Name: Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj metodę zakażenia larw danio pręgowanego Clostridioides difficile poprzez mikroinjekcję i mikrogawage. Technika umożliwia badanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie beztlenowe w modelu żywym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Timo Fritschowi za doskonałą opiekę nad zwierzętami. Dziękujemy członkom laboratoriów Köster i Steinert za wsparcie i pomocne dyskusje. Dziękujemy dr Dandanowi Hanowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Wyrażamy wdzięczność za dofinansowanie ze strony kraju związkowego Dolna Saksonia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Wszystkie opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z przepisami prawa (Dyrektywa UE 2010/63, licencja AZ 325.1.53/56.1-TUBS i licencja AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Przygotowanie niskotopliwej agarozy, płytki żelowej i igieł do mikroiniekcji/mikrogłębników
<ol>
	<li>Rozpuścić 0,08 g niskotopliwej agarozy (tabela materiałów, agaroza A2576) w 10 ml 30% pożywki Danieau (0,12 mMMgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) i 17,4 mM NaCl, przechowywanych w temperaturze pokojowej (RT), aby uzyskać 0,8% roztwór. 
	UWAGA: Można stosować wyższe lub niższe stężenia agarozy. Jednak wymagany czas krzepnięcia różni się w zależności od marki agarozy, nawet przy tym samym stężeniu.</li>
	<li>Przygotować igły do mikroiniekcji i mikrogłębników ze szklanych naczyń włosowatych (tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Użyj ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami (należy pamiętać, że jednostki są specyficzne dla używanego tutaj ściągacza; patrz Tabela materiałów): igły do mikroiniekcji (ciśnienie powietrza = 500; ciepło = 400; pociągnięcie = 125; prędkość = 75; czas = 150); oraz igły do mikrogłębków (ciśnienie powietrza = 500; ciepło = 400; pociągnięcie = 100; prędkość = 75; czas = 150). Użyj końcówki do mikroładowarki, aby załadować 3 μl wolnego od nukleazH2Odo wyciągniętej igły.</li>
		<li>Wprowadzić igłę do wstrzykiwacza i prawidłowo ją zamocować. Ustawić igłę pod odpowiednim kątem do wstrzyknięcia. Ustawić ciśnienie iniekcji w zakresie 600–900 hPa dla igły do mikroiniekcji i 200–300 hPa dla igły do wstrzykiwania.</li>
		<li>Umieść kroplę oleju mineralnego na czarnym okręgu szkiełka kalibracyjnego. Użyj cienkich kleszczyków, aby przyciąć końcówkę igły. Wstrzyknąć jedną kroplę do oleju mineralnego, aby zmierzyć wielkość kropli.</li>
		<li>W przypadku mikroiniekcji należy dostosować czas iniekcji, aby uzyskać kroplę o średnicy 0,10–0,12 mm, co odpowiada objętości 0,5–1,0 nL. W przypadku mikrozgłębnika uzyskaj kroplę o średnicy 0,18–0,20 mm, co odpowiada objętości 3–5 nL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1,5 % talerz agarozy z agarozą (Tabela materiałów, 8050) na 10 cm szalce Petriego w 30% pożywce Danieau, używając plastikowej formy jako formy do mikrozgłębków. Przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec wysuszeniu do czasu, gdy będzie potrzebna. Ogrzać do temperatury pokojowej lub 28 °C przed eksperymentem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i znakowanie C. difficile i zarodników barwnikiem fluorescencyjnym
<ol>
	<li>Przygotować 1 mM roztwór podstawowy barwnika fluorescencyjnego (tabela materiałów). Ponieważ barwnik jest sprzedawany w porcjach 50 μg proszku, dodaj 69 μl DMSO do fiolki, aby uzyskać stężenie podstawowe 1 mM.</li>
	<li>Przygotować 100 μM roztwór roboczy barwnika fluorescencyjnego, dodając 2 μl 1 mM roztworu podstawowego do 18 μL DMSO w probówce wirówkowej i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Kultura C. difficile (R20291, szczep rybotyp 027) poprzez inokulację 10 ml płynnej pożywki BHIS dwiema do trzech kolonii z płytki w kapturze beztlenowym bez wytrząsania przez noc. BHIS to BHI uzupełniony 0,5% (w/v) ekstraktem drożdżowym i 0,1% (w/v) L-cysteiną. Rozpuścić 1 g L-cysteiny w 10 ml ddH2O i wysterylizować przez filtrację, a następnie dodać do autoklawowanej pożywki do uzyskania końcowego stężenia 1 g/l. Płytki przygotowuje się przez dodanie 15 g/l agar-agaru do pożywki przed autoklawowaniem. Selektywna hodowla C. difficile odbywa się przy użyciu płytek chromID C. difficile (tabela materiałów).</li>
