Name: Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę ukierunkowanej ewolucji endonukleaz restrykcyjnych in vitro z wykorzystaniem kompartmentalizacji. Protokół umożliwia uzyskanie wariantów o bardziej rygorystycznej swoistości sekwencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (0295/B/PO1/2008/34 dla MB i N301 100 31/3043 dla KS), z Narodowego Centrum Nauki (NCN) (UMO-2011/02/A/NZ1/00052, UMO-2014/13/B/NZ1/03991 i UMO-2014/14/M/NZ5/00558 dla MB) oraz przez krótkoterminowe stypendium EMBO dla KS (ATSF 277.00-05).

<ol><li>Schöttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li>
<li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li>
<li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li>
<li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme%3A+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li>
<li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+restriction+endonucleases%3A+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li>
<li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li>
<li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li>
<li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li>
<li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li>
<li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83(2007).</li>
<li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li>
<li>Howland, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowland%2C+JL+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. , Third edition, John Wiley & Sons. New York. (1995).</li>
<li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+DS+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons. New York. (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół selekcji został przetestowany dla NlaIV8, dimerycznej sekwencji rozpoznawania fałd PD-(D / E)XK, która rozpoznaje palindromiczne miejsce docelowe z centralnymi zasadami NN i katalizuje cięcie końca między zasadami NN. NlaIV został wybrany, ponieważ rozszczepienie między zasadami NN sugeruje, że zasady te są zbliżone do białka w kompleksie. Zasadniczo protokół może być stosowany do dowolnej endonukleazy restrykcyjnej specyficznej dla sekwencji, monomerycznej lub dimerycznej, dowolnej grupy fałdowej, katalizującej pęknięcia dwuniciowe dowolnego zataczania, niezależnie od tego, czy domeny katalityczne i specyficzności pokrywają się (jak w przykładzie NlaIV), czy są oddzielne (np. FokI). Co więcej, protokół ten jest w zasadzie przydatny nie tylko do generowania nowej, węższej specyficzności enzymatycznej, ale może być również wykorzystany do eliminacji aktywności gwiazd lub do tworzenia endonukleaz o wysokiej wierności. Jednak wszystko to nie zostało jeszcze przetestowane. W szczególności celowana eliminacja aktywności gwiazdy może być skomplikowana, ponieważ te same reszty aminokwasowe mogą być zaangażowane w wiązanie się z pożądanymi i niepożądanymi zasadami. Etapy in vitro opisane w niniejszym protokole nie ograniczają się do wyboru zawężonych swoistości, ale mogą być również wykorzystane do wybrania swoistości zmienionych w inny sposób. Istnieje jednak problem z endonukleazami wariantowymi: jeśli spektrum substratów obejmuje nowe cele, które nie zostały rozszczepione przez endonukleazę rodzicielską, na ogół nie ma dobrego sposobu ochrony komórek przed szkodliwymi skutkami tej aktywności. W przeciwieństwie do tego, jeśli swoistość endonukleazy jest tylko zawężona, cele są podzbiorem celów typu dzikiego, a zatem już dostępna pokrewna metylotransferaza powinna być w pełni ochronna.
Nasz protokół różni się pod kilkoma względami od wielu protokołów ukierunkowanej ewolucji. Różnorodność otwartych ramek odczytu jest generowana raz na początku eksperymentu, a nie w każdej iteracji. Co więcej, jest tworzony w procesie syntezy typu split-and-mix, a nie przez EP-PCR. Dla podstawień NNS kodonów, użytych w tej pracy, istnieje (4 x 4 x 2)6 ~ 1,07 x 109 kombinacji dla sześciu pozycji. W związku z tym każdy wariant występuje średnio raz na 1,7 mola ESC. Zdolność tę można zwiększyć do siedmiu pozycji, stosując syntezę z mieszaniną 20 prekursorów trinukleotydów, która jest oferowana przez Glen Research lub zmniejszając częstotliwość mutacji w mniej obiecujących pozycjach za pomocą syntezy oligonukleotydów typu split-and-mix. Jeśli to możliwe, zaleca się ograniczenie zakresu zmienności do sześciu pozycji. Oczywiście, takie ukierunkowanie na mutagenezę wymaga pewnej istniejącej wcześniej wiedzy na temat przynajmniej regionów REazy zaangażowanych w wiązanie substratu. Protokół split-and-mix do generowania różnorodności ma wyraźne zalety w porównaniu z EP-PCR. Za pomocą EP-PCR uzyskaliśmy niezmienione warianty i sekwencje niosące osiem podstawień dla ESC NlaIV w tym samym EP-PCR (Tabela 4). Biblioteka z EP-PCR zawiera znaczną część klonów, których należy unikać (sekwencje typu dzikiego, wielokrotne podstawienia, mutacje z przesunięciem ramki i nonsensem oraz mutacje w miejscach, w których jest mało prawdopodobne, aby wpływały na specyficzność sekwencji).
