Kwantyfikacja parametrów czasoprzestrzennych egzocytozy komórkowej w komórkach z mikrowzorami
16 września 2020
Obrazowanie na żywo lizosomalnej egzocytozy na mikrowzorcach komórek pozwala na przestrzenną kwantyfikację tego procesu. Normalizacja morfologii za pomocą mikrowzorców jest znakomitym narzędziem do odkrywania ogólnych zasad dotyczących przestrzennego rozkładu procesów komórkowych.
Protokół ten pokazuje, jak badać wydzielanie komórek za pomocą obrazowania na żywo za pomocą mikroskopii TOF i zapewnia narzędzia do wykrywania zdarzeń grupowania lub regionów o wysokiej aktywności. Korzystając z tego protokołu, możemy generować hodowle komórkowe na powierzchniach mikrowzorców, które normalizują podział komórek, a tym samym ułatwiają specjalne zakresy zdarzeń wydzielniczych. Komórki wydzielają różne makrocząsteczki, które odgrywają ważną rolę w regulacji odporności.
W przypadku raka rozregulowane wydzielanie wpływa na uwalnianie enzymów proteolitycznych, które ułatwiają inwazję. Kwantyfikacja wydzielania pozwoli nam lepiej zrozumieć zdegradowane wydzielanie w nowotworach i innych dynamicznych procesach, takich jak prezentacja antygenu. Chociaż nasz protokół obrazowania i analizy jest prosty, wymaga wygenerowania pojedynczych komórek, które są dobrze rozsiane na kawałku mikrowzoru.
W tym filmie pokażemy, jak hodować komórki na szkiełkach nakrywkowych z mikrowzorami oraz jak wizualizować i analizować zdarzenia wydzielnicze za pomocą narzędzi statystyki przestrzennej. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe do mikromodelowania, aktywuj sterylizowane etanolem szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 milimetrów w głębokim świetle ultrafioletowym przez pięć minut. Podczas aktywacji szkiełek nakrywkowych dodaj jedną 30 mikrolitrową kroplę glikolu polietylenowego do przeszczepu polilizyny na szkiełko nakrywkowe na kawałek folii parafinowej w wilgotnej komorze.
Pod koniec aktywacji umieścić szkiełka nakrywkowe aktywowaną powierzchniowo do dołu na kroplach i przykryć wilgotną komorę na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy w wodzie destylowanej. Podczas wysychania szkiełek nakrywkowych umyj kwarcową maskę fotograficzną raz wodą destylowaną, a drugi raz alkoholem.
Wysuszyć maskę fotograficzną przefiltrowanym strumieniem powietrza i wystawić maskę fotograficzną chromowaną stroną na działanie głębokiego światła ultrafioletowego przez pięć minut. Pod koniec oświetlenia dodaj 10 mikrolitrów kropli wody na chromowaną stronę każdej maski fotograficznej i umieść stronę z glikolem polietylenowym każdego szkiełka nakrywkowego na każdej kropli wody. Po usunięciu nadmiaru wody umieść folię na szkiełkach, aby uniknąć odwodnienia.
Wystaw niepokryte chromem boki masek fotograficznych na działanie głębokiego światła ultrafioletowego przez dodatkowe pięć minut przed dodaniem nadmiaru wody do masek fotograficznych w celu usunięcia szkiełek nakrywkowych. Ten krok spowoduje powstanie odcisków mikrowzorów na powierzchni. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze białka macierzy zewnątrzkomórkowej na folii parafinowej w wilgotnej komorze przez godzinę pod okapem z przepływem laminarnym.
W celu wysiewu komórek na przygotowaną powierzchnię mikrowzoru, pod koniec inkubacji umieść szkiełka nakrywkowe w magnetycznym uchwycie na szkiełka nakrywkowe stroną z mikrowzorem do góry i natychmiast dodaj podłoże do szkiełek nakrywkowych. Po dodaniu uszczelki należy unieruchomić szkiełka nakrywkowe za pomocą urządzenia magnetycznego przed napełnieniem uchwytu szkiełek nakrywkowych dodatkowym medium wzorcowym. Następnie zamknij uchwyt szklaną pokrywką.
Gdy komórki są gotowe, dodaj 5 razy 10 do jednej piątej transfekowanych, unieśmiertelnionych komórek nabłonka barwnika siatkówki do szkiełek nakrywkowych i inkubuj komórki w uchwycie przez 10 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji należy użyć jednej pipety do zasysania starej pożywki, a drugiej pipety przemyć komórki pięć razy świeżą pożywką na przemycie w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek i wszelkich resztek płodowej surowicy bydlęcej. Po ostatnim płukaniu umieść uchwyt z powrotem w inkubatorze na trzy godziny, aby umożliwić pełne rozłożenie komórek.
