Połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta

Nowotworowe komórki macierzyste są zaangażowane w nawroty raka z przerzutami oporności na leki. Protokół ten zapewnia skuteczną metodę badania funkcji kluczowych genów w nowotworowych komórkach macierzystych. Wykorzystując system warunkowego knockdown i dostosowany test tworzenia kuli, metodę tę można łatwo dostosować do badania funkcji in vitro i in vivo dotyczących genów związanych z macierzystością w różnych typach nowotworowych komórek macierzystych.

Procedurę zademonstrują Yuting Li i Xiangyu Tan, asystenci naukowi z mojego laboratorium. Aby wygenerować cząsteczki lentiwirusa, umieść cztery miliony komórek pakujących lentiwirusa 293T na 100-milimetrowej szalce Petriego z 10 mililitrami DMEM uzupełnionymi 10% FBS. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, upewniając się, że komórki są zlewające się w 50 do 80% w dniu transfekcji.

Doprowadzić zredukowaną pożywkę surowicy do temperatury pokojowej i przygotować probówki A i B zgodnie z instrukcjami manuskryptu. Dodać zawartość probówki A do probówki B. Dobrze wymieszać i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu przygotowania kompleksów lipidowo-DNA. Usuń pięć mililitrów pożywki z naczynia do hodowli komórkowych.

Następnie dodaj pięć mililitrów kompleksu lipidowo-DNA do naczynia do hodowli komórkowej, kroplami i delikatnie zamieszaj naczynie. Inkubuj szalkę hodowlaną przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji ostrożnie usuń pożywkę transfekcyjną i zastąp ją 10 mililitrami wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS.

Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. Około 48 godzin po transfekcji zbierz 10 mililitrów supernatantów zawierających lentiwirusa i przefiltruj je filtrem o średnicy 0,45 mikrometra, aby usunąć resztki komórkowe. Wszystkie naczynia do hodowli komórkowych, końcówki, filtry i strzykawki mogą zawierać lentiwirusa i przed usunięciem należy je potraktować 10% wybielaczem.

Przenieść oczyszczony supernatant do sterylnego pojemnika. Dodaj koncentrator Lenti-X i wymieszaj z delikatną inwersją. Inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia odwirować próbkę w temperaturze 1500 razy G przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie. Delikatnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze DMEM uzupełnionym 10% FBS i przechowywać go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Wysiewaj 6 milionów komórek macierzystych raka żołądka lub GCSC na 100-milimetrowej szalce Petriego z 10 mililitrami DMEM uzupełnionymi 10% FBS. Hoduj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, odessać pożywkę z naczynia i dodać skoncentrowane cząstki lentiwirusa rozcieńczone czterema milimetrami kompletnej pożywki DMEM, zawierającej odczynnik Polybrene.

Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 18 godzin. Polibren powinien być testowany w różnych warunkach, aby określić skuteczne stężenie, które zwykle mieści się w zakresie od dwóch do 10 miligramów na mililitr. Po 18 godzinach zastąp pożywkę 10 mililitrami DMEM z 10% FBS i włóż komórki z powrotem do inkubatora na 24 godziny.

Następnie odessać supernatant z resztkami komórek i dodać świeży DMEM uzupełniony 10% FBS i 2,5 mikrograma na mililitr Puromycyny. Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. Następnie ponownie zmień pożywkę na świeży DMEM uzupełniony 10% FBS i pięcioma mikrogramami na mililitr Puromycyny.

Po kolejnej 24-godzinnej inkubacji przepłukać przylegające GCSC dwukrotnie pięcioma mililitrami DPBS bez wapnia i magnezu. Odciąć komórki za pomocą jednego mililitra wstępnie podgrzanego roztworu do dysocjacji komórek i inkubować je przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj pięć mililitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki GCSC complete culture do zawiesiny komórek.

Dozować trzy mililitry tej zawiesiny do 15-mililitrowej probówki wirówkowej w celu kriokonserwacji, a pozostałe trzy mililitry do innej probówki w celu indukcji doksycykliną. Odwirować obie probówki w temperaturze 800 razy G przez pięć minut. Następnie odessać supernatant z probówki B i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej, wstępnie ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej GCSC.

Umieść odpowiednią liczbę komórek na nowej 100-milimetrowej szalce Petriego z 10 mililitrami świeżej, wstępnie ogrzanej pożywki GCSC complete culture i 2,5 mikrograma na mililitr doksycykliny. Następnie inkubuj naczynie przez 48 godzin. Użyj automatycznego licznika komórek, aby określić gęstość próbki komórek o pojemności 10 mikrolitrów.

Następnie dostosuj objętość za pomocą wstępnie ogrzanej kompletnej pożywki hodowlanej GCSC, aby uzyskać stężenie 20 000 żywych komórek na mililitr. Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki nowej, 96-dołkowej płytki hodowlanej o bardzo niskim nasadce. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Formowanie się kuli powinno nastąpić w ciągu trzech do 10 dni. Wyobraź sobie tworzenie się kuli guza co dwa dni. Komórki macierzyste raka żołądka z pierwotnego gruczolakoraka żołądka u ludzi hodowano w pożywce hodowlanej wolnej od surowicy.

Po sześciu dniach komórki rozszerzyły się z fenotypu jednokomórkowego do dużych kul. Aby ocenić funkcję klastryny w GCSC, krótkie sekwencje RNA spinki do włosów przeciwko klastrinowi sklonowano do wektora Tet-GV307-RFP-Puro. Komórki transfekowane wektorem ekspresyjnym traktowano doksycykliną przez 48 godzin.

Następnie ekspresję klastryny zweryfikowano za pomocą Western blot i określono ilościowo za pomocą densytometrii. Obecność doksycykliny i knockdown klastryny w GCSC hamowała tworzenie się sfery nowotworowej. Chociaż nie zaobserwowano zahamowania tworzenia sfery nowotworowej w komórkach transdukowanych zaszyfrowanymi kontrolami shRNA, co wskazuje, że sama doksycyklina nie hamuje tworzenia się sfery nowotworowej.

Wyniki te sugerują, że po wyciszeniu klastrów GCSC rosną powoli i nie mogą tworzyć kulek guza. Na podstawie tych danych klasteryna odgrywa kluczową rolę w promowaniu aktywności samoodnawiania się GCSC, co wskazuje, że może być obiecującym celem leku do tłumienia nowotworowych komórek macierzystych u pacjentów z rakiem żołądka. Kule guza powinny być stałymi okrągłymi strukturami na pojedynczych lub zagregowanych komórkach, nie powinny być uważane za kule nowotworowe.

Jednak niektóre nowotworowe komórki macierzyste mogą nie tworzyć typowych struktur sfery nowotworowej. Procedura ta może być stosowana z innymi metodami badania rakowych komórek macierzystych pod kątem potencjału odnawialnego in vitro. Na przykład można badać ekspresję markerów związanych z łodygą.

Protokół może zostać rozszerzony w celu zbadania funkcji krytycznych genów w nowotworowych komórkach macierzystych, takich jak zdolność macierzysta do przeżycia.