Name: Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do identyfikacji receptorów powierzchniowych w skali genomu. Technika ta umożliwia niezależne odkrywanie interakcji ligand-receptor bez wcześniejszej wiedzy o biologii receptora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez grant Wellcome Trust numer 206194 przyznany GJW. Dziękujemy placówce Cytometry Core: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson i Christopher Hall za pomoc w FACS.

<ol><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+intercellular+adhesion%3A+the+importance+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions.</a> Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).</li>
<li>Wood, L., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).</li>
<li>Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li>
<li>Visser, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+biochemical+screen+reveals+that+FLRTs+and+Unc5s+mediate+neuronal+subtype+recognition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina.</a> eLife. 4, e08149(2015).</li>
<li>Özkan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+interactome+of+immunoglobulin+and+LRR+proteins+reveals+receptor-ligand+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks.</a> Cell. 154 (1), 228-239 (2013).</li>
<li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Screen+for+Human+Cytomegalovirus+Identifies+Neuropilin-2+as+a+Central+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor.</a> Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).</li>
<li>Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juno+is+the+egg+Izumo+receptor+and+is+essential+for+mammalian+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization.</a> Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).</li>
<li>Mullican, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRAL+is+the+receptor+for+GDF15+and+the+ligand+promotes+weight+loss+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+malaria+is+associated+with+parasite+binding+to+endothelial+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor.</a> Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+ligand-receptor+interactions+on+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).</li>
<li>Sobotzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HATRIC-based+identification+of+receptors+for+orphan+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands.</a> Nature Communications. 9 (1), 1519(2018).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Genetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+antigen+specificity+of+a+monoclonal+antibody+using+genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library.</a> Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).</li>
<li>Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+toolbox+to+study+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR toolbox to study virus-host interactions.</a> Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).</li>
<li>Kerr, J. S., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidity-based+extracellular+interaction+screening+%28AVEXIS%29+for+the+scalable+detection+of+low-affinity+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3881(2012).</li>
<li>Tzelepis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Dropout+Screen+Identifies+Genetic+Vulnerabilities+and+Therapeutic+Targets+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.</a> Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).</li>
<li>Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+cellular+pathways+required+for+cell+surface+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition.</a> Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+pooled+CRISPR+genetic+screens+using+MAGeCKFlute%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute.</a> Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).</li>
<li>R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).</li>
<li>Crosnier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).</li>
<li>Kirk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+is+tightly+associated+with+lactate+transporters+MCT1+and+MCT4+and+facilitates+their+cell+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression.</a> The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).</li>
<li>Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+extracellular+receptor-ligand+interaction+screening+using+CRISPR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation.</a> Genome Biology. 19 (1), 205(2018).</li>
<li>van der Meer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Model+Passports-a+hub+for+clinical%2C+genetic+and+functional+datasets+of+preclinical+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models.</a> Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PloS One. 10 (3), e0121314(2015).</li>
<li>Behan, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prioritization+of+cancer+therapeutic+targets+using+CRISPR-Cas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens.</a> Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano strategię badań przesiewowych opartą na CRISPR w celu identyfikacji genów kodujących komponenty komórkowe zaangażowane w rozpoznawanie komórek. Podobne podejście wykorzystujące aktywację CRISPR zapewnia również genetyczną alternatywę do identyfikacji bezpośrednio oddziałujących receptorów rekombinowanych białek bez konieczności generowania dużych bibliotek białek26. Jednak jedną z głównych zalet tego podejścia jest to, że ma ono zastosowanie do interakcji, w których pośredniczą cząsteczki powierzchniowe natywnie wyświetlane na komórce i nie zależy od nadekspresji receptorów, co może wpływać na awidność wiązania receptora. W przeciwieństwie do innych metod, technika ta nie przyjmuje żadnych założeń dotyczących biochemicznej natury lub biologii komórki receptorów i daje możliwość badania interakcji, w których pośredniczą białka, które zwykle są trudne do zbadania przy użyciu podejść biochemicznych, takich jak bardzo duże białka lub te, które wielokrotnie przechodzą przez błonę lub tworzą kompleksy z innymi białkami. oraz cząsteczki inne niż białka, takie jak glikany, glikolipidy i fosfolipidy. Biorąc pod uwagę charakter metody w skali genomu, podejście to ma również tę zaletę, że nie tylko identyfikuje receptor, ale także dodatkowe składniki komórkowe, które są wymagane do zdarzenia wiązania, zapewniając w ten sposób wgląd w biologię komórki receptora.
