Name: Wizualizacja i analiza tętnic łukowych gardła z wykorzystaniem immunohistochemii całego montażu i rekonstrukcji 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji tętnic łukowych gardła w zarodkach myszy z wykorzystaniem immunofluorescencji całego preparatu, przezroczystości tkanek i rekonstrukcji 3D. Technika umożliwia ilościową analizę komórek śródbłonka oraz badanie wpływu mutacji na rozwój naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Briannie Alexander, Caolanowi O'Donnellowi i Michaelowi Warkala za uważne przeczytanie i zredagowanie tego rękopisu. Praca ta była wspierana przez finansowanie z Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 do SA; AJR jest wspierany przez NHLBI HL103920-08S1 oraz grant szkoleniowy Narodowego Instytutu Zapalenia Stawów i Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry T32052283-11.

<ol><li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li>
<li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3%2C+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li>
<li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+%28HREM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58(2018).</li>
<li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li>
<li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li>
<li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Możliwość wizualizacji śródbłonka w zarodkach myszy w 3D dostarczyła nowych informacji na temat ich rozwoju3. Poniżej przedstawiamy protokół, który pozwala na obrazowanie 3D zarodków w wysokiej rozdzielczości, wizualizację połączeń naczyniowych oraz analizy ilościowe powstawania PAA. Protokół ten można zastosować, aby zobaczyć, jak zmiany genetyczne lub zniewagi środowiskowe wpływają na rozwój PAA. Opisana tutaj procedura wykorzystuje przeciwciała przeciwko VEGFR2 i ERG do wizualizacji tworzenia P...

Podczas embriogenezy myszy, tętnice łukowate gardła (PAA) powstają jako symetryczne, obustronne pary tętnic, które łączą serce z aortą grzbietową1. W miarę rozwoju zarodka pierwsza i druga para PAA ulegają regresji, podczas gdy 3., 4. i 6. PAA przechodzą serię asymetrycznych zdarzeń przebudowy, tworząc tętnice łuku aorty2.
PAA 3, 4 i 6 rozwijają się poprzez waskulogenezę, która jest tworzeniem naczyń krwionośnych de novo3. Wady w tworzeniu lub przebudowie tych tętnic łukowych powodują różne wrodzone wady serca, takie jak te obserwowane u pacjentów z zespołem DiGeorge'a4,5. Dlatego zrozumienie mechanizmów regulujących rozwój PAA może prowadzić do lepszego zrozumienia etiologii wrodzonych wad serca (CHD).
Obecne podejścia do wizualizacji i analizy rozwoju PAA obejmują immunofluorescencję skrawków tkanek, odlewy naczyniowe, wstrzykiwanie tuszu indyjskiego, mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości i/lub immunohistochemię całej góry1,4,5,6,7. W tym artykule opisujemy protokół łączący immunofluorescencję z całą mocą, mikroskopię konfokalną i renderowanie obrazów 3D w celu gromadzenia, analizy i ilościowego określania danych wolumetrycznych, połączeń naczyniowych i tożsamości komórek. Ponadto szczegółowo opisujemy metodę podziału i ilościowego określania liczby EC w każdym łuku gardłowym jako sposób na badanie powstawania splotu naczyniowego łuku gardłowego i jego przebudowy w PAA. Chociaż protokół ten jest przeznaczony do analizy rozwoju PAA, może być używany do analizy innych rozwijających się sieci naczyniowych.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td></td></tr><tr><td>20x obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Nikon</td><td>MRD77200</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 antykozioł</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anty-mysie</td><td></td> oprogramowanie <td></td> analityczne Invitrogen A-31570 <td></td></tr><tr><td></td><td>Imaris 9.2.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>305197</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18701.0100</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (zapas 5 mg/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf (2.0 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon (50 ml)</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Szybkie studnie</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664113</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-VEGFR2</td><td>R& D Systems, Inc.</td><td>AF644</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>A1HD25</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ERG</td><td>Abcam</td><td>ab214341</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (35 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (60 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>Formy plastikowe</td><td>VWR</td><td>18000-128</td><td></td></tr><tr><td>Scapels</td><td>Exelint International Co.</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja i analiza tętnic łukowych gardła z wykorzystaniem immunohistochemii całego montażu i rekonstrukcji 3d

