Name: LarvaSPA, czyli metoda montowania larw Drosophila do długotrwałego obrazowania poklatkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę LarvaSPA do długotrwałego obrazowania żywych larw Drosophila przez ponad 10 godzin. Technika umożliwia badanie dynamicznych procesów komórkowych neuronów czuciowych i rozwoju dendrytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lingfeng Tang za stworzenie wcześniejszej wersji metody LarvaSPA; Glenn Swan w Cornell Olin Hall Machine Shop za wykonanie wcześniejszych prototypów komory obrazowania; Philipp Isermann za konstrukcję ram metalowych i sugestie dotyczące wykonania prostopadłościanów PDMS; Placówka obrazowania Cornell BRC zapewniająca dostęp do mikroskopów (finansowana z grantu NIH S10OD018516); Marii Sapar za krytyczną lekturę rękopisu. Praca ta była wspierana przez stypendium Cornell Fellowship przyznane H.J.; fundusz startowy Cornell i granty NIH (R01NS099125 i R21OD023824) przyznane C.H. J. i C.H. opracowali projekt i zaprojektowali eksperymenty. H.J. przeprowadził eksperymenty. H.J. i C.H. napisali rękopis.

1. Wykonanie komory obrazowania
<ol>
	<li>Metalowa rama może być wykonana z aluminiowego bloku w typowym warsztacie mechanicznym. Specyfikacja ramy jest zilustrowana w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A.</li>
	<li>Aby zbudować komorę obrazowania, uszczelnij spód metalowej ramy za pomocą długiego szkiełka nakrywkowego (22 mm x 50 mm) i kleju UV (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Utwardź klej UV za pomocą ręcznej lampy UV.</li>
</ol>
2. Wykonywanie prostopadłościanów PDMS
<ol>
	<li>Przygotuj formę do prostopadłościanów PDMS.
	<ol>
		<li>Przymocuj warstwy taśmy pakowej do wewnętrznej powierzchni prostokątnej (80 mm x 55 mm) szalki Petriego lub okrągłej płytki do hodowli komórkowych. Użyj jednej warstwy (0,063 mm grubości) dla larw drugiego stadium rozwojowego, 2 warstwy (0,126 mm grubości) dla wczesnych larw trzeciego stadium lub trzech warstw (0,189 mm grubości) dla larw późnego trzeciego stadium rozwojowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Pokrój taśmę na paski o określonej szerokości za pomocą żyletki: 1,5 mm dla taśmy 1-warstwowej i 2 mm dla taśmy 2-warstwowej lub 3-warstwowej. Szerokość i grubość paska określi wielkość larw, które może pomieścić końcowy prostopadłościan PDMS. Pozostaw co najmniej 5 mm odstępu między dwoma paskami. Usuń warstwy taśmy zakrywające przestrzeń (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Usuń kurz z wewnętrznej powierzchni płyty za pomocą taśmy klejącej. Forma jest gotowa do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszankę PDMS.
	<ol>
		<li>W małym pojemniku dokładnie wymieszaj 7 g bazy PDMS i 0,7 g utwardzacza (w proporcji 10:1).</li>
		<li>Umieścić pojemnik w eksykatorze próżniowym na co najmniej 15 minut w celu usunięcia powietrza z mieszaniny.</li>
		<li>Powoli wlej około 5,5 g mieszaniny PDMS na formę, aby osiągnąć grubość 1–2 mm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Umieścić mieszaninę PDMS w eksykatorze próżniowym ponownie na co najmniej 15 minut w celu usunięcia pozostałych pęcherzyków powietrza z mieszaniny. Rozbij kilka ostatnich pęcherzyków za pomocą końcówki pipety.</li>
		<li>Utwardzić PDMS na płaskiej powierzchni w inkubatorze ciepła w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Użyj żyletki, aby poluzować utwardzony PDMS wzdłuż krawędzi formy i odłącz go od formy. Przechowuj PDMS między dwoma kawałkami dużej taśmy klejącej w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W przypadku wczesnych i późnych larw trzeciego stadium rozwojowego, pokrój PDMS na prostopadłościany o wymiarach 8 mm x 2 mm x 1 mm (wzdłuż przerywanych linii w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B), umieszczając rowek utworzony przez pasek taśmy (krok 2.1.2) pośrodku dłuższego boku prostopadłościanu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B,C). W przypadku larw drugiego stadium rozwojowego przytnij prostopadłościan o wymiarach 8 mm x 1 mm x 1 mm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Montaż larw do długoterminowego obrazowania poklatkowego