Jednym z głównych ograniczeń tej metody przy użyciu jej do identyfikacji receptora białka sierocego jest początkowy wymóg, aby najpierw zidentyfikować linię komórkową, która wiąże się z białkiem. Nie zawsze jest to łatwe, a identyfikacja linii komórkowej, która wykazuje fenotyp wiązania, który jest również dopuszczalny dla genetycznych badań przesiewowych, może być krokiem ograniczającym czas wdrożenia tego testu. Niektóre linie komórkowe mają tendencję do wiązania się z większą liczbą białek niż inne. Jest to szczególnie istotne w przypadku białek, które wiążą HS, ponieważ białka te mają tendencję do wiązania się z dowolną linią komórkową, która wykazuje łańcuchy boczne HS, niezależnie od natywnego kontekstu wiązania. Dodatkowo zaobserwowaliśmy, że regulacja w górę syndekanów (tj. proteoglikanów zawierających HS) w liniach komórkowych prowadzi do zwiększonego wiązania białek wiążących HS26. Może to być czynnik, który należy wziąć pod uwagę przy wyborze linii komórkowej do badań przesiewowych. Jednak ważne jest również, aby pamiętać, że addytywne wiązanie HS nie zakłóca wiązania z określonym receptorem. Oznacza to, że jeśli zaobserwuje się wiązanie, możliwe jest, że jest ono pośredniczone wyłącznie przez HS, ponieważ wiązanie, w którym pośredniczy HS w tym teście, jest addytywne, a nie współzależne19. W takim scenariuszu opisane podejście do blokowania heparyny może zidentyfikować takie zachowania bez konieczności przeprowadzania pełnego badania genetycznego.
Przydatnym źródłem do wyboru linii komórkowych jest Paszport Modelu Komórki, który zawiera informacje o genomice, transkryptomice i warunkach hodowli dla ~1,000 linii komórek rakowych27. W zależności od kontekstu biologicznego komórki można wybierać na podstawie ich profili ekspresji. Aby pomóc w selekcji linii komórkowych, zgrupowaliśmy ~ 1,000 linii komórkowych w paszporcie modelu komórki zgodnie z ekspresją ~ 1,500 wstępnie opisanych glikoprotein powierzchniowych komórek ludzkich28 (rysunek uzupełniający 2; informacje o klastrach dla każdej linii komórkowej wraz z warunkami wzrostu znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 2). Podczas testowania wiązania białka o nieznanej funkcji przydatne jest wybranie panelu reprezentatywnych linii komórkowych z każdego klastra, aby zwiększyć szansę na pokrycie szerokiego zakresu receptorów. Mając wybór, zaleca się wybór linii komórkowych, które są łatwe do hodowli i łatwe do transdukcji. Ponieważ te linie komórkowe będą wykorzystywane w badaniach przesiewowych w skali genomu, preferowane jest, aby można je było łatwo hodować w dużych ilościach i były podatne na transdukcję lentiwirusową, ponieważ jest to najpowszechniej dostępna metoda dostarczania sgRNA do genetycznych badań przesiewowych opartych na CRISPR na późniejszych etapach.
Ogólnie rzecz biorąc, selekcja fenotypów jest przeprowadzana w jednym sortowaniu. Decyduje o tym jednak jasność wybarwionej populacji komórek w porównaniu z kontrolą. Iteracyjne rundy selekcji mogą być stosowane w scenariuszach, w których stosunek sygnału do szumu pożądanego fenotypu jest niski lub gdy celem badania przesiewowego jest identyfikacja mutantów o silnych fenotypach. W przypadku stosowania podejścia do selekcji iteracyjnej dla badań przesiewowych opartych na FACS ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że proces sortowania może spowodować śmierć komórki, głównie ze względu na samą siłę sortera. W związku z tym nie wszystkie zebrane komórki będą reprezentowane w następnej rundzie sortowania.
