Name: Połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę warunkowego knockdownu i testu tworzenia kul do badania komórek macierzystych raka żołądka. Ta technika pozwala analizować geny związane ze zdolnością do samoodnawiania nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Nauk o Przyrodzie Prowincji Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), Fundację Badań Naukowych Medycznych Prowincji Guangdong (A2019405), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81772957), Program Nauki i Technologii Prowincji Guangdong w Chinach (2017B030301016) oraz Fundację Przemysłu i Technologii Informacyjnych Shenzhen (20180309100135860).

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z wykorzystaniem komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjentów zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną7.
1. Hodowla komórek macierzystych raka żołądka
<ol>
	<li>Przygotowanie kompletnej pożywki hodowlanej GCSC
	<ol>
		<li>Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną GCSCs, dodając świeżą pożywkę DME/F12 z następującymi niezbędnymi składnikami: 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF, 1% insuliny/transferyny/seleninu sodu, 0,2% glukozy, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminokwasów endogennych, 10 μM 2-merkaptoetanolu, 0,75 mg/mlNaHCO3, 10 μM tioglicerolu, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Filtruj i sterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm. 
		UWAGA: Zaleca się przechowywanie kompletnej pożywki GCSC najlepiej nie dłużej niż dwa tygodnie w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie GCSC i hodowli 
	UWAGA: GCSC uzyskano w następujący sposób: Próbki guza poddano dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej. Zawiesiny jednokomórkowe uzyskano przez filtrowanie siatką nylonową z dobrze rozsypanej zawiesiny. Powstałe w ten sposób komórki rakowe hodowano w pożywce GCSC Complete Culture Balance, a niektóre komórki rosły, tworząc kule. Kule te zostały następnie poddane dysocjacji enzymatycznej, a GCSC można uzyskać przez cytofluorometryczne sortowanie populacji komórek wybarwionych markerami CD44/CD54. Szczegółowy protokół i testy funkcjonalne GCSC zostały zgłoszone7.
	<ol>
		<li>Wstępnie podgrzane GCSC wypełniają pożywkę hodowlaną w temperaturze 37 °C nie dłużej niż 30 minut.</li>
		<li>Rozmrozić GCSC z magazynu ciekłego azotu i szybko rozmrozić kriowiale w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszaj fiolki, aż cała zawartość całkowicie się rozpuści. 
		UWAGA: Zamrożone komórki rozmrozić szybko (<1 min) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przenieść całą zawartość kriowiów do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej GCSC. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie odessać supernatant i zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej kompletnej pożywki GCSC. Zawiesinę komórek umieścić na płytce Petriego o średnicy 100 mm. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i dodać 5 ml świeżej, kompletnej pożywki trzeciego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Subkultura guzów GCSCs 
	UWAGA: GCSC w centrum guza mają wystarczającą ilość składników odżywczych tylko przed rozmiarem kulek dorastających do 80-100 μm średnicy. Po pojawieniu się ciemnych i nisko załamujących się sfer (około 6 dni hodowli) konieczne jest subkulturowanie guzów.
	<ol>
		<li>Delikatnie wstrząśnij naczyniem i przenieś pożywkę do hodowli guzów GCSC (pożywkę i nieprzylegające guzy) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. W przypadku większych, średnich objętości mogą być potrzebne większe probówki wirówkowe.</li>
		<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant. Po odwirowaniu widoczne będą białawe osady.</li>
		<li>Dodać 2 ml roztworu do dysocjacji komórek, aby ponownie zawiesić osad do dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej w temperaturze 37 °C. Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy co 2-3 minuty w procedurze trawienia, aby rozbić kulki, aż guzy zostaną rozproszone w zawiesinę jednokomórkową. Zaleca się, aby ten całkowity proces dysocjacji był krótszy niż 15 min. 
		UWAGA: Wykonaj kontrolę wzrokową pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie pozostały żadne duże kule ani agregaty komórek.</li>
		<li>Dodać 10 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki GCSC (5 razy więcej niż objętość roztworu oddzielającego komórki), aby zakończyć procedurę trawienia i odwirować przy 800 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej GCSC. Umieścić odpowiednią liczbę komórek na nowej szalce Petriego o średnicy 100 mm z 10 ml świeżej, wstępnie ogrzanej pożywki hodowlanej GCSC i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Po 3 dniach należy ponownie nakarmić kultury nowotworów, dodając 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki. Po 6 dniach pasażują komórki, gdy guzy dorastają do 80-100 μm średnicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwacja GCSC 
