Wysokoprzepustowa identyfikacja oporności na Pseudomonas syringae pv. Pomidor w pomidorze za pomocą testu powodziowego sadzonek

Ten wysokowydajny protokół umożliwia szybkie badanie przesiewowe sadzonek pomidorów pod kątem dzikich zakażeń patogenem bakteryjnym Pseudomonas syringae. Test zalewania sadzonek minimalizuje czas wzrostu roślin i zapotrzebowanie na komorę wzrostu, umożliwia szybki obrót roślin i umożliwia testowanie dużych rozmiarów próbek. Test ten jest potężnym narzędziem, które można wykorzystać do badań przesiewowych pod kątem odporności u dzikich akcesji i innych linii o złożonym tle genetycznym.

Protokół zawiera szczegółowe wskazówki dotyczące innokulacji powodziowej dwóch szczepów Pseudomonas syringae. Jest jednak wszechstronny i może być modyfikowany w celu wykrycia oporności gospodarza na inne patogeny bakteryjne. Procedurę zademonstruje Yana Hasan, specjalistka ds. badań w moim laboratorium.

Zacznij od wyhodowania sadzonek pomidorów. Umieść nasiona pomidora w 2,2 mililitrowej probówce do mikrowirówki i dodaj dwa mililitry 50% roztworu wybielacza. Kołysz probówką przez 25 minut, a następnie usuń roztwór wybielacza pipetą.

Dodaj dwa mililitry ultra czystej wody i umyj nasiona, pięciokrotnie odwracając rurkę. Odessać płyn z probówki i powtórzyć pranie jeszcze cztery razy. Po ostatnim umyciu dodaj dwa mililitry ultraczystej wody i wlej nasiona do sterylnej szalki Petriego.

Wysterylizuj kleszcze, paląc je w etanolu, a następnie użyj ich do przeniesienia od pięciu do siedmiu nasion na płytkę o wymiarach 100 na 25 mililitrów z 0,5 XMS plus 0,8 procent podłoża agarowego. Uszczelnij krawędzie płytki taśmą chirurgiczną. Upewnij się, że talerze są ułożone płasko i stroną zadrukowaną do góry.

Rozwarstwiaj wysterylizowane nasiona w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez co najmniej trzy dni, aby zsynchronizować kiełkowanie. Po trzech dniach ustaw płytki pionowo tak, aby korzenie rosły wzdłuż powierzchni płytki, a linia nasion była zorientowana poziomo. Przenieś nasiona do komory wzrostowej ustawionej na 22 stopnie Celsjusza z 16-godzinnym cyklem światła i 8-godzinnym ciemnym cyklem.

Hoduj sadzonki przez dziesięć dni w komorze, po czym zazwyczaj będą miały w pełni rozwinięte liścienie i pojawiające się pierwsze prawdziwe liście. Nanieś świeże bakterie na odpowiedni agar KB płaską, sterylną wykałaczką. W przypadku PstT1 inkubuj płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 48 godzin przed użyciem bakterii w eksperymencie powodziowym.

Aby przygotować inokulum, należy aseptycznie zawiesić bakterie w sterylnym, dziesięciomilimolowym chlorku magnezu do gęstości optycznej 0,1. Następnie wykonać dwa seryjne rozcieńczenia, aby uzyskać stężenie robocze z OD600 0075. Przygotuj również rozcieńczenie od jednego do dziesięciu niejonowo-silikonowoorganicznego kopolimeru środka powierzchniowo czynnego w dziesięciomilimolowym chlorku magnezu.

Zwiruj go i dodaj do bakterii, obracając probówkę do wymieszania. Przenieś płytki z dziesięciodniowymi sadzonkami z komory wzrostowej do szafki bezpieczeństwa biologicznego i usuń taśmę chirurgiczną. Następnie przenieś sześć mililitrów inokulum na każdą płytkę.

Delikatnie wepchnij sadzonki do inokulum za pomocą końcówki pipety i uruchom minutnik na trzy minuty. Trzymaj po jednej płytce w każdej ręce i przechyl przód talerza w dół, aby zanurzyć liścienie i liście sadzonek. Przetrząśnij inokulum na boki pięć do siedmiu razy, a następnie przechyl płytki z powrotem, aby przykryć korzenie inokulum.

Ponownie przechyl płytki w dół i powtórz cykl w sumie przez trzy minuty. Wylej inokulum z płytek, połóż je na płaskiej powierzchni i odlej resztki inokulum po raz drugi. Ponownie zawiń płytki i umieść je z powrotem w komorze wzrostowej.

Odmiany Moneymaker-PtoR i Moneymaker-PtoS zostały zalane PSTDC3000 i poddane fenotypowaniu od siedmiu do dziesięciu dni po powodzi. Siewki Moneymaker-PtoR były nosicielami klastra genów PtoPRF i były odporne na PSTDC3000. Natomiast prawie izogeniczne siewki Moneymaker-PtoS, które nie potrafią rozpoznać efektorów PSTDC3000 AVRPto lub AVRPto-B zginęły szybko, w ciągu siedmiu dni po powodzi.

Dziesięciodniowe siewki zostały zalane PstT1 i poddane fenotypowi co najmniej dziesięć dni po powodzi. Podatne akcesje były martwe, miały brązowe merystemy wierzchołkowe i brakowało im nowego wzrostu. Natomiast odporne siewki wykazywały wysoki poziom nowego zielonego wzrostu i przetrwały zakażenie PstT1.

Przeprowadzono testy wzrostu bakterii w celu ilościowego potwierdzenia oporności na PstT1 i Solanum NeoRici LA1329. Stwierdzono 1,7 log różnicy we wzroście bakterii między opornym i podatnym LA1329 oraz 1,6 log różnicy między opornym LA1329 a Moneymaker-PtoS, co korelowało z wynikami fenotypowymi. Podczas wykonywania tego testu najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to zwrócenie szczególnej uwagi na technikę aseptyczną w całym protokole i upewnienie się, że wszystkie sadzonki na płytce są dokładnie zalane.

Należy pamiętać o autoklawie zainfekowanych tkanek roślinnych i bakterii oraz utylizować materiały zgodnie z odpowiednimi przepisami.