Wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3D w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Chromagnon
16 czerwca 2020
Korekcja przesunięć chromatycznych w trójwymiarowych (3D) wielokolorowych obrazach mikroskopii fluorescencyjnej jest kluczowa dla ilościowych analiz danych. Protokół ten został opracowany w celu pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych poprzez pozyskiwanie odpowiednich obrazów referencyjnych i przetwarzanie za pomocą oprogramowania open source Chromagnon.
Obrazy z mikroskopii koralowców bagiennych zawierają przesunięcie chromatyczne w trzech wymiarach. To upośledza analizę kolokalizacyjną obrazów o wysokiej rozdzielczości. Ogólnie rzecz biorąc, trudno jest usunąć przesunięcie chromatyczne pochodzące z samej próbki biologicznej, nasza metoda może skorygować przesunięcie chromatyczne w próbce biologicznej przy użyciu oddzielnie uzyskanych obrazów referencyjnych.
Procedurę zademonstruje Takako Koujin, technik z mojej grupy. Zacznij od wysiewu 2,5 razy 10 do piątej komórki uzdrowiciela na 35-milimetrowym szklanym naczyniu i hodowaniu ich w inkubatorze dwutlenku węgla. Po 24 godzinach inkubacji zastąp pożywkę dwoma mililitrami 3,7% formaldehydu w PBS i delikatnie wymieszaj.
Ustal sprzedaż na 15 minut w temperaturze pokojowej na obrotowej platformie. Umyj komórki trzy razy dwoma mililitrami PBS przez pięć do 10 minut. Przesusz je dwoma mililitrami punktu 1%, wypróbuj następne 100 w PBS, obracając i powtórz prania z PBS.
Następnie wybarwić komórki przy użyciu standardowego protokołu barwienia przeciwciałami, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Aby uzyskać obraz referencyjny odniesienia przesłuchu dla mikroskopii szerokokątnej, dodaj dwa mililitry pięciu mikrogramów na mililitr Dappy, aby pozostać w DNA. Pozostaw komórki na obrotowej platformie na 30 minut.
Następnie zastąp roztwór 100 mikrolitrami podłoża montażowego Aby uzyskać obraz referencyjny kalibracji biologicznej, odniesienie dla każdego rodzaju mikroskopii, w tym mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej. Napraw komórki zgodnie z wcześniejszym opisem i przygotuj roztwór podstawowy, fluorescencyjny barwnik sprzężony z falloidyną w 1,5 mililitra metanolu. Dodaj falloidynę do PBS w rozcieńczeniu od jednego do 100 dla piętra Alexa 405, jednego do 1000 dla piętra Alexa 488 i jednego do 200 dla piętra Alexa 594.
Dodaj jeden mililitr roztworu do komórek i inkubuj je przez 30 minut, obracając się. Umyj komórki trzy do pięciu razy dwoma mililitrami PBS. Następnie wymień PBS na 100 mikrolitrów medium montażowego.
Aby uzyskać obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopii szerokokątnej, umieść próbkę docelową na mikroskopie w oprogramowaniu do obrazowania, otwórz okno projektowania i uruchamiania eksperymentu, ustaw odpowiedni krok Z i wybierz kanał niebieski, zielony i czerwony. Na karcie Uruchom dodaj nazwę pliku obrazu i rozpocznij obrazowanie. Aby uzyskać obrazy referencyjne przesłuchów do pomiaru przesunięć chromatycznych w próbce, wybierz światło wzbudzenia tylko dla Dappy i upewnij się, że używasz dokładnie tej samej pozycji stolika i wysokości Z, co dla próbki docelowej.
Alternatywnie, można użyć obrazu jasnego pola jako miejsca odniesienia do próbki docelowej w mikroskopie szerokokątnym i uzyskać obraz fluorescencyjny celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym. Następnie uzyskaj obrazy celu w jasnym polu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym dokładnie w tej samej pozycji stopnia i przy użyciu tej samej wysokości Z. Aby uzyskać obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, takiej jak 3D Sim, umieść próbkę docelową w mikroskopie i uzyskaj obraz symulacyjny fluorescencji celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym.
Następnie zrekonstruuj obraz w super rozdzielczości. Następnie umieść próbkę barwienia za pomocą wielokolorowej falloidyny na mikroskopie 3D sim. Pozyskaj wiele obrazów symulujących fluorescencję jako obrazy referencyjne kalibracji biologicznej w pozycjach punktu docelowego, a następnie zrekonstruuj obrazy o wysokiej rozdzielczości.
