Name: Wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3D w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Chromagnon (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Naucz się korekcji przesunięć chromatycznych w mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem oprogramowania Chromagnon i komórek HeLa. Ta metoda poprawia dokładność analizy kolokalizacji w obrazowaniu biologicznym o wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez JSPS KAKENHI Granty Numery JP19H03202 do A.M., JP18H05528 i JP17H03636 do T.H., oraz JP17H01444 i JP18H05533 do H.Y. L.S. dziękuje za wsparcie ze strony Welcome Trust Strategic Awards 091911 oraz 107457/Z/15/Z finansujące zaawansowane obrazowanie w Micron Oxford.

<ol><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li>
<li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583(2018).</li>
<li>Grünwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+%CE%B2-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-Field+Optical+Nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li>
<li>Müller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Scanning+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101(1981).</li>
<li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li>
<li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerin%2C+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy%2C+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li>
<li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li>
<li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Procedura korekcji chromatycznej stanowi kompromis między dokładnością a nakładem pracy. Aby uniknąć zbędnego wysiłku, warto wcześniej określić, jaka dokładność jest wymagana dla danego badania. W przypadku konwencjonalnego obrazowania szerokopolowego (na żywo) najwyższa dokładność może nie być konieczna, dlatego obrazy referencyjne w jasnym polu są często wystarczające do skorygowania przesunięcia chromatycznego. Podobnie, gdy warunki obrazowania i środowisko pozostają stałe, powtarzalne stosowanie kalibracji biologicznej pozwoli zaoszczędzić czas. Z drugiej strony, jeśli pożądana jest wysokodokładna rejestracja, niezbędne są wysokiej jakości obrazy referencyjne kalibracji biologicznej lub przesłuchów (crosstalk). Dla uzyskania najlepszych wyników obrazy referencyjne powinny być pozyskiwane w warunkach i w czasie jak najbliższych obrazom docelowym. Dopóki zarówno obrazy referencyjne, jak i docelowe są pozyskiwane za pomocą tej samej mikroskopii, wyższa rozdzielczość przestrzenna poprawi dokładność korekcji. Jeśli dla obu typów obrazów dostępna jest dekonwolucja, zastosowanie jej przed korekcją może zwiększyć dokładność procesu. Ponadto, dla osiągnięcia optymalnych wyników, w pliku referencyjnym i docelowym powinno zostać spełnione twierdzenie o próbkowaniu dla optycznej osi Z w celu precyzyjnej interpolacji podpikselowej (krok protokołu 2.1.3).
Brak korekcji przesunięcia chromatycznego prowadzi do błędnych wniosków. Co więcej, zastosowanie niewłaściwej kalibracji może nawet pogorszyć przesunięcia chromatyczne zamiast je skorygować, czego należy zatem unikać. Możliwe przyczyny błędów oraz ich typowe rozwiązania podsumowano w Tabeli 2. Aby zbadać przyczynę błędu, w pierwszej kolejności należy wizualnie sprawdzić, czy przesunięcie chromatyczne na obrazie referencyjnym zostało dokładnie skorygowane (krok protokołu 3.12). Większość błędów wynika z jakości obrazów referencyjnych i można je łatwo naprawić zgodnie z opisami w Tabeli 2. W odniesieniu do jakości obrazów referencyjnych należy zaznaczyć, że dokładność wyrównania globalnego spada, jeśli całe pole widzenia nie jest wypełnione próbką (Rysunek 7, Tabela 2). W porównaniu z dobrym przykładem pokazanym na Rysunku 7A, zły przykład na Rysunku 7B zawiera tylko trzy otoczki jądrowe w lewym górnym obszarze, a program Chromagnon nie zdołał wyrównać części tego obrazu. Dzieje się tak dlatego, że metoda wyrównania globalnego w Chromagnon dzieli pole widzenia na cztery obszary (Rysunek 7C), aby z wysoką dokładnością zmierzyć różnice w rotacji i powiększeniu3. Metoda ta, przy prawidłowym działaniu, jest o rząd wielkości dokładniejsza niż inne metody liniowe, takie jak transformacja log-polarna i metody simpleksowe3. Jeśli którykolwiek z czterech obszarów jest niedostępny, Chromagnon przełączy się na mniej skuteczne metody liniowe. Dlatego w celu uzyskania najlepszych wyników przykłady pokazane na Rysunku 7B i Rysunku 7C są niewskazane; wszystkie cztery obszary powinny być wypełnione obiektami. Użytkownicy mogą sprawdzić, czy którykolwiek z kwadratowych obszarów pola widzenia jest niedostępny do pomiaru, zaglądając do pliku dziennika („Chromagnon.log”; patrz krok protokołu 3.10). Na szczęście problem ten można łatwo rozwiązać poprzez uśrednianie wielu biologicznych obrazów kalibracyjnych lub stosowanie wyrównania lokalnego dla obrazów crosstalk lub obrazów referencyjnych w jasnym polu (Tabela 2). W przeciwieństwie do przypadku błędów w korekcji obrazów referencyjnych, błędy w korekcji obrazów docelowych są trudniejsze do zidentyfikowania. Ponieważ takie błędy wynikają z różnic w formatach plików, warunkach obrazowania, czasie obrazowania oraz metodach obrazowania/wyrównania pomiędzy obrazami referencyjnymi a docelowymi (Tabela 2), użytkownicy powinni zachować ostrożność podczas korzystania z obrazów referencyjnych uzyskanych w innych warunkach lub w innym czasie niż obrazy docelowe. Przykładowe obrazy do testów są dostępne pod adresem (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon</a>), co pozwala uzyskać konkretne wyobrażenie o prawidłowych i błędnych przykładach obrazów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Problem</td>