<ol>
	<li>Przygotuj górne szkiełko nakrywkowe do montażu.
	<ol>
		<li>Wybierz sześć prostopadłościanów PDMS z rowkami dopasowanymi do rozmiarów larw. Postępuj zgodnie z zalecanym rowkiem i rozmiarem PDMS w oparciu o kroki 2.1.1, 2.1.2 i 2.2.7.</li>
		<li>Usuń kurz z powierzchni PDMS za pomocą taśmy klejącej.</li>
		<li>Przymocuj cztery kawałki taśmy dwustronnej (12 mm x 5 mm) na długim szkiełku nakrywkowym (22 mm x 50 mm) w celu późniejszego zamocowania prostopadłościanów PDMS. Odstępy między dwoma kawałkami taśmy dwustronnej powinny być takie same jak szerokość rowka PDMS.</li>
		<li>Nałóż małą kroplę (~1,2 μl) kleju UV w rowek każdego prostopadłościanu PDMS i dodaj sześć małych kropli kleju UV w przestrzeń między taśmą dwustronną na szkiełku nakrywkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj larwy do montażu.
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy oczyść larwy w wodzie, aby usunąć pokarm z powierzchni ciała.</li>
		<li>Umieść czyste larwy na małym kawałku zwilżonej bibuły na małej (35 mm) szalce Petriego bez pokrywki. Umieść małą szalkę Petriego na dużej (60 mm) szalce Petriego zawierającej kawałek suchej bibuły. W kapturze chemicznym nanieść 8–12 kropli (160–240 μl) izofluranu na suchą bibułkę za pomocą plastikowej pipety transferowej i zamknąć pokrywę dużej szalki Petriego.</li>
		<li>Odczekaj 2–3 minuty, monitorując larwy. Wyjmij larwy z dużej szalki Petriego, gdy ich haczyki gębowe przestaną się poruszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dosiądź zwierząt.
	<ol>
		<li>Aby zobrazować struktury po stronie grzbietowej zwierzęcia, umieść unieruchomione larwy na kleju UV między dwustronną taśmą na szkiełku nakrywkowym, tak aby naskórek grzbietowy był skierowany w stronę szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Przykryj każdą larwę blokiem PDMS i dopasuj pień larwy do rowka PDMS. Pozostaw głowę i ogon larwy poza rowkiem PDMS. Unikaj blokowania przetchlinków larwy przez klej.</li>
		<li>Dociśnij końce bloku PDMS do taśmy dwustronnej bez przykładania siły do rowka. Delikatnie pociągnij za ogon larwy, aby spłaszczyć naskórek pod PDMS.</li>
		<li>Klej UV utwardzać przez 4 minuty za pomocą ręcznej lampy UV na wysokim ustawieniu (około 0,07 mW/mm2). 
		UWAGA: Chroń oczy okularami ochronnymi podczas korzystania z UV lamp.</li>
		<li>Odwróć szkiełko nakrywkowe do góry nogami i powtórz krok 3.3.4.</li>
		<li>Zwilż mały kawałek papieru do soczewek (15 mm x 30 mm) 20 μl–30 μl wody. Umieść zwilżony papier do soczewek na dnie komory obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,D).</li>
		<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na komorze tak, aby larwy były skierowane do wnętrza komory. Przyklej oba końce szkiełka nakrywkowego do metalowej powierzchni za pomocą kleju UV (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 1A,D). Grzbietowa strona larwy jest gotowa do obrazowania pod mikroskopem konfokalnym (<silna klasa="xfig">Ryc. 1E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Zobrazuj larwy za pomocą odpowiedniego mikroskopu. Wszystkie wyniki pokazane w tym protokole (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3, Wideo S2, Wideo S3 i Wideo S4) zostały uzyskane przy użyciu systemu konfokalnego z obiektywem olejowym 40x (1,30 NA).</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie komory obrazowania i prostopadłościanów PDMS
<ol>
	<li>Po obrazowaniu usuń olej z górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą bibuły do soczewek. Odłącz górne szkiełko nakrywkowe od metalowej ramy, wycinając żyletką przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a metalową ramą. Komora obrazowania jest gotowa do ponownego użycia.</li>