Złożoność biblioteki jest bardzo ważnym czynnikiem w przeprowadzaniu udanych badań genetycznych, zwłaszcza w przypadku badań przesiewowych selekcji negatywnej, ponieważ zakres ich uszczuplenia można określić tylko poprzez porównanie wyników z tym, co było obecne w bibliotece wyjściowej. W przypadku ekranów selekcji negatywnej często utrzymuje się biblioteki o złożoności 500-1,000x. Ekrany selekcji pozytywnej są jednak bardziej odporne na rozmiary bibliotek, ponieważ w takich ekranach oczekuje się, że tylko niewielka liczba mutantów zostanie wybrana dla określonego fenotypu. W związku z tym, na opisanym tutaj ekranie wyboru pozytywnego, rozmiar biblioteki może zostać zmniejszony do złożoności 50-100x bez uszczerbku dla jakości ekranu. Na dodatek, w badaniach tych możliwe jest również użycie biblioteki kontrolnej dla danej linii komórkowej w danym dniu jako "kontroli ogólnej" dla wszystkich próbek posortowanych w danym dniu dla tej danej linii komórkowej. Zmniejszy to liczbę bibliotek kontrolnych, które muszą być tworzone i sekwencjonowane.
Inną ważną kwestią przy stosowaniu tego podejścia są ograniczenia badań przesiewowych utraty funkcji w identyfikacji genów, które są niezbędne do wzrostu komórek in vitro. Czas badań przesiewowych ma w tym względzie kluczowe znaczenie, ponieważ im dłużej zmutowane komórki są trzymane w hodowli, tym większe prawdopodobieństwo, że komórki z mutacjami w podstawowych genach staną się niezdolne do życia i nie będą już reprezentowane w bibliotece mutantów. Niedawne badania genetyczne przeprowadzone w ramach inicjatywy Project Score na ponad 300 liniach komórkowych pokazują, że wiele genów w szlaku wydzielania białek i N-glikozylacji z adnotacją KEGG jest często identyfikowanych jako niezbędne dla wielu linii komórkowych (rysunek uzupełniający 3)29. Można to wziąć pod uwagę przy projektowaniu badań przesiewowych, jeśli wpływ genów niezbędnych do proliferacji i żywotności ma być badany w kontekście procesu rozpoznawania komórkowego. W takim przypadku przeprowadzenie badań przesiewowych we wczesnym punkcie czasowym (np. 9 dnia po transdukcji) byłoby ogólnie właściwe. Jeśli jednak podejście to jest stosowane do identyfikacji kilku celów o silnym wpływie na wielkość, a nie ogólnych szlaków komórkowych, właściwe może być przeprowadzenie badań przesiewowych w późniejszym czasie (np. 15-16 dnia po transdukcji).
Wyniki badań przesiewowych są bardzo solidne; W ośmiu badaniach przesiewowych wiązania rekombinacji białek przeprowadzonych w przeszłości, receptor powierzchniowy komórki był największym hitem w każdym przypadku19. Stosując to podejście do identyfikacji partnera interakcji, należy się zatem spodziewać, że receptor i czynniki przyczyniające się do jego prezentacji na powierzchni będą identyfikowane z dużą pewnością statystyczną. Po przeprowadzeniu badania przesiewowego i walidacji trafienia za pomocą pojedynczego nokautu gRNA, można przeprowadzić dalsze obserwacje przy użyciu istniejących metod biochemicznych, takich jak AVEXIS4 i bezpośrednie saturywalne wiązanie oczyszczonych białek za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Opisane tutaj podejście ma zastosowanie do wszystkich białek, dla których możliwe jest wygenerowanie rozpuszczalnej rekombinowanej sondy wiążącej.
Podsumowując, jest to podejście oparte na nokaucie CRISPR w skali genomu w celu identyfikacji interakcji, w których pośredniczą białka powierzchniowe komórki. Metoda ta ma ogólne zastosowanie do identyfikacji szlaków komórkowych wymaganych do rozpoznawania powierzchni komórki w szerokim zakresie różnych kontekstów biologicznych, w tym między własnymi komórkami organizmu (np. rozpoznawanie neuronalne i immunologiczne), a także między komórkami gospodarza a białkami patogenu. Metoda ta stanowi genetyczną alternatywę dla podejść biochemicznych przeznaczonych do identyfikacji receptorów, a ponieważ nie wymaga żadnych wcześniejszych założeń dotyczących biochemicznej natury lub biologii komórki receptorów, ma ogromny potencjał do dokonywania zupełnie nieoczekiwanych odkryć.