			<td>Przyczyna</td>
			<td>Rozwiązanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nie udało się poprawić obrazu referencyjnego</td>
			<td>Niski kontrast</td>
			<td>Jeśli to możliwe, uzyskaj obraz o wyższym kontraście. W przypadku zastosowania referencyjnego obrazu w jasnym polu, wykonaj ponowne obrazowanie w roztworze na bazie wody, aby uzyskać wyższy kontrast komórki. Alternatywnie można spróbować zastosować komputerową redukcję szumów (np. filtrowanie gaussowskie). Wyłącz wyrównywanie lokalne, które jest bardziej podatne na szumy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Zanieczyszczenie obrazami niepowiązanymi</td>
			<td>Jeśli to możliwe, usuń z próbki źródła obrazów niezwiązanych z badanym obiektem. W przypadku obrazów referencyjnych dla przesłuchów (crosstalk), sprawdź widma wzbudzenia barwników użytych do obrazowania celu. Jeśli barwniki te ulegają wzbudzeniu podczas akwizycji obrazu referencyjnego dla przesłuchów (np. Alexa Fluor 568 lub 594), rozważ zastosowanie innych barwników (np. Alexa Fluor 55). Jeśli zanieczyszczenia pyłem na matrycy kamery powodują wyraźne różnice między kanałami, wyczyść matrycę lub zastosuj komputerową metodę korekcji pola (flat-fielding).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Niezwykle jasny punkt powstały w wyniku działania promieniowania kosmicznego</td>
			<td>W razie możliwości należy ponownie pozyskać obraz. Alternatywnie można spróbować zastosować komputerową redukcję szumów (np. filtrowanie medianowe lub gaussowskie).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Artefakty dekonwolucji (sygnały sztuczne na krawędziach osiowych i bocznych)</td>
			<td>Usuń piksele krawędziowe lub sekcje Z po dekonwolucji. Jeśli przycięto jedną stronę, należy przyciąć również stronę przeciwległą, aby zachować centrum obrazu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Zbyt rzadki skok w osi Z</td>
			<td>Należy wykonać stos obrazów (Z-stack), aby spełnić kryterium Nyquista, zgodnie z opisem w protokole 2.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Aberracja optyczna</td>
			<td>Aberracja sferyczna jest główną aberracją powodowaną przez użytkowników. Należy dobrać odpowiedni obiektyw do próbki i zastosować szkiełko cover slip o grubości 170 µmJeśli obiektyw jest wyposażony w pierścień korekcyjny, należy go wyregulować, aby znaleźć pozycję, w której w punkcie ogniskowania uzyskuje się najwyższą liczbę sygnałów fluorescencyjnych. W przypadku obiektywu imersyjnego olejowego bez pierścienia korekcyjnego należy dobrać olej imersyjny o takim współczynniku załamania światła, który zwiększy liczbę sygnałów fluorescencyjnych w punkcie ogniskowania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pole widzenia jest niezapełnione (Ryc. 7)</td>
			<td>W przypadku obrazów referencyjnych do kalibracji biologicznej należy uśrednić wiele obrazów. W przypadku obrazów referencyjnych dla przesłuchów (crosstalk) lub pola jasnego należy zastosować lokalne dopasowanie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Niezidentyfikowany błąd oprogramowania</td>
			<td>Zgłoś problem za pośrednictwem GitHub (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nie udało się skorygować obrazu docelowego</td>
			<td>Metadane pliku obrazu zostały utracone</td>
			<td>Należy użyć oryginalnego formatu pliku z mikroskopu, który zawiera pełne metadane, i unikać konwersji do wielostronicowego pliku TIFF przed przetworzeniem. Należy zastosować tę samą kolejność kanałów, która została zapisana w protokole 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Błędne metody ustawiania dla danej mikroskopii</td>
			<td>Nie należy stosować metody wyrównania lokalnego podczas pomiarów z biologicznych obrazów referencyjnych do obrazów docelowych. Nie należy używać obrazów referencyjnych przesłuchów (crosstalk) innych niż pochodzące z mikroskopii szerokopolowej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Różnice w warunkach obrazowania</td>
			<td>Należy zachować stałe warunki obrazowania pomiędzy obrazami referencyjnymi a docelowymi, zgodnie z protokołem 2.3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Różnice w próbce (w tym w szkiełku nakrywce)</td>
			<td>Zawsze należy stosować to samo medium montażowe, szkiełko nakrywki (np. nr 1.5H) oraz podobną głębię ostrości.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dryf mikroskopu od czasu ostatniej kalibracji</td>
			<td>Przeprowadzaj kalibrację nie rzadziej niż co dwa tygodnie. Utrzymuj stałą temperaturę i korzystaj z stołu optycznego (pływającego), aby uniknąć dryfu sprzętowego mikroskopu.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Rozwiązywanie problemów z korekcją chromatyczną.