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Niewłaściwe tworzenie lub przebudowa tętnic łuku gardłowego (PAA) 3, 4 i 6 przyczyniają się do niektórych z najcięższych form wrodzonych wad serca. Aby zbadać powstawanie PAA, opracowaliśmy protokół wykorzystujący immunofluorescencję całej góry w połączeniu z oczyszczaniem tkanek alkoholu benzylowego / benzoesanu benzylu (BABB) i mikroskopią konfokalną. Pozwala to na wizualizację śródbłonka łuku gardłowego w drobnej rozdzielczości komórkowej, a także łączność 3D naczyń krwionośnych. Korzystając z oprogramowania, opracowaliśmy protokół ilościowego określania liczby komórek śródbłonka (EC) w PAA, a także liczby EC w splocie naczyniowym otaczającym PAA w łukach gardłowych 3, 4 i 6. Metodologia ta, zastosowana do całego zarodka, zapewnia kompleksową wizualizację i analizę ilościową unaczynienia zarodka.

Przedstawiony tutaj protokół immunofluorescencji całego preparatu (whole-mount) pozwala na uzyskanie wyraźnych i czystych wyników, umożliwiając trójwymiarową rekonstrukcję śródbłonka łuków gardzielowych, co pokazano na Rysunku 1A. Ważne jest, aby inkubować embriony przez wystarczający czas w każdym roztworze przeciwciał, aby zapewnić pełną penetrację próbki, a także dokładnie przemywać embriony po inkubacji z przeciwciałami. Na <strong class=...

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji i analizy tętnic łuku gardłowego 3, 4 i 6 zarodków myszy za pomocą immunofluorescencji całego montażu, oczyszczania tkanek, mikroskopii konfokalnej i rekonstrukcji 3D.