Zewnętrzne interakcje białek receptorowych na powierzchni komórki kierują ważnymi procesami biologicznymi, takimi jak organizacja tkanek, rozpoznawanie gospodarza-patogenu i regulacja immunologiczna. Badanie tych interakcji jest interesujące dla szerszej społeczności biomedycznej, ponieważ receptory błonowe są celami systematycznie dostarczanych środków terapeutycznych, takich jak przeciwciała monoklonalne. Pomimo ich znaczenia, badanie tych interakcji pozostaje wyzwaniem technicznym. Dzieje się tak głównie dlatego, że receptory osadzone w błonie są amfipatyczne, co utrudnia ich wyizolowanie od błon biologicznych w celu manipulacji biochemicznej, a ich interakcje charakteryzują się słabym powinowactwem do interakcji (KDs w zakresie μM-mM)1. W związku z tym wiele powszechnie stosowanych metod nie nadaje się do wykrywania tej klasy interakcji białkowych1,2.
Opracowano szereg metod w celu szczegółowego badania interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy, które uwzględniają ich unikalne właściwości biochemiczne3. Wiele z tych podejść obejmuje ekspresję całej ektodomeny receptora jako rozpuszczalnego białka rekombinowanego w systemach opartych na komórkach ssaków lub owadów, aby zapewnić, że białka te zawierają modyfikacje potranslacyjne, które są ważne strukturalnie, takie jak glikany i wiązania dwusiarczkowe. Aby przezwyciężyć wiązanie o niskim powinowactwie, ektodomeny są często oligomeryzowane, aby zwiększyć ich awidność wiązania. Ektodomeny białkowe Avid zostały z powodzeniem wykorzystane jako sondy wiążące do identyfikacji partnerów interakcji w bezpośrednich rekombinowanych ekranach interakcji białko-białko4,5,6,7. Chociaż metody oparte na białkach rekombinowanych są szeroko skuteczne, wymagają, aby ektodomena receptora błonowego była wytwarzana jako białko rozpuszczalne. W związku z tym ma ogólne zastosowanie tylko do białek, które zawierają ciągły region zewnątrzkomórkowy (np. jednoprzebiegowe typu I, typu II lub zakotwiczone w GPI) i nie jest ogólnie odpowiedni dla kompleksów receptorowych i białek błonowych, które wielokrotnie obejmują błonę.
Techniki klonowania wyrażeń, w których biblioteka komplementarnych DNA (cDNA) jest transfekowana do komórek i testowana pod kątem fenotypu wzmocnienia wiązania, zostały również wykorzystane do identyfikacji zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko8. Dostępność dużych zbiorów sklonowanych i zsekwencjonowanych plazmidów ekspresji cDNA w ostatnich latach ułatwiła metody, w których linie komórkowe z nadekspresją cDNA kodujące receptory na powierzchni komórki są badane pod kątem wiązania białek rekombinowanych w celu identyfikacji interakcji9,10. Podejścia oparte na nadekspresji cDNA, w przeciwieństwie do metod opartych na rekombinacji białek, dają możliwość identyfikacji interakcji w kontekście błony komórkowej. Jednak sukces stosowania konstruktów ekspresji cDNA zależy od zdolności komórek do nadekspresji białka w prawidłowo sfałdowanej formie, ale często wymaga to komórkowych czynników dodatkowych, takich jak transportery, białka opiekuńcze i prawidłowe składanie oligomeryczne. Transfekcja pojedynczego cDNA może zatem nie wystarczyć do osiągnięcia ekspresji na powierzchni komórki.