<img alt="Porównanie segmentacji komórek: wyniki poprawne, błędne i niepożądane w analizie obrazów mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7: Przykłady obrazów referencyjnych. Otoczka jądrowa w komórkach drożdży rozdzielających się, znakowana GFP i mCherry. Obrazy uzyskano za pomocą konwencjonalnej mikroskopii szerokopolowej. Przesunięcia chromatyczne skorygowano przy użyciu Kromagnon bez lokalnego dopasowania, wykorzystując same obrazy jako obrazy referencyjne. Następnie wykonano dekonwolucję obrazów w celu uwidocznienia szczegółów. (A) Dobry przykład z wieloma obiektami w polu widzenia. (B) Zły przykład z obiektami znajdującymi się tylko w lewym górnym rogu. Przesunięcie jest wyraźne w określonym obszarze obrazu. (C) Niepożądany przykład, w którym jedna z ćwiartkek (oddzielona kropkowanymi liniami krzyża) jest pusta. Pasek skali w panelu A wskazuje 5 µm dla pełnego widoku pola i 1.25 µm dotyczy powiększonego widoku i ma zastosowanie do wszystkich paneli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W niniejszym protokole opisano trzy różne typy referencyjne (Tabela 1). Wśród nich obrazy referencyjne przesłuchów (crosstalk) oraz obrazy referencyjne kalibracji biologicznej wymagają dalszej szczegółowej dyskusji. W przypadku obrazów referencyjnych przesłuchów, próbki barwione DAPI lub Hoechst 3342 i zamontowane w glicerolu lub komercyjnych mediach montażowych mogą być efektywnie wykorzystane do wyrównania kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego. Podobnie, Alexa Fluor 48 może być użyty do wyrównania kanałów zielonego i czerwonego. Jednakże uzyskanie fluorescencji przesłuchów jest często trudne, ponieważ wiele barwników niebieskich, z wyjątkiem DAPI i Hoechst, jest słabszych i szybciej ulega degradacji niż większość barwników zielonych i czerwonych. Ponadto widma emisji nowoczesnych barwników są węższe, co utrudnia wyrównanie więcej niż trzech kanałów tą metodą. Należy również zwrócić uwagę na niektóre powszechne barwniki czerwone (np. Alexa Flour 568 i 594, ale nie Alexa Fluor 5), które mogą być wzbudzane światłem fioletowym, co uniemożliwia uzyskanie wysokokontrastowych obrazów przesłuchów z barwników niebieskich. Koleją wadą jest to, że metoda ta nie pozwala na pomiar aberracji chromatycznej ścieżek światła wzbudzenia w przypadku wzbudzenia wielokolorowego, ponieważ do wzbudzenia używana jest tylko jedna długość fali (Tabela 1). Ponieważ większość zaawansowanych mikroskopów wykorzystuje zmodyfikowaną optykę oświetlenia, zastosowanie tej metody jest ograniczone. Mimo to, jej wyższa dokładność korekcji jest wystarczająco korzystna, aby została opisana w tym protokole. Generalnie obraz przesłuchów powinien zostać wykonany po obrazie docelowym, aby zapobiec blaknięciu lub efektom fototoksycznym. W przypadku SMLM obserwowanego w trybie szerokopolowym, obraz referencyjny powinien zostać uzyskany przed obrazem docelowym, ponieważ barwniki fluorescencyjne mogą ulec blaknięciu podczas obrazowania.
Biologiczne obrazy referencyjne do kalibracji pozwalają użytkownikom na łatwe dopasowanie dowolnej liczby kanałów kosztem dodatkowego przygotowania próbek. Inną zaletą biologicznych obrazów referencyjnych do kalibracji jest możliwość „uśredniania” wielu referencji, co pomaga wypełnić wszystkie pola widzenia. Metoda ta może być obarczona błędami wynikającymi z różnic w warunkach obrazowania, jeśli próbka kalibracyjna jest przygotowana na innym szkiełku. Większość tych problemów można rozwiązać, przygotowując zarówno cele, jak i referencje na tym samym szkiełku przy użyciu komercyjnych lamidek z komorą (Tabela 1), przy zachowaniu stałych pozostałych warunków obrazowania, zgodnie z krokiem 2.3.3 protokołu. W takim przypadku można spodziewać się dokładności korekcji zbliżonej do tej uzyskanej przy użyciu obrazów referencyjnych dla przeplotów (crosstalk)3. Protokół wykorzystujący faloidynę, przedstawiony tutaj, jest jednym z najprostszych sposobów barwienia pojedynczej struktury komórkowej wieloma kolorami. Istnieje wiele możliwych scenariuszy przygotowania biologicznych próbek kalibracyjnych. W przypadku immunobarwienia próbkę można znakować jednym przeciwciałem pierwotnym, a następnie barwić przeciwciałami wtórnymi w wielu kolorach. W ten sposób pojedynczą strukturę docelową można znakować wieloma kolorami. Alternatywnie, 5-etynyl-2'-deoksyurydyna, wykrywana za pomocą chemii „klik”, znakuje nowo syntetyzowane DNA w wielu kolorach przy wysokiej gęstości, co zostało szczegółowo opisane wcześniej8. W przypadku żywych komórek użyteczne jest przygotowanie szczepu transgenicznego posiadającego dwie kopie genu połączone z GFP lub mCherry, aby znakować tę samą strukturę dwoma kolorami. Jeśli liczba kopii genu jest krytyczna, co często obserwuje się w przypadku białek błonowych, pojedynczą kopię genu można połączyć tandemowo z GFP i mCherry (Rysunek 7). Można również zastosować fotokonwertowalne białka fluorescencyjne, takie jak mEOS218, poprzez naświetlanie umiarkowanym natężeniem światła fioletowego w celu uzyskania obu form białka, z fotokonwersją lub bez niej. W warunkach niskiego poziomu tlenu GFP może być również stosowane jako białko fotokonwertowalne z koloru zielonego na czerwony19,20. Wybór odpowiedniej próbki kalibracyjnej sprawi zatem, że eksperyment będzie bardziej wiarygodny.