Wizualizacja i analiza tętnic łukowych gardła z wykorzystaniem immunohistochemii całego montażu i rekonstrukcji 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Ta metoda pozwala na podział każdego łuku gardłowego na przedziały. Liczba komórek śródbłonka może być następnie określona ilościowo w każdym łuku jako sposób na zbadanie rozwoju tętnicy łuku gardłowego. Głównymi zaletami tego podejścia jest możliwość wizualizacji związku między różnymi strukturami naczyniowymi oraz możliwość ilościowego określenia, w jaki sposób struktury te wpłynęły na mutanty.Tętnice łukowate aorty są często zmutowane we wrodzonych wadach serca. Nasza metoda pozwala na zbadanie, w jaki sposób mutacje zmieniają fizjologiczny proces powstawania i przebudowy naczyń. Chociaż używamy tej metody, aby uzyskać wgląd w mechanizmy wrodzonych wad serca, można ją zastosować do innych systemów, szczególnie wraz z pojawieniem się mikroskopii świetlnej.Zacznij od użycia szklanej pipety do przeniesienia każdego zarodka myszy w 9,5 lub 10,5 dniu embrionalnym do pojedynczych dwumililitrowych probówek zawierających jeden mililitr PBS. Po utrwaleniu użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie uszczypnąć zarodek tuż nad tylną kończyną i wykonaj poprzeczne cięcie, aby usunąć tylną połowę zarodka. Aby przepuszczalność zarodków, zastąp PBS PBST PBST i umieść zarodki w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem przez noc.Następnego dnia zastąp PBST 600 mikrolitrami buforu blokującego bez dotykania zarodków na 16 do 18 godzin inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem. Następnego ranka zastąp bufor blokujący 600 mikrolitrami podstawowego przeciwciała na probówkę na cztery do pięciu dni inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem. Pod koniec inkubacji umyj zarodki w jednym mililitrze PBST przez cztery do pięciu godzin z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej, zmieniając PBS co godzinę, a następnie przez noc inkubuj w świeżym PBST w temperaturze czterech stopni Celsjusza i cztery do pięciu dodatkowych godzinnych płukań następnego dnia.Po ostatnim przemyciu zastąpić PBST w każdej probówce 600 mikrolitrami odpowiedniego roztworu przeciwciał drugorzędowych na cztery do pięciu dni inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj zarodki w jednym mililitrze świeżego PBST na przemycie, jak właśnie pokazano, i użyj szklanej pipety, aby delikatnie przenieść każdy zarodek do indywidualnych plastikowych form parafinowych. Ostrożnie usuń PBST z okolic każdego zarodka i ustaw każdy zarodek w pozycji strzałkowej.Następnie szybko dodaj około 500 mikrolitrów gorącej agarozy do każdej formy, aż każdy zarodek zostanie pokryty i umieść foremki na lodzie pokrytym folią aluminiową, aż agaroza zastygnie. W celu odwodnienia próbek embrionalnych użyj czystego skalpela, aby przeciąć blok agarozy wokół każdego zarodka i użyj kleszczy, aby chwycić agarozę w celu przeniesienia do oznakowanej dwumililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr 25% metanolu. Po godzinnej inkubacji z delikatnym mieszaniem w ciemności, zastąp 25% metanolu jednym mililitrem 50% metanolu na probówkę na dodatkową godzinną inkubację w ciemności.Po zakończeniu odwodnienia zastąp 100% metanol jednym mililitrem 50% BABB na godzinną inkubację z delikatnym mieszaniem w ciemności. Pod koniec inkubacji zastąp 50% BABB jednym mililitrem 100% BABB na probówkę na godzinną inkubację z delikatnym mieszaniem w ciemności, a następnie drugą inkubację ze 100% BABB, jak właśnie pokazano. Aby zamontować zarodki do obrazowania, usuń klej ze zderzaka szybkiej studzienki i umieść zderzak na szklanym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 na sześć mililitrów o rozmiarze 1,5.Delikatnie dociśnij klej, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a zderzakiem i ostrożnie wyrzuć 100% BABB z każdej tubki. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie przenieś zarodek do zarodka bez dotykania zarodka i umieść drugie szkiełko nakrywkowe na zderzaku. Aby wyświetlić śródbłonek w całym trzecim łuku gardłowym, otwórz interesujący Cię obraz w oprogramowaniu i kliknij dodaj nową powierzchnię.Kliknij dwukrotnie powierzchnię pierwszą i zmień nazwę nowej powierzchni na trzeci łuk gardłowy. Wybierz opcję pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie i ustaw orientację powierzchni na płaszczyznę YZ. Użyj pozycji przekroju, aby umieścić trzecią płaszczyznę powierzchni łuku gardłowego w miejscu, w którym łączą się trzecie PAA i aorta grzbietowa.Obróć obraz tak, aby widoczna była trzecia płaszczyzna powierzchni łuku gardłowego i wyłącz slicer orto. W trybie rysowania konturu wybierz funkcję trybu rysowania odległości i w razie potrzeby dostosuj ustawienia parametrów. Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij Escape i kliknij rysuj, aby prześledzić obwód trzeciego łuku gardłowego za pomocą kursora myszy.Następnie użyj pozycji plasterka, aby przesunąć od 10 do 25 plasterków i obrysuj obwód łuku gardłowego. Po obrysowaniu całego łuku kliknij przycisk Utwórz powierzchnię, aby wygenerować powierzchnię śledzonego obszaru. W celu maskowania konstrukcji powierzchniowych w menu edycji wybierz wybór maski dla trzeciego PAA i DAPI i kliknij przycisk OK. Następnie zmień nazwę nowego kanału na PAA DAPI.Powtórz ten krok dla pozostałych kanałów. Aby uwidocznić splot śródbłonkowy oddzielnie od PAA, wybierz wybór maski dla trzeciego PAA i wybierz DAPI. Usuń zaznaczenie opcji wybierz woksele na zewnątrz powierzchni do i zaznacz opcję wybierz woksele wewnątrz powierzchni do.Ustaw opcję select voxsels inside surface na zero i kliknij przycisk OK. Zmień nazwę nowego kanału na DAPI bez PAA. Powtórz ten krok dla pozostałych kanałów. Wybierz wybór maski dla trzeciego PA i wybierz DAPI bez PAA i kliknij OK. Zmień nazwę nowego kanału na plexus DAPI.Powtórz ten krok dla pozostałych kanałów. Aby określić ilościowo poszczególne komórki śródbłonka w każdej strukturze będącej przedmiotem zainteresowania, w panelu regulacji wyświetlania wyłącz wszystkie kanały z wyjątkiem kanału PAA ERG. W menu właściwości kliknij dodaj nowe plamki i kliknij, aby zmienić nazwę plam na jedną całkowitą liczbę komórek śródbłonka PAA.Kliknij niebieską strzałkę i wybierz kanał PAA ERG jako kanał źródłowy. Dostosuj szacowaną średnicę XY do czterech mikrometrów i kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do następnego panelu. Użyj przesuwanej skali, aby dostosować liczbę plamek, aby upewnić się, że każde jądro komórki śródbłonka ERG dodatnie jest reprezentowane przez jedną plamkę.Następnie kliknij zieloną podwójną strzałkę i wyłącz kanał PAA ERG w panelu regulacji wyświetlania. Włącz kanał PAA VEGFR2, aby uwidocznić śródbłonek PAA, a następnie kliknij edytuj i dodaj/usuń, aby wybrać powierzchnię obiektu. Następnie naciśnij Escape i przytrzymaj Shift, aby usunąć wszystkie miejsca, które nie są dodatnie pod względem VEGFR2 i kliknij kartę statystyk, aby określić całkowitą liczbę komórek śródbłonka.Immunofluorescencja całego wierzchowca daje wyraźne i czyste wyniki, umożliwiając rekonstrukcję 3D śródbłonka łuku gardłowego. Na tym obrazie obecność dużych, jasnych kropek jest wynikiem cząstek stałych w przeciwciałie lub blokujących roztworów buforowych. Po zabarwieniu łuku gardłowego i powierzchni PAA, użycie funkcji maski pozwala na wizualne oddzielenie i niezależną analizę wyprofilowanych obszarów.Maskowanie umożliwia również indywidualną analizę i kwantyfikację liczby komórek śródbłonka w każdej strukturze. Na przykład w tym przypadku funkcja plamki została wykorzystana do ilościowego określenia całkowitej liczby komórek śródbłonka zarówno w PAA, jak i w splocie, przypisując pojedynczą plamkę dla każdego jądra wykazującego ekspresję ERG. Na tym obrazie można zaobserwować ujemną plamkę VEGFR2 dodatnią ERG, która została wygenerowana przez funkcję punktu.Dlatego ważne jest, aby sprawdzić, czy każda kropka rozpoznana przez oprogramowanie rzeczywiście reprezentuje pojedynczą komórkę śródbłonka. Aby uzyskać czyste i wyraźne obrazy, należy pamiętać o odkręceniu wszystkich roztworów oraz prawidłowym i dokładnym umyciu każdego zarodka po inkubacji przeciwciał. Należy pamiętać, że BABB jest i toksyczny.Z rozpuszczalnikiem należy obchodzić się i wyrzucać go w odpowiedni sposób oraz pamiętać o całkowitym uszczelnieniu stopionych zarodków, aby zapobiec wyciekowi BABB.