	<li>Barwienie C. difficile barwnikiem fluorescencyjnym
	<ol>
		<li>Zebrać C. difficile przy OD600 1,0-1,2 i przemyć 1x 1 ml 1x PBS (5,000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej). Zawiesić w 1 ml 1 x PBS.</li>
		<li>Dodać 3 μl roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego do 1 ml zawiesiny bakteryjnej. Inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj poplamiony C. difficile raz 1 ml PBS, aby usunąć resztki barwnika i ponownie zawiesić w 1x PBS do OD600 1,0 (1,0 OD600 jest w przybliżeniu równoważne 10-8 jtk/ml).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie barwionego C. difficile do larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Znieczulić 20–30 larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia (określanych tutaj jako 5 dpf) 0,02%–0,04% trikainy (proszek trikainy rozpuszcza się w wodzie podwójnie destylowanej i dostosowuje do pH = 7 za pomocą 1 M roztworu Tris-HCL) w 30% pożywce Danieau ~10 min przed wstrzyknięciem. Przenieś znieczulone larwy na świeżą 10 cm szalkę Petriego i usuń nadmiar 30% pożywki Danieau.</li>
	<li>Umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwach danio pręgowanego, aby się przykryć. Delikatnie ustaw larwy w pozycji bocznej. Umieść szalkę Petriego na lodzie na 30–60 sekund, aby niskotopliwa agaroza zastygła. Dodaj 30% pożywki Danieau zawierającej 0,02%–0,04% trikainy, aby pokryć agarozę.</li>
	<li>Przygotować roztwór do wstrzykiwań. Dodaj 1 μl 0,5% czerwieni fenolowej w roztworze PBS do 9 μl barwionego barwnikiem inokulum C. difficile, aby uwidocznić proces wstrzykiwania.</li>
	<li>Załadować skalibrowaną igłę do mikroiniekcji roztworem do wstrzykiwań za pomocą mikroładowarki. Zamontuj załadowaną igłę na mikromanipulatorze i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Wyreguluj ciśnienie wtrysku w zakresie 600–900 hPa. Ustawić czas wstrzykiwania na 0,1–0,3 s, aby uzyskać 0,5–1,0 nL. Ustaw igłę w mikromanipulatorze pod kątem ~45° skierowaną w stronę osadzonych larw.</li>
	<li>Umieść końcówkę igły nad przewodem pokarmowym w pobliżu porów moczowo-płciowych. Przebić przez agarozę, a następnie mięsień końcówką igły, a następnie wprowadzić go do światła jelita i wstrzyknąć 0,5–1,0 nL C. difficile. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby monitorować wstrzyknięte larwy i pobrać prawidłowo wstrzyknięte larwy do obrazowania konfokalnego.</li>
</ol>
4. Wytwarzanie gnotobiotycznych larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Skorzystaj z dobrze znanej naturalnej metody hodowli do generowania gnotobiotycznych zarodków grybo, w tym: zapłodnienie in vitro, mycie pożywką zawierającą antybiotyki (1 μg/ml amfoterycyny B, 10 μg/ml kanamycyny i 20 μg/ml ampicyliny), mycie 0,1% wag./obj. roztworem poliwinylopirolidonu jodu (PVP-I) i inkubacja zarodków w kapturze do hodowli komórkowych12.</li>
	<li>Utrzymuj wszystkie gnotobiotyczne larwy danio pręgowanego w warunkach gnotobiotycznych do 5 dpf lub tuż przed zgłębnikiem. Po zgłębniku larwy danio pręgowanego zostaną przeniesione do standardowego inkubatora, ale ze sterylnym 30% podłożem Danieau.</li>
</ol>
5. Zgłębnik larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Skalibrować igłębnik do mikrozgłębnika zgodnie z opisem w kroku 1.2.</li>
	<li>Zmierz średnicę końcówki igły, umieszczając igłę na szkiełku kalibracyjnym z jedną kroplą oleju mineralnego. Upewnij się, że końcówka ma średnicę 30–40 μm, jest i gładka. Wyrzuć ostre lub szorstkie igły. 
	UWAGA: Ostre krawędzie igieł mogą zostać stępione przez szybkie spalanie.</li>
	<li>Przygotować roztwór do zgłębnika zgodnie z opisem w kroku 3.3.</li>
	<li>Załadować igłę i zamontować ją na mikromanipulatorze zgodnie z opisem w kroku 3.4. Wyreguluj mikromanipulator tak, aby ustawić igłę pod kątem 45°.</li>
	<li>Znieczulić larwy danio pręgowanego, o których mowa w kroku 3.1. Kiedy larwy przestaną się poruszać, przenieś je do rowka formy do mikrozgłębnika za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwach danio pręgowanego, aby się przykryć. Delikatnie wyreguluj larwy z głowami skierowanymi do góry pod kątem 45° w rowku i ogonami przy ścianie rowka. Upewnij się, że kąty główek są w przybliżeniu takie same, tak aby były wyrównane z kątem igieł do zgłębnika. Umieść formę do mikrozgłębnika na lodzie na 30–60 s, pozwalając niskotopliwej agarozie zestalić się w celu ustabilizowania pozycji larw.</li>
