LarvaSPA, czyli metoda montowania larw Drosophila do długotrwałego obrazowania poklatkowego
27 lutego 2020
Ten protokół opisuje metodę montowania larw Drosophila w celu osiągnięcia dłuższego niż 10 godzin nieprzerwanego obrazowania poklatkowego u nienaruszonych żywych zwierząt. Metoda ta może być stosowana do obrazowania wielu procesów biologicznych w pobliżu ściany ciała larwy.
LarvaSPA to pierwsza metoda, która pozwala na ciągłe obrazowanie na żywo nienaruszonych larw Drosophila przez ponad 10 godzin z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Metoda ta służy do ujawniania dynamicznych procesów komórkowych larw, obwodowych neuronów czuciowych oraz do badania wielu innych procesów komórkowych, które zachodzą w pobliżu ściany ciała larwy. Ta metoda jest łatwa w użyciu i ma mniejsze ograniczenia co do wielkości larw.
W komorze obrazowania można jednocześnie umieścić od sześciu do dziewięciu larw, co umożliwia przeprowadzenie eksperymentu. Komora obrazowania w prostopadłościanach PDMS może być produkowana przy minimalnych kosztach i nadaje się do wielokrotnego użytku. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania mechanizmów rozwoju i degeneracji dendrytów z wykorzystaniem neuronów autoryzujących dendryty larw drosophila.
Możliwość obrazowania tego samego neuronu przez wiele godzin może ujawnić, jak długoterminowe globalne zmiany wzorców dendrytycznych wynikają z krótkoterminowych zachowań na poziomie poszczególnych gałęzi. Stosowanie prostopadłościanów PDMS, które pasują do rozmiarów larw, zwiększy wskaźnik sukcesu unieruchamiania larw. Więcej przydatnych taśm można znaleźć w naszej sekcji rozwiązywania problemów.
Po skonstruowaniu bloku aluminiowego z warsztatu mechanicznego należy uszczelnić spód metalowej ramy za pomocą długiego szkiełka nakrywkowego z klejem UV. Utwardź wskazówkę UV za pomocą ręcznej lampy UV przez 30 sekund. Przymocuj warstwy taśmy pakowej do wewnętrznej powierzchni prostokątnej szalki Petriego lub okrągłej płytki do hodowli komórkowej.
Użyj jednej warstwy dla larw w drugiej gwiazdie, dwóch warstw dla larw we wczesnej trzeciej fazie lub trzech warstw dla larw w późnej trzeciej fazie. Pokrój taśmę na wycieczki o określonej szerokości za pomocą żyletki, 1,5 milimetra dla taśmy jednowarstwowej i dwa milimetry dla taśmy dwuwarstwowej lub trzywarstwowej. Pozostaw co najmniej pięciomilimetrowy odstęp między dwoma paskami.
Usuń warstwy taśmy pokrywające przestrzeń. Usuń kurz z wewnętrznej powierzchni płyty za pomocą taśmy klejącej. Następnie forma jest gotowa do użycia.
Aby przygotować mieszankę PDMS, dokładnie wymieszaj siedem gramów zasady PDMS w 0,7 grama utwardzacza w małym pojemniku. Umieścić pojemnik w eksykatorze próżniowym na co najmniej 15 minut w celu usunięcia powietrza z mieszaniny. Powoli wlej około 5,5 grama mieszanki PDMS na formę, aby osiągnąć grubość od jednego do dwóch milimetrów.
Umieścić mieszaninę PDMS w eksykatorze próżniowym ponownie na co najmniej 15 minut w celu usunięcia pozostałych pęcherzyków powietrza z mieszaniny. Rozbij kilka ostatnich pęcherzyków za pomocą końcówki pipety. Utwardź PDMS na płaskiej powierzchni w inkubatorze ciepła w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny.
Następnie użyj żyletki, aby poluzować utwardzony PDMS wzdłuż krawędzi formy i odłącz go od formy. Przechowuj PDMS między dwoma kawałkami dużej taśmy klejącej w temperaturze pokojowej. W przypadku wczesnych i późnych larw trzeciej gwiazdy, pokrój PDMS na prostopadłościany o wymiarach osiem na dwa na jeden milimetr, umieszczając rowek utworzony przez pasek taśmy pośrodku dłuższego boku prostopadłościanu.
W przypadku larw drugiej gwiazdy przytnij prostopadłościan do ośmiu przez jeden na jeden milimetr. Aby przygotować górne szkiełko nakrywkowe do montażu, należy wybrać sześć prostopadłościanów PDMS z rowkami dopasowanymi do rozmiarów larw. Usuń kurz z powierzchni PDMS za pomocą taśmy klejącej.