Użyj przeglądarki internetowej, aby pobrać najnowszą binarną wersję Chromagnon. Rozpakuj program i umieść plik wykonywalny w dogodnej lokalizacji. Przeciągnij i upuść pliki referencyjne z odwołaniami do prawego pola przesłuchu lub kalibracji biologicznej do pola odniesienia lub kliknij pliki referencyjne, aby otworzyć okno dialogowe wyboru plików.
Jeśli program poprosi o zainstalowanie zestawu Java Development Kit, naciśnij Tak i przejdź do pobranej strony. Następnie pobierz i zainstaluj JDK dla systemu operacyjnego zgodnie z instrukcjami. Przeciągnij i upuść pliki docelowe barwienia przeciwciał w polu docelowym.
Wybierz format obrazu wyjściowego i określ sufiks nazwy pliku wyjściowego. Do przesłuchów obrazów referencyjnych o wysokim stosunku sygnału do szumu. Wybierz Projekcja z listy opcji Wyrównanie lokalne i użyj minimalnego rozmiaru okna 60.
W przypadku wielu obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej zaznacz opcję średnich odniesień I wybierz brak dla wyrównania lokalnego, a następnie kliknij przycisk Uruchom wszystko, aby rozpocząć pomiary. Aby upewnić się, że pomiar został wykonany poprawnie, przeciągnij i upuść obrazy referencyjne do pola odniesienia i pola docelowego. Następnie uruchom program i sprawdź, czy obrazy idealnie na siebie nakładają się.
Korekcję przesunięcia chromatycznego w mikroskopii szerokokątnej można wykonać przy użyciu obrazu referencyjnego przesłuchu. Obraz ten uzyskano za pomocą mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w pojedynczą kamerę. Emisja fluorescencji z Dappy została wykorzystana jako odniesienie do korekcji kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego.
Po wyrównaniu z Chromagnonem poprawiono przesunięcie chromatyczne i obraz referencyjny. Gdy parametr dopasowania został zastosowany do obrazu docelowego przez Chromagnon, DNA i mostek anafazowy, który jest nieprawidłowo widoczny na zewnątrz otoczki jądrowej, zanim wyrównanie pojawi się zgodnie z oczekiwaniami wewnątrz otoczki. Korekcja przesunięcia chromatycznego obrazu karty SIM 3D może być wykonana przy użyciu obrazu referencyjnego kalibracji biologicznej.
Trzy obrazy symulacyjne 3D komórek HeLa barwionych falloidynami sprzężonymi z niebieskimi, zielonymi i czerwonymi barwnikami zostały przeanalizowane, a przesunięcie chromatyczne zmierzono za pomocą Chromagnon. Po wyrównaniu przesunięcie chromatyczne i obraz referencyjny zostały poprawione. Parametr alignment został zastosowany do obrazu docelowego.
Widok XZ pokazuje nieprawidłowe położenie kanału wzdłuż kierunku Z i nieznacznie wzdłuż kierunku X, co zostało poprawione po wyrównaniu. Aby uzyskać najlepszą wydajność, ważne jest, aby uzyskać obrazy referencyjne w tych samych warunkach i w tym samym czasie, co obrazy docelowe.
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy problemu przesunięć chromatycznych w wielokolorowych obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Opracowany protokół pozwala na dokładną korekcję tych przesunięć w próbkach biologicznych, co zapewnia lepszą analizę danych ilościowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Mikroskopia
- Obrazowanie fluorescencyjne
- Analiza danych
Wstęp
- Przesunięcia chromatyczne mogą zakłócać analizę kolokalizacji w obrazach z mikroskopii o wysokiej rozdzielczości.
- Przesunięcia te mogą wynikać z samych próbek biologicznych, co komplikuje ich korekcję.
- Protokół wykorzystuje pozyskane obrazy referencyjne w celu zwiększenia dokładności przetwarzania obrazu.
Zastosowane metody
- Opracowanie protokołu z wykorzystaniem oprogramowania Chromagnon
- System biologiczny: komórki HeLa
- Techniki: mikroskopia fluorescencyjna, protokoły barwienia, przetwarzanie obrazu
Główne wyniki
- Wykazano skuteczną korekcję przesunięcia chromatycznego przy użyciu obrazów referencyjnych.
