Name: Wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metodę oceny ochrony komórek nabłonka rogówki przed wysuszeniem za pomocą preparatów sztucznych łez. Badanie wykorzystuje pomiar aktywności metabolicznej komórek w modelu in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują firmie Alcon za wsparcie finansowe dla tych badań.

1. Hodowla ludzkich komórek nabłonka rogówki
<ol>
	<li>Uprawiaj unieśmiertelnione HCEC19 w pokrytych kolagenem75 cm 2 kolbach z 20 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle / składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Potrząsanie nie jest wymagane.</li>
	<li>Zmieniaj nośnik co 2-3 dni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do testowania
<ol>
	<li>Po tym, jak komórki prawie się zlewają, usuń pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Dodaj 4-6 ml roztworu dysocjacyjnego komórek do każdych kolb o długości 75 cm2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek (około 20-30 min), okresowo sprawdzając pod mikroskopem.</li>
	<li>Dodać 2-6 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS do każdej kolbyo długości 75 cm2.</li>
	<li>Przenieść zawartość kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 450−500 x g przez 5 min. Odpipetować supernatant i ponownie zawiesić komórki w podgrzanym pożywce.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość nośnika, który zawiera łącznie 1 x 105 komórek.</li>
	<li>Dodaj 1 x 105 komórek do każdej studzienki 48-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1. Dodaj tyle pożywki do studzienki, aby końcowa objętość pożywki w studzience wynosiła 0,5 ml kultury DMEM/F12 z 10% FBS. 
	UWAGA: Preparat sztucznego łez może powodować cytotoksyczność, którą można zmierzyć poprzez zmniejszenie aktywności metabolicznej HCEC. Spójność danych zależy od dodania tej samej liczby HCEC do każdego dołka podczas wysiewu. Stężenie kultury zalecane dla płytek 48-dołkowych wynosi 1 x 105. Ponieważ komórki ssaków mogą osadzać się w probówce wirówkowej po ponownym zawieszeniu, zaleca się częste zawieszanie komórek przez mieszanie podczas wysiewania płytek z komórkami, tak aby zawiesina komórkowa miała równomiernie rozłożony HCEC.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Brak protokołu osuszania
<ol>
	<li>Procedura kontrolna
	<ol>
		<li>Po 24 godzinnej inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną z płytki.</li>
		<li>Natychmiast poddać działaniu 150 μl preparatu testowego i roztworu kontrolnego pożywki.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.</li>
		<li>Usuń roztwory testowe z komórek.</li>
		<li>Dodaj 0,5 ml 10% metabolicznego roztworu barwnika, aby przetestować aktywność metaboliczną. Inkubować komórki przez kolejne 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Po 4-godzinnym okresie inkubacji usunąć 100 μl metabolicznego roztworu barwnika z każdej studzienki i umieścić każde 100 μl w studzience z 96-dołkową płytką.</li>
		<li>Zmierz fluorescencję każdej studzienki za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (Tabela materiałów). Ustaw długość fali wzbudzenia na 540 nm, a długość fali emisji na 590 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Brak protokołu osuszania (procedura odzyskiwania)
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 3.1.1−3.1.4.</li>
		<li>Dodaj 0,5 ml pożywki DMEM/F12 do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować jeden zestaw kultur przez 18 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Usuń pożywkę i dodaj 0,5 ml 10% metabolicznego roztworu barwnika. Powtórz kroki 3.1.6 i 3.1.7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Protokół osuszania
<ol>
	<li>Procedura kontrolna
	<ol>
		<li>Po 24 godzinnej inkubacji (krok 2.8) usunąć pożywkę hodowlaną z płytki.</li>
		<li>Natychmiast poddać działaniu 150 μl preparatu testowego i roztworu kontrolnego pożywki.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.</li>
		<li>Usuń roztwory testowe z komórek.</li>
		<li>Umieść komórki w komorze o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 45% na 5 minut, aby wysuszyć komórki.</li>
		<li>Dodaj 0,5 ml 10% roztworu barwnika metabolicznego, aby przetestować aktywność metaboliczną. Inkubować komórki przez kolejne 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Po 4-godzinnym okresie inkubacji usunąć 100 μl metabolicznego roztworu barwnika z każdej studzienki i umieścić każde 100 μl w studzience z 96-dołkową płytką.</li>
		<li>Zmierz fluorescencję każdej studzienki za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ustaw długość fali wzbudzenia na 540 nm, a długość fali emisji na 590 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura odzyskiwania należności
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 4.1.1-4.1.5.</li>
		<li>Dodaj 0,5 ml pożywki DMEM/F12 do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować jeden zestaw kultur przez 18 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Usuń pożywkę i dodaj 0,5 ml 10% metabolicznego roztworu barwnika. Powtórz kroki 4.1.7 i 4.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczyć średnią fluorescencję kontrolnego medium. Obliczyć procentową żywotność próbki, korzystając z następującego wzoru: 