Obrazowanie wielokolorowe jest jednym z podstawowych aspektów biologicznej mikroskopii fluorescencyjnej, w przypadkach, gdy relacje przestrzenne różnych cząsteczek lub struktur są szczególnie interesujące. Aberracja chromatyczna, aberracja optyczna światła polichromatycznego spowodowana dyspersją, zmienia pozorne położenie kolorowych obiektów zainteresowania. Podobnie mikroskopy wyposażone w wiele kamer poświęconych rejestrowaniu każdego koloru mają bardziej złożone przesunięcia chromatyczne spowodowane różnicami w elementach optycznych i niedoskonałym wyrównaniem kanałów. W związku z tym takie przesunięcia chromatyczne mogą prowadzić do błędnych wniosków, chyba że zostaną wyraźnie skorygowane przez użytkownika. Chociaż przesunięcia chromatyczne nie stanowią większego problemu, dopóki rozdzielczość mikroskopii jest ograniczona przez klasyczny limit rozdzielczości, niedawny rozwój mikroskopii superrozdzielczej1 spowodował potrzebę dokładniejszej korekcji przesunięć chromatycznych.
Powszechną praktyką jest mierzenie przesunięć chromatycznych systemów mikroskopowych za pomocą wielokolorowego szkiełka do kalibracji koralików2. Metoda kalibracji opartej na koralikach jest odpowiednia do pomiaru przesunięć chromatycznych od całej optyki mikroskopu w kierunku powierzchni szkiełka nakrywkowego2. Metoda ta nie jest jednak w stanie zmierzyć przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych będących przedmiotem zainteresowania. Należy zauważyć, że wiele próbek biologicznych jest trójwymiarowych (3D), a przesunięcia chromatyczne takich próbek różnią się od tych na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Co więcej, przesunięcia chromatyczne zmieniają się wraz z warunkami obrazowania2,3. Zmierzyliśmy przesunięcia chromatyczne w próbkach biologicznych 3D i stwierdziliśmy, że niepewność przesunięć chromatycznych wynosiła często nawet 350 nm przy użyciu klasycznej metody kalibracji wielokolorowych koralików3. W związku z tym przesunięcia chromatyczne muszą być mierzone w próbkach biologicznych na głębokości zainteresowania i w stosowanych warunkach obrazowania.
Tutaj opisujemy procedury pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych i korygowania tych przesunięć za pomocą naszego oprogramowania, Chromagnon3. Aby zmierzyć przesunięcia chromatyczne w próbkach biologicznych, nasza metoda wykorzystuje dwa rodzaje zestawów danych: obraz "docelowy" i obraz "referencyjny". Obraz "docelowy" to wielokolorowy obraz będący przedmiotem zainteresowania, na przykład obrazy barwione pod kątem DNA, otoczki jądrowej i mikrotubul. Często niemożliwe jest zmierzenie przesunięć chromatycznych na takim obrazie. W związku z tym potrzebujemy obrazu "referencyjnego", który jest dedykowany do pomiaru przesunięć chromatycznych w próbce. Jedyną definicją obrazu "referencyjnego" jest wielokolorowy obraz tego samego obiektu. W tym sensie wielokolorowy obraz koralików jest również rodzajem obrazu referencyjnego. W tym miejscu opisujemy trzy różne typy obrazów referencyjnych, które są używane do pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych: "obrazy referencyjne przesłuchów", "obrazy referencyjne jasnego pola" i "obrazy referencyjne kalibracji biologicznej". Rodzaj obrazu referencyjnego zależy od typu używanego mikroskopu lub wymaganej dokładności korekcji, jak podsumowano w tabeli 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Crosstalk</td>
			<td>Jasne pole</td>
			<td>Kalibracja biologiczna (na innym slajdzie)</td>
			<td>Kalibracja biologiczna (na tym samym szkiełku)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precyzjaa</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>prostota</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stosowana mikroskopia</td>
			<td>Szerokie pole widzenia</td>
			<td>Szerokie pole widzenia</td>
			<td>cały</td>
			<td>cały</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dostępność lokalnego wyrównania</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c</td>
			<td>-c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">a: Liczba znaków "+" oznacza rosnącą ocenę. Pojedynczy plus to około 50 nm, a trzy plus to około 15 nm w 3D. 
			b: Dokładność zależy od tego, jak bardzo zmienne warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie. 
			c: Kalibracja lokalna mierzona za pomocą próbek wielokolorowych ściegów może być łączona zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry przy wyborze typu obrazów referencyjnych.
"Crosstalk reference images" mają najwyższą dokładność korekcji i są stosunkowo proste do osiągnięcia3,4 (Tabela 1). Wadą jest ich ograniczenie w zastosowaniach mikroskopowych ze względu na niemożność pomiaru przesunięć chromatycznych w ścieżkach wzbudzenia. Ponadto, aby uzyskać takie obrazy, mikroskop powinien być wyposażony w wielopasmowe zwierciadła dichroiczne oraz filtry emisyjne, które są niezależnie sterowane od filtrów wzbudzenia lub źródeł światła. Odpowiednia mikroskopia obejmuje konwencjonalną mikroskopię szerokokątną, mikroskopię lokalizacyjną pojedynczych cząsteczek (SMLM), taką jak mikroskopia lokalizacyjna aktywowana światłem/stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna optyczna (PALM/STORM)5,6 i mikroskopia ekspansywna7 obserwowane za pomocą mikroskopii szerokokątnej. Obraz referencyjny przesłuchu jest uzyskiwany z samej próbki docelowej. Jest to obraz przesłuchu (przebijającego) fluorescencji barwnika uzyskany we wszystkich wymaganych kanałach. Emisja fluorescencji zawsze rozszerza się w kierunku dłuższych fal, dlatego barwniki o najkrótszej długości fali emisji są wzbudzane w celu uzyskania fluorescencji przesłuchu w kanałach o dłuższych falach. Na przykład, gdy próbka jest barwiona na niebiesko, zielono i czerwono, wzbudzany jest tylko niebieski barwnik, a światło emisyjne uzyskuje się w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym. W tym protokole DNA barwione 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI) wykorzystano w celu uzyskania fluorescencji przesłuchu.