	<li>Wyreguluj ciśnienie wtrysku w zakresie 200–300 hPa. Ustawić czas wstrzyknięcia na 0,1–0,3 s, aby uzyskać objętość wstrzyknięcia wynoszącą 3–5 nL C. difficile.</li>
	<li>Delikatnie przeprowadź igłę przez agarozę, a następnie do pyska larw danio pręgowanego, przez przełyk. Gdy końcówka igły znajdzie się w opuszki jelita przedniego, naciśnij pedał iniekcji, aby uwolnić bakterie. Wypełnij światło jelita dostarczoną objętością. Nie pozwól, aby z przełyku lub kloaki. Delikatnie wyjmij igłę z pyska danio pręgowanego.</li>
	<li>Po zgłębniku uratuj zainfekowane larwy danio pręgowanego przed agarozą za pomocą elastycznej końcówki mikroładowarki, najpierw odcinając agarozę, a następnie podnosząc larwy. Przenieś te larwy do sterylnego 30% podłoża Danieau. Dwukrotnie opłucz larwy w sterylnym podłożu. Przenieś larwy na świeżą 10 cm szalkę Petriego. Larwy będą utrzymywane do 11 dpf.</li>
</ol>
6. Analiza mikroskopii konfokalnej wstrzykniętych larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Znieczulić larwy danio pręgowanego, o których mowa w kroku 3.1. Wykonać otwór w dnie szalki Petriego o średnicy 35 mm z przymocowanym do otworu szklanym szkiełkiem, zwanym komorą obrazowania. Przenieść zarodki na dno komory obrazowania z odpowiednią ilością 30% pożywki Danieau.</li>
	<li>Dodaj 200–300 μl 1% niskotopliwej agarozy, aby przykryć znieczulone larwy. Ponieważ używany jest odwrócony mikroskop konfokalny, należy przyłożyć zainfekowany obszar larw do szkiełka tak blisko, jak to możliwe.</li>
	<li>Pozwól agarozie zestalić się na lodzie przez 30–60 s. Zanurz agarozę w 30% Danieau's zawierającym 0,02%-0,04% tricainy.</li>
	<li>Zobrazuj larwy za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (tabela materiałów).</li>
</ol>
7. Sekcja jelita larwalnego danio pręgowanego w celu odzyskania żywego C. difficile
<ol>
	<li>Odizoluj przewód pokarmowy od larw, aby przeanalizować obciążenie bakteryjne. Zacznij od eutanazji larw danio pręgowanego za pomocą 0,4% tricainy.</li>
	<li>Zegmunowany krótko opłucz sterylnym 1x PBS i przenieś je na świeżą płytkę agarozową.</li>
	<li>Sekcja danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Wbij igłę w grzbietowy pień larw danio pręgowanego w pobliżu głowy, aby unieruchomić danio pręgowanego. Usuń głowę za skrzelami za pomocą lancetu.</li>
		<li>Włóż drugą igłę w środek tułowia grzbietowego. Wbić trzecią igłę do brzucha danio pręgowanego i wyciągnąć jelito z jamy ciała. 
		UWAGA: Konieczna jest szczególna ostrożność, aby wyizolować nienaruszone jelito. Jeśli jest to trudne, wykonaj dodatkowe pociągnięcia, aby oddzielić resztę jelita od pozostałych narządów wewnętrznych.</li>
		<li>Za pomocą igły do mikroiniekcji przenieś 10-15 jelit do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl sterylnego 1x PBS.</li>
		<li>Homogenizuj jelita za pomocą tłuczka, aby rozbić tkankę i przygotować homogenaty. Upewnij się, że tłuczek dotrze do dna probówki, aby całkowicie rozbić wszystkie jelita.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować homogenaty w pożywce hodowlanej C. difficile zawierającej D-cykloserynę i cefoksytynę, z taurocholanem (TCA, kiełkującym zarodnikiem C. difficile) lub bez niego w komorze beztlenowej.</li>
	<li>Inkubować płytkę beztlenowo przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Użyj kultury bakteryjnej do 16S rRNA-PCR.
	<ol>
		<li>Zawiesić kolonię w 50 μlH2Oi gotować ją w temperaturze 95 °C przez 15 minut. Zdeponować zlizowane szczątki przez odwirowanie (14 000 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej) i użyć 2 μl supernatantu jako matrycy w 25 μl reakcji PCR przy użyciu starterów specyficznych dla C. difficile (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').</li>
		<li>W przypadku stosowania bakterii z płynnej hodowli należy zebrać 1 ml kultury i przemyć raz 1 ml PBS (14 000 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej). Zawiesić osad w 100 μl H2Odd i postępować jak powyżej. Aby dokładniej scharakteryzować kolonie bakteryjne, należy narysować smugi na płytce BHIS lub chromID (Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<!--Nie usuwaj—>

