Kwantyfikacja parametrów czasoprzestrzennych egzocytozy komórkowej w komórkach z mikrowzorami
September 16th, 2020
Obrazowanie na żywo lizosomalnej egzocytozy na mikrowzorcach komórek pozwala na przestrzenną kwantyfikację tego procesu. Normalizacja morfologii za pomocą mikrowzorców jest znakomitym narzędziem do odkrywania ogólnych zasad dotyczących przestrzennego rozkładu procesów komórkowych.
Protokół ten pokazuje, jak badać wydzielanie komórek za pomocą obrazowania na żywo za pomocą mikroskopii TOF i zapewnia narzędzia do wykrywania zdarzeń grupowania lub regionów o wysokiej aktywności. Korzystając z tego protokołu, możemy generować hodowle komórkowe na powierzchniach mikrowzorców, które normalizują podział komórek, a tym samym ułatwiają specjalne zakresy zdarzeń wydzielniczych. Komórki wydzielają różne makrocząsteczki, które odgrywają ważną rolę w regulacji odporności.
W przypadku raka rozregulowane wydzielanie wpływa na uwalnianie enzymów proteolitycznych, które ułatwiają inwazję. Kwantyfikacja wydzielania pozwoli nam lepiej zrozumieć zdegradowane wydzielanie w nowotworach i innych dynamicznych procesach, takich jak prezentacja antygenu. Chociaż nasz protokół obrazowania i analizy jest prosty, wymaga wygenerowania pojedynczych komórek, które są dobrze rozsiane na kawałku mikrowzoru.
W tym filmie pokażemy, jak hodować komórki na szkiełkach nakrywkowych z mikrowzorami oraz jak wizualizować i analizować zdarzenia wydzielnicze za pomocą narzędzi statystyki przestrzennej. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe do mikromodelowania, aktywuj sterylizowane etanolem szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 milimetrów w głębokim świetle ultrafioletowym przez pięć minut. Podczas aktywacji szkiełek nakrywkowych dodaj jedną 30 mikrolitrową kroplę glikolu polietylenowego do przeszczepu polilizyny na szkiełko nakrywkowe na kawałek folii parafinowej w wilgotnej komorze.
Pod koniec aktywacji umieścić szkiełka nakrywkowe aktywowaną powierzchniowo do dołu na kroplach i przykryć wilgotną komorę na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy w wodzie destylowanej. Podczas wysychania szkiełek nakrywkowych umyj kwarcową maskę fotograficzną raz wodą destylowaną, a drugi raz alkoholem.
Wysuszyć maskę fotograficzną przefiltrowanym strumieniem powietrza i wystawić maskę fotograficzną chromowaną stroną na działanie głębokiego światła ultrafioletowego przez pięć minut. Pod koniec oświetlenia dodaj 10 mikrolitrów kropli wody na chromowaną stronę każdej maski fotograficznej i umieść stronę z glikolem polietylenowym każdego szkiełka nakrywkowego na każdej kropli wody. Po usunięciu nadmiaru wody umieść folię na szkiełkach, aby uniknąć odwodnienia.
Wystaw niepokryte chromem boki masek fotograficznych na działanie głębokiego światła ultrafioletowego przez dodatkowe pięć minut przed dodaniem nadmiaru wody do masek fotograficznych w celu usunięcia szkiełek nakrywkowych. Ten krok spowoduje powstanie odcisków mikrowzorów na powierzchni. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze białka macierzy zewnątrzkomórkowej na folii parafinowej w wilgotnej komorze przez godzinę pod okapem z przepływem laminarnym.
W celu wysiewu komórek na przygotowaną powierzchnię mikrowzoru, pod koniec inkubacji umieść szkiełka nakrywkowe w magnetycznym uchwycie na szkiełka nakrywkowe stroną z mikrowzorem do góry i natychmiast dodaj podłoże do szkiełek nakrywkowych. Po dodaniu uszczelki należy unieruchomić szkiełka nakrywkowe za pomocą urządzenia magnetycznego przed napełnieniem uchwytu szkiełek nakrywkowych dodatkowym medium wzorcowym. Następnie zamknij uchwyt szklaną pokrywką.