	UWAGA: Nie należy kriokonserwować komórek GCSC poprzez bezpośrednie dodawanie pożywki do guzów. Guzosfery GCSC powinny być trawione do pojedynczych komórek, aby środek ochronny mógł dostać się do każdej komórki, aby zapewnić długotrwałe stabilne przechowywanie komórek. Upewnij się, że komórki są w dobrym stanie i nie są zanieczyszczone.
	<ol>
		<li>Zbierz guzy GCSCs. Wirować przy 600 x g przez 5 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i dodać 2 ml roztworu dysocjacji komórek w celu dysocjacji guzów GCSC w temperaturze 37 °C. Zakończyć procedurę trawienia przez dodanie 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej GCSC.</li>
		<li>Wirować przy 800 x g przez 5 minut i zbierać pojedyncze GCSC.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić GCSC za pomocą kriokonserwantu bez surowicy. Zalecane stężenie końcowe to 5 x 105 - 5 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dozować zawiesinę komórkową w podwielokrotnościach o objętości 1 ml do oznaczonych fiolek kriogenicznych.</li>
		<li>Natychmiast umieścić kriowiale zawierające komórki w komorze izopropanolowej i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Następnego dnia przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generowanie indukowalnych linii GCSC knockdown
UWAGA: Rekombinowane lentiwirusy zostały oznaczone jako organizmy poziomu 2 przez Narodowy Instytut Zdrowia i Centrum Kontroli Chorób. Prace związane z lentiwirusem wymagają utrzymania zakładu o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, biorąc pod uwagę, że supernatanty wirusowe wytwarzane przez te systemy lentiwirusowe mogą zawierać potencjalnie niebezpieczny rekombinowany wirus.
<ol>
	<li>Wytwarzanie cząstek lentiwirusa
	<ol>
		<li>Zsyntetyzuj 2 wektory lentiwirusowe przenoszące indukowalne shRNA ukierunkowane na ludzką klasterynę i niecelujący kontrolny wektor lentiwirusowy (GV307) z GeneChem w oparciu o projekt tabeli 1 (wektor GV307 zawiera: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycyna).</li>
		<li>Wysiew 4 x 106 komórek pakujących wirusa lenti-293T na 100 mm szalki Petriego z 10 ml DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą.</li>
		<li>Inkubować komórki 293T przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Upewnij się, że gęstość komórek 293T wynosi około 50-80% zlewania w dniu transfekcji.</li>
		<li>Doprowadzić zredukowaną pożywkę surowicy do temperatury pokojowej i przygotować probówkę A i probówkę B zgodnie z opisem w Tabeli 2.</li>
		<li>Przenieś probówkę A do probówki B, dobrze wymieszaj i inkubuj kompleksy przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu przygotowania kompleksów lipidowo-DNA.</li>
		<li>Usuń 5 ml pożywki przed dodaniem kompleksu lipid-DNA, pozostawiając w sumie 5 ml.</li>
		<li>Kroplami dodać 5 ml kompleksu lipid-DNA do szalki hodowlanej i delikatnie zawirować szalkę, aby rozprowadzić kompleks. 
		UWAGA: Ostrożnie dozuj płyn do ścianki naczynia, aby nie przeszkadzać komórkom 293T.</li>
		<li>Inkubować naczynie hodowlane przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Po 24 godzinach od transfekcji ostrożnie usuń pożywkę do transfekcji i delikatnie zastąp ją 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
		UWAGA: Cały supernatant i końcówki należy przed usunięciem potraktować 10% wybielaczem.</li>
		<li>Około 48 godzin po transfekcji zebrać 10 ml supernatantów zawierających lentiwirusa. 
		UWAGA: Wszystkie naczynia i końcówki kultur komórkowych należy przed usunięciem potraktować 10% wybielaczem.</li>
		<li>Przefiltruj supernatant lentiwirusa za pomocą filtra porowego 0,45 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. 
		UWAGA: Wszystkie filtry i strzykawki należy przed wyrzuceniem potraktować 10% wybielaczem.</li>
		<li>Przenieść oczyszczony supernatant do sterylnego pojemnika, dodać koncentrator Lenti-X (1/3 objętości oczyszczonego supernatantu) do wymieszania przez delikatne odwrócenie.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 1 500 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu i białawy osad będzie widoczny. Ostrożnie usunąć sklarowany sklarant, uważając, aby nie naruszyć osadu. 
		UWAGA: Cały supernatant i końcówki należy przed usunięciem potraktować 10% wybielaczem.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić osad w 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS jako zapas wirusa, przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie stabilnych transfekowanych linii komórkowych
	<ol>
		<li>Wysiewaj 6 x 106 GCSC na 100 mm szalkę Petriego z 10 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (70-80% konfluencji przed infekcją).</li>
		<li>Odessać pożywkę w naczyniu, dodać do naczynia skoncentrowane cząstki lentiwirusa rozcieńczone 4 ml kompletnej pożywki DMEM zawierającej odczynnik polibrenowy (5 μg/ml). Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
		UWAGA: Optymalne stężenie polibrenu zależy od typu ogniwa i może wymagać przetestowania w różnych stężeniach, aby określić skuteczne stężenia. W przeciwnym razie można ją określić empirycznie, zwykle w zakresie 2-10 μg/ml. Wszystkie tubki i końcówki należy przed wyrzuceniem potraktować 10% wybielaczem.</li>
