Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Nasz protokół pozwala na tworzenie enzymów restrykcyjnych o zmienionej, bardziej rygorystycznej specyficzności sekwencji, przy użyciu kompartmentalizacji in vitro i unikalnej strategii selekcji w ukierunkowanej ewolucji. Potencjalnie jest to dość uniwersalne, ponieważ powinno mieć zastosowanie do każdego ograniczenia endonukleazy, a selekcja może być skierowana na dowolną, bardziej rygorystyczną wersję oryginalnej sekwencji pokrewnej. Jeśli nowo utworzone warianty są wyrażane przez transkrypcję-translację in vitro, protokół jest odpowiedni nie tylko do zawężenia swoistości, ale także do zmiany swoistości.

Aby zdecydować o miejscach do mutagenezy subsaturacji, należy wybrać częstość mutagenezy zgodnie z hipotetycznym znaczeniem miejsc, mając na uwadze ograniczenia dotyczące ogólnej złożoności biblioteki. Aby rozpocząć syntezę, włóż do syntezatora kolumny, które zostały wypełnione nową żywicą. Zsyntetyzować oligonukleotydy we wszystkich kolumnach aż do trypletu, bezpośrednio poprzedzając drugie miejsce mutagenezy przesycenia, licząc od końca trzech pierwszych.

Zsyntetyzować, pozostawiając na końcu pięcioosobową grupę trytylową. Grupa chroniąca zostanie usunięta na początku następnego cyklu syntezy. Otwórz kolumny syntezy i na krótko odwiruj do suchych probówek o pojemności 1,5 mililitra, aby zebrać żywicę.

Pociągnij wspornik syntezy CPG i wymieszaj przez wirowanie. Ponownie podziel zmieszaną żywicę CPG na nowe kolumny syntezy. Unikaj wprowadzania wilgoci, ponieważ zmniejszy to ogólną wydajność.

Kontynuować syntezę, zaczynając od trypletu miejsca mutagenezy przesycenia. Przypisz kolumny do losowych trojaczków NNS lub trojaczków typu dzikiego zgodnie z pożądaną częstością mutagenezy. Jeśli obecne są dodatkowe miejsca podnasycenia, należy przejść tylko do trypletu poprzedzającego następne miejsce mutagenezy podnasycenia.

Jeśli w dalszej części rzeki nie ma już miejsc nasycenia, należy zakończyć syntezę, pozostawiając na końcu pięcioelementową grupę trytylową. Użyj końcówek do pipet o szerokim otworze, aby przygotować mieszaninę olejowych środków powierzchniowo czynnych, dodając 225 mikrolitrów Span 80 i 25 mikrolitrów Tween 80 do pięciu mililitrów oleju mineralnego w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Dokładnie wymieszaj przez delikatne odwrócenie 15 razy.

Mieszanina na tym etapie powinna być półprzezroczysta. Dla każdej biblioteki przenieś 950 mikrolitrów mieszaniny olejowych środków powierzchniowo czynnych do dwumililitrowej fiolki kriogenicznej z okrągłym dnem. Oznacz etykietą z nazwą biblioteki i przenieś do lodu.

Umieścić jedno małe cylindryczne mieszadło do każdej fiolki. Przygotować mieszaninę reakcji transkrypcji i translacji in vitro zgodnie z sugestiami producenta. Uzupełnij mieszaninę chlorkiem magnezu do końcowego stężenia 1,5 milimola.

Dozować 50 mikrolitrów podwielokrotności mieszaniny reakcyjnej do 1,5 mililitrowych probówek na lodzie. Dodać 1,7 femtomoli z biblioteki do mieszaniny reakcyjnej na lodzie. Przygotuj kolejno emulsję typu woda w oleju dla każdej biblioteki, umieszczając najpierw małą zlewkę wypełnioną lodem na mieszadle magnetycznym z prędkością mieszania ustawioną na 1150 obr./min.

Następnie przenieś fiolkę kriogeniczną z 950 mikrolitrami mieszaniny olejowych środków powierzchniowo czynnych i małym mieszadłem do lodowatej zlewki na mieszadle magnetycznym. Sprawdź, czy pręt mieszający się obraca. Dodać pięć 10-mikrolitrowych porcji mieszaniny transkrypcji-translacji z biblioteki in vitro w ciągu dwóch minut w odstępach 30-sekundowych i kontynuować mieszanie przez dodatkową minutę.