<ol><li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li>
<li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li>
<li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li>
<li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain%2C+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li>
<li>Pépin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%3A+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li>
<li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgavage+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434(2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li>
<li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li>
<li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li>
<li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li>
<li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li>
<li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58(2011).</li>
<li>Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li>
<li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione metody modyfikują i rozszerzają dotychczasowe podejście do infekowania larw danio pręgowanego poprzez wykonanie zarówno iniekcji, jak i mikrozgłębnika10,14. Zademonstrowano również podejście do badania patogenów beztlenowych z udziałem larw danio pręgowanego22. Ponadto protokół ułatwia analizę wrodzonych odpowiedzi komórek odpornościowych in vivo po CDI i po kolonizacji C. difficile u danio pręgowanego. Metoda jest p...

C. difficile to Gram-dodatnia, tworząca przetrwalniki, beztlenowa i wytwarzająca toksyny pałeczka, która jest główną przyczyną ciężkich infekcji w przewodzie pokarmowym1. Typowe objawy CDI obejmują biegunkę, ból brzucha i śmiertelne rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego, które czasami może prowadzić do śmierci1,2. Dowody wykazały, że odpowiedzi immunologiczne gospodarza odgrywają kluczową rolę zarówno w postępie, jak i wyniku tej choroby3. Oprócz odpowiedzi immunologicznej, rodzima mikrobiota jelitowa ma kluczowe znaczenie dla wystąpienia i patogenezy CDI4. W ciągu ostatniej dekady zarówno liczba przypadków, jak i śmiertelność CDI znacznie wzrosły z powodu pojawienia się hiperwirulentnego szczepu C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Lepsze zrozumienie mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw i roli mikrobioty podczas CDI pomoże w opracowaniu nowych rozwiązań terapeutycznych i postępów, umożliwiając lepszą kontrolę nad tą epidemią.
Kilka modeli zwierzęcych, takich jak chomik i mysz, zostało opracowanych, aby zapewnić wgląd w obronę immunologiczną przed C. difficile7,8. Jednak rola wrodzonych komórek odpornościowych jest nadal słabo poznana, zwłaszcza że zachowanie wrodzonych komórek odpornościowych wynika głównie z analizy histologicznej lub hodowli komórek in vitro. W związku z tym ustanowienie przezroczystego modelu danio pręgowanego w celu ujawnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na C. difficile wewnątrz żywego organizmu kręgowca ułatwi takie badania. Larwy danio pręgowanego mają funkcjonalny wrodzony układ odpornościowy, ale brakuje im adaptacyjnego układu odpornościowego do 4–6 tygodni po zapłodnieniu9. Ta unikalna cecha sprawia, że larwy danio pręgowanego są doskonałym modelem do badania izolowanej odpowiedzi i funkcji wrodzonych komórek odpornościowych w CDI.
Ten raport opisuje nowe metody wykorzystujące larwy danio pręgowanego do badania interakcji między C. difficile a wrodzonymi komórkami odpornościowymi, takimi jak makrofagi i neutrofile. Najpierw przedstawiono miejscowy protokół mikroiniekcji, który obejmuje inokulum C. difficile i barwienie. Za pomocą konfokalnego obrazowania poklatkowego in vivo rejestruje się odpowiedź neutrofili i makrofagów w kierunku miejsca zakażenia oraz obserwuje się fagocytozę bakterii przez neutrofile i makrofagi. Doniesiono jednak, że samo wstrzyknięcie powoduje uszkodzenie tkanek i prowadzi do rekrutacji leukocytów niezależnie od bakterii10. W związku z tym opisano nieinwazyjny protokół mikrozgłębnika mający na celu dostarczenie C. difficile do jelita larw danio pręgowanego. Wcześniejsze badania wykazały, że rodzima mikrobiota przewodu pokarmowego chroni gospodarza przed kolonizacją C. difficile11. Dlatego gnotobiotyczne larwy danio pręgowanego są również wykorzystywane do predyspozycji danio pręgowanego, które są zakażone 12. Następnie przeprowadza się sekcję jelit w celu odzyskania żywotnych C. difficile i sprawdzenia czasu ich obecności w przewodzie pokarmowym danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td>Agaroza o bardzo niskiej zawartości żelowania</td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa (LM)</td><td>Pronadisa</td><td>8050</td><td>Jest stosowany w płytkach agarozowych</td></tr><tr><td>BacLight Red Bacterial Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35001</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Bulion naparowy mózgowo-sercowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X916.1</td><td></td></tr><tr><td>Mosiądz (typ dziki)</td><td></td><td></td><td>niedobór syntezy melaniny, używany do generowania stabilnych linii transgenicznych</td></tr><tr><td>Azotan wapnia (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Szkło kapilarne</td><td>Aparat Harvarda</td><td>30-0019</td><td>Igły iniekcyjne</td></tr><tr><td>Clostridioides difficile</td><td></td><td></td><td>R20291,, szczep rybotyp 027, produkcja TcdA+/TcdB+/CDT+ DMSO</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A994</td><td></td></tr><tr>Platforma <td></td><td>open source</td><td>FIJI</td><td>Przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igłowy poziomy</td><td>Sutter instrument Inc</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Przetwarzanie</td><td></td> obrazów Leica <td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P026</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>eppendorf</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Formy do mikroiniekcji</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe Mikroskop</td> konfokalny <td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Taurocholate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8149</td><td></td></tr><tr><td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td></td><td></td><td>stabilna linia transgeniczna, w której promotory lyZ napędzają ekspresję białka fluorescencyjnego EGFP w neutrofilach</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td>stabilna linia transgeniczna, w której mpeg1.1 steruje ekspresją białka fluorescencyjnego EGFP w makrofagach</td>Trikaine Sigma-Aldrich E10521 Ekstrakt drożdżowy BD Bacto 212750 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku clostridioides difficile

