorzystuje żółć lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym do określenia przepuszczalności jelit. Metodę tę można zastosować do określenia przepuszczalności parakomórkowej w enteroidach, które modelują choroby zapalne jelit, takie jak martwicze zapalenie jelit.

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Poznaj mikroskopię przyżyciową do badania przepuszczalności jelit i wydalania komórek nabłonkowych u myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Przeglądaj więcej filmów