Nasz protokół różni się również od wielu innych protokołów ukierunkowanej ewolucji obecnością dwóch sekwencyjnych etapów selekcji. Selekcja pozytywna zapewnia, że pożądana aktywność zostanie zachowana, w przeciwnym razie znacznik biotyny nie zostanie usunięty, a sekwencję kodującą można usunąć przez pociągnięcie w dół. Jest technicznie możliwe, że przypadkowe pojawienie się nowej, nienakładającej się na siebie specyficzności (np. GCATGC) może również prowadzić do zerwania znacznika biotyny, jeśli odpowiednie miejsce rozszczepienia jest obecne w pobliżu pożądanego rozszczepienia, ale nie gdzie indziej. Powinno to być jednak bardzo mało prawdopodobne. Selekcja ujemna usuwa otwarte ramki odczytu, które kodują enzymy, które nadal mają niepożądaną aktywność. Ten krok nie jest ściśle obowiązkowy, ponieważ protokół nadal wzbogaci bibliotekę wyjściową o warianty, które są w stanie rozszczepić sekwencję wyboru, ale nie są w stanie rozszczepić w innym miejscu ESC, co czyni ją nieodpowiednią do amplifikacji PCR. Oczekuje się jednak, że skuteczność selekcji będzie niższa, ponieważ enzymy o pierwotnej specyficzności sekwencji nie zostaną usunięte z wyników i będą konkurować z obiecującymi wariantami o zmienionej specyficzności, ale także zmniejszonej aktywności enzymatycznej. Należy zauważyć, że na poziomie populacji zarówno pożądane, jak i niepożądane sekwencje docelowe mogą, ale nie muszą, ulegać degeneracji. W przykładzie NlaIV anty-cel był zdegenerowany, a cel nie-zdegenerowany. Nawet jeśli występuje degeneracja na poziomie populacji, w pojedynczej kropli obecny jest tylko jeden (niezdegenerowany) cel lub anty-cel. W naszym protokole sekwencje docelowe i anty-docelowe są ponownie wprowadzane przy każdym powtórzeniu kroków selekcji. W związku z tym, otwarta ramka odczytu musi kodować enzym zdolny do rozszczepienia wszystkich możliwych celów i niezdolny do rozszczepienia żadnego z anty-celów, aby przetrwać wiele rund selekcji. Zwróć uwagę, że konieczność ponownego wprowadzenia celu antyselekcji w każdej iteracji protokołu wymusza dwa sekwencyjne PCR. Pierwszy PCR wykorzystuje starter, który wyżarza się na zewnątrz anty-celu, dzięki czemu rozszczepienie anty-celu zapobiega reakcji PCR. Drugi PCR wymaga startera, który wykracza poza anty-cel i ponownie wprowadza anty-cel, aby upewnić się, że podczas wielu rund selekcji każda otwarta ramka odczytu jest testowana pod kątem wszystkich wariantów anty-celu.
W przypadku enzymów, które generują lepkie końce, można zastosować powiązany alternatywny protokół oparty na wcześniej opisanej metodzie izolacji REazyORF 10 . Zubożenie nieaktywnych wariantów przez wychwytywanie biotyny, które jest stosowane w naszych eksperymentach, jest zastępowane w alternatywnym protokole przez ligację kompatybilnego adaptera z sekwencją, która jest używana jako miejsce wiązania startera w selektywnym PCR (Figura 9). Tylko ESC, które wytwarzają enzymy o wybranej specyficzności, generują końce zdolne do ligacji i dlatego zostaną wybrane. Sekwencja lepkiego końca licznika ewybranej sekwencji musi być zaprojektowana w taki sposób, aby nie mogła uczestniczyć w podwiązywaniu za pomocą adapterów. Iterację procesu selekcji można łatwo osiągnąć, przełączając się między dwoma różnymi adapterami, a co za tym idzie, dwoma różnymi odwróconymi starterami w selektywnym PCR.
Nawet przy nowych protokołach zadanie opracowania nowych specyfików in vitro jest nadal bardzo trudne. W przypadku typowych REaz typu II specyficzność sekwencji i aktywność endonukleolityczna zależą od tych samych regionów białka. Dlatego trudno jest zmienić jedno bez wpływu na drugie. Sukces jest bardziej prawdopodobny dzięki strategii, która bierze pod uwagę ślad enzymu, szanuje symetrię interakcji białko-DNA i opiera się na istniejących wcześniej preferencjach enzymatycznych, które powinny być określone z góry w eksperymentach biochemicznych, tak jak to miało miejsce w przypadku przykładuNlaIV 8.

Inżynieria specyficzności sekwencji jest niezwykle trudna dla klas II. W tej klasie endonukleaz rozpoznawanie sekwencji i kataliza są ze sobą ściśle powiązane, najprawdopodobniej jako ewolucyjne zabezpieczenie przed powstaniem endonukleazy o szerszej specyficzności niż pokrewna metylotransferaza, która uszkodziłaby DNA gospodarza. Ukierunkowana ewolucja nowych specyficzności w komórkach jest dodatkowo skomplikowana ze względu na konieczność ochrony DNA gospodarza przed nowo zmodyfikowaną aktywnością endonukleazy. W związku z tym zgłoszono tylko kilka udanych prób inżynierii REase i wszystkie z nich wykorzystują unikalne cechy konkretnego enzymu1,2,3,4,5,6,7.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół inżynierii specyficzności, który może być wykorzystany do generowania wariantów endonukleazy o węższej specyficzności niż enzym macierzysty, który jest oparty na naszej udanej inżynierii endonukleazy NlaIV8. Dla każdego takiego enzymu z dowolną sekwencją rozpoznawania można wprowadzić dodatkową specyficzność dla zasad w bokach. W przypadku enzymów rodzicielskich, które rozpoznają częściowo zdegenerowane sekwencje (takie jak NlaIV z celem GGNNCC), w sekwencji rozpoznawania można również wprowadzić dodatkową specyficzność. Ponieważ dodatkowa specyficzność będzie prawdopodobnie wymagała kontaktów białko-DNA, nowo rozpoznane zasady powinny leżeć w śladzie endonukleazy rodzicielskiej na DNA. Zasadniczo schematy wyboru można ustawić dla dowolnej specjalizacji sekwencji rozpoznawania. Jednak większość REaz, które rozpoznają palindromiczne i prawie palindromiczne sekwencje docelowe, to funkcjonalne dimery, które rozpoznają tylko połowę miejsca palindromu. W związku z tym selekcja nowych specyficzności, które naruszają symetrię oddziaływań nukleinowych białek, prawdopodobnie nie zadziała. Na przykład dla dimerycznego NlaIV sekwencję GGNNCC można teoretycznie zawęzić do GGATCC, ale oczekuje się, że zawężenie specyficzności do GGAACC będzie trudniejsze. Nasz schemat obejmuje zarówno selekcję pozytywną, jak i negatywną.