Przymocuj cztery kawałki taśmy dwustronnej o wymiarach 12 na pięć milimetrów na długim szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 na 50 milimetrów w celu późniejszego zamocowania prostopadłościanów PDMS. Dostosuj odstępy między dwoma kawałkami taśmy dwustronnej do szerokości rowka PDMS. Nałóż niewielką kroplę kleju UV w rowek każdego prostopadłościanu PDMS i dodaj sześć małych kropli kleju UV w przestrzeń między dwustronnymi taśmami na szkiełku nakrywkowym.
Aby przygotować larwy do montażu, za pomocą kleszczy oczyść larwy w wodzie, aby usunąć pokarm z powierzchni ciała. Umieść czyste larwy na małym kawałku zwilżonej bibułki na małej szalce Petriego bez pokrywki i umieść małą szalkę Petriego na dużej szalce Petriego zawierającej kawałek suchej bibuły. W kapturze chemicznym użyj plastikowej pipety transferowej, aby nałożyć od 160 do 240 mikrolitrów izofluranu na suchą bibułkę i zamknij pokrywę dużej szalki Petriego.
Odczekaj dwie do trzech minut, monitorując larwy. Gdy ich haczyki ust przestaną się poruszać, wyjmij larwy z dużej szalki Petriego. Unieruchomione larwy umieścić na kleju UV między dwustronnymi taśmami na szkiełku nakrywkowym tak, aby naskórek grzbietowy był skierowany w stronę szkiełka nakrywkowego.
Przykryj każdą larwę blokiem PDMS i dopasuj pień larwy do rowka PDMS. Pozostaw głowę i ogon larwy poza rowkiem PDMS. Unikaj blokowania przetchlinków larwy przez klej.
Dociśnij końce bloku PDMS do taśmy dwustronnej bez przykładania siły do rowka. Delikatnie pociągnij za ogon larwy, aby spłaszczyć naskórek pod PDMS. Załóż okulary ochronne i użyj ręcznej lampy UV, aby utwardzić klej UV przez cztery minuty na wysokim ustawieniu.
Odwróć szkiełko nakrywkowe do góry nogami i użyj lampy UV, aby utwardzić klej UV przez kolejne cztery minuty. Umieść mały kawałek papieru do soczewek o wymiarach 15 na 30 milimetrów na dnie komory obrazowania. Zwilż papier 20 do 30 mikrolitrami wody.
Umieść szkiełko nakrywkowe na komorze tak, aby larwy były skierowane do wnętrza komory. Użyj kleju UV, aby przykleić oba końce szkiełka nakrywkowego do metalowej powierzchni. Grzbietowa strona larw jest gotowa do obrazowania pod mikroskopem konfokalnym.
Po zobrazowaniu usuń olej z górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą papieru do soczewek. Odłącz górną szkiełko nakrywkowe od metalowej ramy, wycinając żyletką przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a metalową ramką. Komora obrazowania jest gotowa do ponownego użycia.
Odczep prostopadłościany PDMS od górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy. Zwiń prostopadłościany PDMS na taśmie klejącej, aby usunąć resztki kleju i kurz. Prostopadłościany PDMS są gotowe do ponownego użycia.
W tym protokole larwy Drosophila były unieruchomione na dłużej niż 10 godzin w celu ciągłego obrazowania. Rysunek ten przedstawia sześć larw późnej trzeciej gwiazdy zamontowanych w komorze. Pnie larw były unieruchomione, podczas gdy ich głowy i ogony mogły się swobodnie poruszać.
Tutaj pokazujemy zastosowanie LarvaSPA w badaniu dynamiki neuronalnych dendrytów i degeneracji dendrytów przy użyciu neuronów DA klasy czwartej jako modelu. Aby skutecznie unieruchomić larwy tą metodą, bardzo ważne jest, aby zaprzestać wystawiania larw na działanie izofluranu, gdy haczyki gębowe przestaną się poruszać i utwardzić klej UV, zanim larwy w pełni się obudzą. Aby zbadać zwyrodnienie i regenerację dendrytów, uszkodzenie laserem można wykonać, gdy larwy są unieruchomione w komorze obrazowania.
LarvaSPA pomogła nam zrozumieć, w jaki sposób dynamicznie rosnące dendryty nie unerwiają komórek naskórka, jak w proteoglikanach komórek wątroby, oraz w jaki sposób fosfatydyloseryna jest narażona na dendryty degenerujące się po urazie laserowym. Chroń oczy okularami ochronnymi podczas korzystania z lampy UV. Wybijanie larw za pomocą izofluranu powinno odbywać się pod wyciągiem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza LarvaSPA, nowatorską metodę ciągłego obrazowania na żywo nienaruszonych larw Drosophila przez ponad 10 godzin. Technika ta została opracowana, aby ułatwić badanie dynamicznych procesów biologicznych, w szczególności w obwodowych neuronach sensorycznych oraz w rozwoju dendrytów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
- Mikroskopia
Wstęp
- Konieczność długotrwałego obrazowania w systemach z żywymi larwami.
- Zrozumienie procesów komórkowych w pobliżu ściany ciała larwy.
- Wyzwania związane z unieruchamianiem larw przez dłuższy czas.