Przenieść fiolkę z emulsją do pojemnika na lód. W tym momencie płyn powinien być nieprzezroczysty, a nie półprzezroczysty. Następnie przejdź do następnej biblioteki.

Po przetworzeniu wszystkich bibliotek rozpocznij inkubację wszystkich bibliotek zgodnie z zaleceniami producenta zestawu. Przenieś fiolki do temperatury optymalnej dla zmodyfikowanej endonukleazy na dodatkowe dwie godziny przed umieszczeniem ich na lodzie na co najmniej 10 minut. Przenieś emulsje z fiolek kriogenicznych do probówek o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj jeden mikrolitr 5 molowych EDTA. I odwirować je z prędkością 13 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Jeśli po odwirowaniu nie widać wyraźnie granicy faz woda-olej, należy zamrozić mieszaninę przed aspiracją górnej fazy olejowej.

Przesuń górną fazę olejową za pomocą pipety i wyrzuć. Natychmiast przeprowadzić ekstrakcję, dodając do fazy wodnej 150 mikrolitrów chloroformu fenolowego i 100 mikrolitrów 10 milimolowych Tris-HCl. Wirować, a następnie przeprowadzić separację faz przez 30-sekundowe wirowanie przy 13 000 razy g.

Zebrać górną fazę wodną. Wytrącić DNA, dodając 15 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu, 2,5 do pięciu mikrogramów glikogenu i 375 mikrolitrów etanolu. Po inkubacji próbek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez godzinę, wirować przez 15 minut w temperaturze 13 000 razy g, cztery stopnie Celsjusza.

Odrzucić supernatant i krótko umyć osad jednym mililitrem zimnego 70% etanolu. Suszyć osad glikogenu DNA w odkurzaczu lub suszarce powietrznej przez okres dłuższy niż pięć minut. Następnie rozpuść osad w 50 mikrolitrach 10 milimolowych Tris-HCl.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny, przygotowanych zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaj przez godzinę w temperaturze pokojowej, najlepiej w mikserze karuzelowym lub delikatnie wirując. Przenieś rurki na stojak magnetyczny, aby oddzielić koraliki.

Następnie zbierz płyn wzbogacony w DNA bez biotyny. Protokół ten jest narzędziem do zwiększania częstości występowania pożądanych wariantów zmodyfikowanych endonukleaz restrykcyjnych poprzez zubożenie nieaktywnych enzymów i endonukleaz o niezmienionej swoistości sekwencji typu dzikiego. Udane badania przesiewowe mogą zidentyfikować do 20% obiecujących wariantów.

Warianty są oznaczane jako obiecujące warianty, jeśli wytwarzają wzór rozszczepienia różniący się od enzymu typu dzikiego. Warianty, które mogły mieć zmienioną preferencję sekwencji, są również oznaczone etykietami. Pokazano tutaj nieudane badanie przesiewowe, w którym większość wariancji jest nieaktywna, oraz jeden wariant z pozornie niezmienionym wzorcem rozszczepienia.

W tym przypadku biblioteki są najprawdopodobniej zdominowane przez nieaktywne warianty, które uniknęły etapu wyboru wychwytywania streptawidyny. Niezwykle ważne jest staranne zaprojektowanie wybranych i przeciwselekcjonowanych sekwencji oraz ograniczenie różnorodności bibliotek poprzez strategię mutagenezy, która generuje podstawienia tylko w kilku wybranych pozycjach. Najlepiej wybrane warianty powinny być dokładnie scharakteryzowane pod kątem kinetyki wiązania i rozszczepienia na preferowanych i nierozszczepionych sekwencjach w oparciu o wyniki wstępnego badania przesiewowego.

W naszym przypadku testowym miejsca mutagenezy zostały wybrane na podstawie modelu homologii. Co zaskakujące, struktura krystaliczna wykazała później, że niektóre zmienione reszty najprawdopodobniej nie mają bezpośredniego kontaktu z DNA.