Proces jest bardziej wydajny, gdy selekcja negatywna jest również używana do usuwania specyficzności, które są w stanie rozszczepić wszystkie sekwencje inne niż preferowana węższa specyficzność. Na przykład, selekcja dla GGATCC może być połączona z antyselekcją przeciwko GGBVCC (gdzie B jest dowolną bazą inną niż A, a V jest dowolną bazą inną niż T). Gdy niektóre z możliwych sekwencji docelowych nie są uwzględnione, wynik eksperymentu selekcyjnego zależy od skuteczności selekcji pozytywnej i negatywnej. W naszej pracy NlaIV dokonaliśmy selekcji dla GGATCC i przeciwko GGSSCC (gdzie S jest G lub C) i uzyskaliśmy specyficzność, która, ignorując cele łamiące symetrię, może być opisana jako GGWWCC (gdzie W to A lub T), sugerując, że w tym konkretnym przypadku selekcja negatywna była ważniejsza niż selekcja pozytywna.
Nasze podejście zaczyna się od stworzenia kasety wyboru wyrażeń (ESC). ESC składa się z sekcji. W wewnętrznej części rdzenia znajdują się warianty otwartej ramki odczytu (ORF) REazy, pod kontrolą promotora T7. Ta podstawowa sekcja ESC nie może zawierać żadnego pokrewnego miejsca dla zaprojektowanej REazy. Rdzeń jest umieszczony pomiędzy dwoma pokrewnymi miejscami dla dzikiej typu REazy: miejscem rozszczepienia dla niepożądanej aktywności (licznik wybranej sekwencji, GGSSCC w tym przykładzie) i miejscem rozszczepienia dla pożądanej aktywności (wybrana sekwencja, GGATCC w przykładzie). Ostatnim etapem przygotowania ESC w PCR jest dodanie biotyny w pobliżu pożądanej aktywności na końcu 5' i tworzenie różnorodnych sekwencji wybranych przez licznik (w przykładzie GGSSCC). Strategia selekcji opiera się na zastosowaniu starannie zaprojektowanych starterów w protokole reamplifikacji ESC po protokole transkrypcji/translacji/selekcji in vitro (ryc. 1A). Biblioteka ESC jest wyrażona w translacji transkrypcyjnej in vitro emulsji woda w oleju9,10,11. W obrębie każdej kropli specyficzność eksprymowanego enzymu wpływa na stan ESC (Rysunek 1B, krok I). W opisanym układzie pożądana aktywność rozszczepienia translowanego białka usuwa znacznik biotyny DNA, ale nie wpływa na drugi koniec ESC z przeciwnie wybraną sekwencją. Gdy emulsja zostaje rozbita, biotynylowane fragmenty są usuwane przez ściąganie powinowactwa do streptawidyny, tak że pozostają tylko fragmenty kropelek o pożądanej aktywności (Rysunek 1B, krok II). Ten krok usuwa nieaktywne warianty REase. Frakcja supernatantowa etapu pull-down jest następnie amplifikowana metodą PCR. W pierwszej reakcji PCR stosuje się startery F2 i R1 (Figura 1A, B, krok III). Starter F2 wiąże się z sekcją ESC między wybraną sekwencją licznika a końcem cząsteczki. W związku z tym ESC wyrażające warianty, które są zdolne do rozszczepienia wybranej sekwencji licznika (a zatem rozdzielenia miejsc wiązania starterów F2 i R1 na dwie różne cząsteczki DNA) nie są amplifikowane i są w ten sposób usuwane z biblioteki. Starter R1 wiąże się między wybranym miejscem a rdzeniem ESC, tak że nie ma na niego wpływu stan rozszczepienia wybranego miejsca i przywraca miejsce rozszczepienia dla pożądanej aktywności (GGATCC). Cykl zamyka się drugim PCR (ze starterami F1 i R2), który dodaje biotynę na końcu 5' w pobliżu wybranego miejsca i przywraca zaprojektowaną zmienność w przeciwstawnym wybranym miejscu w pobliżu przeciwległego końca ESC (Figura 1B, krok IV). Otrzymana mieszanina DNA jest gotowa do kolejnej rundy selekcji.