		<li>Zmienić pożywkę, zastąpić 10 ml DMEM 10% pożywką FBS i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
		UWAGA: Całe podłoże i końcówki należy przed wyrzuceniem potraktować 10% wybielaczem.</li>
		<li>Odessać supernatant ze szczątkami komórkowymi, zastąpić świeżym DMEM uzupełnionym 10% pożywką FBS zawierającą puromycynę (2,5 μg/ml) i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Następnie zastąp świeży DMEM uzupełniony 10% pożywką FBS zawierającą puromycynę (5 μg/ml) i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez dodatkowe 24 godziny.</li>
		<li>Przepłucz przylegające GCSC dwukrotnie 5 ml DPBS bez wapnia i magnezu.</li>
		<li>Dysocjować GCSC za pomocą 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu do dysocjacji komórek i inkubować 2-3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki GCSC do zawiesiny komórkowej.</li>
		<li>Dozować 3 ml do 15 ml probówki odśrodkowej (probówka A) w celu kriokonserwacji komórek, a pozostałe 3 ml do 15 ml probówki odśrodkowej (probówka B) w celu indukcji przez doksycyklinę.</li>
		<li>Odwirować probówkę A i probówkę B o masie 800 x g przez 5 min.</li>
		<li>Zawiesić osad z probówki A z 1 ml niezawierającego surowicy pożywki kriokonserwującej, przenieść fiolkę do temperatury -80 °C na noc i przenieść ją do ciekłego azotu.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki probówki B w 1 ml świeżej, wstępnie ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej GCSC. Wysiać odpowiednią liczbę komórek na nową, 100 mm szalkę Petriego zawierającą 10 ml świeżej, wstępnie ogrzanej pożywki GCSC z doksycykliną (Dox) (2,5 μg/ml) i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
		UWAGA: Optymalne stężenie Dox może się różnić w zależności od linii komórkowych. Każda linia komórkowa powinna być badana w różnych stężeniach Dox, aby zdecydować o skutecznych stężeniach KD i toksyczności dla komórek.</li>
		<li>Potwierdź stabilną represję klastryny w GCSC przez western blot.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test formowania kuli
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone, indukowane linie GCSC (patrz krok 1.2).</li>
	<li>Określ żywotną gęstość komórek w próbce o objętości 10 μl za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Dostosuj objętość za pomocą wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej GCSC, aby uzyskać stężenie 2 x 104 żywotnych komórek/ml.</li>
	<li>Dozuj do 3 nowych 96-dołkowych dołków na płytki hodowlane o bardzo niskim stopniu przylegania (0,1 ml / dołek) w każdej grupie.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Formowanie się kuli powinno nastąpić w ciągu 3-10 dni. Monitoruj i rejestruj wizualizację powstawania guzów co 2 dni. 
	UWAGA: Nie zaleca się wymiany pożywki w przypadku jakichkolwiek zaburzeń tworzenia się guzów. Guzy te powinny być łatwe do odróżnienia od komórek pojedynczych i zagregowanych.</li>
	<li>Określ wyniki tworzenia guza, oceniając rozmiary uformowanych guzów za pomocą oprogramowania do obrazowania.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).</li>
<li>Valent, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+definitions+and+terminology%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).</li>
<li>Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cancer+stem+cell+targeting%3A+How+to+strike+the+evil+at+its+root%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).</li>
<li>Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cancer+Stemness+in+the+Clinic%3A+From+Hype+to+Hope%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope.</a> Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).</li>
<li>Takaishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+gastric+cancer+stem+cells+using+the+cell+surface+marker+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44.</a> Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+cancer+stem+cells+in+tumor+tissues+and+peripheral+blood+derived+from+gastric+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients.</a> Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3A+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Hannon, G. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+the+human+genome+with+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of the human genome with RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).</li>
<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+gene+knockdown+in+mice+using+a+tight%2C+inducible+shRNA+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system.</a> Nucleic Acids Research. 35 (7), e54(2007).</li>
<li>Xiong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verteporfin+blocks+Clusterin+which+is+required+for+survival+of+gastric+cancer+stem+cell+by+modulating+HSP90+function%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).</li>
<li>Ohkawa, J., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+functional+activity+of+an+antisense+RNA+by+a+tetracycline-responsive+derivative+of+the+human+U6+snRNA+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter.</a> Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