	Procent żywotności próbki = fluorescencja próbki testowej/fluorescencja kontrolna pożywki x 100 
	UWAGA: Średnia kontrola nośnika to 100% żywotności. Sam barwnik metaboliczny ma związaną z nim niewielką ilość fluorescencji. Fluorescencję odczynnika barwnika metabolicznego można odjąć od fluorescencji próbki kontrolnej i badanej przed obliczeniem % żywotności badanych próbek w stosunku do pożywki kontrolnej.</li>
	<li>Przeprowadzić test normalności i test na równe odchylenia w próbkach kontrolnych i testowych.</li>
	<li>Jeśli test normalności zakończy się pomyślnie, a wariancje są równe, wykonaj jednokierunkową analizę ANOVA. Aby zidentyfikować znaczące różnice między określonymi grupami, wykonaj test porównań parami post hoc (tj. testy wielokrotnych porównań Tukeya lub Dunnetta).</li>
	<li>Jeśli test normalności zakończy się pomyślnie, a wariancje są różne, wykonaj ANOVA firmy Welch. Aby zidentyfikować znaczące różnice między określonymi grupami, należy przeprowadzić test porównań post hoc (tj. testy wielokrotnych porównań Dunnetta lub Gamesa-Howella).</li>
	<li>Jeśli test normalności zakończy się niepowodzeniem, należy użyć testu nieparametrycznego (tj. testu Kruskala-Wallisa). Aby zidentyfikować znaczące różnice między określonymi grupami, wykonaj test porównań parami post hoc (tj. test Dunna).</li>
</ol>

<ol><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li>
<li>Maurer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+acute+corneal+injury+in+rabbits+with+surfactants+of+different+type+and+irritancy%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).</li>
<li>Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+viability+reagent+PrestoBlue+in+comparison+with+alamarBlue+and+MTT+to+assess+the+viability+of+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).</li>
<li>Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+alamar+blue+reduction+for+the+in+vitro+assay+of+hepatocyte+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity.</a> Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).</li>
<li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubricating+agents+differ+in+their+protection+of+cultured+human+epithelial+cells+against+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation.</a> Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).</li>
<li>Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+artificial+tears+against+desiccation+in+cultured+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells.</a> Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).</li>
<li>Ubels, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+investigation+of+the+efficacy+of+an+artificial+tear+solution+containing+hydroxypropyl-guar+as+a+gelling+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent.</a> Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).</li>
<li>Hovakimyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+protective+effects+of+trehalose+on+desiccation+of+epithelial+cells+in+three+dimensional+reconstructed+human+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium.</a> Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).</li>
<li>Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+efficacy+of+ocular+surface+lubricants+against+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration.</a> Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).</li>
<li>Matsuo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+protects+corneal+epithelial+cells+from+death+by+drying%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying.</a> British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+activated+NLRP3+inflammasomes+initiate+inflammation+in+hyperosmolarity+stressed+human+corneal+epithelial+cells+and+environment-induced+dry+eye+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients.</a> Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+Effects+of+L-Carnitine+Against+Oxidative+Injury+by+Hyperosmolarity+in+Human+Corneal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).</li>
<li>Schulze, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trefoil+factor+family+peptide+3+%28TFF3%29+is+upregulated+under+experimental+conditions+similar+to+dry+eye+disease+and+supports+corneal+wound+healing+effects+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).</li>
<li>Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+quality+and+relative+humidity+in+commercial+aircrafts%3A+An+experimental+investigation+on+short-haul+domestic+flights%5BTitle%5D)+AND+%22Building+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights.</a> Building and Environment. 67, 69-81 (2013).</li>
<li>van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+seasonality+and+effects+of+psychrometry+in+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).</li>
<li>Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+culture+media+and+deswelling+agents+on+survival+of+human+corneal+endothelial+and+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).</li>
<li>Zachari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Alamarblue+Assay+for+Adherent+Cell+Irradiation+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Dose-Response%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments.</a> Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).</li>