Sukces protokołu selekcji zależy w dużej mierze od właściwego wyboru nowej, bardziej rygorystycznej sekwencji rozpoznawania celów oraz od starannego zaprojektowania strategii mutagenezy i jej skutecznego wdrożenia. Ponieważ o wiele łatwiej jest poprawić nieznacznie istniejące wcześniej preferencje REazy niż je przezwyciężyć, zalecamy rozpoczęcie od kinetycznego badania wszelkich istniejących wcześniej preferencji. Konieczność starannego projektowania mutagenezy wynika z ograniczonej wielkości biblioteki mutantów, która może być przetwarzana przez prezentowany protokół (10,9 klonów w jednym eksperymencie). Dlatego wszystkie 20 możliwych podstawień aminokwasów może być skutecznie przetestowanych tylko w kilku pozycjach (patrz Dyskusja). Mutageneza losowa, taka jak podatna na błędy PCR (EP-PCR) przedstawiona jako metoda alternatywna, doprowadzi do głębokiego niedopróbkowania istniejącej złożoności. Jeśli dostępne są jakiekolwiek informacje na temat potencjalnych pozycji aminokwasów biorących udział w kontaktach z DNA (lub nawet znajdujących się w bliskim sąsiedztwie zdegenerowanych nukleotydów w sekwencji pokrewnej), z pewnością powinny one zostać wykorzystane do wyselekcjonowania kilku aminokwasów do mutagenezy nasycenia sterowanej oligonukleotydami (kroki protokołu 1.6-3.10).

<table><tbody><tr><td>1000&Aring; Obsługa CPG (dA, dT, dC, dG)</td><td>Biosset</td><td>45-1000-050</td><td>Można również użyć innych dostawców</td></tr><tr><td>ASM-800 DNA/RNA</td><td>Biosset</td><td>800-001-000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td>Można użyć dowolnego innego zestawu</td></tr><tr><td>Wkład oczyszczający DNA Glen-Pak</td><td>Glen Research</td><td>60-5200</td><td></td></tr><tr><td>HIS-Select Żel powinowactwa do niklu</td><td>Sigma</td><td>P6611</td><td></td></tr><tr>Wektor <td></td><td></td><td>pET 28a</td><td>Zamiast tego można użyć dowolnego innego wektora z promotorem T7 przed miejscem klonowania</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td>Zamiast tego można użyć dowolnego innego termofilnego polimetru o wysokiej wierności i wysokiej jakości</td></tr><tr><td>Porowata folia</td><td>stalowa Biosset</td><td>40-063</td><td></td></tr><tr><td>System szybkiego tłumaczenia RTS 100, E.coli HY Zestaw</td><td>Roche</td><td>3 186 148</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleazy restrykcyjne</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Oczywiście można stosować innych dostawców, enzymy Kulki</td></tr><tr><td>magnetyczne Streptawidyny</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td>Można również użyć innych dostawców. Pozytywnie przetestowaliśmy złoża chemiczne Sigma</td></tr><tr><td>Synthesis, w tym fosforamidy,</td><td>Carl Roth</td><td></td><td>Można również użyć innych dostawców:</td></tr><tr><td>Kolumny syntezy (różne rozmiary)</td><td>Biosset</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>T4, ligaza DNA</td>, <td>Thermo Scientific</td>, <td>EL0011</td><td>Można użyć dowolnej innej ligazy</td></tr></tbody></table>

ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Inżynieria specyficzności endonukleazy restrykcyjnej (REazy) jest niezwykle trudna. Tutaj opisujemy wieloetapowy protokół, który pomaga wytwarzać warianty REazy, które mają bardziej rygorystyczną specyficzność niż enzym macierzysty. Protokół wymaga stworzenia biblioteki kaset selekcyjnych ekspresji (ESC) dla wariantów REazy, najlepiej ze zmiennością pozycji, która może wpływać na wiązanie DNA. ESC jest otoczony z jednej strony sekwencją dla pożądanej aktywności miejsca restrykcji i znacznikiem biotyny, a z drugiej strony przez miejsce restrykcji dla niepożądanej aktywności i miejsce wyżarzania startera. ESC są transkrybowane i translowane w emulsji typu woda w oleju, w warunkach, które sprawiają, że obecność więcej niż jednej cząsteczki DNA na kroplę jest mało prawdopodobna. Dlatego DNA w każdej cząsteczce kasety jest poddawane tylko aktywności translowanego, kodowanego enzymu. Warianty REazy o pożądanej specyficzności usuwają znacznik biotyny, ale nie miejsce wyżarzania podkładu. Po rozbiciu emulsji cząsteczki DNA poddawane są ściąganiu biotyny i tylko te znajdujące się w supernatancie są zatrzymywane. Ten krok zapewnia, że zachowywane są tylko ESC dla wariantów, które nie utraciły pożądanej aktywności. Te cząsteczki DNA są następnie poddawane pierwszej reakcji PCR. Rozszczepienie w niepożądanej kolejności odcina miejsce wiązania podkładu dla jednego ze starterów. Dlatego PCR amplifikuje tylko ESC z kropelek bez niepożądanej aktywności. Następnie przeprowadza się drugą reakcję PCR w celu ponownego wprowadzenia miejsca restrykcji dla pożądanej specyficzności i znacznika biotyny, tak aby można było powtórzyć etap selekcji. Wybrane otwarte ramki odczytu mogą ulegać nadekspresji w komórkach bakteryjnych, które również wyrażają pokrewną metylotransferazę macierzystej REazy, ponieważ nowo wyewoluowana REaza celuje tylko w podzbiór miejsc docelowych metylotransferazy.

