Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Wykrywanie interakcji na powierzchni komórek przy użyciu obecnie dostępnych metod biochemicznych nadal stanowi wyzwanie techniczne. Protokół ten stanowi alternatywę genetyczną wykorzystującą podejście do badań przesiewowych komórek w skali genomu w celu identyfikacji interakcji ligandów receptora na powierzchni komórki. W przeciwieństwie do większości innych istniejących metod, ta metoda nie przyjmuje żadnych założeń dotyczących biologii receptorów.

Daje to możliwość identyfikacji interakcji, w których pośredniczy szeroki zakres cząsteczek na powierzchni komórki. Cząsteczki na powierzchni komórki są bezpośrednio dostępne dla leków, takich jak przeciwciała monoklonalne. W związku z tym identyfikacja interakcji, w których pośredniczą te cząsteczki, może mieć ważne implikacje terapeutyczne.

Metoda ta ma ogólne zastosowanie dla badaczy zainteresowanych badaniem procesów sygnalizacji komórkowej i rozpoznawania w szerokim zakresie kontekstów biologicznych, w tym interakcji neuronalnych i immunologicznych, a także interakcji patogenów gospodarza. Protokół wymaga wysokowydajnej maszyny do sortowania komórek i maszyn do sekwencjonowania nowej generacji. Upewnij się, że te udogodnienia są dostępne przed rozpoczęciem protokołu.

Rozpocząć od wykonania ośmiu seryjnych rozcieńczeń biotynylowanych próbek białka na 96-dołkowej płytce, upewniając się, że końcowa objętość każdego rozcieńczenia wynosi co najmniej 200 mikrolitrów i że uwzględniona jest kontrola tylko ze znacznikiem. Wykonać zduplikowaną płytkę z próbek, usuwając 100 mikrolitrów z każdej studzienki i przenosząc ją do nowej płytki 96-dołkowej. Dołącz kontrolę białka tylko do tagowania, która będzie używana jako sonda kontrolna we wszystkich wiążących esejach.

Dodać 100 mikrolitrów po 0,1 mikrograma na mililitr streptawidyny-PE do studzienek w jednej z płytek i 100 mikrolitrów buforu rozcieńczającego do studzienek drugiej płytki. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie zatkać studzienki płytki kodowanej streptawidyną buforem rozcieńczającym na 15 minut.

Po umyciu talerza upewnij się, że jest suchy. Następnie przenieść całkowitą objętość próbki z obu płytek do poszczególnych dołków płytki kodowanej streptawidyną i inkubować ją przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami buforu do płukania.

Dodaj 100 mikrolitrów mysiego anty-szczura Cd4d3+4 IgG I inkubuj płytkę przez kolejną godzinę. Powtórz prania. Dodać 100 mikrolitrów koniugatu fosfatazy alkalicznej przeciw myszom i pozostawić na płytce w temperaturze pokojowej na godzinę.

Następnie przemyć studzienki trzykrotnie buforem do przemywania i raz buforem rozcieńczającym. Przygotować fosforan p-nitrofenylu w ilości jednego miligrama na mililitr w buforze barwnika etanoloaminy i dodać 100 mikrolitrów do każdej studzienki. Po 15 minutach inkubacji zmierz absorbancję każdej studzienki przy 405 nanometrach.

Użyć minimalnego rozcieńczenia, przy którym nie ma sygnału na płytce, jako odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia do wytworzenia tetramerów. Inkubować streptawidynę-PE i odpowiednie rozcieńczenie białka biotynylowanego przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przechowuj sprzężone białka w osłoniętej światłem probówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Obracać stożkowe probówki z próbkami poddanymi działaniu środka i kontrolnymi pod ciśnieniem 200 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i zamrozić jedną z probówek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszego użycia. Ponownie zawiesić osad w drugiej probówce w 10 mililitrach PBS z 1% BSA i odłożyć 100 mikrolitrów komórek jako kontrolę ujemną na 96-dołkowej płytce.

Następnie dodaj wstępnie sprzężone rekombinowane białko do zawiesiny komórkowej w stożkowej probówce i na 96-dołkowej płytce. Barwienie komórek należy wykonywać przez co najmniej godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wirniku stołowym z delikatnym obrotem. Następnie osadzać komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut i usunąć supernatant.