	<li>Odczep prostopadłościany PDMS od górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy. Zwiń prostopadłościany PDMS na taśmie klejącej, aby usunąć resztki kleju i kurz. Prostopadłościany PDMS są gotowe do ponownego użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li>
<li>Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+axonal+trafficking+via+a+novel+live-imaging+technique+reveals+distinct+hedgehog+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics.</a> Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunostaining+of+hemocyte+compartments+in+Drosophila+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging.</a> PLoS One. 9 (6), 98191(2014).</li>
<li>Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-driven+membrane+markers+for+analysis+of+nonautonomous+mechanisms+reveal+neuron-glia+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+Selectivity+in+Drosophila+Proprioceptors+Requires+the+Mechanosensory+Channel+Tmc%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc.</a> Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).</li>
<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism%2C+segment%2C+and+somatic+body+wall+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li>
<li>Vaadia, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Proprioceptive+System+Dynamics+in+Behaving+Drosophila+Larvae+Using+High-Speed+Volumetric+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy.</a> Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50998(2014).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+imaging+chamber+for+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junctions+to+study+synapse+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+intact+Drosophila+larvae+at+sub-cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (43), e2249(2010).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).</li>
<li>Chaudhury, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+cryo-anesthesia+of+Drosophila+larvae+for+high+resolution+in+vivo+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
<li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
<li>Poe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+space-filling+requires+a+neuronal+type-specific+extracellular+permissive+signal+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Drosophila+sensory+neuron+axons+and+dendrites+is+regulated+by+the+Akt+pathway+involving+Pten+and+microRNA+bantam%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam.</a> Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).</li>
<li>Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+injury+triggers+DLK-independent+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration.</a> Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).</li>
<li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+Externalization+Results+from+and+Causes+Neurite+Degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).</li>
<li>Desjardins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awake+Mouse+Imaging%3A+From+Two-Photon+Microscopy+to+Blood+Oxygen+Level-Dependent+Functional+Magnetic+Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%3A+Cognitive+Neuroscience+and+Neuroimaging%22%5BJournal%5D)">Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging.</a> Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+brain+imaging+in+live+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies.</a> Nature Communications. 9 (1), 872(2018).</li>
<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Tutaj opisujemy LarvaSPA, wszechstronną metodę montowania żywych larw Drosophila w celu długoterminowego obrazowania poklatkowego. Metoda ta nie wymaga odzyskiwania ani ponownego montowania larw, co umożliwia nieprzerwane obrazowanie. Dlatego idealnie nadaje się do śledzenia procesów biologicznych, które trwają godzinami, takich jak degeneracja i regeneracja dendrytów. Metoda ta może być również stosowana do obrazowania wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia i zdarzeń subkomórkowych, takich jak wzrost mikrotubul. Po...