Techniki przesiewowe wykorzystujące konstrukty cDNA lub rekombinowane sondy białkowe są zasobożerne i wymagają dużych zbiorów cDNA lub bibliotek białek rekombinowanych. Specjalnie zaprojektowane metody oparte na spektrometrii mas zostały ostatnio wykorzystane do identyfikacji oddziaływań zewnątrzkomórkowych, które nie wymagają składania dużych bibliotek. Techniki te wymagają jednak chemicznej manipulacji powierzchnią komórki, która może zmienić biochemiczny charakter cząsteczek obecnych na powierzchni komórek i obecnie ma zastosowanie tylko w przypadku interakcji, w których pośredniczą białka glikozylowane11,12. Większość obecnie dostępnych metod również w dużym stopniu koncentruje się na interakcjach między białkami, w dużej mierze ignorując wkład mikrośrodowiska błonowego, w tym cząsteczek takich jak glikany, lipidy i cholesterol.
Niedawny rozwój wysoce efektywnego celowania bialleleicznego przy użyciu metod opartych na CRISPR umożliwił biblioteki w skali genomu komórek pozbawionych zdefiniowanych genów w jednej puli, które mogą być badane w systematyczny i bezstronny sposób w celu identyfikacji komponentów komórkowych zaangażowanych w różne konteksty, w tym analizowanie procesów sygnalizacji komórkowej, identyfikacja zaburzeń nadających odporność na leki, toksyny, i patogenów oraz określanie swoistości przeciwciał13,14,15,16. W tym miejscu opisujemy test przesiewowy komórek nokautujących oparty na CRISPR w skali genomu, który stanowi alternatywę dla obecnych podejść biochemicznych do identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy. To podejście polegające na identyfikowaniu interakcji, w których pośredniczą receptory błonowe, za pomocą genetycznych badań przesiewowych jest szczególnie odpowiednie dla badaczy, którzy koncentrują się na pojedynczych ligandach, ponieważ pozwala uniknąć konieczności kompilowania dużych bibliotek cDNA lub rekombinowanych białek.
Ten test składa się z trzech głównych etapów: 1) Wysoce zapalone sondy wiążące białka rekombinowane, składające się z zewnątrzkomórkowych regionów receptora będącego przedmiotem zainteresowania, są produkowane i używane w testach wiązania opartych na cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji; 2) Testy wiązania służą do identyfikacji linii komórkowej, która wyraża partnera interakcji rekombinowanej sondy białkowej; 3) Wytwarzana jest wersja linii komórkowej z ekspresją Cas9, która oddziałuje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie przeprowadza się badanie przesiewowe nokautu oparte na CRISPR / Cas9 w skali genomu (Figura 1). W tym genetycznym badaniu przesiewowym wiązanie rekombinowanego białka z liniami komórkowymi jest wykorzystywane jako mierzalny fenotyp, w którym komórki w bibliotece nokautu, które utraciły zdolność wiązania sondy, są sortowane za pomocą opartego na fluorescencji aktywnego sortowania komórek (FACS) i genów, które spowodowały utratę fenotypu wiązania zidentyfikowanego przez sekwencjonowanie. W zasadzie identyfikowane są geny kodujące receptor odpowiedzialny za wiązanie sondy Avid oraz te, które są niezbędne do wyświetlania jej powierzchni komórki.
Pierwszy krok tego protokołu polega na produkcji rekombinowanych sond białkowych reprezentujących ektodomenę receptorów związanych z błoną. Wiadomo, że receptory te często zachowują swoje zewnątrzkomórkowe funkcje wiązania, gdy ich ektodomeny są wyrażane jako rekombinowane rozpuszczalne białko1. W przypadku białka będącego przedmiotem zainteresowania, rozpuszczalne białka rekombinowane mogą być wytwarzane w dowolnym odpowiednim systemie ekspresji białek eukariotycznych w dowolnym formacie, pod warunkiem, że mogą być oligomeryzowane w celu zwiększenia awidności wiązania i zawierają znaczniki, które można stosować w testach wiązania opartych na cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji (np. znacznik FLAG, znacznik biotyny). Szczegółowe protokoły wytwarzania rozpuszczalnych ektodomen receptorów błonowych z wykorzystaniem systemu ekspresji białek HEK293, a także różne techniki multimeryzacji i konstrukty ekspresji białek do produkcji zarówno białek pentamerycznych, jak i białek monomerycznych zostały wcześniej opisane1,17. Protokół tutaj opisze etapy generowania fluorescencyjnych sond avid z monomerycznych biotynylowanych białek poprzez sprzężenie ich ze streptawidyną sprzężoną z fluorochromem (np. fikoerytryną lub PE), która może być stosowana bezpośrednio w testach wiązania opartych na komórkach i ma tę zaletę, że nie wymaga wtórnego przeciwciała do wykrywania. Ogólne protokoły wykonywania badań przesiewowych w skali genomu zostały już opisane20,21, dlatego protokół koncentruje się głównie na specyfice wykonywania badań przesiewowych wiązania białek rekombinowanych opartych na cytometrii przepływowej przy użyciu systemu badań przesiewowych CRISPR/Cas9 knockout przy użyciu <biblioteki Human V1 ("Yusa") sup class="xref">18.