GC jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie. GCSC mają kluczowe znaczenie w nawrocie raka żołądka, przerzutach i oporności na leki. Wykorzystanie GCSC od pacjentów z rakiem żołądka pozwoli nam zbadać ich słaby punkt i opracować leki celowane do leczenia pacjentów z GC.
Test tworzenia kuli jest przydatną metodą do badania potencjału samoodnawiania się nowotworowych komórek macierzystych in vitro. Wyniki można przedstawić jako procent utworzonych kulek podzielony ...

Rak żołądka (GC) jest jednym z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych rodzajów nowotworów1. Pomimo postępów w chirurgii skojarzonej, chemioterapii i radioterapii w terapii GC, rokowanie pozostaje złe, a pięcioletni wskaźnik przeżycia jest nadal bardzo niski2. Nawrót i przerzuty są głównymi przyczynami zgonów po leczeniu.
Rakowe komórki macierzyste (CSC) to podzbiór komórek nowotworowych, które posiadają zdolność do samoodnawiania się i generowania różnych linii komórkowych, które rekonstytuują nowotwór3. Uważa się, że CSC są odpowiedzialne za nawroty raka i przerzuty ze względu na ich zdolność do samoodnawiania się i wysiewania nowych nowotworów, a także ich odporność na tradycyjne chemo- i radioterapie4. W związku z tym ukierunkowanie na CSC i eliminacja CSC stanowią ekscytujący potencjał w zakresie poprawy leczenia i zmniejszenia śmiertelności pacjentów onkologicznych.
CSC zostały wyizolowane z wielu typów guzów litych5. W 2009 roku komórki macierzyste raka żołądka (GCSC) wyizolowane z linii komórkowych ludzkiego raka żołądka zostały pierwotnie opisane przez Takaishi et al.6. Chen i jego koledzy najpierw zidentyfikowali i oczyścili GCSC z tkanek nowotworowych ludzkiego gruczolakoraka żołądka (GAC)7. Odkrycia te nie tylko dają możliwość zbadania biologii GCSCs, ale mają również ogromne znaczenie kliniczne.
Szczególną cechą CSC jest ich zdolność do tworzenia sfery8. Pojedyncze komórki są siane w nieprzylegających warunkach o niskiej gęstości i tylko komórki posiadające zdolność do samoodnawiania się mogą wyrosnąć w stałe, kuliste skupisko zwane kulą. W związku z tym test tworzenia się kuli został uznany za złoty standard testu i jest szeroko stosowany do oceny potencjału samoodnawiania się komórek macierzystych in vitro.
Interferencja RNA (RNAi) to potężne narzędzie badawcze do badania funkcji genów poprzez knockdown określonego genu9. Jednak technologie długotrwałego stabilnego knockdownu genów mają pewne ograniczenia, takie jak wyzwanie związane z badaniem funkcji genu, który jest niezbędny do przetrwania komórki. Warunkowe systemy RNAi mogą być przydatne do obniżania poziomu pożądanych genów w sposób czasowy i/lub specjalnie kontrolowany przez podanie czynnika indukującego. Układy indukowane tetracykliną (Tet) są jednym z najczęściej używanych warunkowych systemów RNAi10. Systemy indukowane Tet mogą indukować wyciszanie genów docelowych poprzez kontrolowanie ekspresji shRNA po dodaniu induktora egzogennego (preferencyjnie doksycykliny, Dox). Systemy indukowane przez Tet można podzielić na dwa typy: systemy Tet-On lub Tet-Off. Ekspresja shRNA może być włączona (Tet-On) lub wyłączona (Tet-Off) w obecności induktora. W układzie Tet-ON bez induktora, konstytutywnie wyrażany represor Tet (TetR) wiąże się z sekwencją elementu reagującego na Tet (TRE) zawierającą reagujący na Tet zależny od Pol III promotor ekspresji shRNA, hamując w ten sposób ekspresję shRNA. Podczas gdy po dodaniu Dox, TetR jest odizolowany od reagującego na Tet promotora zależnego od Pol III. Ułatwia to ekspresję shRNA i prowadzi do knockdownu genu.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje funkcjonalny system shRNA indukowany tetracykliną oraz dostosowany test tworzenia sfery do badania funkcji klastryny w GCSC pochodzących od pacjentów. Kasteryna została zidentyfikowana jako nowa kluczowa cząsteczka dla utrzymania macierzystki i przeżywalności GCSC w poprzednim badaniu11. Używamy opisanego protokołu do badania wpływu klastryny na samoodnawianie GCSC. Metodologia ta ma również zastosowanie do innych typów nowotworowych komórek macierzystych.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>1-tioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>2068586</td><td></td></tr><tr><td>Bezzwierzęcy rekombinowany ludzki suplement</td><td>EGF Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (50X), bez surowicy</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Płytka wielodołkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3474</td><td></td></tr><tr><td>Countess Szkiełka komory do liczenia komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Wysoki poziom glukozy, GlutaMAX, Pirogronian</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10569044</tr><tr><td>Hyklanów doksycykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, Australia</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, Transferyna, Roztwór Selenu (ITS -G), 100X</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>41400045</tr><tr><td>wektor lentiwirusowy</td><td>GeneChem</td><td>GV307</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Lenti-X</td><td>Takara</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych MEM, 100X</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0,45 i mikro; m, PVDF, 33 mm, sterylizowane promieniami gamma</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Ogólne rurki kriogeniczne do długoterminowego przechowywania</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórek Nunc/szalki Petriego</td><td>Thermo Scientific 171099</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, płyn</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pHelper 1.0 (składnik gag/pol)</td><td>GeneChem</td><td>pHelper 1.0</td><td></td></tr><tr><td>pHelper 2.0 (komponent VSVG)</td><td>GeneChem</td><td>pHelper 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>STEM-CELLBANKER Pożywka do kriokonserwacji</td><td>ZENOAQ</td><td>11890</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Roztwór do dysocjacji komórek</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1 M Bufor Tris-HCI, pH 7,5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony ZEISS</td><td>Axio</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr></tbody></table>

połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Nowotworowe komórki macierzyste (CSC) są zaangażowane w inicjację, rozwój i nawrót nowotworu po leczeniu i stały się przedmiotem zainteresowania wielu badań w ostatnich dziesięcioleciach. Dlatego ważne jest opracowanie metod badania roli kluczowych genów zaangażowanych w macierzystość komórek nowotworowych. Rak żołądka (GC) jest jednym z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych rodzajów nowotworów. Uważa się, że komórki macierzyste raka żołądka (GCSC) są przyczyną nawrotu raka żołądka, przerzutów i oporności na leki. Zrozumienie biologii GCSC jest konieczne, aby przyspieszyć rozwój terapii celowanych i ostatecznie zmniejszyć śmiertelność wśród pacjentów. W tym protokole przedstawiamy projekt eksperymentalny wykorzystujący system warunkowego knockdown i dostosowany test tworzenia kuli w celu zbadania wpływu klastryny na macierzystość GCSC pochodzących od pacjenta. Protokół można łatwo dostosować do badania zarówno in vitro, jak i in vivo funkcji genów związanych z macierzystą naturą w różnych typach CSC.

Macierzyste komórki raka żołądka pobrane z pierwotnego gruczolakoraka żołądka człowieka hodowano w bezsurowiczej pożywce hodowlanej. Po 6 dniach komórki przekształciły się z pojedynczego fenotypu przypominającego pojedynczą komórkę (Rysunek 1A) w duże sferoidy (Rysunek 1B).
Aby ocenić funkcję klasteryny w GCSCs, sekwencje shRNA przeciwk...

W tym protokole prezentujemy eksperymentalny projekt wykorzystujący system warunkowego knockdown i dostosowany test tworzenia kuli w celu zbadania wpływu klastryny na macierzystość GCSC pochodzących od pacjenta. Protokół można łatwo dostosować do badania zarówno in vitro, jak i in vivo funkcji genów związanych z macierzystą naturą w różnych typach CSC.

Połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Nowotworowe komórki macierzyste są zaangażowane w nawroty raka z przerzutami oporności na leki. Protokół ten zapewnia skuteczną metodę badania funkcji kluczowych genów w nowotworowych komórkach macierzystych. Wykorzystując system warunkowego knockdown i dostosowany test tworzenia kuli, metodę tę można łatwo dostosować do badania funkcji in vitro i in vivo dotyczących genów związanych z macierzystością w różnych typach nowotworowych komórek macierzystych.Procedurę zademonstrują Yuting Li i Xiangyu Tan, asystenci naukowi z mojego laboratorium. Aby wygenerować cząsteczki lentiwirusa, umieść cztery miliony komórek pakujących lentiwirusa 293T na 100-milimetrowej szalce Petriego z 10 mililitrami DMEM uzupełnionymi 10% FBS. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, upewniając się, że komórki są zlewające się w 50 do 80% w dniu transfekcji.Doprowadzić zredukowaną pożywkę surowicy do temperatury pokojowej i przygotować probówki A i B zgodnie z instrukcjami manuskryptu. Dodać zawartość probówki A do probówki B. Dobrze wymieszać i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu przygotowania kompleksów lipidowo-DNA. Usuń pięć mililitrów pożywki z naczynia do hodowli komórkowych.Następnie dodaj pięć mililitrów kompleksu lipidowo-DNA do naczynia do hodowli komórkowej, kroplami i delikatnie zamieszaj naczynie. Inkubuj szalkę hodowlaną przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji ostrożnie usuń pożywkę transfekcyjną i zastąp ją 10 mililitrami wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS.Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. Około 48 godzin po transfekcji zbierz 10 mililitrów supernatantów zawierających lentiwirusa i przefiltruj je filtrem o średnicy 0,45 mikrometra, aby usunąć resztki komórkowe. Wszystkie naczynia do hodowli komórkowych, końcówki, filtry i strzykawki mogą zawierać lentiwirusa i przed usunięciem należy je potraktować 10% wybielaczem.Przenieść oczyszczony supernatant do sterylnego pojemnika. Dodaj koncentrator Lenti-X i wymieszaj z delikatną inwersją. Inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia odwirować próbkę w temperaturze 1500 razy G przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie. Delikatnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze DMEM uzupełnionym 10% FBS i przechowywać go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Wysiewaj 6 milionów komórek macierzystych raka żołądka lub GCSC na 100-milimetrowej szalce Petriego z 10 mililitrami DMEM uzupełnionymi 10% FBS. Hoduj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, odessać pożywkę z naczynia i dodać skoncentrowane cząstki lentiwirusa rozcieńczone czterema milimetrami kompletnej pożywki DMEM, zawierającej odczynnik Polybrene.Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 18 godzin. Polibren powinien być testowany w różnych warunkach, aby określić skuteczne stężenie, które zwykle mieści się w zakresie od dwóch do 10 miligramów na mililitr. Po 18 godzinach zastąp pożywkę 10 mililitrami DMEM z 10% FBS i włóż komórki z powrotem do inkubatora na 24 godziny.Następnie odessać supernatant z resztkami komórek i dodać świeży DMEM uzupełniony 10% FBS i 2,5 mikrograma na mililitr Puromycyny. Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. Następnie ponownie zmień pożywkę na świeży DMEM uzupełniony 10% FBS i pięcioma mikrogramami na mililitr Puromycyny.Po kolejnej 24-godzinnej inkubacji przepłukać przylegające GCSC dwukrotnie pięcioma mililitrami DPBS bez wapnia i magnezu. Odciąć komórki za pomocą jednego mililitra wstępnie podgrzanego roztworu do dysocjacji komórek i inkubować je przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj pięć mililitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki GCSC complete culture do zawiesiny komórek.Dozować trzy mililitry tej zawiesiny do 15-mililitrowej probówki wirówkowej w celu kriokonserwacji, a pozostałe trzy mililitry do innej probówki w celu indukcji doksycykliną. Odwirować obie probówki w temperaturze 800 razy G przez pięć minut. Następnie odessać supernatant z probówki B i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej, wstępnie ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej GCSC.Umieść odpowiednią liczbę komórek na nowej 100-milimetrowej szalce Petriego z 10 mililitrami świeżej, wstępnie ogrzanej pożywki GCSC complete culture i 2,5 mikrograma na mililitr doksycykliny. Następnie inkubuj naczynie przez 48 godzin. Użyj automatycznego licznika komórek, aby określić gęstość próbki komórek o pojemności 10 mikrolitrów.Następnie dostosuj objętość za pomocą wstępnie ogrzanej kompletnej pożywki hodowlanej GCSC, aby uzyskać stężenie 20 000 żywych komórek na mililitr. Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki nowej, 96-dołkowej płytki hodowlanej o bardzo niskim nasadce. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Formowanie się kuli powinno nastąpić w ciągu trzech do 10 dni. Wyobraź sobie tworzenie się kuli guza co dwa dni. Komórki macierzyste raka żołądka z pierwotnego gruczolakoraka żołądka u ludzi hodowano w pożywce hodowlanej wolnej od surowicy.Po sześciu dniach komórki rozszerzyły się z fenotypu jednokomórkowego do dużych kul. Aby ocenić funkcję klastryny w GCSC, krótkie sekwencje RNA spinki do włosów przeciwko klastrinowi sklonowano do wektora Tet-GV307-RFP-Puro. Komórki transfekowane wektorem ekspresyjnym traktowano doksycykliną przez 48 godzin.Następnie ekspresję klastryny zweryfikowano za pomocą Western blot i określono ilościowo za pomocą densytometrii. Obecność doksycykliny i knockdown klastryny w GCSC hamowała tworzenie się sfery nowotworowej. Chociaż nie zaobserwowano zahamowania tworzenia sfery nowotworowej w komórkach transdukowanych zaszyfrowanymi kontrolami shRNA, co wskazuje, że sama doksycyklina nie hamuje tworzenia się sfery nowotworowej.Wyniki te sugerują, że po wyciszeniu klastrów GCSC rosną powoli i nie mogą tworzyć kulek guza. Na podstawie tych danych klasteryna odgrywa kluczową rolę w promowaniu aktywności samoodnawiania się GCSC, co wskazuje, że może być obiecującym celem leku do tłumienia nowotworowych komórek macierzystych u pacjentów z rakiem żołądka. Kule guza powinny być stałymi okrągłymi strukturami na pojedynczych lub zagregowanych komórkach, nie powinny być uważane za kule nowotworowe.Jednak niektóre nowotworowe komórki macierzyste mogą nie tworzyć typowych struktur sfery nowotworowej. Procedura ta może być stosowana z innymi metodami badania rakowych komórek macierzystych pod kątem potencjału odnawialnego in vitro. Na przykład można badać ekspresję markerów związanych z łodygą.Protokół może zostać rozszerzony w celu zbadania funkcji krytycznych genów w nowotworowych komórkach macierzystych, takich jak zdolność macierzysta do przeżycia.