Niniejszy protokół jest jedynie narzędziem służącym do zwiększenia częstotliwości występowania pożądanych wariantów zmodyfikowanej REazy poprzez usunięcie (ale nie całkowite wyeliminowanie) dwóch niepożądanych klas: enzymów nieaktywnych oraz endonukleaz o niezmienionej specyficzności sekwencyjnej typu dzikiego. Z drugiej strony, ponieważ zmiana specyficzności REazy jest niezwykle trudna, znalezienie choćby jednego takiego wariantu, który generuje wzór cięcia różniący się od enzymu typu dzikiego w pojedynczym przesiewie 24 klonów, powinno być uznane za sukces. W naszych badaniach najlepsze przesiewy pozwoliły zidentyfikować do 20% obiecujących wariantów (Rysunek 8A).
Pozytywny wynik w dużym stopniu zależy od jakości biblioteki (tzn. ograniczonej częstotliwości substytucji i ich losowego rozkładu) oraz wydajnego wychwytu biotynylowanej populacji członków biblioteki (etapy 3.6–3.7). Oba problemy można wykryć. Jakość biblioteki należy sprawdzić przed selekcją poprzez sekwencjonowanie jak największej liczby klonów (&gt;15) lub poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie biblioteki metodą wysokoprzepustową (etap 3.10, Tabela 3). Jeśli większość wybranych klonów jest nieaktywna, jest to jasna wskazówka dotycząca niepowodzenia selekcji z wykorzystaniem wychwytu streptawidyną. Podobny efekt obserwuje się w przypadku bibliotek poddawanych wielu cyklom selekcji, ponieważ w takich bibliotekach najprawdopodobniej dominują warianty nieaktywne, które uniknęły etapu selekcji z wykorzystaniem wychwytu streptawidyną (Rysunek 8B). Dlatego zaleca się przeprowadzanie screeningu po każdym cyklu selekcji i dalszy rozwój ręcznie wybranych, obiecujących wariantów, zamiast polegania na iteracjach selekcji.
<img alt="Schemat transkrypcji i translacji in vitro; wybór genu, proces PCR; wychwyt streptawidyną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Selekcja in vitro nowej specyficzności sekwencji w oparciu o inżynierię NlaIV. (A) Organizacja kasety ekspresyjnej/selekcyjnej (ESC) obejmuje dwa miejsca rozpoznawania dla REazy: 1) sekwencję wybraną (GGATCC) blisko prawego końca oraz 2) sekwencję kontraselekcyjną (GGSSCC) blisko lewego końca, a także promotor T7p i T7t-T7 oraz terminator T7. Miejsca wiązania starterów są pokazane poniżej. Cięcia wykonywane przez warianty NlaIV typu dzikiego i wyselekcjonowane są przedstawione odpowiednio jako czerwone i zielone trójkąty. (B) Etapy cyklu selekcji: I) Emulsyfikacja mieszanin reakcyjnych transkrypcji-translacji-cięcia z biblioteką ESC; II) Całe biotynilowane DNA jest wychwytywane na cząsteczkach magnetycznych powlekanych streptawidyną i usuwane, co eliminuje warianty nieaktywne; III) ESC kodujące REazy o aktywności typu dzikiego (tj. zdolne do cięcia sekwencji GGSSCC) są eliminowane, ponieważ przecięcie sekwencji oddziela miejsca wiązania starterów forward i reverse. W związku z tym nie dochodzi do amplifikacji tych ESC; IV) Materiał wyjściowy do kolejnej rundy selekcji jest tworzony poprzez dodanie biotyny na prawym końcu i ponowne wprowadzenie zmienności sekwencji kontraselekcyjnych na lewym końcu. Przedrukowano z Czapinska et al.8 za zgodą wydawnictwa Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mapowania genetycznego z miejscami restrykcyjnymi, enzymami (NlaIV, EcoRI) i strzałkami kierunkowymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przygotowanie ESC. Fragment pochodzący z oryginalnej konstrukcji w wektorze ekspresyjnym zawierającym ORF NlaIV pod kontrolą promotora T7 został zmodyfikowany w celu dostosowania go do ekspresji/selekcji. Miejsce NlaIV poniżej ORF NlaIV zostało usunięte, a w obrębie ORF NlaIV wprowadzono unikalne miejsca (SalI, EcoRI i Eco52I), wykorzystane do mutagenezy wybranych pozycji, w formie mutacji cichych. Końcowa konstrukcja została namnożona za pomocą flankujących starterów, które wprowadziły dwa flankujące miejsca NlaIV: sekwencję kontraselekcyjną (GGSSCC) po lewej stronie oraz sekwencję selekcyjną (GGATCC) po prawej stronie. Starter odwrotny wprowadził również biotynę. Startery użyte do stworzenia zmutowanych ECS przedstawiono jako niebieskie strzałki i opisano poniżej (patrz Tabela 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Proces syntezy genów i mutogenezy; mutacje sekwencji DNA; schemat projektu eksperymentalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat syntezy metodą rozdzielania i mieszania (split and mix). Przykład dotyczy syntezy primera MutB, w którym sekwencja NNS została wprowadzona z częstotliwością 0,8 w czterech pozycjach (patrz również Tabela 3). Należy pamiętać, że synteza chemiczna odbywa się w kierunku 3' do 5', ale wszystkie sekwencje są przedstawione w kanonicznej orientacji 5'-3' (tj. w tym schemacie przebiega ona od prawej do lewej). Sekwencje typu dzikiego w pozycjach zmutowanych zaznaczono na zielono, natomiast mutagenne sekwencje NNS na czerwono. Podkreślono miejsce rozpoznawania SalI, które jest później wykorzystywane do wprowadzania mutacji w ESCs. Wskazano