Po dwukrotnym umyciu ogniw ponownie zawieś je w pięciu mililitrach PBS. Przecedź komórki przez sitko o średnicy 30 mikrometrów, aby usunąć skupiska komórek. Następnie przeanalizuj je za pomocą Sodoru przepływowego.

Użyj próbki kontroli ujemnej do bramki dla komórek dodatnich BFP i PE ujemnych. Następnie posortuj próbkę i zbierz od 500 000 do 1 miliona komórek dodatnich BFP i PE ujemnych do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Bolesna klatka będzie zależeć od wiązania komórek z białkiem, ale zwykle pobiera się od 1 do 5% próbek PE ujemnych.

Teraz pozwól posortowanym komórkom wirować przez odwirowanie przez 500 razy G przez pięć minut, a następnie ostrożnie usuń supernatant. Pellet można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do sześciu miesięcy. Użyj funkcji magic count, aby odwzorować sekwencje z nieposortowanej i posortowanej populacji do biblioteki referencyjnej, co da nieprzetworzony plik zliczania.

Uruchom funkcję testową magii, używając surowych zliczeń z nieposortowanej próbki kontrolnej jako kontroli i zliczeń z posortowanej próbki jako traktowania. Otwórz wygenerowany plik podsumowania genów i uszereguj kolumnę rangi pauzy w kolejności rosnącej. Następnie zidentyfikuj trafienia, których współczynnik fałszywych wykryć jest mniejszy niż 0,05.

Receptor jest zwykle wysoko oceniany na pierwszej pozycji. Na koniec użyj R lub równoważnego oprogramowania, aby wykreślić solidny wynik algorytmu klasyfikacji dla pozytywnej selekcji. W komórkach NCI-SNU-1 i HEC-293 przeprowadzono badania przesiewowe knockdown w skali genomu w celu identyfikacji partnera wiążącego ludzkiego TNFSF9 i P falciparum lub H5 ludzkiego TNFSF9 i P falciparum Rh5.

Na wiązanie Rh5 miał wpływ zarówno siarczan heparanu, jak i jego znany receptor BSG, podczas gdy TN-FRSF-9 nie utracił wiązania ze znanym receptorem TN-FSF-9. Po wstępnej inkubacji z rozpuszczalną heparyną. Rozkład GNA w bibliotece mutantów kontrolnych ujawnił, że złożoność biblioteki utrzymywała się przez cały czas trwania eksperymentu.

Jakość techniczną badań przesiewowych oceniono, badając rozkład obserwowanych zmian fałdowania G-RNA ukierunkowanych na referencyjny zestaw genów nieistotnych, w porównaniu z rozkładem dla referencyjnego zestawu niezbędnych genów. Ponadto wzbogacenie na poziomie szlaku ujawniło, że oczekiwane niezbędne szlaki zostały zidentyfikowane i znacznie wzbogacone w populacji osób przedwcześnie kończących naukę. Podczas porównywania próbki kontrolnej z oryginalną biblioteką plazmidów.

Solidny algorytm rangi lub wynik RRA zapewnia miarę, w której G-RNA są konsekwentnie oceniane wyżej niż oczekiwano. Na ekranie dla TNFRSF9 największym hitem był TNFSF9, który jest znanym partnerem wiążącym. Ponadto zidentyfikowano również szereg genów związanych ze szlakiem TP53.

W przypadku RH5, oprócz znanego receptora i genu niezbędnego do produkcji siarczanowych gagów, zidentyfikowano również gen SLC16A1. Podejście przesiewowe jest zwykle bardzo solidne, a receptor oddziałujący bezpośrednio powinien być wysoko sklasyfikowany na liście genów wzbogaconych w tej kolejności populacji. Kluczowe jest zweryfikowanie trafień uzyskanych z ekranu.

Jeśli w interakcji pośredniczą białka, do dalszych badań walidacyjnych można wykorzystać podejścia biochemiczne zaprojektowane na przykład do badania binarnych oddziaływań białkowych. Ze względu na bezstronny charakter tego podejścia w skali genomu, przewidujemy, że pomoże ono w badaniu interakcji, w których pośredniczą trudne do zbadania cząsteczki komórkowe, takie jak lipidy, wieloprzebiegowe białka błonowe i glikany. Może również ujawnić nowe szlaki wymagane do transportu receptorów i biologii.