<table><tbody><tr><td>Przeciw-mysia fosfataza alkaliczna</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>Krew i Cell Culture DNA Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dietanoloamina</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do krwi i tkanek Dneasy</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Magnes boczny</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T opakowanie komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina LTX z odczynnikiem PLUS</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik komórek MoFlo XDP</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA koraliki agarozowe</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68 przeciwciało</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>fosforan p-nitrofenylu</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 kolumny odsalające</td><td>GE healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe o objętości łoża 5 ml</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2 razy; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Filtr SCFA</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Sony Sortownik komórek</td><td>Koraliki Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI (koraliki Agencourt AMPure XP)</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do mikromiareczkowania pokryte streptawidyną</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych crispr/cas9 w skali genomu

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Komunikacja międzykomórkowa, w której pośredniczą bezpośrednie interakcje między receptorami na powierzchni komórki osadzonej w błonie, jest kluczowa dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania organizmów wielokomórkowych. Wykrywanie tych interakcji pozostaje jednak wyzwaniem technicznym. Niniejszy manuskrypt opisuje systematyczne podejście do genetycznego nokautowania CRISPR/Cas9 w skali genomu, które ujawnia szlaki komórkowe wymagane dla określonych zdarzeń rozpoznawania powierzchni komórki. Test ten wykorzystuje rekombinowane białka wytwarzane w systemie ekspresji białek ssaków jako zapalone sondy wiążące do identyfikacji partnerów interakcji w genetycznym badaniu przesiewowym opartym na komórkach. Metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji genów niezbędnych do interakcji na powierzchni komórki wykrywanych przez rekombinowane sondy wiążące odpowiadające ektodomenom receptorów osadzonych w błonie. Co ważne, biorąc pod uwagę charakter tego podejścia w skali genomu, ma ono również tę zaletę, że nie tylko identyfikuje bezpośredni receptor, ale także komponenty komórkowe, które są wymagane do prezentacji receptora na powierzchni komórki, dostarczając w ten sposób cennych informacji na temat biologii receptora.

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Wykrywanie interakcji na powierzchni komórek przy użyciu obecnie dostępnych metod biochemicznych nadal stanowi wyzwanie techniczne. Protokół ten stanowi alternatywę genetyczną wykorzystującą podejście do badań przesiewowych komórek w skali genomu w celu identyfikacji interakcji ligandów receptora na powierzchni komórki. W przeciwieństwie do większości innych istniejących metod, ta metoda nie przyjmuje żadnych założeń dotyczących biologii receptorów.Daje to możliwość identyfikacji interakcji, w których pośredniczy szeroki zakres cząsteczek na powierzchni komórki. Cząsteczki na powierzchni komórki są bezpośrednio dostępne dla leków, takich jak przeciwciała monoklonalne. W związku z tym identyfikacja interakcji, w których pośredniczą te cząsteczki, może mieć ważne implikacje terapeutyczne.Metoda ta ma ogólne zastosowanie dla badaczy zainteresowanych badaniem procesów sygnalizacji komórkowej i rozpoznawania w szerokim zakresie kontekstów biologicznych, w tym interakcji neuronalnych i immunologicznych, a także interakcji patogenów gospodarza. Protokół wymaga wysokowydajnej maszyny do sortowania komórek i maszyn do sekwencjonowania nowej generacji. Upewnij się, że te