Aby zobrazować zdarzenia egzocytozy, umieść uchwyt szkiełka nakrywkowego pod mikroskopem fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem i poszukaj komórki wykazującej ekspresję VAMP7-pHluorin, która jest w pełni rozprowadzona. Zmieniaj kąt lasera, aż zostanie osiągnięty całkowity kąt fluorescencji odbicia wewnętrznego, który umożliwia wizualizację zdarzeń egzocytozy VAMP7-pHluorin i wykonaj pięciominutową akwizycję z częstotliwością zgodną z częstością egzocytozy i skalą czasową. Aby uzyskać współrzędne egzocytozy, otwórz film o zdarzeniach nabytej egzocytozy na Fidżi i ręcznie zidentyfikuj zdarzenia egzocytozy po pojawieniu się jasnego sygnału, który rozprzestrzenia się na zewnątrz.
Użyj narzędzia punktowego, aby zaznaczyć środek zdarzenia egzocytozy i użyj analizy i pomiaru, aby zmierzyć współrzędne x i y, a także współrzędną czasową. Zapisz pomiary jednej komórki w jednym pliku tekstowym. Otwórz plik tekstowy w arkuszu kalkulacyjnym i usuń wszystkie kolumny z wyjątkiem kolumn o współrzędnych x i y.
Następnie użyj narzędzia do owalu i zmierz, aby zmierzyć środek i średnicę oraz uzyskać współrzędne x i y oraz średnicę Fereta każdej komórki. Zapisz pomiary wszystkich komórek w jednym pliku tekstowym. Otwórz plik tekstowy w arkuszu kalkulacyjnym i usuń wszystkie kolumny z wyjątkiem współrzędnych x i y oraz średnicy Fereta.
Następnie dodaj pomiar promienia dla każdej komórki, a następnie uzyskaj promień ze średnicy Fereta dla każdej komórki. Użyj narzędzia linii prostej, aby zmierzyć grubość pierścienia mikrowzoru każdej komórki. Zapisz ten pomiar dla wszystkich komórek w jednym pliku tekstowym, a następnie podziel długość przylegania przez promień komórki, aby obliczyć znormalizowaną długość przylegania.
W przypadku analizy przestrzennej pojedynczej komórki najpierw zainstaluj pakiet programu RStudio i załaduj pakiet do programu RStudio. Uruchom pakiet za pomocą funkcji ESA. Otworzy się interfejs użytkownika, a następnie wybierz katalog dla plików TXT zestawu danych i katalog dla wykresów wyjściowych.
Skrypt automatycznie rozpocznie i wykona analizę, dostarczając pliki PDF z odpowiednimi wykresami oraz pliki TXT zawierające wyniki numeryczne. Wewnątrz komórki podłoga w sondzie jest wygaszana przez niskie pH lizosomu, ale podczas egzocytozy pHluorin zaczyna emitować sygnał, gdy pH wzrasta w wyniku uwalniania protonów. Sygnał pHluorin wykazuje szczyt podczas egzocytozy, który reprezentuje szybkie uwalnianie protonów lizosomalnych, po którym następuje wykładniczy zanik sygnału, który reprezentuje dyfuzję 2D sondy na błonie plazmatycznej.
Zazwyczaj transfekcyjne, unieśmiertelnione ludzkie barwnikowe komórki nabłonkowe siatkówki wykazują ważną aktywność wydzielania lizosomalnego ze średnią szybkością egzocytozy 0,28 Hz. Możliwe jest zobrazowanie rozkładu 2D egzocytozy poprzez oszacowanie gęstości jądra w celu ujawnienia różnic w gęstości lokalnej. Istnieją trzy możliwe odchylenia od całkowitej losowości przestrzennej: grupowanie, dyspersja lub mieszanina grupowania i dyspersji.
Funkcja K Ripleya może być użyta do oceny tych odchyleń. Warto zauważyć, że zdarzenia egzocytozy w obszarze nieadhezyjnym są również zgrupowane, co wskazuje, że cząsteczki adhezyjne nie są jedynymi strukturami, które indukują gorące punkty wydzielnicze na błonach plazmatycznych. Wykreślenie histogramu zdarzeń egzocytozy zgodnie z modułem dla reprezentatywnej komórki ujawnia pik wokół granicy między obszarami adhezyjnymi i nieadhezyjnymi.