- Osiągnięto właściwe wyrównanie obrazów po przeprowadzeniu korekcji.
- Zweryfikowano zastosowane podejście poprzez porównanie obrazów przetworzonych i oryginalnych.
Wnioski
- Badanie w sposób skuteczny demonstruje metodę korygowania przesunięć chromatycznych w mikroskopii.
- Praca ta ma istotne znaczenie dla poprawy dokładności w badaniach nad obrazowaniem biologicznym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjne obrazowanie wielokolorowe jest niezbędne do wiarygodnej kolokalizacji i analizy ilościowej w walidacji celów terapeutycznych oraz screeningu fenotypowym. Przesunięcia chromatyczne pochodzące z próbek biologicznych mogą naruszyć integralność danych, prowadząc do błędnych interpretacji mechanistycznych. Chromagnon umożliwia korekcję przesunięcia chromatycznego w 3D bezpośrednio w systemach biologicznie istotnych, co zwiększa pewność predykcyjną w początkowych etapach procesów odkrywania leków.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zapewnienie dokładnego dopasowania przestrzennego wielokolorowych sygnałów w testach komórkowych.
- Wartość operacyjna: Redukuje liczbę fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich odczytów kolokalizacji, które mogłyby prowadzić do błędnych wniosków w badaniach nad angażowaniem celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez minimalizowanie artefaktów technicznych w analizie szlaków sygnałowych i mapowaniu oddziaływań białkowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy obrazowania biologicznego do wysokoprzepustowego screeningu (high-content screening) poprzez korygowanie rozregulowania kanałów, które wpływa na dokładność odczytu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wyniki obrazowania fluorescencyjnego w obrębie studzienek i płytek, zwiększając powtarzalność analiz oraz niezawodność współczynnika Z-factor.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie obrazów referencyjnych w różnych partiach eksperymentalnych, zapewniając spójne działanie w zautomatyzowanych platformach obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia wierność obrazowania od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez korekcję zależnych od głębokości przesunięć chromatycznych w modelach 3D.
- Dopasowanie biomarkerów: Gwarantuje dokładność kolokalizacji przy ocenie biomarkerów translacyjnych w utrwalonych tkankach lub systemach organoidalnych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Redukuje liczbę biologicznych wyników fałszywie dodatnich w badaniach mechanistycznych, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o wiarygodne dane obrazowe.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnej walidacji celu po przedkliniczne badania mechanistyczne, w których precyzyjne obrazowanie wielokolorowe wspiera identyfikację głównych kandydatów na leki oraz ograniczanie ryzyka związanego ze szlakami sygnałowymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając precyzyjną analizę kolokalizacji kompleksów białkowych i zdarzeń sygnałowych w utrwalonych komórkach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy poprzez skorygowane kanały fluorescencji, gwarantując wiarygodne odczyty fenotypowe indukowane związkami.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów przestrzennych, które pozwalają zespołom porównywać warunki traktowania z wysoką dokładnością pozycyjną.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie spójnego obrazowania w trójwymiarowych systemach biologicznych, takich jak sferoidy lub przekroje tkankowe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku narzędzie kalibracyjne w różnych projektach, redukując redundantne wysiłki walidacyjne w wspólnych centrach obrazowania.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększenie wiarygodności predykcyjnej w walidacji celów poprzez eliminację artefaktów chromatycznych w danych kolokalizacyjnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność obrazowania wielokolorowego pomiędzy różnymi użytkownikami, ośrodkami i punktami czasowymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki redukcji ryzyka niepowodzenia na późnych etapach wynikającego z błędnych założeń mechanistycznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o mechanistycznie uzasadnione i zwalidowane obrazowo hipotezy.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz oprogramowania do przetwarzania obrazów.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopów szerokopolowych lub mikroskopów o wysokiej rozdzielczości (super-resolution), umożliwiających akwizycję wielokanałową.
- Konieczne jest zastosowanie zestandaryzowanych protokołów akwizycji obrazów referencyjnych w celu zapewnienia dokładności korekcji.
- Wymagana jest adaptacja barwienia referencyjnego (np. DAPI, falloidyna) dla różnych linii komórkowych lub typów tkanek.
- Wydajność zależy od dopasowania warunków próbki referencyjnej i docelowej, w tym utrwalania, permeabilizacji oraz głębokości obrazowania.
