Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek
30 marca 2020
Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.
Ta metoda jest pomocna w wykrywaniu i kolokalizacji wielu biomarkerów w jednej kriosekcji, w tym markerów, które normalnie nie są wykrywalne w skrawkach parafiny. Dzięki tej eksperymentalnej metodzie barwienia czas barwienia jest znacznie skrócony, a metodę można wykonać w każdym laboratorium. Tę metodę zademonstruje Dinesh Jaishankar.
Jest wykwalifikowanym doktorem habilitowanym z laboratorium, a także kierownikiem ds. oceny immunoterapii. Wybierając przeciwciała do analizy, należy wziąć pod uwagę zestawy filtrów wzbudzenia i emisji dostępne w półautomatycznym systemie obrazowania. Po przetestowaniu różnych kombinacji przeciwciał pierwszorzędowych sprzężonych z fluoroforem, przygotuj fluorofory do użycia, aby zminimalizować nakładanie się widma, jak sugerowano w tabeli.
W przypadku barwienia multipleksowego przygotuj koktajl przeciwciał z kompatybilnymi fluoroforami w ustalonych optymalnych urojeniach i dodaj koktajl do interesujących sekcji tkanki. W przypadku barwienia pojedynczym markerem należy dodać pierwszorzędowe sprzężone przeciwciało tylko do szkiełka. Do wszystkich barwień należy dołączyć kontrolny niebarwiony szkiełko, które jest poddawane tej samej procedurze barwienia bez dodawania pierwszorzędowego sprzężonego przeciwciała.
Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem, umyć szkiełka dwa razy PBS przez pięć minut na pranie. Po drugim praniu wybarwione szkiełka multipleksowe należy wybarwić DAPI przez siedem minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem, a następnie wykonać dwa pięciominutowe prania w PBS. Aby utworzyć bibliotekę spektralną, ustaw moc lampy systemu obrazowania multispektralnego na 100% i otwórz oprogramowanie operacyjne mikroskopu.
Wybierz opcję Edytuj protokół i nowy protokół. Wprowadź nazwę protokołu i wybierz opcję Fluorescencja w trybie obrazowania. Następnie podaj nazwę badania i załaduj pojedyncze poplamione szkiełka na scenę.
Kliknij opcję Edytuj ekspozycję i użyj opcji automatycznego ustawiania ostrości i automatycznego naświetlania, aby dostosować czasy ekspozycji i uzyskać migawki pojedynczych poplamionych slajdów. Po zobrazowaniu pojedynczych barwionych szkiełek zapisz protokół. W oprogramowaniu do uczenia maszynowego na karcie Build Library załaduj każdy pojedynczy poplamiony obraz.
Wybierz odpowiednią podłogę i kliknij przycisk Wyciąg. Oprogramowanie automatycznie wyodrębni sygnał fluorescencyjny wybrany w podłodze. Aby zapisać wyodrębniony kolor, kliknij przycisk Zapisz w sklepie.
Można utworzyć nową grupę lub wyodrębniony kolor można zapisać w istniejącej grupie. W przypadku obrazowania wielospektralnego, po utworzeniu i zweryfikowaniu biblioteki spektralnej, dostosuj czasy ostrości i ekspozycji na szkiełku barwionym multipleksem, jak pokazano, i otwórz zeskanowane slajdy, aby utworzyć nowe zadanie. Podaj identyfikator slajdu i wybierz protokół.
W obszarze Zadanie wybierz opcję Skanowanie całego slajdu, aby wykonać skanowanie całego slajdu na szkiełku barwionym multipleksem. Na całym obrazie skanowania slajdu wybierz obszary zainteresowania na obrazie. Obszary te zostaną zeskanowane przy użyciu wcześniej ustawionych czasów ekspozycji na szkiełku multipleksowym, które zostaną wykorzystane do rozmieszania i analizy spektralnej.
W oprogramowaniu operacyjnym mikroskopu wybierz opcję pobierz pola MSI w obszarze zadanie, a następnie kliknij przycisk Process Slide (Szkiełko procesu), aby uzyskać interesujące Cię obszary przy 20-krotnym powiększeniu. Po uzyskaniu interesujących regionów, w oprogramowaniu do uczenia maszynowego kliknij Plik i Otwórz na karcie analizy ręcznej, aby załadować obrazy barwione multipleksem. Wybierz źródło biblioteki spektralnej i kliknij przycisk Wybierz piętra, aby wybrać poprzednio zapisaną bibliotekę spektralną.
Kliknij Plik i Otwórz, aby załadować niepoplamiony obraz. Następnie kliknij ikonę markera atramentowego autofluorescencji i narysuj linię lub obszar na niezabarwionym szkiełku, aby zidentyfikować autofluorescencję w tkance. Następnie na karcie Edytuj znaczniki i kolory przypisz nazwy dla każdego znacznika i kliknij przycisk Przygotuj wszystko.