Obrazowanie poklatkowe na żywo to potężna metoda badania dynamicznych procesów komórkowych. Informacje przestrzenne i czasowe dostarczane przez filmy poklatkowe mogą ujawnić ważne szczegóły, które pomogą odpowiedzieć na pytania dotyczące biologii komórki. Larwa Drosophila jest popularnym modelem in vivo do badań z wykorzystaniem obrazowania na żywo, ponieważ jej przezroczysta ściana ciała pozwala na nieinwazyjne obrazowanie struktur wewnętrznych1,2. Ponadto u Drosophila dostępne są liczne narzędzia genetyczne do fluorescencyjnego znakowania struktur anatomicznych i makrocząsteczek3. Jednak długoterminowe obrazowanie poklatkowe larw Drosophila jest trudne. W przeciwieństwie do nieruchomych wczesnych zarodków lub poczwarek, larwy Drosophila poruszają się nieustannie, co wymaga unieruchomienia w celu obrazowania na żywo. Skuteczne sposoby unieruchamiania żywych larw Drosophila obejmują montaż w oleju halowęglowym z chloroformem4, znieczulenie za pomocą roztworu izofluranu lub dichlorfosu5 i ściskanie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem mikroskopowym6. Chociaż niektóre z tych metod były używane w mikroskopii, żadna z nich nie jest skuteczna w długoterminowym obrazowaniu na żywo. Opracowano inne metody obrazowania neuronów ściany ciała u pełzających larw przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii świetlnej7,8,9. Jednak metody te nie są idealne do monitorowania dynamiki komórkowej ze względu na ruch larw.
Opracowano nowe metody, aby uzyskać długoterminowe obrazowanie poklatkowe larw Drosophila. Za pomocą "chipa larwowego" z polidimetylosiloksanu (PDMS), larwy Drosophila mogą być skutecznie unieruchomione poprzez odsysanie wytwarzane przez podciśnienie w specjalistycznej mikrokomorze bez znieczulenia. Jednak ta metoda nie oferuje wysokiej rozdzielczości czasowej dla badań biologii komórki i ma ścisłe ograniczenia dotyczące wielkości zwierząt10. Inna metoda wykorzystująca urządzenie anestezjologiczne pozwoliła na obrazowanie na żywo larw Drosophila w wielu punktach czasowych i została zastosowana do badania połączeń nerwowo-mięśniowych11,12,13,14,15,16. Jednak ta metoda również nie pozwala na ciągłe obrazowanie przez okres dłuższy niż 30 minut i wymaga wielokrotnego stosowania desfluranu, który może hamować aktywność neuronalną i wpływać na badany proces biologiczny17,18. Ostatnio nowa metoda, która łączy urządzenie mikroprzepływowe i krioanestezję, została wykorzystana do unieruchamiania larw o różnych rozmiarach na krótkie okresy czasu (minuty)19. Jednak metoda ta wymaga specjalistycznych urządzeń, takich jak system chłodzenia, a dłuższe okresy unieruchomienia wymagają wielokrotnego chłodzenia larw.
Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę unieruchamiania larw Drosophila, która jest kompatybilna z nieprzerwanym obrazowaniem poklatkowym przez ponad 10 godzin. Ta metoda, którą nazywamy "stabilizacją larw przez częściowe przyczepienie" (LarvaSPA), polega na przyklejeniu naskórka larwy do szkiełka nakrywkowego w celu obrazowania w specjalnie zbudowanej komorze obrazowania. Protokół ten opisuje, jak wykonać komorę obrazowania i jak montować larwy na różnych etapach rozwoju. W metodzie LarvaSPA pożądane segmenty ciała są przyklejane do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleju reagującego na promieniowanie UV. Prostopadłościan PDMS dodatkowo wywiera nacisk na larwy, uniemożliwiając ucieczkę. Powietrze i wilgoć w komorze obrazowania zapewniają przeżycie częściowo unieruchomionych larw podczas obrazowania. Zalety LarvaSPA w porównaniu z innymi technikami obejmują: (1) Jest to pierwsza metoda, która pozwala na ciągłe obrazowanie na żywo nienaruszonych larw Drosophila przez wiele godzin z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną; (2) Metoda ma mniej ograniczeń co do wielkości larw; (3) Komora obrazowania i prostopadłościany PDMS mogą być produkowane przy minimalnych kosztach i nadają się do wielokrotnego użytku.
Oprócz opisania metody montowania larw, podajemy kilka przykładów jej zastosowania do badania rozwoju dendrytów i degeneracji dendrytów neuronów arboryzacji dendrytycznej (da) Drosophila.