Gdy komórki są gotowe, dodaj 5 razy 10 do jednej piątej transfekowanych, unieśmiertelnionych komórek nabłonka barwnika siatkówki do szkiełek nakrywkowych i inkubuj komórki w uchwycie przez 10 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji należy użyć jednej pipety do zasysania starej pożywki, a drugiej pipety przemyć komórki pięć razy świeżą pożywką na przemycie w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek i wszelkich resztek płodowej surowicy bydlęcej. Po ostatnim płukaniu umieść uchwyt z powrotem w inkubatorze na trzy godziny, aby umożliwić pełne rozłożenie komórek.
Aby zobrazować zdarzenia egzocytozy, umieść uchwyt szkiełka nakrywkowego pod mikroskopem fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem i poszukaj komórki wykazującej ekspresję VAMP7-pHluorin, która jest w pełni rozprowadzona. Zmieniaj kąt lasera, aż zostanie osiągnięty całkowity kąt fluorescencji odbicia wewnętrznego, który umożliwia wizualizację zdarzeń egzocytozy VAMP7-pHluorin i wykonaj pięciominutową akwizycję z częstotliwością zgodną z częstością egzocytozy i skalą czasową. Aby uzyskać współrzędne egzocytozy, otwórz film o zdarzeniach nabytej egzocytozy na Fidżi i ręcznie zidentyfikuj zdarzenia egzocytozy po pojawieniu się jasnego sygnału, który rozprzestrzenia się na zewnątrz.
Użyj narzędzia punktowego, aby zaznaczyć środek zdarzenia egzocytozy i użyj analizy i pomiaru, aby zmierzyć współrzędne x i y, a także współrzędną czasową. Zapisz pomiary jednej komórki w jednym pliku tekstowym. Otwórz plik tekstowy w arkuszu kalkulacyjnym i usuń wszystkie kolumny z wyjątkiem kolumn o współrzędnych x i y.
Następnie użyj narzędzia do owalu i zmierz, aby zmierzyć środek i średnicę oraz uzyskać współrzędne x i y oraz średnicę Fereta każdej komórki. Zapisz pomiary wszystkich komórek w jednym pliku tekstowym. Otwórz plik tekstowy w arkuszu kalkulacyjnym i usuń wszystkie kolumny z wyjątkiem współrzędnych x i y oraz średnicy Fereta.
Następnie dodaj pomiar promienia dla każdej komórki, a następnie uzyskaj promień ze średnicy Fereta dla każdej komórki. Użyj narzędzia linii prostej, aby zmierzyć grubość pierścienia mikrowzoru każdej komórki. Zapisz ten pomiar dla wszystkich komórek w jednym pliku tekstowym, a następnie podziel długość przylegania przez promień komórki, aby obliczyć znormalizowaną długość przylegania.
W przypadku analizy przestrzennej pojedynczej komórki najpierw zainstaluj pakiet programu RStudio i załaduj pakiet do programu RStudio. Uruchom pakiet za pomocą funkcji ESA. Otworzy się interfejs użytkownika, a następnie wybierz katalog dla plików TXT zestawu danych i katalog dla wykresów wyjściowych.
Skrypt automatycznie rozpocznie i wykona analizę, dostarczając pliki PDF z odpowiednimi wykresami oraz pliki TXT zawierające wyniki numeryczne. Wewnątrz komórki podłoga w sondzie jest wygaszana przez niskie pH lizosomu, ale podczas egzocytozy pHluorin zaczyna emitować sygnał, gdy pH wzrasta w wyniku uwalniania protonów. Sygnał pHluorin wykazuje szczyt podczas egzocytozy, który reprezentuje szybkie uwalnianie protonów lizosomalnych, po którym następuje wykładniczy zanik sygnału, który reprezentuje dyfuzję 2D sondy na błonie plazmatycznej.
Zazwyczaj transfekcyjne, unieśmiertelnione ludzkie barwnikowe komórki nabłonkowe siatkówki wykazują ważną aktywność wydzielania lizosomalnego ze średnią szybkością egzocytozy 0,28 Hz. Możliwe jest zobrazowanie rozkładu 2D egzocytozy poprzez oszacowanie gęstości jądra w celu ujawnienia różnic w gęstości lokalnej. Istnieją trzy możliwe odchylenia od całkowitej losowości przestrzennej: grupowanie, dyspersja lub mieszanina grupowania i dyspersji.