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Zakażenie Clostridioides difficile (CDI) jest uważane za jedną z najczęstszych infekcji żołądkowo-jelitowych związanych z opieką zdrowotną w Stanach Zjednoczonych. Opisano wrodzoną odpowiedź immunologiczną przeciwko C. difficile, ale dokładna rola neutrofili i makrofagów w CDI jest mniej poznana. W obecnym badaniu larwy danio pręgowanego wykorzystano do ustanowienia modelu infekcji C. difficile do obrazowania zachowania i współpracy tych wrodzonych komórek odpornościowych in vivo. W celu monitorowania C. difficile ustalono protokół znakowania przy użyciu barwnika fluorescencyjnego. Miejscową infekcję uzyskuje się poprzez mikrowstrzyknięcie znakowanego C. difficile, który aktywnie rośnie w przewodzie pokarmowym danio pręgowanego i naśladuje uszkodzenie nabłonka jelitowego w CDI. Jednak ten protokół bezpośredniej infekcji jest inwazyjny i powoduje mikroskopijne rany, które mogą wpływać na wyniki eksperymentalne. W związku z tym opisano tutaj bardziej nieinwazyjny protokół mikrozgłębnika. Metoda polega na dostarczeniu komórek C. difficile bezpośrednio do jelita larw danio pręgowanego poprzez intubację przez otwarte usta. Ta metoda infekcji ściśle naśladuje naturalną drogę infekcji C. difficile.