Analiza sparowana pokazuje, że gęstość powierzchni jest niższa w obszarze adhezji niż w obszarze bez adhezji, potencjalnie z powodu silnego spadku egzocytozy na obrzeżach komórki. Połączenie adhezji komórek na mikrowzorcach z analizą statystyczną ułatwia określenie, w jaki sposób złożone procesy komórkowe, takie jak wydzielanie, są regulowane w przestrzeni. Potrzebne są dalsze dalsze prace, aby określić, jaki mechanizm molekularny leży u podstaw grupowania aktywności wydzielniczej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje egzocytozę lizosomalną w komórkach nabłonka barwnego siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TOF na powierzchniach mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia przestrzenną kwantyfikację zdarzeń wydzielniczych, co pozwala na lepsze zrozumienie uwalniania makrocząsteczek w procesach regulacji odpornościowej oraz w nowotworach.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Biologia nowotworów
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Egzocytoza lizosomalna odgrywa kluczową rolę w funkcjach wydzielniczych.
- Zaburzone wydzielanie może wpływać na progresję nowotworu.
- Metoda mikrowzorowania normalizuje morfologię komórek w celu usprawnienia analizy.
Zastosowane metody
- Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii TOF
- Komórki nabłonka pigmentowego siatkówki
- Mikrofabrykacja szkiełek podstawowych do mikrowzorowania
Główne wyniki
- Przeprowadzono ilościową analizę przestrzenną zdarzeń egzocytozy.
- Normalizacja podziałów komórkowych zwiększyła dokładność wykrywania zdarzeń wydzielniczych.
- Analiza danych umożliwiła szczegółne śledzenie rozkładu przestrzennego egzocytozy.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza wiedzy na temat dynamiki przestrzennej sekrecji lizosomalnej.
- Wyniki mają znaczenie dla zrozumienia procesów komórkowych w nowotworach oraz odpowiedzi immunologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza przestrzenna egzocytozy lizosomalnej w komórkach w mikro-wzorach umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów wydzielniczych istotnych dla regulacji odpornościowej i biologii nowotworów. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnych etapach odkryć, ujawniając nierandomowe skupianie się zdarzeń wydzielniczych oraz wpływ adhezji komórkowej. Metoda ta wspiera podejmowanie decyzji skorygowanych o ryzyko w punktach zwrotnych walidacji celu i opracowywania testów w procesach rozwoju produktów biofarmaceutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację przestrzennego skupiania się zdarzeń egzocytozy.
- Wyjaśnia wkład cząsteczek adhezyjnych w tworzenie tzw. gorących punktów wydzielniczych (secretory hot spots).
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie wzorców sekrecji z komórkowym mikrośrodowiskiem.
- Ułatwia selekcję w ramach portfolio poprzez rozróżnienie przypadkowych od regulowanych zachowań sekrecyjnych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Standaryzuje morfologię komórek przy użyciu mikrowzorców w celu zapewnienia powtarzalnych warunków analizy.
- Generuje wyniki ilościowe za pomocą narzędzi statystyki przestrzennej, takich jak funkcja K Ripley’a oraz analiza NND.
- Umożliwia niezawodną detekcję aktywności wydzielniczej dla późniejszej oceny związków.
- Wspiera skalowalność analizy i ponowne wykorzystanie platformy poprzez dostarczanie znormalizowanych odczytów wysokotreściowych (high-content).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie analizy sekrecji przestrzennej z modelami istotnymi dla przebiegu chorób, takimi jak inwazja komórek nowotworowych i modulacja odpornościowa.
- Zapewnia ciągłość przejścia od fazy odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez ilościowe określanie dynamicznych procesów sekrecyjnych.
- Minimalizuje ryzyko w procesie wdrażania do praktyki klinicznej poprzez ujawnienie przestrzennych determinantów dysfunkcji sekrecyjnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy – od wczesnych studiów mechanistycznych, poprzez opracowywanie testów analitycznych, aż po badania translacyjne, wspierając zarówno weryfikację hipotez, jak i analizy ilościowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących przestrzennej regulacji egzocytozy i wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty przestrzenne niezbędne do przygotowania testów.
- Analityka: Zapewnia wyniki statystyczne (np. indeksy klastrowania, mapy gęstości) dla wiarygodnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy przestrzenne wzorce sekrecji z zachowaniami komórkowymi istotnymi dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje reużywalny framework analityczny dla różnorodnych badań nad sekrecją i transportem wewnątrzkomórkowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w analizie szlaków wydzielniczych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność przestrzennych testów wydzielania.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe dane przestrzenne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obrazowania żywych komórek, mikrowzorowania i statystyki przestrzennej.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopii TIRF oraz narzędzi obliczeniowych do analizy przestrzennej.
- Konieczna jest standaryzacja hodowli komórkowych i procesów przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych typów komórek lub szlaków wydzielniczych.
- Ręczna adnotacja zdarzeń i kuratela danych mogą być zasobożerne.
