Wizualizacja i analiza tętnic łukowych gardła z wykorzystaniem immunohistochemii całego montażu i rekonstrukcji 3D
31 marca 2020
Tutaj opisujemy protokół wizualizacji i analizy tętnic łuku gardłowego 3, 4 i 6 zarodków myszy za pomocą immunofluorescencji całego montażu, oczyszczania tkanek, mikroskopii konfokalnej i rekonstrukcji 3D.
Ta metoda pozwala na podział każdego łuku gardłowego na przedziały. Liczba komórek śródbłonka może być następnie określona ilościowo w każdym łuku jako sposób na zbadanie rozwoju tętnicy łuku gardłowego. Głównymi zaletami tego podejścia jest możliwość wizualizacji związku między różnymi strukturami naczyniowymi oraz możliwość ilościowego określenia, w jaki sposób struktury te wpłynęły na mutanty.
Tętnice łukowate aorty są często zmutowane we wrodzonych wadach serca. Nasza metoda pozwala na zbadanie, w jaki sposób mutacje zmieniają fizjologiczny proces powstawania i przebudowy naczyń. Chociaż używamy tej metody, aby uzyskać wgląd w mechanizmy wrodzonych wad serca, można ją zastosować do innych systemów, szczególnie wraz z pojawieniem się mikroskopii świetlnej.
Zacznij od użycia szklanej pipety do przeniesienia każdego zarodka myszy w 9,5 lub 10,5 dniu embrionalnym do pojedynczych dwumililitrowych probówek zawierających jeden mililitr PBS. Po utrwaleniu użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie uszczypnąć zarodek tuż nad tylną kończyną i wykonaj poprzeczne cięcie, aby usunąć tylną połowę zarodka. Aby przepuszczalność zarodków, zastąp PBS PBST PBST i umieść zarodki w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem przez noc.
Następnego dnia zastąp PBST 600 mikrolitrami buforu blokującego bez dotykania zarodków na 16 do 18 godzin inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem. Następnego ranka zastąp bufor blokujący 600 mikrolitrami podstawowego przeciwciała na probówkę na cztery do pięciu dni inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem. Pod koniec inkubacji umyj zarodki w jednym mililitrze PBST przez cztery do pięciu godzin z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej, zmieniając PBS co godzinę, a następnie przez noc inkubuj w świeżym PBST w temperaturze czterech stopni Celsjusza i cztery do pięciu dodatkowych godzinnych płukań następnego dnia.
Po ostatnim przemyciu zastąpić PBST w każdej probówce 600 mikrolitrami odpowiedniego roztworu przeciwciał drugorzędowych na cztery do pięciu dni inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj zarodki w jednym mililitrze świeżego PBST na przemycie, jak właśnie pokazano, i użyj szklanej pipety, aby delikatnie przenieść każdy zarodek do indywidualnych plastikowych form parafinowych. Ostrożnie usuń PBST z okolic każdego zarodka i ustaw każdy zarodek w pozycji strzałkowej.
Następnie szybko dodaj około 500 mikrolitrów gorącej agarozy do każdej formy, aż każdy zarodek zostanie pokryty i umieść foremki na lodzie pokrytym folią aluminiową, aż agaroza zastygnie. W celu odwodnienia próbek embrionalnych użyj czystego skalpela, aby przeciąć blok agarozy wokół każdego zarodka i użyj kleszczy, aby chwycić agarozę w celu przeniesienia do oznakowanej dwumililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr 25% metanolu. Po godzinnej inkubacji z delikatnym mieszaniem w ciemności, zastąp 25% metanolu jednym mililitrem 50% metanolu na probówkę na dodatkową godzinną inkubację w ciemności.
Po zakończeniu odwodnienia zastąp 100% metanol jednym mililitrem 50% BABB na godzinną inkubację z delikatnym mieszaniem w ciemności. Pod koniec inkubacji zastąp 50% BABB jednym mililitrem 100% BABB na probówkę na godzinną inkubację z delikatnym mieszaniem w ciemności, a następnie drugą inkubację ze 100% BABB, jak właśnie pokazano. Aby zamontować zarodki do obrazowania, usuń klej ze zderzaka szybkiej studzienki i umieść zderzak na szklanym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 na sześć mililitrów o rozmiarze 1,5
.Delikatnie dociśnij klej, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a zderzakiem i ostrożnie wyrzuć 100% BABB z każdej tubki. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie przenieś zarodek do zarodka bez dotykania zarodka i umieść drugie szkiełko nakrywkowe na zderzaku. Aby wyświetlić śródbłonek w całym trzecim łuku gardłowym, otwórz interesujący Cię obraz w oprogramowaniu i kliknij dodaj nową powierzchnię.