visualization-analysis-pharyngeal-arch-arteries-using-whole-mount

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Tutaj prezentujemy protokół hodowli łuków gardłowych w celu zbadania biologii komórek progenitorowych serca i mięśni oraz ich mikrośrodowiska.

Ex vivo Hodowla łuków gardłowych w celu zbadania przodków serca i mięśni oraz ich niszy

Opisano procedurę przygotowania en face tętnicy szyjnej i aorty myszy. Takie preparaty, po immunofluorescencyjnym wybarwieniu specyficznymi przeciwciałami, umożliwiają badanie lokalizacji białek i identyfikację typów komórek w obrębie całej ściany naczyniowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

En Face Przygotowanie naczyń krwionośnych myszy

Proponujemy ustandaryzowany protokół do scharakteryzowania składu komórkowego późnych zmian miażdżycowych u myszy, w tym systematyczne metody preparacji zwierząt, osadzania tkanek, cięcia, barwienia i analizy tętnic ramienno-głowowych od myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich w atheroprone.

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Udostępniamy krok po kroku protokół barwienia immunofluorescencyjnego całego węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) u mysich serc.

Barwienie immunofluorescencyjne w całości mount, obrazowanie konfokalne i rekonstrukcja 3D węzła zatokowo-przedsionkowego i przedsionkowo-komorowego u myszy

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Ten protokół przedstawia kompleksowy potok do analizy próbek pobranych z ludzkich serc, które obejmują mikroskopijne i makroskopowe skale.

Rurociąg do wieloskalowych trójwymiarowych badań anatomicznych ludzkiego serca

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Przedstawiamy tutaj protokół zachowania architektury tętnic ludzkich poprzez wprowadzenie żelu stabilizującego tkanki do lumenu naczynia przed przecięciem w celu analizy molekularnej lub histologicznej.

In vitro Intraluminalna infuzja żelowa: zaawansowane podejście do mikroskopowej analizy tętnic oporowych człowieka

Poznaj metodę wizualizacji tętnic łukowych gardła w zarodkach myszy z wykorzystaniem immunofluorescencji całego preparatu, przezroczystości tkanek i rekonstrukcji 3D. Technika umożliwia ilościową analizę komórek śródbłonka oraz badanie wpływu mutacji na rozwój naczyń.

Wizualizacja i analiza tętnic łukowych gardła z wykorzystaniem immunohistochemii całego montażu i rekonstrukcji 3D

Przeglądaj więcej filmów