C. difficile jest organizmem ściśle beztlenowym, jednak chromofor białek fluorescencyjnych zazwyczaj wymaga tlenu do dojrzewania. Aby rozwiązać ten problem, do barwienia żywych, aktywnie rosnących komórek C. difficile (R20291, szczep o rybotypie 027; Rycina 1A) zastosowano barwnik fluorescencyjny. Wykorzystując system Gal4/UAS, stworzono stabilne transgeniczne linie danio pręgowanego do obrazowania na żywo, w których promotory mpeg1.1 lub lyZ</...

Przedstawiona tutaj jest bezpieczna i skuteczna metoda infekowania larw danio pręgowanego fluorescencyjnie znakowanym beztlenowym C. difficile za pomocą mikroiniekcji i nieinwazyjnego mikrozgłębnika.

Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytanie o rolę wrodzonego układu odpornościowego w zakażeniu Clostridium, np. czy i w jaki sposób makrofagi rozpoznają lub fagocytozą ten patogen. Główną zaletą tej metody jest to, że można ją stosować do wielu różnych bakterii beztlenowych, że można manipulować czasem infekcji i że podawanie doustne znacznie bardziej przypomina normalną infekcję u ludzi. Po wyhodowaniu przenieś jeden mililitr kultury do kuwety spektrofotometru i zmierz OD600.Przenieś wymaganą ilość do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra, aby osiągnąć końcową średnicę zewnętrzną od jednego do 1,2 w jednym mililitrze końcowej objętości. Umyj jeden raz jednym mililitrem 1X PBS i odwiruj przy 5 000 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zawiesić ponownie w jednym mililitrze 1X PBS.Dodać trzy mikrolitry roztworu roboczego przygotowanego barwnika fluorescencyjnego do jednomililitrowej zawiesiny bakteryjnej. Inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie umyj poplamione Clostridioides difficile raz 1X PBS, aby usunąć resztki barwnika, i ponownie zawieś w jednym mililitrze 1X PBS, aby uzyskać OD600 1,0.Najpierw umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwach danio pręgowanego na szalce Petriego, aby przykryć. Delikatnie ustaw larwy w pozycji bocznej. Umieść szalkę Petriego na lodzie na 30 do 60 sekund, aby niskotopliwa agaroza zastygła.Dodaj 30% pożywki Danieau zawierającej od 0,02% do 0,04% trikainy, aby pokryć agarozę. Aby przygotować roztwór do wstrzykiwań, dodać jeden mikrolitr 0,5% czerwieni fenolowej w roztworze PBS do dziewięciu mikrolitrów barwionego barwnikiem inokulum Clostridioides difficile. Załadować skalibrowaną igłę do mikroiniekcji roztworem do wstrzykiwań za pomocą mikroładowarki.Zamontuj załadowaną igłę w mikromanipulatorze i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym. Ustawić ciśnienie wtrysku w zakresie od 600 do 900 hektopaskalów. Ustaw czas wstrzykiwania na 0,1 do 0,3 sekundy, aby uzyskać 0,5 do 1,0 nanolitrów.Ustaw igłę w mikromanipulatorze pod kątem około 45 stopni, skierowaną w stronę osadzonych larw. Umieść końcówkę igły nad przewodem pokarmowym, w pobliżu porów moczowo-płciowych. Przebij przez agarozę, a następnie mięsień końcówką igły.Następnie włóż go do światła jelita i wstrzyknij od 0,5 do 1,0 nanolitrów Clostridioides difficile. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego do monitorowania wstrzykniętych larw i użyj elastycznej końcówki Microloadera, aby pobrać prawidłowo wstrzyknięte larwy do obrazowania konfokalnego. Na 1,5% płytce agarozowej z rowkami umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwy danio pręgowanego, aby je przykryć.Delikatnie wyreguluj larwy z głowami skierowanymi do pozycji pionowej pod kątem 45 stopni w rowku i ogonami przy ścianie rowka. Delikatnie przeprowadź igłę przez agarozę, a następnie do pyska larw danio pręgowanego, przez