Kliknij dwukrotnie powierzchnię pierwszą i zmień nazwę nowej powierzchni na trzeci łuk gardłowy. Wybierz opcję pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie i ustaw orientację powierzchni na płaszczyznę YZ. Użyj pozycji przekroju, aby umieścić trzecią płaszczyznę powierzchni łuku gardłowego w miejscu, w którym łączą się trzecie PAA i aorta grzbietowa.
Obróć obraz tak, aby widoczna była trzecia płaszczyzna powierzchni łuku gardłowego i wyłącz slicer orto. W trybie rysowania konturu wybierz funkcję trybu rysowania odległości i w razie potrzeby dostosuj ustawienia parametrów. Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij Escape i kliknij rysuj, aby prześledzić obwód trzeciego łuku gardłowego za pomocą kursora myszy.
Następnie użyj pozycji plasterka, aby przesunąć od 10 do 25 plasterków i obrysuj obwód łuku gardłowego. Po obrysowaniu całego łuku kliknij przycisk Utwórz powierzchnię, aby wygenerować powierzchnię śledzonego obszaru. W celu maskowania konstrukcji powierzchniowych w menu edycji wybierz wybór maski dla trzeciego PAA i DAPI i kliknij przycisk OK. Następnie zmień nazwę nowego kanału na PAA DAPI.
Powtórz ten krok dla pozostałych kanałów. Aby uwidocznić splot śródbłonkowy oddzielnie od PAA, wybierz wybór maski dla trzeciego PAA i wybierz DAPI. Usuń zaznaczenie opcji wybierz woksele na zewnątrz powierzchni do i zaznacz opcję wybierz woksele wewnątrz powierzchni do.
Ustaw opcję select voxsels inside surface na zero i kliknij przycisk OK. Zmień nazwę nowego kanału na DAPI bez PAA. Powtórz ten krok dla pozostałych kanałów. Wybierz wybór maski dla trzeciego PA i wybierz DAPI bez PAA i kliknij OK. Zmień nazwę nowego kanału na plexus DAPI.
Powtórz ten krok dla pozostałych kanałów. Aby określić ilościowo poszczególne komórki śródbłonka w każdej strukturze będącej przedmiotem zainteresowania, w panelu regulacji wyświetlania wyłącz wszystkie kanały z wyjątkiem kanału PAA ERG. W menu właściwości kliknij dodaj nowe plamki i kliknij, aby zmienić nazwę plam na jedną całkowitą liczbę komórek śródbłonka PAA.
Kliknij niebieską strzałkę i wybierz kanał PAA ERG jako kanał źródłowy. Dostosuj szacowaną średnicę XY do czterech mikrometrów i kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do następnego panelu. Użyj przesuwanej skali, aby dostosować liczbę plamek, aby upewnić się, że każde jądro komórki śródbłonka ERG dodatnie jest reprezentowane przez jedną plamkę.
Następnie kliknij zieloną podwójną strzałkę i wyłącz kanał PAA ERG w panelu regulacji wyświetlania. Włącz kanał PAA VEGFR2, aby uwidocznić śródbłonek PAA, a następnie kliknij edytuj i dodaj/usuń, aby wybrać powierzchnię obiektu. Następnie naciśnij Escape i przytrzymaj Shift, aby usunąć wszystkie miejsca, które nie są dodatnie pod względem VEGFR2 i kliknij kartę statystyk, aby określić całkowitą liczbę komórek śródbłonka.
Immunofluorescencja całego wierzchowca daje wyraźne i czyste wyniki, umożliwiając rekonstrukcję 3D śródbłonka łuku gardłowego. Na tym obrazie obecność dużych, jasnych kropek jest wynikiem cząstek stałych w przeciwciałie lub blokujących roztworów buforowych. Po zabarwieniu łuku gardłowego i powierzchni PAA, użycie funkcji maski pozwala na wizualne oddzielenie i niezależną analizę wyprofilowanych obszarów.
Maskowanie umożliwia również indywidualną analizę i kwantyfikację liczby komórek śródbłonka w każdej strukturze. Na przykład w tym przypadku funkcja plamki została wykorzystana do ilościowego określenia całkowitej liczby komórek śródbłonka zarówno w PAA, jak i w splocie, przypisując pojedynczą plamkę dla każdego jądra wykazującego ekspresję ERG. Na tym obrazie można zaobserwować ujemną plamkę VEGFR2 dodatnią ERG, która została wygenerowana przez funkcję punktu.
Dlatego ważne jest, aby sprawdzić, czy każda kropka rozpoznana przez oprogramowanie rzeczywiście reprezentuje pojedynczą komórkę śródbłonka. Aby uzyskać czyste i wyraźne obrazy, należy pamiętać o odkręceniu wszystkich roztworów oraz prawidłowym i dokładnym umyciu każdego zarodka po inkubacji przeciwciał. Należy pamiętać, że BABB jest i toksyczny.