Zastosowane metody
- Ciągłe obrazowanie na żywo z wykorzystaniem niestandardowych sześcianów z PDMS.
- Larwy Drosophila jako model biologiczny.
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości z użyciem mikroskopu konfokalnego.
Główne wyniki
- Skuteczna immobilizacja wielu larw na potrzeby długotrwałych sesji obrazowania.
- Możliwość wizualizacji rozwoju i degeneracji dendrytów.
- Wykazanie, w jaki sposób wzorce dendrytyczne zmieniają się w czasie pod wpływem krótkotrwałych zachowań.
Wnioski
- Metoda ta prezentuje przełom w technikach obrazowania służących do badania rozwoju neuronalnego larw.
- Zwiększa zrozumienie podstawowej dynamiki komórkowej w organizmie modelowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Długoterminowe obrazowanie na żywo nienaruszonych organizmów modelowych umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka we wczesnej fazie odkrywania leków, ujawniając dynamiczne procesy komórkowe, które dostarczają informacji niezbędnych do walidacji celu i przesiewu fenotypowego. LarvaSPA zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad neurorozwojem i neurodegeneracją, dostarczając wysokorozdzielczych danych temporalnych na temat dynamiki dendrytów w extended periods. Zdolność ta wpisuje się w optymalizację modeli przedklinicznych oraz odkrywanie biomarkerów translacyjnych w zaburzeniach układu nerwowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych w szlakach rozwoju i degeneracji neuronów przy użyciu nienaruszonych układów nerwowych larw.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez wizualizację odpowiedzi dendrytów w czasie rzeczywistym na zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w identyfikacji związków wiodących poprzez korelację krótkoterminowych zachowań odgałęzień z długoterminowymi zmianami strukturalnymi w neuronach sensorycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na przygotowanie zestandaryzowanych, powtarzalnych preparatów larwalnych do ilościowego przesiewu związków wpływających na wzrost lub stabilność neurytów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia obrazowanie multipleksowe od sześciu do dziewięciu larw w jednej komorze, co zwiększa wydajność badań zależności dawka-odpowiedź lub przesiewów genetycznych.
- Gotowość do analizy: Zapewnia stabilne, długoterminowe warunki obrazowania kompatybilne z odczytami konfokalnymi w celu prowadzenia ciągłej obserwacji fenotypowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje dokonane w neuronach *Drosophila* z modelami ssaczymi chorób neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wykazuje, w jaki sposób krótkoterminowa dynamika dendrytów przyczynia się do długoterminowych patologii, co dostarcza informacji dla wczesnych ocen bezpieczeństwa celów terapeutycznych.
- Zgodność biomarkerów: Ułatwia badanie ekspozycji fosfatydyloseryny oraz zaburzeń unerwienia naskórka jako potencjalnych biomarkerów translacyjnych stresu lub uszkodzenia neuronów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu molekularnego po optymalizację wiodących związków, w szczególności w ramach procesów badawczych skoncentrowanych na neuronauce, które wymagają dynamicznych odczytów fenotypowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego w modelach neuronów somatosensorycznych, umożliwiając przewlekłe obrazowanie arboryzacji i degeneracji dendrytów.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzację testów oraz dane ilościowe niezbędne do porównywania efektów związków na dynamikę neurytów w różnych warunkach.
- Analityka: Generuje wysokorozdzielcze zbiory danych czasowych i przestrzennych, które pozwalają zespołom korelować zachowania subkomórkowe z wynikami fenotypowymi w czasie.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy neuronalne larw z przedklinicznymi modelami chorób poprzez zachowane mechanizmy utrzymania dendrytów i odpowiedzi na urazy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje komorę obrazowania i kuboidy PDMS jako wielorazowe komponenty platformy, co obniża koszt pojedynczego eksperymentu i wspiera projektowanie badań podłużnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celów terapeutycznych dzięki bezpośredniej obserwacji dynamiki wzrostu i degeneracji dendrytów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zastosowaniu wielorazowych sześcianów z PDMS oraz modułowej konstrukcji komory obrazowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go w programach dotyczących neurodegeneracji poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie plastyczności strukturalnej neuronów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o podłużne dane fenotypowe z nienaruszonych układów larwalnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z muchami Drosophila, mikroskopii konfokalnej oraz technik mikrowytwarzania opartych na promieniowaniu UV.
- Zależne od dostępu do eksykatorów próżniowych, inkubatorów cieplnych oraz precyzyjnych narzędzi tnących do wytwarzania prostopadłościanów z PDMS.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie określania stadiów larwalnych, czasu unieruchomienia oraz montażu komory obrazowania w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu tej metody do różnych stadiów larwalnych lub podtypów neuronów poza neuronami da klasy IV.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność uniknięcia zablokowania przetchlinek oraz precyzyjne określenie czasu utwardzania UV w stosunku do czasu regeneracji larw po izofluranie.