udogodnienia są dostępne przed rozpoczęciem protokołu.Rozpocząć od wykonania ośmiu seryjnych rozcieńczeń biotynylowanych próbek białka na 96-dołkowej płytce, upewniając się, że końcowa objętość każdego rozcieńczenia wynosi co najmniej 200 mikrolitrów i że uwzględniona jest kontrola tylko ze znacznikiem. Wykonać zduplikowaną płytkę z próbek, usuwając 100 mikrolitrów z każdej studzienki i przenosząc ją do nowej płytki 96-dołkowej. Dołącz kontrolę białka tylko do tagowania, która będzie używana jako sonda kontrolna we wszystkich wiążących esejach.Dodać 100 mikrolitrów po 0,1 mikrograma na mililitr streptawidyny-PE do studzienek w jednej z płytek i 100 mikrolitrów buforu rozcieńczającego do studzienek drugiej płytki. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie zatkać studzienki płytki kodowanej streptawidyną buforem rozcieńczającym na 15 minut.Po umyciu talerza upewnij się, że jest suchy. Następnie przenieść całkowitą objętość próbki z obu płytek do poszczególnych dołków płytki kodowanej streptawidyną i inkubować ją przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami buforu do płukania.Dodaj 100 mikrolitrów mysiego anty-szczura Cd4d3+4 IgG I inkubuj płytkę przez kolejną godzinę. Powtórz prania. Dodać 100 mikrolitrów koniugatu fosfatazy alkalicznej przeciw myszom i pozostawić na płytce w temperaturze pokojowej na godzinę.Następnie przemyć studzienki trzykrotnie buforem do przemywania i raz buforem rozcieńczającym. Przygotować fosforan p-nitrofenylu w ilości jednego miligrama na mililitr w buforze barwnika etanoloaminy i dodać 100 mikrolitrów do każdej studzienki. Po 15 minutach inkubacji zmierz absorbancję każdej studzienki przy 405 nanometrach.Użyć minimalnego rozcieńczenia, przy którym nie ma sygnału na płytce, jako odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia do wytworzenia tetramerów. Inkubować streptawidynę-PE i odpowiednie rozcieńczenie białka biotynylowanego przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przechowuj sprzężone białka w osłoniętej światłem probówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia.Obracać stożkowe probówki z próbkami poddanymi działaniu środka i kontrolnymi pod ciśnieniem 200 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i zamrozić jedną z probówek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszego użycia. Ponownie zawiesić osad w drugiej probówce w 10 mililitrach PBS z 1% BSA i odłożyć 100 mikrolitrów komórek jako kontrolę ujemną na 96-dołkowej płytce.Następnie dodaj wstępnie sprzężone rekombinowane białko do zawiesiny komórkowej w stożkowej probówce i na 96-dołkowej płytce. Barwienie komórek należy wykonywać przez co najmniej godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wirniku stołowym z delikatnym obrotem. Następnie osadzać komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut i usunąć supernatant.Po dwukrotnym umyciu ogniw ponownie zawieś je w pięciu mililitrach PBS. Przecedź komórki przez sitko o średnicy 30 mikrometrów, aby usunąć skupiska komórek. Następnie przeanalizuj je za pomocą Sodoru przepływowego.Użyj próbki kontroli ujemnej do bramki dla komórek dodatnich BFP i PE ujemnych. Następnie posortuj próbkę i zbierz od 500 000 do 1 miliona komórek dodatnich BFP i PE ujemnych do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Bolesna klatka będzie zależeć od wiązania komórek z białkiem, ale zwykle pobiera się od 1 do 5% próbek PE ujemnych.Teraz pozwól posortowanym komórkom wirować przez odwirowanie przez 500 razy G przez pięć minut, a następnie ostrożnie usuń supernatant. Pellet można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do sześciu miesięcy. Użyj funkcji magic count, aby odwzorować sekwencje z nieposortowanej i posortowanej populacji do biblioteki referencyjnej, co da nieprzetworzony plik zliczania.Uruchom funkcję testową magii, używając surowych zliczeń z nieposortowanej próbki kontrolnej jako kontroli i zliczeń z posortowanej próbki jako traktowania. Otwórz wygenerowany plik podsumowania genów i