przełyk. Gdy końcówka igły znajdzie się w opuszki jelita przedniego, naciśnij pedał iniekcji, aby uwolnić od 0,5 do jednego nanolitra kultury bakterii.Wypełnij światło jelita. Nie pozwól, aby z przełyku lub kloaki. Delikatnie wyjmij igłę z pyska danio pręgowanego.Po zgłębniku uratuj zainfekowane larwy danio pręgowanego przed agarozą za pomocą elastycznej końcówki mikroładowacza, najpierw odcinając agarozę, a następnie podnosząc larwy. Przenieś te larwy do sterylnego 30% podłoża Danieau i spłucz dwukrotnie. Po znieczuleniu larw danio pręgowanego dodaj od 200 do 300 mikrolitrów 1% niskotopliwej agarozy, aby przykryć znieczulone larwy.Umieść zainfekowany obszar larw na szkiełku tak blisko, jak to możliwe. Pozwól agarozie zestalić się na lodzie przez 30 do 60 sekund. Zanurz agarozę w 30% pożywce Danieau zawierającej od 0,02% do 0,04% trikainy.Przystąp do obrazowania larw za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Po eutanazji zakażonych larw danio pręgowanego wbij igłę w grzbietowy pień larw danio pręgowanego w pobliżu głowy, aby unieruchomić danio pręgowanego. Usuń głowę za skrzelami za pomocą lancetu.Włóż drugą igłę w środek tułowia grzbietowego. Wbij trzecią igłę w brzuch danio pręgowanego i wyciągnij jelito z jamy ciała. Użyj igły do mikroiniekcji, aby przenieść 10 do 15 jelit do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów sterylnego 1X PBS.Homogenizuj jelita za pomocą tłuczka, aby rozbić tkankę i przygotować homogenaty. Upewnij się, że tłuczek dotrze do dna probówki, aby całkowicie rozbić wszystkie jelita. Do homogenatów dodać pożywkę hodowlaną Clostridioides difficile zawierającą D-cykloserynę i cefoksytynę, z taurocholanem lub bez, i inkubować w komorze beztlenowej.W tym badaniu zarówno neutrofile, jak i makrofagi docierają do miejsc infekcji. Przykład aktywowanego makrofaga fagocytującego dwie bakterie pokazuje oczyszczanie przez fagocytozę i trawienie znakowanego Clostridioides difficile. Mikrozgłębnik do dostarczania znakowanych fluorescencyjnie Clostridioides difficile do światła jelita linii reporterowych makrofagów i neutrofili w ciągu pięciu dni po zapłodnieniu naśladuje naturalną drogę infekcji Clostridioides difficile.Jednak neutrofile i makrofagi nie wykazywały oczywistej migracji do przewodu pokarmowego do 12 godzin po mikrozgłębniku. W międzyczasie fluorescencja znakowanego Clostridioides difficile zniknęła po około pięciu godzinach po mikrozgłębniku. Próbki jelit 24 godziny po zakażeniu zostały wypreparowane i wykazały wzrost bakterii.W grupie kontrolnej nie rozwijały się żadne bakterie. W późniejszych punktach czasowych inkubowane próbki rosły tylko w pożywce zawierającej TCA, co sugeruje, że całkowite Clostridioides difficile w jelitach utworzyły zarodniki. 16S rDNA PCR zidentyfikował wyhodowaną bakterię jako Clostridioides difficile, która wytwarza specyficzne amplikony PCR o przewidywalnej wielkości około 800 par zasad.Kultury bakterii wyhodowane na płytce CHROMID wyglądały jak typowe czarne kolonie, co dodatkowo wskazywało, że bakterie z jelit danio pręgowanego to Clostridioides difficile. Praca z bakteriami beztlenowymi wymaga, aby kroki tlenowe były krótkie, ponieważ wpływa to oczywiście na biologię bakterii. Wrodzonymi komórkami odpornościowymi u danio pręgowanego można manipulować.Na przykład mogą rozszyfrować mechanizm wrodzonych odpowiedzi komórek odpornościowych na infekcję. Nasza metoda wykazała, że danio pręgowany może być narzędziem do badania beztlenowego patogenu z ludzkiego jelita. Praca z wieloopornymi patogenami wymaga podjęcia odpowiednich środków bezpieczeństwa.