punkty etapów mieszania i rozdzielania (2 i 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat edycji genów z enzymem NlaIV.R, trawienie za pomocą SalI, proces ligacji DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wykorzystanie unikalnych miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych w mutagenezie celowanej z użyciem oligonukleotydów. Strategia wprowadzania mutacji przedstawiona jest na przykładzie konstrukcji bibliotek A-C (patrz kroki 3.1–3.7). Przedrukowano z Czapinska et al.8 za zgodą wydawnictwa Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej przedstawiający rozdzielenie DNA, prążki oraz ścieżki 1-4 dla analizy genetycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Cięcie endonukleolityczne w transkrypcji i translacji in vitro. (A) Cięcie substratu testowego w optymalnym buforze dla REazy: 1) Substrat, produkt PCR o długości 612 bp z pojedynczą sekwencją rozpoznawania dla NlaIV; 2) Produkty cięcia, 355 bp i 257 bp. (B) Cięcie w reakcji transkrypcji i translacji in vitro (zawierającej 0,5 µg ESC): 1–2) Alikwoty 15 µL transkrypcji i translacji in vitro bez substratu (ścieżka 2: reakcja uzupełniona o 1,5 mM MgCl2); 3–4) Alikwoty 15 µL transkrypcji i translacji in vitro z 1 µg substratu testowego; (ścieżka 4: reakcja uzupełniona o 1,5 mM MgCl2). Marker wielkości DNA S (pBR322 trawiony MspI). Próbki rozdzielono w 6% natywnym PAGE. DNA barwiono bromkiem etydyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Żel do elektroforezy, rozdzielanie DNA, układ eksperymentalny, markery wielkości po prawej stronie, wyniki analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Produkty pierwszej reakcji PCR w cyklu selekcji. Patrz Rysunek 1B, krok III; krok protokołu 5.10. Zestawy kolumn 1 i 2 to alikwoty dwóch różnych bibliotek naniesione w trzech powtórzeniach. Standard wielkości S-DNA (lambda DNA trawione HindIII i EcoRI). Strzałka wskazuje pozycję pełnej długości ESC (1,050 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy wykazujący rozdział białek; analiza rozkładu masy cząsteczkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Warianty NlaIV oczyszczone do dalszego przesiewania w mikroskali. Patrz krok 6.3.11. Każda ścieżka zawiera 10 µL aliquoty innego wariantu. Standard masy cząsteczkowej białek S. Masa cząsteczkowa podjednostki REazy NaIV wynosi 29.9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej przedstawiający rozdzielanie DNA i wzory prążków do analizy i porównania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Przykłady przesiewania wariantów NlaIV pod kątem zmiany specyficzności sekwencji. Patrz krok 6.4.2. (A) Udane przesiewanie z wysoką częstotliwością obiecujących wariantów. S = marker wielkości DNA, lambda DNA trawiona HindIII i EcoRI; typy dzikie (wt) = lambda DNA trawiona NlaIV typu dzikiego; λ = substrat lambda DNA, nietrawiony; pozostałe kolumny = warianty o bardzo niskiej aktywności. Warianty są oznaczone: ! = obiecujące warianty, które wykazują wzór cięcia różniący się od enzymu typu dzikiego; ? = warianty, które również mogą mieć zmienioną preferencję sekwencji. (B) Nieudane przesiewanie, w którym większość wariantów jest nieaktywna, a jeden wariant wykazuje pozornie niezmieniony wzór cięcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces edycji genów; schemat cięcia sekwencji DNA, ligacji adaptera i selektywnego PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Alternatywna selekcja poprzez ligację. Tę alternatywę można zastosować dla wszystkich REaz generujących lepkie końce. Przedstawiamy tutaj przykładowy protokół schematu selekcji dla enzymu MwoI (niepublikowany). I) Sekwencja wyselekcjonowana (znajdująca się na prawym końcu ESC) z określonymi resztami zaznaczonymi na czerwono i wyselekcjonowaną wariacją sekwencji kognatywnej zaznaczoną na niebiesko. W nawiasach poniżej pokazano sekwencję kontr-wyselekcjonowaną, która ma zostać umieszczona na lewym końcu ESC; II) Produkt cięcia MwoI; III) Po zakończeniu transkrypcji/translacji in vitro produkty są oczyszczane i przeprowadzana jest ligacja z nadmiarem adaptera. W ligacji mogą uczestniczyć tylko produkty cięcia, które zostały przecięte w sekwencji wyselekcjonowanej. W związku z tym warianty nieaktywne są eliminowane, a etap pulldown jest niepotrzebny. Produkt cięcia w sekwencji kontr-wyselekcjonowanej (na lewym końcu ESC, niewidoczny) nie może uczestniczyć w tej ligacji, ponieważ wystający koniec adaptera nie jest komplementarny do sekwencji kontr-wyselekcjonowanej; IV) Selektywny PCR wykorzystuje tę samą strategię co w głównym protokole w celu wyeliminowania wariantów o specyficzności sekwencji zdegenerowanej typu dzikiego (primer F1 wiążący się dystalnie względem miejsca kontr-wyselekcjonowanego), podczas gdy warianty nieaktywne są eliminowane przez selektywny primer odwrotny, który nie może związać się z nieprzeciętym (a zatem niemodyfikowanym przez ligację adaptera) prawym końcem. W kolejnym cyklu proces można powtórzyć, używając adaptera identycznego