Z rozpuszczalnikiem należy obchodzić się i wyrzucać go w odpowiedni sposób oraz pamiętać o całkowitym uszczelnieniu stopionych zarodków, aby zapobiec wyciekowi BABB.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół wizualizacji i analizy tętnic łuków gardłowych 3, 4 i 6 w zarodkach myszy. Metoda wykorzystuje immunofluorescencyjną analizę całych tkanek, klarowanie tkanek, mikroskopie konfokalną i 3D rekonstrukcję do badania rozwoju układu krążenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwojowa
- Biologia naczyniowa
Tło
- Tętnice łuków gardłowych są kluczowe dla rozwoju zarodkowego.
- Wrodzone wady serca często wiążą się z mutacjami w tętnicach łuku aorty.
- Zrozumienie relacji struktur naczyniowych jest kluczowym elementem badań nad rozwojem.
- Mikroskopia arkuszową poprawia możliwości wizualizacji.
Cel badania
- Wizualizacja i analiza rozwoju tętnic łuków gardłowych.
- Ilościowa ocena liczby komórek śródbłonka w każdym łuku.
- Badanie wpływu mutacji na tworzenie i przekształcanie naczyń.
Zastosowanie metod
- Immunofluorescencyjna analiza całych tkanek
- Techniki klarowania tkanek
- Mikroskopia konfokalna
- 3D rekonstrukcja struktur naczyniowych
Główne wyniki
- Ilościowa ocena komórek śródbłonka w łukach gardłowych.
- Wizualizacja relacji struktur naczyniowych.
- Wgląd w mechanizmy wrodzonych wad serca.
- Potencjalne zastosowania w innych systemach biologicznych.
Wnioski
- Metoda zapewnia kompleksowe podejście do badania rozwoju układu krążenia.
- Umożliwia ocenę wpływu mutacji na procesy fizjologiczne.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne obszary badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise quantification of endothelial cell populations in developing vascular structures, supporting mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. By providing 3D visualization and numerical readouts of arch artery formation, it enhances predictive confidence in early discovery pipelines focused on congenital heart disease pathways. The approach facilitates translational continuity from genetic perturbation to phenotypic vascular outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying endothelial cell numbers in specific pharyngeal arches.
- Operational Value: Supports biological de-risking through compartmentalized analysis of vascular structures affected by genetic mutations.
- Predictive Value: Generates quantitative endothelial cell counts that inform target confidence and pathway validation in cardiovascular disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible vascular whole-mount preparations suitable for downstream immunohistochemical screening.
- Quantitative Output: Delivers endothelial cell number readouts in PAAs and surrounding plexuses, enabling comparative condition analysis.
- Platform Scalability: Compatible with light-sheet microscopy adaptation, supporting increased throughput and cross-project reuse.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models congenital heart disease mechanisms by visualizing PAA 3, 4, and 6 formation and remodeling.
- Translational Continuity: Links genetic mutations to vascular phenotypes through endothelial cell quantification in defined arch territories.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides phenotypic readouts that support go/no-go decisions in preclinical cardiovascular target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing vascular phenotypic data between target engagement and lead optimization stages, particularly for cardiovascular pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular development genes through endothelial cell quantification in defined anatomical compartments.
- Screening: Enables assay-ready tissue preparation with preserved 3D vascular architecture for antibody or compound screening campaigns.
- Analytics: Generates spot-based endothelial cell counts and 3D vascular connectivity data that facilitate comparative statistical analysis across genotypes.
- Translational Research: Connects embryonic vascular phenotypes to congenital heart disease mechanisms via arch-specific endothelial cell analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple cardiovascular target validation projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular development studies through direct endothelial cell quantification and 3D structural mapping.
- Operational Value: Standardizes vascular whole-mount processing and imaging, improving reproducibility across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing quantitative vascular phenotypic data early in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiovascular targets based on arch-specific endothelial cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-mount immunofluorescence, tissue clearing, and confocal microscopy.
- Dependent on optical clearing (BABB) compatibility with antibody penetration and tissue integrity.
- Necessitates standardized washing and blocking protocols to minimize background from antibody particulates.
- Involves careful embryo orientation and agarose embedding to maintain sagittal positioning for consistent arch visualization.
- Relies on validated endothelial markers (ERG, VEGFR2) and spot-detection parameters for accurate cell quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:55
Embryo Staining and Embedding
3:03
Methanol Dehydration and Tissue Clearing
4:04
Embryo Mounting
4:40
Third Pharyngeal Arch (PA) Surfacing
5:57
Surfaced Structure Masking
7:01
Endothelial Cell Quantification
8:19
Results: Representative PA and PAA Surfacing and EC Quantification
9:28
Conclusion