"Obrazy referencyjne jasnego pola" są łatwiejszą i mniej fototoksyczną alternatywą dla "obrazów referencyjnych przesłuchów", ale są najmniej dokładne3 (Tabela 1). Są to obrazy jasnego pola próbki docelowej, uzyskane we wszystkich kanałach kolorów użytych na obrazie docelowym.
"Obrazy referencyjne kalibracji biologicznej" mają tę zaletę, że można je zastosować do każdego rodzaju mikroskopii, ze względu na ich zdolność do pomiaru przesunięć chromatycznych zarówno w ścieżce wzbudzenia, jak i emisji3,8 (Tabela 1). Odpowiednia mikroskopia obejmuje mikroskopię szerokokątną, mikroskopię konfokalną, mikroskopię arkuszy świetlnych, wymuszone zubożenie emisji (STED)9, mikroskopię oświetlenia strukturalnego (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM obserwowany w trybie całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), Olympus super resolution (OSR)13i tak dalej. Obraz referencyjny kalibracji biologicznej uzyskuje się z próbki kalibracyjnej podobnie przygotowanej jak próbka docelowa, ale z barwieniem pojedynczej struktury wieloma kolorami. Dokładność korekcji przewyższa rozdzielczość większości mikroskopii superrozdzielczych, a przygotowanie biologicznej próbki kalibracyjnej może być stosunkowo proste. Kolejną zaletą jest możliwość "uśrednienia" wielu obrazów referencyjnych. W związku z tym, nawet jeśli poszczególne obrazy zawierają słabe informacje do pomiaru przesunięć chromatycznych, zawartość informacji można zwiększyć, uśredniając wiele obrazów. Dokładność zależy od tego, jak bardzo warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie. Pod tym względem najlepszą wydajność uzyskuje się, gdy zarówno próbka docelowa, jak i próbka referencyjna znajdują się na tym samym szkiełku, przy użyciu np. 8-dołkowych szkieł nakrywkowych (tabela 1, skrajnie po prawej). W tym protokole aktyna barwiona trzema kolorami falloidyny została użyta jako kalibracja biologiczna.
Po uzyskaniu obrazu referencyjnego, przesunięcie chromatyczne jest mierzone i korygowane przez nasze oprogramowanie Chromagnon. Nie ma ograniczeń co do liczby kanałów, sekcji Z i ram czasowych, dla których Chromagnon może mierzyć i korygować przesunięcia chromatyczne. Chromagnon mierzy przesunięcia chromatyczne w dwóch etapach. Pierwszy krok polega na uzyskaniu parametrów wyrównania "globalnego" lub "afinicznego" translacji w osiach X, Y, Z, powiększenia wzdłuż osi X, Y, Z i obrotu wokół osi Z. Dokładność obliczeń globalnego wyrównania wynosi ~16 nm w 3D i ~8 nm w 2D. Drugim krokiem jest opcjonalne iteracyjne "lokalne wyrównanie" 2D na wyświetlanych obrazach w celu uzyskania większej dokładności. W procesie wyrównywania lokalnego obrazy są dzielone na wiele regionów i mierzone są przesunięcia chromatyczne w tych regionach lokalnych. Następnie regiony są dalej dzielone, a przesunięcia chromatyczne w podregionach są mierzone iteracyjnie, aż liczba pikseli w regionie osiągnie minimalną liczbę pikseli (zwykle 60 x 60 pikseli). Wynikowa lokalna mapa wyrównania jest łączona z globalnym parametrem wyrównania i jest stosowana do obrazu docelowego przez transformację sprężystą. Po tym kroku dokładność obliczeń poprawia się do ~14 nm w 3D i ~6 nm w 2D. Dopasowanie lokalne nie jest odpowiednie dla obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej, ponieważ struktura biologiczna w odniesieniu różni się od struktury w obiekcie docelowym (tabela 1). W związku z tym dla obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej używane jest tylko wyrównanie globalne.
Lokalne przesunięcia chromatyczne pochodzą z dwóch źródeł; instrumentalnego zniekształcenia lokalnego mikroskopu i biologicznej niejednorodności strukturalnej. Ponieważ zniekształcenia miejscowe instrumentalne mikroskopu są stałe, można je zmierzyć na podstawie próbki referencyjnej wielokolorowych kulek i skorygować jako stały parametr. Chromagnon może łączyć instrumentalną mapę lokalnych zniekształceń mikroskopowych z globalnymi parametrami wyrównania z kalibracji biologicznych (Tabela 1). Stosując tę metodę, oczekuje się, że średnia dokładność kalibracji biologicznej zostanie poprawiona o dodatkowe 1−2 nm.
Tutaj opisujemy protokół do korygowania przesunięć chromatycznych obrazów fluorescencyjnych 3D za pomocą naszego oprogramowania Chromagnon, od najłatwiejszego dołu do najwyższej dokładności. Jako przykład używamy barwienia immunologicznego komórek HeLa i obserwowaliśmy je za pomocą mikroskopii szerokokątnej 3D i 3D-SIM. W pierwszej części opisujemy, jak przygotować próbki docelowe i próbki do kalibracji biologicznej. Ta część protokołu powinna być zoptymalizowana pod kątem konkretnych celów badania. W drugiej części opisujemy metody pozyskiwania trzech rodzajów obrazów referencyjnych za pomocą mikroskopów. Założeniem było uzyskanie kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego, ale skład kanałów powinien być modyfikowany w zależności od konkretnych celów badań i ustawień mikroskopu. Nie ma znaczenia, czy mikroskop jest wyposażony w pojedynczą kamerę, czy w wiele kamer. W trzeciej części opisujemy, w jaki sposób można wykorzystać nasze oprogramowanie do pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych obrazu docelowego za pomocą obrazów referencyjnych. Wreszcie, w czwartej sekcji, opisujemy metodę uzupełniania obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej przy użyciu instrumentalnej kalibracji lokalnej mikroskopu.