<table><tbody><tr><td>6061 Pręty aluminiowe</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K421</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna 3M</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16093</td><td></td></tr><tr><td>Taśma pakowa 3M Scotch</td><td>3M</td><td></td><td>1,88 "szer. x 22,2 jardów</td></tr><tr><td>Kleszcze DUMONT #3 Fisher</td><td>Scientific</td><td>50-241-34</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>Azer Scientific</td><td>1152250</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>193.33161.3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica</td><td></td><td>Leica SP8 wyposażony w rezonans </td><td></td>skaner</tr><tr><td>Papier do soczewek</td><td>Berkshire</td><td>LN90.0406.24</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (średnie)</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (małe)</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-20</td><td></td></tr><tr><td>Prostokątna szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-322</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw SYLGARD 184 (zestaw PBMS)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1371126</td><td></td></tr><tr><td>Klej UV</td><td>Norland products</td><td>#6106, NOA 61</td><td>Współczynnik załamania światła 1.56</td></tr><tr><td>Lampa UV (Workstar 2003)</td><td>Maxxeon</td><td></td><td></td>MXN02003</tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71232</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimwipes</td><td></td></tr></tbody></table>

larvaspa, czyli metoda montowania larw drosophila do długotrwałego obrazowania poklatkowego

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Obrazowanie na żywo jest cennym podejściem do badania zagadnień biologii komórki. Larwa Drosophila jest szczególnie przydatna do obrazowania na żywo in vivo, ponieważ ściana ciała larwy i większość narządów wewnętrznych są przezroczyste. Jednak ciągłe obrazowanie na żywo nienaruszonych larw Drosophila przez okres dłuższy niż 30 minut było wyzwaniem, ponieważ trudno jest nieinwazyjnie unieruchomić larwy przez długi czas. Przedstawiamy metodę aportowania larw o nazwie LarvaSPA, która pozwala na ciągłe obrazowanie żywych larw Drosophila z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną przez okres dłuższy niż 10 godzin. Metoda ta polega na częściowym przyczepieniu larw do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleju reagującego na promieniowanie UV i dodatkowym ograniczeniu ruchu larw za pomocą bloku z polidimetylosiloksanu (PDMS). Ta metoda jest kompatybilna z larwami w stadiach rozwojowych od drugiego stadium do wędrującego trzeciego stadium. Przedstawiono zastosowania tej metody w badaniu dynamicznych procesów neuronów somatosensorycznych Drosophila, w tym wzrostu dendrytów i zwyrodnienia dendrytów wywołanego urazami. Metoda ta może być również stosowana do badania wielu innych procesów komórkowych, które zachodzą w pobliżu ściany ciała larw.

Komora do obrazowania larw jest konstruowana poprzez sklejenie specjalnie wykonanej metalowej ramki i dwóch szkiełek nakrywkowych. Projekt metalowej ramki przedstawiono na Rysunku 1A. Larwy Drosophila wewnątrz komory są przytwierdzone do górnego szkiełka nakrywkowego przy użyciu kleju UV i sześcianów z PDMS. Rowek w sześcianie z PDMS oraz dwustronna taśma, do której przymocowano sześcian, tworzą przestrzeń do utrzymania larw (Rysunek 1B,C). PDMS...

Ten protokół opisuje metodę montowania larw Drosophila w celu osiągnięcia dłuższego niż 10 godzin nieprzerwanego obrazowania poklatkowego u nienaruszonych żywych zwierząt. Metoda ta może być stosowana do obrazowania wielu procesów biologicznych w pobliżu ściany ciała larwy.

LarvaSPA, czyli metoda montowania larw Drosophila do długotrwałego obrazowania poklatkowego