z produktem cięcia z poprzedniego etapu (tj. „przeciętej kasety” na panelu III) oraz odpowiedniego selektywnego primera odwrotnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Startery użyte w inżynierii NlaIV. Sekwencje miejsc restrykcyjnych wspomniane w komentarzach są podkreślone. Małe litery oznaczają sekwencje, które nie mają komplementarności w matrycach DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela 2: Warunki reakcji PCR stosowane w protokole. Tm = temperatura topnienia starterów (jeśli Tm różni się dla poszczególnych starterów, należy przyjąć niższą wartość Tm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela 3: Wyniki kontroli jakości dwóch starterów mutagennych zsyntezowanych strategią split-and-mix. Kodony poddane mutagenezie oznaczono jako [XXX]. Niższy indeks wskazuje pozycję kodowanego aminokwasu. Adaptowano z Czapinska et al.8 za zgodą wydawnictwa Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela 4: Wyniki EP-PCR. Główne parametry uzyskane z analizy sekwencji 22 klonów ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Nasz protokół pozwala na tworzenie enzymów restrykcyjnych o zmienionej, bardziej rygorystycznej specyficzności sekwencji, przy użyciu kompartmentalizacji in vitro i unikalnej strategii selekcji w ukierunkowanej ewolucji. Potencjalnie jest to dość uniwersalne, ponieważ powinno mieć zastosowanie do każdego ograniczenia endonukleazy, a selekcja może być skierowana na dowolną, bardziej rygorystyczną wersję oryginalnej sekwencji pokrewnej. Jeśli nowo utworzone warianty są wyrażane przez transkrypcję-translację in vitro, protokół jest odpowiedni nie tylko do zawężenia swoistości, ale także do zmiany swoistości.Aby zdecydować o miejscach do mutagenezy subsaturacji, należy wybrać częstość mutagenezy zgodnie z hipotetycznym znaczeniem miejsc, mając na uwadze ograniczenia dotyczące ogólnej złożoności biblioteki. Aby rozpocząć syntezę, włóż do syntezatora kolumny, które zostały wypełnione nową żywicą. Zsyntetyzować oligonukleotydy we wszystkich kolumnach aż do trypletu, bezpośrednio poprzedzając drugie miejsce mutagenezy przesycenia, licząc od końca trzech pierwszych.Zsyntetyzować, pozostawiając na końcu pięcioosobową grupę trytylową. Grupa chroniąca zostanie usunięta na początku następnego cyklu syntezy. Otwórz kolumny syntezy i na krótko odwiruj do suchych probówek o pojemności 1,5 mililitra, aby zebrać żywicę.Pociągnij wspornik syntezy CPG i wymieszaj przez wirowanie. Ponownie podziel zmieszaną żywicę CPG na nowe kolumny syntezy. Unikaj wprowadzania wilgoci, ponieważ zmniejszy to ogólną wydajność.Kontynuować syntezę, zaczynając od trypletu miejsca mutagenezy przesycenia. Przypisz kolumny do losowych trojaczków NNS lub trojaczków typu dzikiego zgodnie z pożądaną częstością mutagenezy. Jeśli obecne są dodatkowe miejsca podnasycenia, należy przejść tylko do trypletu poprzedzającego następne miejsce mutagenezy podnasycenia.Jeśli w dalszej części rzeki nie ma już miejsc nasycenia, należy zakończyć syntezę, pozostawiając na końcu pięcioelementową grupę trytylową. Użyj końcówek do pipet o szerokim otworze, aby przygotować mieszaninę olejowych środków powierzchniowo czynnych, dodając 225 mikrolitrów Span 80 i 25 mikrolitrów Tween 80 do pięciu mililitrów oleju mineralnego w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Dokładnie wymieszaj przez delikatne odwrócenie 15 razy.Mieszanina na tym etapie powinna być półprzezroczysta. Dla każdej biblioteki przenieś 950 mikrolitrów mieszaniny olejowych środków powierzchniowo czynnych do dwumililitrowej fiolki kriogenicznej z okrągłym dnem. Oznacz etykietą z nazwą biblioteki i przenieś do lodu.Umieścić jedno małe cylindryczne mieszadło do każdej fiolki. Przygotować mieszaninę reakcji transkrypcji i translacji in vitro zgodnie z sugestiami producenta. Uzupełnij mieszaninę chlorkiem magnezu do końcowego stężenia 1,5 milimola.Dozować 50 mikrolitrów podwielokrotności mieszaniny reakcyjnej do 1,5 mililitrowych probówek na lodzie. Dodać 1,7 femtomoli z biblioteki do mieszaniny reakcyjnej na lodzie. Przygotuj kolejno emulsję typu woda w oleju dla każdej biblioteki, umieszczając najpierw małą zlewkę wypełnioną lodem na mieszadle magnetycznym z prędkością mieszania ustawioną na 1150 obr./min.Następnie przenieś fiolkę kriogeniczną z 950 mikrolitrami mieszaniny olejowych środków powierzchniowo czynnych i małym mieszadłem do lodowatej zlewki na mieszadle magnetycznym. Sprawdź, czy pręt mieszający się obraca. Dodać pięć 10-mikrolitrowych porcji mieszaniny transkrypcji-translacji z biblioteki in vitro w ciągu dwóch minut w odstępach 30-sekundowych i kontynuować mieszanie przez dodatkową minutę.Przenieść fiolkę z emulsją do pojemnika na lód. W tym momencie płyn powinien być nieprzezroczysty, a nie półprzezroczysty. Następnie przejdź do następnej biblioteki.Po przetworzeniu wszystkich bibliotek rozpocznij inkubację wszystkich bibliotek zgodnie z zaleceniami producenta zestawu. Przenieś fiolki do temperatury optymalnej