Funkcja K Ripleya może być użyta do oceny tych odchyleń. Warto zauważyć, że zdarzenia egzocytozy w obszarze nieadhezyjnym są również zgrupowane, co wskazuje, że cząsteczki adhezyjne nie są jedynymi strukturami, które indukują gorące punkty wydzielnicze na błonach plazmatycznych. Wykreślenie histogramu zdarzeń egzocytozy zgodnie z modułem dla reprezentatywnej komórki ujawnia pik wokół granicy między obszarami adhezyjnymi i nieadhezyjnymi.
Analiza sparowana pokazuje, że gęstość powierzchni jest niższa w obszarze adhezji niż w obszarze bez adhezji, potencjalnie z powodu silnego spadku egzocytozy na obrzeżach komórki. Połączenie adhezji komórek na mikrowzorcach z analizą statystyczną ułatwia określenie, w jaki sposób złożone procesy komórkowe, takie jak wydzielanie, są regulowane w przestrzeni. Potrzebne są dalsze dalsze prace, aby określić, jaki mechanizm molekularny leży u podstaw grupowania aktywności wydzielniczej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada lizosomalną egzocytozę w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocą mikroskopii TOF na mikrowzórkach. Podejście to pozwala na przestrzenną ilościową ocenę zdarzeń sekrecji, poprawiając nasze zrozumienie uwalniania makrocząsteczek w regulacji odpowiedzi immunologicznej i raku.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Biologia raka
- Techniki mikroskopiczne
Tło
- Lizosomalna egzocytoza odgrywa kluczową rolę w funkcjach sekrecyjnych.
- Deregulowany sekret może wpływać na progresję raka.
- Podejście mikrowzórkowań normalizuje morfologię komórek dla lepszej analizy.
Stosowane metody
- Żywe obrazy przez mikroskopię TOF
- Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki
- Mikrofabrykacja pokrywek do mikrowzórkowań
Główne wyniki
- Osiągnięto przestrzenną ilościową ocenę zdarzeń egzocytozy.
- Normalizacja podziału komórek poprawiła dokładność wykrywania zdarzeń sekrecyjnych.
- Analiza danych pozwoliła na szczegółowe śledzenie przestrzennej dystrybucji egzocytozy.
Wnioski
- To badanie zapewnia wgląd w przestrzenne dynamiki lizosomalnej sekrecji.
- Wyniki są istotne dla zrozumienia procesów komórkowych w raku i odpowiedziach immunologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative spatial analysis of lysosomal exocytosis in micropatterned cells enables precise interrogation of secretory mechanisms relevant to immune regulation and cancer biology. This approach enhances predictive confidence in early discovery by revealing non-random clustering of secretion events and the influence of cell adhesion. The method supports risk-adjusted decisions at the target validation and assay development inflection points in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by quantifying spatial clustering of exocytosis events.
- Clarifies the contribution of adhesion molecules to secretory hot spot formation.
- Supports functional target validation by linking secretion patterns to cellular microenvironments.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing random from regulated secretion behaviors.
Screening & Assay Development
- Standardizes cell morphology using micropatterns for reproducible assay conditions.
- Generates quantitative outputs through spatial statistical tools such as Ripley’s K function and NND analysis.
- Enables reliable detection of secretory activity for downstream compound evaluation.
- Supports assay scalability and platform reuse by providing normalized, high-content readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial secretion analysis with disease-relevant models, such as cancer cell invasion and immune modulation.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by quantifying dynamic secretion processes.
- De-risks translational advancement by revealing spatial determinants of secretory dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and translational research, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the spatial regulation of exocytosis and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness.
- Analytics: Provides statistical outputs (e.g., clustering indices, density maps) for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects spatial secretion patterns to disease-relevant cellular behaviors.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable analytical framework for diverse secretory and trafficking studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in secretory pathway analysis.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of spatial secretion assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on quantitative spatial data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, micropatterning, and spatial statistics.
- Needs access to TIRF microscopy and computational tools for spatial analysis.
- Demands cross-team standardization of cell culture and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or secretory pathways.
- Manual event annotation and data curation can be resource-intensive.