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

LarvaSPA to pierwsza metoda, która pozwala na ciągłe obrazowanie na żywo nienaruszonych larw Drosophila przez ponad 10 godzin z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Metoda ta służy do ujawniania dynamicznych procesów komórkowych larw, obwodowych neuronów czuciowych oraz do badania wielu innych procesów komórkowych, które zachodzą w pobliżu ściany ciała larwy. Ta metoda jest łatwa w użyciu i ma mniejsze ograniczenia co do wielkości larw.W komorze obrazowania można jednocześnie umieścić od sześciu do dziewięciu larw, co umożliwia przeprowadzenie eksperymentu. Komora obrazowania w prostopadłościanach PDMS może być produkowana przy minimalnych kosztach i nadaje się do wielokrotnego użytku. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania mechanizmów rozwoju i degeneracji dendrytów z wykorzystaniem neuronów autoryzujących dendryty larw drosophila.Możliwość obrazowania tego samego neuronu przez wiele godzin może ujawnić, jak długoterminowe globalne zmiany wzorców dendrytycznych wynikają z krótkoterminowych zachowań na poziomie poszczególnych gałęzi. Stosowanie prostopadłościanów PDMS, które pasują do rozmiarów larw, zwiększy wskaźnik sukcesu unieruchamiania larw. Więcej przydatnych taśm można znaleźć w naszej sekcji rozwiązywania problemów.Po skonstruowaniu bloku aluminiowego z warsztatu mechanicznego należy uszczelnić spód metalowej ramy za pomocą długiego szkiełka nakrywkowego z klejem UV. Utwardź wskazówkę UV za pomocą ręcznej lampy UV przez 30 sekund. Przymocuj warstwy taśmy pakowej do wewnętrznej powierzchni prostokątnej szalki Petriego lub okrągłej płytki do hodowli komórkowej.Użyj jednej warstwy dla larw w drugiej gwiazdie, dwóch warstw dla larw we wczesnej trzeciej fazie lub trzech warstw dla larw w późnej trzeciej fazie. Pokrój taśmę na wycieczki o określonej szerokości za pomocą żyletki, 1,5 milimetra dla taśmy jednowarstwowej i dwa milimetry dla taśmy dwuwarstwowej lub trzywarstwowej. Pozostaw co najmniej pięciomilimetrowy odstęp między dwoma paskami.Usuń warstwy taśmy pokrywające przestrzeń. Usuń kurz z wewnętrznej powierzchni płyty za pomocą taśmy klejącej. Następnie forma jest gotowa do użycia.Aby przygotować mieszankę PDMS, dokładnie wymieszaj siedem gramów zasady PDMS w 0,7 grama utwardzacza w małym pojemniku. Umieścić pojemnik w eksykatorze próżniowym na co najmniej 15 minut w celu usunięcia powietrza z mieszaniny. Powoli wlej około 5,5 grama mieszanki PDMS na formę, aby osiągnąć grubość od jednego do dwóch milimetrów.Umieścić mieszaninę PDMS w eksykatorze próżniowym ponownie na co najmniej 15 minut w celu usunięcia pozostałych pęcherzyków powietrza z mieszaniny. Rozbij kilka ostatnich pęcherzyków za pomocą końcówki pipety. Utwardź PDMS na płaskiej powierzchni w inkubatorze ciepła w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Następnie użyj żyletki, aby poluzować utwardzony PDMS wzdłuż krawędzi formy i odłącz go od formy. Przechowuj PDMS między dwoma kawałkami dużej taśmy klejącej w temperaturze pokojowej. W przypadku wczesnych i późnych larw trzeciej gwiazdy, pokrój PDMS na prostopadłościany o wymiarach osiem na dwa na jeden milimetr, umieszczając rowek utworzony przez pasek taśmy pośrodku dłuższego boku prostopadłościanu.W przypadku larw drugiej gwiazdy przytnij prostopadłościan do ośmiu przez jeden na jeden milimetr. Aby przygotować górne szkiełko nakrywkowe do montażu, należy wybrać sześć prostopadłościanów PDMS z rowkami dopasowanymi do rozmiarów larw. Usuń kurz z powierzchni PDMS za pomocą taśmy klejącej.Przymocuj cztery kawałki taśmy dwustronnej o wymiarach 12 na pięć milimetrów na długim szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 na 50 milimetrów w celu późniejszego zamocowania prostopadłościanów PDMS. Dostosuj odstępy między dwoma kawałkami taśmy dwustronnej do szerokości rowka PDMS. Nałóż niewielką kroplę kleju UV w rowek każdego prostopadłościanu PDMS i dodaj sześć małych kropli kleju UV w przestrzeń między dwustronnymi taśmami na szkiełku nakrywkowym.Aby przygotować larwy do montażu, za pomocą kleszczy oczyść larwy w wodzie, aby usunąć pokarm z powierzchni ciała. Umieść czyste larwy na małym kawałku zwilżonej bibułki na małej szalce Petriego bez pokrywki i umieść małą szalkę Petriego na dużej szalce Petriego