combined-conditional-knockdown-adapted-sphere-formation-assay-to

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Ten film demonstruje protokół rozwoju sferoidów komórek macierzystych raka trzustki in vitro. Test może służyć jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które potencjalnie celują w rakowe komórki macierzyste.

Test tworzenia kuli: metoda in vitro do identyfikacji komórek macierzystych raka trzustki i terapii przesiewowych

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom.  Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Komórki macierzyste raka trzustki (CSC) mogą być namnażane in vitro za pomocą techniki hodowli sferycznej niezależnej od zakotwiczenia, która stanowi potężne narzędzie do badania biologii CSC i może służyć jako pierwszy krok do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na CSC. W tym miejscu przedstawiono metodologię rozszerzania, analizowania i celowania w CSC trzustki.

Badanie charakterystyki komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Prezentowany tutaj jest protokół do odkrycia nadekspresji genów napędzających, które utrzymują ustalone rakopodobne komórki macierzyste pochodzące z komórek HT29 jelita grubego. Przeprowadzono sekwencję RNAseq z dostępnymi danymi bioinformatycznymi w celu zbadania i zbadania sieci ekspresji genów w celu wyjaśnienia potencjalnego mechanizmu związanego z przetrwaniem docelowych komórek nowotworowych.

Odkrycie genów sterujących w guzach przypominających łodygi raka jelita grubego pochodzących z HT29

Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.

Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown

Poznaj metodę warunkowego knockdownu i testu tworzenia kul do badania komórek macierzystych raka żołądka. Ta technika pozwala analizować geny związane ze zdolnością do samoodnawiania nowotworów.

Połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta (Wideo) | JoVE Journal

Połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta

Przeglądaj więcej filmów