dla zmodyfikowanej endonukleazy na dodatkowe dwie godziny przed umieszczeniem ich na lodzie na co najmniej 10 minut. Przenieś emulsje z fiolek kriogenicznych do probówek o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj jeden mikrolitr 5 molowych EDTA. I odwirować je z prędkością 13 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Jeśli po odwirowaniu nie widać wyraźnie granicy faz woda-olej, należy zamrozić mieszaninę przed aspiracją górnej fazy olejowej.Przesuń górną fazę olejową za pomocą pipety i wyrzuć. Natychmiast przeprowadzić ekstrakcję, dodając do fazy wodnej 150 mikrolitrów chloroformu fenolowego i 100 mikrolitrów 10 milimolowych Tris-HCl. Wirować, a następnie przeprowadzić separację faz przez 30-sekundowe wirowanie przy 13 000 razy g.Zebrać górną fazę wodną. Wytrącić DNA, dodając 15 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu, 2,5 do pięciu mikrogramów glikogenu i 375 mikrolitrów etanolu. Po inkubacji próbek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez godzinę, wirować przez 15 minut w temperaturze 13 000 razy g, cztery stopnie Celsjusza.Odrzucić supernatant i krótko umyć osad jednym mililitrem zimnego 70% etanolu. Suszyć osad glikogenu DNA w odkurzaczu lub suszarce powietrznej przez okres dłuższy niż pięć minut. Następnie rozpuść osad w 50 mikrolitrach 10 milimolowych Tris-HCl.Następnie dodaj pięć mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny, przygotowanych zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaj przez godzinę w temperaturze pokojowej, najlepiej w mikserze karuzelowym lub delikatnie wirując. Przenieś rurki na stojak magnetyczny, aby oddzielić koraliki.Następnie zbierz płyn wzbogacony w DNA bez biotyny. Protokół ten jest narzędziem do zwiększania częstości występowania pożądanych wariantów zmodyfikowanych endonukleaz restrykcyjnych poprzez zubożenie nieaktywnych enzymów i endonukleaz o niezmienionej swoistości sekwencji typu dzikiego. Udane badania przesiewowe mogą zidentyfikować do 20% obiecujących wariantów.Warianty są oznaczane jako obiecujące warianty, jeśli wytwarzają wzór rozszczepienia różniący się od enzymu typu dzikiego. Warianty, które mogły mieć zmienioną preferencję sekwencji, są również oznaczone etykietami. Pokazano tutaj nieudane badanie przesiewowe, w którym większość wariancji jest nieaktywna, oraz jeden wariant z pozornie niezmienionym wzorcem rozszczepienia.W tym przypadku biblioteki są najprawdopodobniej zdominowane przez nieaktywne warianty, które uniknęły etapu wyboru wychwytywania streptawidyny. Niezwykle ważne jest staranne zaprojektowanie wybranych i przeciwselekcjonowanych sekwencji oraz ograniczenie różnorodności bibliotek poprzez strategię mutagenezy, która generuje podstawienia tylko w kilku wybranych pozycjach. Najlepiej wybrane warianty powinny być dokładnie scharakteryzowane pod kątem kinetyki wiązania i rozszczepienia na preferowanych i nierozszczepionych sekwencjach w oparciu o wyniki wstępnego badania przesiewowego.W naszym przypadku testowym miejsca mutagenezy zostały wybrane na podstawie modelu homologii. Co zaskakujące, struktura krystaliczna wykazała później, że niektóre zmienione reszty najprawdopodobniej nie mają bezpośredniego kontaktu z DNA.

in-vitro-directed-evolution-restriction-endonuclease-with-more

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Opracowano nową metodę ewolucji kierowanej, specyficzną dla dziedziny inżynierii termostabilności, a następnie zwalidowano ją dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej ewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie wyższą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Nowa metoda przesiewowa dla ewolucji sterowanej termostabilnych enzymów bakterio();tycznych

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Tutaj prezentujemy protokół optymalizujący CRISPR-Cas9 w celu osiągnięcia wyższej specyficzności bez utraty aktywności na miejscu. Używamy podejścia ukierunkowanej ewolucji zwanego Sniper-screen, aby znaleźć zmutowanego Cas9 o pożądanych cechach. Sniper-Cas9 jest kompatybilny ze skróconymi pojedynczymi przewodnikami RNA i dostarczaniem w formacie rybonukleoproteiny, dobrze znanymi strategiami osiągania wyższej specyficzności.

Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

W tym miejscu przedstawiamy protokół redukcji modyfikacji DNA w bakteriofagach za pomocą enzymu NgRET, umożliwiający skuteczną i pozbawioną blizn mutagenezę CRISPR-Cas. Metoda ta ułatwia inżynierię genetyczną fagów do zastosowań w biotechnologii i terapii fagowej.

Precyzyjna mutageneza fagowa za pomocą systemów CRISPR-Cas wspomaganych NgET

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.

Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Poznaj metodę ukierunkowanej ewolucji endonukleaz restrykcyjnych in vitro z wykorzystaniem kompartmentalizacji. Protokół umożliwia uzyskanie wariantów o bardziej rygorystycznej swoistości sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Przeglądaj więcej filmów