zawierającej kawałek suchej bibuły. W kapturze chemicznym użyj plastikowej pipety transferowej, aby nałożyć od 160 do 240 mikrolitrów izofluranu na suchą bibułkę i zamknij pokrywę dużej szalki Petriego.Odczekaj dwie do trzech minut, monitorując larwy. Gdy ich haczyki ust przestaną się poruszać, wyjmij larwy z dużej szalki Petriego. Unieruchomione larwy umieścić na kleju UV między dwustronnymi taśmami na szkiełku nakrywkowym tak, aby naskórek grzbietowy był skierowany w stronę szkiełka nakrywkowego.Przykryj każdą larwę blokiem PDMS i dopasuj pień larwy do rowka PDMS. Pozostaw głowę i ogon larwy poza rowkiem PDMS. Unikaj blokowania przetchlinków larwy przez klej.Dociśnij końce bloku PDMS do taśmy dwustronnej bez przykładania siły do rowka. Delikatnie pociągnij za ogon larwy, aby spłaszczyć naskórek pod PDMS. Załóż okulary ochronne i użyj ręcznej lampy UV, aby utwardzić klej UV przez cztery minuty na wysokim ustawieniu.Odwróć szkiełko nakrywkowe do góry nogami i użyj lampy UV, aby utwardzić klej UV przez kolejne cztery minuty. Umieść mały kawałek papieru do soczewek o wymiarach 15 na 30 milimetrów na dnie komory obrazowania. Zwilż papier 20 do 30 mikrolitrami wody.Umieść szkiełko nakrywkowe na komorze tak, aby larwy były skierowane do wnętrza komory. Użyj kleju UV, aby przykleić oba końce szkiełka nakrywkowego do metalowej powierzchni. Grzbietowa strona larw jest gotowa do obrazowania pod mikroskopem konfokalnym.Po zobrazowaniu usuń olej z górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą papieru do soczewek. Odłącz górną szkiełko nakrywkowe od metalowej ramy, wycinając żyletką przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a metalową ramką. Komora obrazowania jest gotowa do ponownego użycia.Odczep prostopadłościany PDMS od górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy. Zwiń prostopadłościany PDMS na taśmie klejącej, aby usunąć resztki kleju i kurz. Prostopadłościany PDMS są gotowe do ponownego użycia.W tym protokole larwy Drosophila były unieruchomione na dłużej niż 10 godzin w celu ciągłego obrazowania. Rysunek ten przedstawia sześć larw późnej trzeciej gwiazdy zamontowanych w komorze. Pnie larw były unieruchomione, podczas gdy ich głowy i ogony mogły się swobodnie poruszać.Tutaj pokazujemy zastosowanie LarvaSPA w badaniu dynamiki neuronalnych dendrytów i degeneracji dendrytów przy użyciu neuronów DA klasy czwartej jako modelu. Aby skutecznie unieruchomić larwy tą metodą, bardzo ważne jest, aby zaprzestać wystawiania larw na działanie izofluranu, gdy haczyki gębowe przestaną się poruszać i utwardzić klej UV, zanim larwy w pełni się obudzą. Aby zbadać zwyrodnienie i regenerację dendrytów, uszkodzenie laserem można wykonać, gdy larwy są unieruchomione w komorze obrazowania.LarvaSPA pomogła nam zrozumieć, w jaki sposób dynamicznie rosnące dendryty nie unerwiają komórek naskórka, jak w proteoglikanach komórek wątroby, oraz w jaki sposób fosfatydyloseryna jest narażona na dendryty degenerujące się po urazie laserowym. Chroń oczy okularami ochronnymi podczas korzystania z lampy UV. Wybijanie larw za pomocą izofluranu powinno odbywać się pod wyciągiem.

larvaspa-method-for-mounting-drosophila-larva-for-long-term-time

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną technikę mikroskopową, która pozwala uzyskać wysokiej jakości cyfrowe wideo z fenotypami dorosłych i larw zmutowanych Drosophila z perspektywy bocznej.

Akwizycja wysokiej jakości cyfrowego wideo larw Drosophila i zachowań dorosłych z perspektywy bocznej

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania ran na żywo i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej in vivo. Metoda ta wykorzystuje stadium poczwarki rozwoju Drosophila, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie i śledzenie określonych populacji komórek w czasie i jest kompatybilna z wydajną inaktywacją genów za pośrednictwem RNAi.

Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila

Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Poznaj metodę LarvaSPA do długotrwałego obrazowania żywych larw Drosophila przez ponad 10 godzin. Technika umożliwia badanie dynamicznych procesów komórkowych neuronów czuciowych i rozwoju dendrytów.

LarvaSPA, czyli metoda montowania larw Drosophila do długotrwałego obrazowania poklatkowego

Przeglądaj więcej filmów