development-larval-zebrafish-infection-model-for-clostridioides

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Źródło: Li, J. i wsp. Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje oparte na mikroiniekcjach dostarczanie znakowanych fluorescencyjnie Clostridioides difficile do światła jelita znieczulonej larwy danio pręgowanego. Przedstawiono w nim etapy przygotowania larw, wstrzyknięcia bakterii i potwierdzenia lokalizacji bakterii w jelicie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Miejscowe dostarczanie bakterii do światła jelita larwy danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji

Źródło: Li, J., et al., Opracowanie modelu infekcji larwalnego danio pręgowanego dla Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje izolację i hodowlę bakterii Clostridioides difficile z jelita larw danio pręgowanego. Zakażone jelito jest preparowane, homogenizowane i inkubowane w selektywnych pożywkach beztlenowych zawierających antybiotyki. Warunki te hamują konkurencyjne drobnoustroje i sprzyjają wzrostowi żywotnych komórek.

Izolacja i hodowla bakterii Clostridioides difficile z jelita larwalnego danio pręgowanego

Źródło: Flores, E. i inni. Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji pokarmowych u larw danio danio. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę ustalania modelu bakteryjnego zakażenia jelit przenoszonego przez żywność u larw danio pręgowanego poprzez karmienie ich paramecjami zakażonymi fluorescencyjnym E. coli.

Modelowanie infekcji jelit u larw danio pręgowanego przy użyciu bakterii przenoszonych przez żywność

Źródło: Winston, J. A. i in. Model myszy leczonem cefoperazonu klinicznie istotnego szczepu Clostridium difficile R20291.  J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje procedurę szczepienia myszy wcześniej leczonymi antybiotykiem zarodnikami Clostridium difficile , aby ustanowić model infekcji myszy do badania patogenezy i odpowiedzi gospodarza.

Ustanowienie mysiego modelu infekcji Clostridium difficile

Źródło: Li, J. i inni. Opracowanie modelu infekcji larwal danio pręgowanego dla Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje procedurę mikrogavage, w której znieczulona larwa danio jest unieruchomiona w agarozie i doustnie wstrzykiwana patogenną bakterią za pomocą igły prowadzonej przez śledzenie. Nieinwazyjne podanie naśladuje naturalne zakażenie, umożliwiając analizę replikacji bakterii, uwalniania toksyn oraz uszkodzeń nabłonka jelit.

Opracowanie modelu infekcji larw danio pręgowanego z wykorzystaniem mikrogawage

In vivo czasoprzestrzenne interakcje patogenów i obrony immunologicznej na poziomie błony śluzowej nie są łatwe do zobrazowania u istniejących kręgowców gospodarzy. Przedstawiona metoda opisuje wszechstronną platformę do badania kandydozy błony śluzowej u żywych kręgowców przy użyciu pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego jako miejsca zakażenia.

Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Poznaj metodę zakażenia larw danio pręgowanego Clostridioides difficile poprzez mikroinjekcję i mikrogawage. Technika umożliwia badanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie beztlenowe w modelu żywym.

Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile

Przeglądaj więcej filmów