uszereguj kolumnę rangi pauzy w kolejności rosnącej. Następnie zidentyfikuj trafienia, których współczynnik fałszywych wykryć jest mniejszy niż 0,05.Receptor jest zwykle wysoko oceniany na pierwszej pozycji. Na koniec użyj R lub równoważnego oprogramowania, aby wykreślić solidny wynik algorytmu klasyfikacji dla pozytywnej selekcji. W komórkach NCI-SNU-1 i HEC-293 przeprowadzono badania przesiewowe knockdown w skali genomu w celu identyfikacji partnera wiążącego ludzkiego TNFSF9 i P falciparum lub H5 ludzkiego TNFSF9 i P falciparum Rh5.Na wiązanie Rh5 miał wpływ zarówno siarczan heparanu, jak i jego znany receptor BSG, podczas gdy TN-FRSF-9 nie utracił wiązania ze znanym receptorem TN-FSF-9. Po wstępnej inkubacji z rozpuszczalną heparyną. Rozkład GNA w bibliotece mutantów kontrolnych ujawnił, że złożoność biblioteki utrzymywała się przez cały czas trwania eksperymentu.Jakość techniczną badań przesiewowych oceniono, badając rozkład obserwowanych zmian fałdowania G-RNA ukierunkowanych na referencyjny zestaw genów nieistotnych, w porównaniu z rozkładem dla referencyjnego zestawu niezbędnych genów. Ponadto wzbogacenie na poziomie szlaku ujawniło, że oczekiwane niezbędne szlaki zostały zidentyfikowane i znacznie wzbogacone w populacji osób przedwcześnie kończących naukę. Podczas porównywania próbki kontrolnej z oryginalną biblioteką plazmidów.Solidny algorytm rangi lub wynik RRA zapewnia miarę, w której G-RNA są konsekwentnie oceniane wyżej niż oczekiwano. Na ekranie dla TNFRSF9 największym hitem był TNFSF9, który jest znanym partnerem wiążącym. Ponadto zidentyfikowano również szereg genów związanych ze szlakiem TP53.W przypadku RH5, oprócz znanego receptora i genu niezbędnego do produkcji siarczanowych gagów, zidentyfikowano również gen SLC16A1. Podejście przesiewowe jest zwykle bardzo solidne, a receptor oddziałujący bezpośrednio powinien być wysoko sklasyfikowany na liście genów wzbogaconych w tej kolejności populacji. Kluczowe jest zweryfikowanie trafień uzyskanych z ekranu.Jeśli w interakcji pośredniczą białka, do dalszych badań walidacyjnych można wykorzystać podejścia biochemiczne zaprojektowane na przykład do badania binarnych oddziaływań białkowych. Ze względu na bezstronny charakter tego podejścia w skali genomu, przewidujemy, że pomoże ono w badaniu interakcji, w których pośredniczą trudne do zbadania cząsteczki komórkowe, takie jak lipidy, wieloprzebiegowe białka błonowe i glikany. Może również ujawnić nowe szlaki wymagane do transportu receptorów i biologii.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół optymalizujący CRISPR-Cas9 w celu osiągnięcia wyższej specyficzności bez utraty aktywności na miejscu. Używamy podejścia ukierunkowanej ewolucji zwanego Sniper-screen, aby znaleźć zmutowanego Cas9 o pożądanych cechach. Sniper-Cas9 jest kompatybilny ze skróconymi pojedynczymi przewodnikami RNA i dostarczaniem w formacie rybonukleoproteiny, dobrze znanymi strategiami osiągania wyższej specyficzności.

Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Artykuł opisuje protokół zastosowania modelu in vitro do wyczerpania w celu przeprowadzenia całego genomu ekranu nokautującego CRISPR w zdrowych limfocytach T receptora chimerycznego antygenu dawcy.

Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Opracowaliśmy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 dla pierwotnych komórek CAR T. Poprzez redukcję przenoszenia gDNA poprzez trawienie enzymatyczne i pulldown kasety sgRNA, podejście to minimalizuje artefakty PCR, zapewniając dokładne wykrywanie sgRNA i solidną identyfikację funkcjonalnych celów genowych.

Ulepszanie ekranów CRISPR-Cas9 w komórkach CAR T: udoskonalona metoda przygotowania biblioteki

Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do identyfikacji receptorów powierzchniowych w skali genomu. Technika ta umożliwia niezależne odkrywanie interakcji ligand-receptor bez wcześniejszej wiedzy o biologii receptora.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Przeglądaj więcej filmów