Po zweryfikowaniu obrazu spektralnie niezmieszanego, w oprogramowaniu do uczenia maszynowego wybierz opcje błony cytoplazmy i markera z panelu. Za pomocą przycisku wielokropka wybierz Użyj tego sygnału, aby znaleźć, aby skonfigurować marker do wykrywania jąder, cytoplazmy lub błony. po wybraniu markera cytoplazmatycznego lub błonowego wybierz opcję Użyj sygnału, aby wspomóc rozszczepienie jądra.
Oprogramowanie automatycznie wykryje i utworzy indywidualne maski dla jądra, cytoplazmy i błony. Użyj widoku patologii dla określonego znacznika i opcji konfiguracyjnych w oprogramowaniu, aby dostosować maski, a następnie kliknij przycisk Podziel na segmenty wszystko, aby utworzyć mapę segmentacji komórek. Po segmentacji komórek wybierz markery do fenotypu komórek dodatnich.
Dodatkowo wybierz co najmniej pięć komórek, które nie są barwione wybranym markerem, aby fenotypować komórki ujemne. Następnie kliknij przycisk Train Classifier (Trenuj klasyfikator), aby przeszkolić oprogramowanie tak, aby automatycznie wykrywało wszystkie komórki zabarwione wybranymi znacznikami na obrazie. Zostanie utworzona mapa fenotypów.
Jak pokazują te obrazy, przeciwciała zwalidowane dla cytometrii przepływowej mogą być wykorzystane do wizualizacji barwienia tkanek za pomocą przestrajalnego filtra ciekłokrystalicznego w półautomatycznym systemie obrazowania. Tutaj można zaobserwować spektralnie niezmieszany obraz zamrożonego ludzkiego migdałka, który obejmuje znakowanie komórek B i komórek proliferujących w pęcherzykowym centrum rozrodczym i regionie międzypęcherzykowym komórek T. Opcja widoków patologicznych umożliwia wizualizację indywidualnego wzoru barwienia dla każdego markera w tkance będącej przedmiotem zainteresowania, co sugeruje, że metoda barwienia multipleksowego i obrazowanie spektralne działają na zamrożonej tkance.
Jak wykazano na zamrożonym wycinku guza myszy, obrazowanie wielospektralne może być również wykorzystywane do wizualizacji naciekających guz limfocytów T i innych linii komórek szpikowych, w tym makrofagów związanych z nowotworem. Można wygenerować segmentację komórek i mapy fenotypu oraz liczbę barwionych komórek dla każdego markera analizowanego przez oprogramowanie, co pokazuje, że oprogramowanie może być używane do ilościowego oznaczania barwienia wielospektralnego na zamrożonych tkankach. Dla kogoś, kto dopiero zaczyna tę technikę, ważne jest, aby poznać specyficzne cechy swoich fluorochromów i przygotować wysokiej jakości slajdy z biblioteki do rozmieszania spektralnego przy minimalnym nakładaniu się spektralnym.
Ważne jest również wykonanie miareczkowania przeciwciał. Naszym zdaniem, metoda ta może dostarczyć informacji przy łóżku pacjenta na temat skuteczności immunoterapii w leczeniu raka i innych zastosowań terapeutycznych, szczególnie gdy czas ma kluczowe znaczenie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje szybką metodę barwienia do obrazowania wielospektralnego tkanek zamrożonych, umożliwiającą wykrywanie i kolokalizację wielu biomarkerów w jednym przekroju kriostatycznym. Metoda ta znacznie skraca czas barwienia i może być przeprowadzona w każdym laboratorium.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biotechnologia
- Immunologia
Wstęp
- Tradycyjne skrawki parafnowe ograniczają wykrywalność niektórych biomarkerów.
- Mrożone skrawki tkanek zapewniają lepszą konserwację integralności biomarkerów.
- Obrazowanie multispektralne umożliwia jednoczesną analizę wielu markerów.
- Szybkie metody barwienia zwiększają wydajność pracy laboratoryjnej.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej i skutecznej metody barwienia tkanek mrożonych.
- Umożliwienie wykrywania biomarkerów, których zazwyczaj nie można zidentyfikować w przekrojach parafiniowych.
- Ułatwienie zastosowania tej metody w różnych warunkach laboratoryjnych.
Zastosowane metody
- Wybór odpowiednich przeciwciał w oparciu o zestawy filtrów wzbudzenia i emisji.
- Testowanie różnych kombinacji przeciwciał pierwszorzędowych sprzężonych z fluoroforami.
- Dobór fluoroforów w celu zminimalizowania nakładania się widm.
- Prezentacja metody przeprowadzona przez doświadczonego pracownika naukowego na stopniu postdoc.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia ko-lokalizację wielu biomarkerów.
- Czas barwienia jest znacząco krótszy w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Procedurę można przeprowadzić w dowolnych warunkach laboratoryjnych, co zwiększa jej dostępność.
- Wykazano skuteczność metody w wykrywaniu markerów zazwyczaj niewykrywalnych.
Wnioski
- Szybka metoda barwienia jest cennym narzędziem dla badaczy.
- Rozszerza ona możliwości obrazowania wielospektralnego w tkankach mrożonych.
