Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytanie o rolę wrodzonego układu odpornościowego w zakażeniu Clostridium, np. czy i w jaki sposób makrofagi rozpoznają lub fagocytozą ten patogen. Główną zaletą tej metody jest to, że można ją stosować do wielu różnych bakterii beztlenowych, że można manipulować czasem infekcji i że podawanie doustne znacznie bardziej przypomina normalną infekcję u ludzi. Po wyhodowaniu przenieś jeden mililitr kultury do kuwety spektrofotometru i zmierz OD600.

Przenieś wymaganą ilość do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra, aby osiągnąć końcową średnicę zewnętrzną od jednego do 1,2 w jednym mililitrze końcowej objętości. Umyj jeden raz jednym mililitrem 1X PBS i odwiruj przy 5 000 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zawiesić ponownie w jednym mililitrze 1X PBS.

Dodać trzy mikrolitry roztworu roboczego przygotowanego barwnika fluorescencyjnego do jednomililitrowej zawiesiny bakteryjnej. Inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie umyj poplamione Clostridioides difficile raz 1X PBS, aby usunąć resztki barwnika, i ponownie zawieś w jednym mililitrze 1X PBS, aby uzyskać OD600 1,0.

Najpierw umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwach danio pręgowanego na szalce Petriego, aby przykryć. Delikatnie ustaw larwy w pozycji bocznej. Umieść szalkę Petriego na lodzie na 30 do 60 sekund, aby niskotopliwa agaroza zastygła.

Dodaj 30% pożywki Danieau zawierającej od 0,02% do 0,04% trikainy, aby pokryć agarozę. Aby przygotować roztwór do wstrzykiwań, dodać jeden mikrolitr 0,5% czerwieni fenolowej w roztworze PBS do dziewięciu mikrolitrów barwionego barwnikiem inokulum Clostridioides difficile. Załadować skalibrowaną igłę do mikroiniekcji roztworem do wstrzykiwań za pomocą mikroładowarki.

Zamontuj załadowaną igłę w mikromanipulatorze i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym. Ustawić ciśnienie wtrysku w zakresie od 600 do 900 hektopaskalów. Ustaw czas wstrzykiwania na 0,1 do 0,3 sekundy, aby uzyskać 0,5 do 1,0 nanolitrów.

Ustaw igłę w mikromanipulatorze pod kątem około 45 stopni, skierowaną w stronę osadzonych larw. Umieść końcówkę igły nad przewodem pokarmowym, w pobliżu porów moczowo-płciowych. Przebij przez agarozę, a następnie mięsień końcówką igły.

Następnie włóż go do światła jelita i wstrzyknij od 0,5 do 1,0 nanolitrów Clostridioides difficile. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego do monitorowania wstrzykniętych larw i użyj elastycznej końcówki Microloadera, aby pobrać prawidłowo wstrzyknięte larwy do obrazowania konfokalnego. Na 1,5% płytce agarozowej z rowkami umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwy danio pręgowanego, aby je przykryć.

Delikatnie wyreguluj larwy z głowami skierowanymi do pozycji pionowej pod kątem 45 stopni w rowku i ogonami przy ścianie rowka. Delikatnie przeprowadź igłę przez agarozę, a następnie do pyska larw danio pręgowanego, przez przełyk. Gdy końcówka igły znajdzie się w opuszki jelita przedniego, naciśnij pedał iniekcji, aby uwolnić od 0,5 do jednego nanolitra kultury bakterii.

Wypełnij światło jelita. Nie pozwól, aby z przełyku lub kloaki. Delikatnie wyjmij igłę z pyska danio pręgowanego.

Po zgłębniku uratuj zainfekowane larwy danio pręgowanego przed agarozą za pomocą elastycznej końcówki mikroładowacza, najpierw odcinając agarozę, a następnie podnosząc larwy. Przenieś te larwy do sterylnego 30% podłoża Danieau i spłucz dwukrotnie. Po znieczuleniu larw danio pręgowanego dodaj od 200 do 300 mikrolitrów 1% niskotopliwej agarozy, aby przykryć znieczulone larwy.

Umieść zainfekowany obszar larw na szkiełku tak blisko, jak to możliwe. Pozwól agarozie zestalić się na lodzie przez 30 do 60 sekund. Zanurz agarozę w 30% pożywce Danieau zawierającej od 0,02% do 0,04% trikainy.

Przystąp do obrazowania larw za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Po eutanazji zakażonych larw danio pręgowanego wbij igłę w grzbietowy pień larw danio pręgowanego w pobliżu głowy, aby unieruchomić danio pręgowanego. Usuń głowę za skrzelami za pomocą lancetu.

Włóż drugą igłę w środek tułowia grzbietowego. Wbij trzecią igłę w brzuch danio pręgowanego i wyciągnij jelito z jamy ciała. Użyj igły do mikroiniekcji, aby przenieść 10 do 15 jelit do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów sterylnego 1X PBS.

Homogenizuj jelita za pomocą tłuczka, aby rozbić tkankę i przygotować homogenaty. Upewnij się, że tłuczek dotrze do dna probówki, aby całkowicie rozbić wszystkie jelita. Do homogenatów dodać pożywkę hodowlaną Clostridioides difficile zawierającą D-cykloserynę i cefoksytynę, z taurocholanem lub bez, i inkubować w komorze beztlenowej.

W tym badaniu zarówno neutrofile, jak i makrofagi docierają do miejsc infekcji. Przykład aktywowanego makrofaga fagocytującego dwie bakterie pokazuje oczyszczanie przez fagocytozę i trawienie znakowanego Clostridioides difficile. Mikrozgłębnik do dostarczania znakowanych fluorescencyjnie Clostridioides difficile do światła jelita linii reporterowych makrofagów i neutrofili w ciągu pięciu dni po zapłodnieniu naśladuje naturalną drogę infekcji Clostridioides difficile.

Jednak neutrofile i makrofagi nie wykazywały oczywistej migracji do przewodu pokarmowego do 12 godzin po mikrozgłębniku. W międzyczasie fluorescencja znakowanego Clostridioides difficile zniknęła po około pięciu godzinach po mikrozgłębniku. Próbki jelit 24 godziny po zakażeniu zostały wypreparowane i wykazały wzrost bakterii.

W grupie kontrolnej nie rozwijały się żadne bakterie. W późniejszych punktach czasowych inkubowane próbki rosły tylko w pożywce zawierającej TCA, co sugeruje, że całkowite Clostridioides difficile w jelitach utworzyły zarodniki. 16S rDNA PCR zidentyfikował wyhodowaną bakterię jako Clostridioides difficile, która wytwarza specyficzne amplikony PCR o przewidywalnej wielkości około 800 par zasad.

Kultury bakterii wyhodowane na płytce CHROMID wyglądały jak typowe czarne kolonie, co dodatkowo wskazywało, że bakterie z jelit danio pręgowanego to Clostridioides difficile. Praca z bakteriami beztlenowymi wymaga, aby kroki tlenowe były krótkie, ponieważ wpływa to oczywiście na biologię bakterii. Wrodzonymi komórkami odpornościowymi u danio pręgowanego można manipulować.

Na przykład mogą rozszyfrować mechanizm wrodzonych odpowiedzi komórek odpornościowych na infekcję. Nasza metoda wykazała, że danio pręgowany może być narzędziem do badania beztlenowego patogenu z ludzkiego jelita. Praca z wieloopornymi patogenami wymaga podjęcia odpowiednich środków bezpieczeństwa.