<table><tbody><tr><td>16% roztwór formaldehydu</td><td>Polyscience</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynie ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 falloidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30104</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 falloidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 falloidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16170078</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Matsunami</td><td>No. 1S HT</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle z L-Gln i pirogronianem sodu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-16</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka montażowa (VECTASHIELD)</td> <td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne antytubulinowe (TAT1)</td><td></td><td></td><td>Opisane w ref 15.</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe komorowe Nunc Lab-Tek II (8 dołków)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne anty-emeryny królika (ED1)</td><td></td><td></td><td>Prezent od Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japonia i Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokio, Japonia; zmarły.</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21424</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Mikrosfery, 0,2 i mikro; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7280</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3d w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Ilościowa wielobarwna mikroskopia fluorescencyjna opiera się na starannym przestrzennym dopasowaniu kanałów kolorów uzyskanych na różnych długościach fal. Ze względu na aberrację chromatyczną i niedoskonałe wyrównanie kamer, obrazy uzyskane w każdym kanale mogą być przesuwane i powiększane, a także obracane względem siebie w dowolnym z trzech wymiarów. W przypadku klasycznej metody kalibracji przesunięcia chromatyczne są mierzone za pomocą wielokolorowych koralików przymocowanych do powierzchni szkiełka nakrywkowego, a dostępnych jest wiele programów do pomiaru przesunięć chromatycznych z takich próbek kalibracyjnych. Jednak aberracja chromatyczna może zmieniać się wraz z głębokością, zmieniać się w zależności od warunków obserwacji i być indukowana przez samą próbkę biologiczną, utrudniając w ten sposób określenie rzeczywistej wielkości przesunięcia chromatycznego w próbce będącej przedmiotem zainteresowania i w całej objętości. Korekcja przesunięć chromatycznych z większą dokładnością jest szczególnie istotna w przypadku mikroskopii superrozdzielczej, gdzie tylko niewielkie przesunięcia chromatyczne mogą wpływać na analizy ilościowe i zmieniać interpretację obrazów wielokolorowych. Opracowaliśmy oprogramowanie typu open source Chromagnon i towarzyszące mu metody pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych 3D w próbkach biologicznych. W tym miejscu udostępniamy szczegółowy protokół aplikacji, który zawiera specjalne wymagania dotyczące przygotowania próbki, akwizycji danych i przetwarzania oprogramowania w celu pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych będących przedmiotem zainteresowania.

Przykład korekcji przesunięcia chromatycznego z wykorzystaniem referencyjnego obrazu przenikania (crosstalk) przedstawiono na Rysunku 5. Obraz uzyskano za pomocą mikroskopu szerokopolowego wyposażonego w jedną kamerę. Emisję fluorescencji DAPI wykorzystano jako referencję (Rysunek 5A,B) do korekcji kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego. Obraz składa się z 3 kanałów po 60 przekrojów Z, z których każdy obejmuje 256 x 256 pikseli. Przed pomiarem przesunięć chromatycznych obrazy poddano dekonwolucji. Pomiar lokalnych przesunięć chromatycznych za pomocą programu Chromagnon trwał 51 s na komputerze Mac z procesorem Intel Core i7 (quad core, 8-wątkowy, 2,7 GHz), 16 GB RAM i dyskiem flash 1 TB. Parametr wyrównania zastosowano do obrazu docelowego (Rysunek 5C,D), który posiada dokładnie taką samą liczbę wokseli jak obraz referencyjny. Przygotowanie wyrównanego pliku trwało 3 s. W wyniku przycięcia pikseli krawędziowych podczas procesu wyrównywania (pole wyboru crop margins na Rysunku 1C), liczba wokseli po wyrównaniu uległa zmniejszeniu (Rysunek 5B, 51 przekrojów Z, 252 x 251 pikseli). DNA w mostku anafazowym (wskazane grotami strzałek) przed wyrównaniem widoczne jest błędnie poza otoczką jądrową (Rysunek 5C, co jest wyraźne w dolnym panelu przedstawiającym widok XZ), natomiast po wyrównaniu znajduje się zgodnie z oczekiwaniami wewnątrz otoczki (Rysunek 5D).
Przykład korekcji przesunięcia chromatycznego z wykorzystaniem biologicznego obrazu referencyjnego do kalibracji przedstawiono na Rysunku 6. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu SIM wyposażonego w trzy kamery. Uśredniono trzy obrazy komórek HeLa barwionych falloidynami sprzężonymi z barwnikami niebieskim, zielonym i czerwonym (Rysunek 6A). Obraz referencyjny składa się z 3 kanałów po 76 przekrojów Z, z których każdy ma rozdzielczość 1 024 x 1 024 pikseli. Pomiar przesunięć chromatycznych za pomocą programu Chromagnon bez lokalnego dopasowania zajął 194 s na opisanym powyżej systemie Mac. Parametr ten zastosowano do obrazu docelowego składającego się z 3 kanałów po 73 przekroje Z, z których każdy ma rozdzielczość 1 024 x 1 024 pikseli. Generowanie dopasowanego pliku trwało 25 s. Widok XZ pokazuje nieprawidłowe pozycje kanałów wzdłuż osi Z oraz w niewielkim stopniu wzdłuż osi X (Rysunek 6A,C), jednak błąd ten został skorygowany po dopasowaniu (Rysunek 6B,D).