- Podejście to może prowadzić do bardziej kompleksowej analizy biomarkerów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia szybką multipleksową detekcję biomarkerów w zamrożonych skrawkach tkanek, rozwiązując kluczowe ograniczenie testów opartych na materiale FFPE, w których niektóre biomarkery są niewykrywalne z powodu artefaktów fiksacji lub niekompatybilności przeciwciał. Dzięki skróceniu czasu barwienia i wykorzystaniu komercyjnie dostępnych systemów obrazowania multispektralnego, metoda ta wspiera szybszą weryfikację hipotez w programach badawczych z zakresu immunologii i onkologii. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych, umożliwiając analizę przestrzennej ko-lokalizacji markerów odpornościowych i nowotworowych w klinicznie istotnych modelach tkanek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez jednoczesną detekcję do sześciu markerów w pojedynczym cięciu kriostatycznym, co pozwala na wyjaśnienie wzorców koekspresji antygenów.
- Wartość operacyjna: Znacząco skraca czas barwienia w porównaniu z metodami tradycyjnymi, przyspieszając procesy przesiewowe wczesnych etapów poszukiwania biomarkerów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera charakterystykę fenotypową nacieków immunologicznych (np. limfocytów B, limfocytów T, makrofagów) w zamrożonych tkankach ludzkich i mysich, pomagając w ograniczaniu ryzyka związanego z wyborami celów funkcjonalnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez generowanie bibliotek widmowych z kontroli barwionych pojedynczo, co zapewnia minimalny overlap widmowy.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje półautomatyczny system obrazowania multispektralnego do standaryzacji akwizycji i analizy, co poprawia powtarzalność wyników pomiędzy użytkownikami i laboratoriami.
- Skalowalność: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez generowanie ilościowych map fenotypowych dzięki segmentacji komórek i detekcji markerów w oparciu o uczenie maszynowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje integralność biomarkerów w tkankach zamrożonych, oferując system istotny z punktu widzenia choroby do wykrywania markerów niedostępnych w przekrojach FFPE.
- Zgodność z modelami przedklinicznymi: Wykazana użyteczność w zamrożonych przekrojach guzów mysich do wizualizacji naciekających guz T-limfocytów oraz linii mieloidalnych, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad immunoterapią.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwia kwantyfikację barwionych komórek dla każdego markera, dostarczając danych do decyzji typu go/no-go w priorytetyzacji celów i selekcji portfolio.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po walidację przedkliniczną, szczególnie w przypadku immunoterapii, w których kontekst przestrzenny ekspresji biomarkerów ma kluczowe znaczenie dla mechanizmu działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy kolokalizacji wielu biomarkerów w nienaruszonej architekturze tkankowej.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu tworzeniu biblioteki widm oraz skanowaniu całych preparatów przy powiększeniu 20x, co gwarantuje powtarzalne wyniki ilościowe.
- Analityka: Generuje mapy segmentacji i mapy fenotypów za pomocą oprogramowania do uczenia maszynowego, umożliwiając obiektywne porównanie warunków barwienia i populacji komórek.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez zachowanie antygenowości w tkankach zamrożonych, co pozwala na wykrycie markerów utraconych podczas procesu parafianowania.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania analizy multipleksowej biomarkerów w różnych projektach, zmniejszając zależność od jednorazowych protokołów barwienia.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki multipleksowaniu przestrzennemu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i odtwarzalność dzięki półautomatycznemu obrazowaniu oraz sterowanemu programowo rozdzielaniu widm (spectral unmixing).
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając szybkie podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz redukując późne ryzyko biologiczne poprzez wczesną minimalizację ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając ilościowych, rozdzielczych przestrzennie danych o biomarkerach z klinicznie istotnych modeli tkankowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej, doboru przeciwciał pod kątem kompatybilności wzbudzenia/emisji oraz generowania bibliotek widmowych.
- Zależna od dostępu do półautomatycznego systemu obrazowania multispektralnego z filtrem strojonym ciekłokrystalicznym oraz kompatybilnego oprogramowania do analizy opartego na uczeniu maszynowym.
- Wymaga standaryzacji koktajli przeciwciał, protokołów rozcieńczania i kontroli barwienia pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnych wyników w różnych laboratoriach.
- Wymaga adaptacji paneli fluoroforów w celu zminimalizowania nakładania się widm, szczególnie przy rozszerzeniu liczby markerów powyżej sześciu lub zmianie rodzaju tkanki.
- Ograniczenie praktyczne: metoda jest zoptymalizowana dla tkanek mrożonych; wydajność w sekcjach FFPE nie jest potwierdzona i może wymagać ponownej walidacji ze względu na różnice w dostępności antygenów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Antibody and Fluorophore Selecting and Staining
1:52
Spectral Library Preparation
2:59
Multispectral Imaging
3:54
Spectral Unmixing
4:37
Analyzing Multispectral Images via Cell Segmentation and Phenotyping
5:52
Results: Representative Multispectral Imaging and Cell Quantification
7:07
Conclusion