<img alt="Proces wyrównywania mikroskopii fluorescencyjnej w analizie komórkowej; porównanie wizualne przed i po." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Przykład dopasowania z obrazem referencyjnym przesłuchów. Komórki HeLa barwiono DAPI w celu uwidocznienia DNA (kolor magenta), Alexa Fluor 48 (kolor żółty) dla otoczki jądrowej oraz Alexa Fluor 5 (kolor niebieski) dla mikrotubul. Obrazy uzyskano za pomocą trójwymiarowej mikroskopii szerokopolowej z wykorzystaniem jednej kamery, a następnie poddano je dekonwolucji.A,B) Reprezentatywny obraz referencyjny przesłuchu z wykorzystaniem emisji DAPI, przed i po wyrównaniu przez ChromagnonWyświetlono trzy nałożone na siebie kanały kolorów.C,D) Przekrój optyczny stosu 3D w trzech kanałach przed i po wyrównaniu. Aberracja chromatyczna w osi jest widoczna w obrębie mostka anafazowego wskazanego grotami strzałek. Pasek skali na panelu A wskazuje 5 µm dla wszystkich paneli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Porównanie dopasowania mikroskopowego; referencyjne vs. docelowe; wyniki obrazowania fluorescencyjnego; przed/po." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przykład wyrównania z biologicznym obrazem referencyjnym do kalibracji Obrazy pozyskano za pomocą mikroskopu 3D-SIM wyposażonego w trzy kamery.A,B) obraz referencyjny uśredniony z trzech obrazów wykonanych przed (A) i po (B) ustawienia. Komórki HeLa barwiono falloidyną sprzężoną z Alexa Fluor 405, 48 lub 594. (C,D) obraz docelowy przed (C) oraz po (D) dopasowanie. Komórki HeLa barwiono DAPI w celu uwidocznienia DNA (kolor magenta), Alexa Fluor 48 (kolor żółty) dla otoczki jądrowej oraz Alexa Fluor 594 (kolor niebieski) dla mikrotubul. Pasek skali na panelu A wskazuje 5 µm dla wszystkich paneli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Korekcja przesunięć chromatycznych w trójwymiarowych (3D) wielokolorowych obrazach mikroskopii fluorescencyjnej jest kluczowa dla ilościowych analiz danych. Protokół ten został opracowany w celu pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych poprzez pozyskiwanie odpowiednich obrazów referencyjnych i przetwarzanie za pomocą oprogramowania open source Chromagnon.

Wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3D w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Obrazy z mikroskopii koralowców bagiennych zawierają przesunięcie chromatyczne w trzech wymiarach. To upośledza analizę kolokalizacyjną obrazów o wysokiej rozdzielczości. Ogólnie rzecz biorąc, trudno jest usunąć przesunięcie chromatyczne pochodzące z samej próbki biologicznej, nasza metoda może skorygować przesunięcie chromatyczne w próbce biologicznej przy użyciu oddzielnie uzyskanych obrazów referencyjnych.Procedurę zademonstruje Takako Koujin, technik z mojej grupy. Zacznij od wysiewu 2,5 razy 10 do piątej komórki uzdrowiciela na 35-milimetrowym szklanym naczyniu i hodowaniu ich w inkubatorze dwutlenku węgla. Po 24 godzinach inkubacji zastąp pożywkę dwoma mililitrami 3,7% formaldehydu w PBS i delikatnie wymieszaj.Ustal sprzedaż na 15 minut w temperaturze pokojowej na obrotowej platformie. Umyj komórki trzy razy dwoma mililitrami PBS przez pięć do 10 minut. Przesusz je dwoma mililitrami punktu 1%, wypróbuj następne 100 w PBS, obracając i powtórz prania z PBS.Następnie wybarwić komórki przy użyciu standardowego protokołu barwienia przeciwciałami, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Aby uzyskać obraz referencyjny odniesienia przesłuchu dla mikroskopii szerokokątnej, dodaj dwa mililitry pięciu mikrogramów na mililitr Dappy, aby pozostać w DNA. Pozostaw komórki na obrotowej platformie na 30 minut.Następnie zastąp roztwór 100 mikrolitrami podłoża montażowego Aby uzyskać obraz referencyjny kalibracji biologicznej, odniesienie dla każdego rodzaju mikroskopii, w tym mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej. Napraw komórki zgodnie z wcześniejszym opisem i przygotuj roztwór podstawowy, fluorescencyjny barwnik sprzężony z falloidyną w 1,5 mililitra metanolu. Dodaj falloidynę do PBS w rozcieńczeniu od jednego do 100 dla piętra Alexa 405, jednego do 1000 dla piętra Alexa 488 i jednego do 200 dla piętra Alexa 594.Dodaj jeden mililitr roztworu do komórek i inkubuj je przez 30 minut, obracając się. Umyj komórki trzy do pięciu razy dwoma mililitrami PBS. Następnie wymień PBS na 100 mikrolitrów medium montażowego.Aby uzyskać obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopii szerokokątnej, umieść próbkę docelową na mikroskopie w oprogramowaniu do obrazowania, otwórz okno projektowania i uruchamiania eksperymentu, ustaw odpowiedni krok Z i wybierz kanał niebieski, zielony i czerwony. Na karcie Uruchom dodaj nazwę pliku obrazu i rozpocznij obrazowanie. Aby uzyskać obrazy referencyjne przesłuchów do pomiaru przesunięć chromatycznych w próbce, wybierz światło wzbudzenia tylko dla Dappy i upewnij się, że używasz dokładnie tej samej pozycji stolika i wysokości Z, co dla próbki docelowej.Alternatywnie, można użyć obrazu jasnego pola jako miejsca odniesienia do próbki docelowej w mikroskopie szerokokątnym i uzyskać obraz fluorescencyjny celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym. Następnie uzyskaj obrazy celu w jasnym polu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym dokładnie w tej samej pozycji stopnia i przy użyciu tej samej wysokości Z. Aby uzyskać obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, takiej jak 3D Sim, umieść próbkę docelową w mikroskopie i uzyskaj obraz symulacyjny fluorescencji celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym.Następnie zrekonstruuj obraz w super rozdzielczości. Następnie umieść próbkę barwienia za pomocą wielokolorowej falloidyny na mikroskopie 3D sim. Pozyskaj wiele obrazów symulujących fluorescencję jako obrazy referencyjne kalibracji biologicznej w pozycjach punktu docelowego, a następnie zrekonstruuj obrazy o wysokiej rozdzielczości.Użyj przeglądarki internetowej, aby pobrać najnowszą binarną wersję Chromagnon. Rozpakuj program i umieść plik wykonywalny w dogodnej lokalizacji. Przeciągnij i upuść pliki referencyjne z odwołaniami do prawego pola przesłuchu lub kalibracji biologicznej do pola odniesienia lub kliknij pliki referencyjne, aby otworzyć okno dialogowe wyboru plików.Jeśli program poprosi o zainstalowanie zestawu Java Development Kit, naciśnij Tak i przejdź do pobranej strony. Następnie pobierz i zainstaluj JDK dla systemu operacyjnego zgodnie z instrukcjami. Przeciągnij i upuść pliki docelowe barwienia przeciwciał w polu docelowym.Wybierz format obrazu wyjściowego i określ sufiks nazwy pliku wyjściowego. Do przesłuchów obrazów referencyjnych o wysokim stosunku sygnału do szumu. Wybierz Projekcja z listy opcji Wyrównanie lokalne i użyj minimalnego rozmiaru okna 60.W przypadku wielu obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej zaznacz opcję średnich odniesień I wybierz brak dla wyrównania lokalnego, a następnie kliknij przycisk Uruchom wszystko, aby rozpocząć pomiary. Aby upewnić się, że pomiar został wykonany poprawnie, przeciągnij i upuść obrazy referencyjne do pola odniesienia i pola docelowego. Następnie uruchom program i sprawdź, czy obrazy idealnie na siebie nakładają się.Korekcję przesunięcia chromatycznego w mikroskopii szerokokątnej można wykonać przy użyciu obrazu referencyjnego przesłuchu. Obraz ten uzyskano za pomocą mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w pojedynczą kamerę. Emisja fluorescencji z Dappy została wykorzystana jako odniesienie do korekcji kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego.Po wyrównaniu z Chromagnonem poprawiono przesunięcie chromatyczne i obraz referencyjny. Gdy parametr dopasowania został zastosowany do obrazu docelowego przez Chromagnon, DNA i mostek anafazowy, który jest nieprawidłowo widoczny na zewnątrz otoczki jądrowej, zanim wyrównanie pojawi się zgodnie z oczekiwaniami wewnątrz otoczki. Korekcja przesunięcia chromatycznego obrazu karty SIM 3D może być wykonana przy użyciu obrazu referencyjnego kalibracji biologicznej.Trzy obrazy symulacyjne 3D komórek HeLa barwionych falloidynami sprzężonymi z niebieskimi, zielonymi i czerwonymi barwnikami zostały przeanalizowane, a przesunięcie chromatyczne zmierzono za pomocą Chromagnon. Po wyrównaniu przesunięcie chromatyczne i obraz referencyjny zostały poprawione. Parametr alignment został zastosowany do obrazu docelowego.Widok XZ pokazuje nieprawidłowe położenie kanału wzdłuż kierunku Z i nieznacznie wzdłuż kierunku X, co zostało poprawione po wyrównaniu. Aby uzyskać najlepszą wydajność, ważne jest, aby uzyskać obrazy referencyjne w tych samych warunkach i w tym samym czasie, co obrazy docelowe.

high-accuracy-correction-3d-chromatic-shifts-age-super-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Mikroskopia poklatkowa pozwala na wizualizację procesów rozwojowych. Wzrost lub dryf próbek podczas akwizycji obrazu zmniejsza zdolność do dokładnego śledzenia i mierzenia ruchów komórek podczas rozwoju. Opisujemy zastosowanie oprogramowania do przetwarzania obrazów typu open source w celu skorygowania trójwymiarowego dryfu próbki w czasie.

Korekcja dryfu próbki po konfokalnym obrazowaniu poklatkowym 4D

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Obrazowanie spektralne stało się niezawodnym rozwiązaniem do identyfikacji i separacji wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce i może łatwo odróżnić interesujące sygnały od tła lub autofluorescencji. Obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia ulepsza tę technikę, skracając niezbędny czas akwizycji obrazu przy jednoczesnym zwiększeniu stosunku sygnału do szumu.

Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Naucz się korekcji przesunięć chromatycznych w mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem oprogramowania Chromagnon i komórek HeLa. Ta metoda poprawia dokładność analizy kolokalizacji w obrazowaniu biologicznym o wysokiej rozdzielczości.

Wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3D w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Chromagnon (Wideo) | JoVE Journal

Wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3D w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Chromagnon

Przeglądaj więcej filmów