<li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li>
<li>Benelli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systane+lubricant+eye+drops+in+the+management+of+ocular+dryness%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness.</a> Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).</li>
<li>Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity%3A+A+review+and+primer+on+atmospheric+moisture+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health.</a> Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).</li>
<li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Adverse+Environment+Chambers+in+Dry+Eye+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research.</a> Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).</li>
<li>McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+evaporation+on+aqueous+tear+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Ophthalmological+Society%22%5BJournal%5D)">Impact of evaporation on aqueous tear loss.</a> Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).</li>
<li>Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+the+tear+film+lipid+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of the tear film lipid layer.</a> Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).</li>
<li>Purslow, C., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+temperature%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Ocular surface temperature: a review.</a> Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).</li>
<li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+of+the+MTT+assay%3A+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over%2Funderestimation+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li>
<li>Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+salts+and+formazan+products+in+Cell+Biology%3A+Viability+assessment%2C+fluorescence+imaging%2C+and+labeling+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives.</a> Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+new+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Rampersad, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Applications+of+Alamar+Blue+as+an+Indicator+of+Metabolic+Function+and+Cellular+Health+in+Cell+Viability+Bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays.</a> Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).</li>
<li>Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyethyl+disulfide+as+an+efficient+metabolic+assay+for+cell+viability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).</li>
<li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).</li>
<li>Uzunoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+XTT+and+Alamar+blue+assays+in+the+assessment+of+the+viability+of+various+human+cancer+cell+lines+by+AT-101+%28-%2F-+gossypol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol).</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).</li>
<li>McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+functions+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase functions in cell death and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716(2015).</li>
<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desiccation+tolerance+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Desiccation tolerance in human cells.</a> Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).</li>
<li>Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+Lipid-Based+Products+in+the+Management+of+Dry+Eye+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).</li>
<li>Lievens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+enhanced+viscosity+artificial+tear+for+moderate+to+severe+dry+eye+disease%3A+A+multicenter%2C+double-masked%2C+randomized+30-day+study%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Lens+%26+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study.</a> Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).</li>
</ol>

Troje autorów (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) jest pracownikami firmy Alcon. Firma Alcon jest jedynym źródłem finansowania i sponsorem tego projektu. Lyndon W. Jones w ciągu ostatnich 3 lat otrzymał wsparcie badawcze lub honoraria wykładowców od następujących firm: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass i Visioneering. Lyndon Jones jest również konsultantem i/lub zasiada w radzie doradczej firm Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis i Ophtecs. Poniższa lista autorów nie ma nic do ujawnienia: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.

Protokół ten ma na celu określenie ochronnego działania roztworów sztucznych łez przed wysuszeniem komórek. Początkowo komórki są wystawiane na działanie kropli do suchego oka w celu pokrycia komórek. Następnie komórki są suszone, a aktywność metaboliczna jest monitorowana w celu oceny, czy preparaty mogą złagodzić szkodliwe skutki stresu związanego z wysuszaniem. Kroki te mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ogólnego wpływu, jaki preparaty suchego oka mogą mieć na ogólną żywotność komórek nabłonka rogówki.
Po usunięciu większości preparatów z suchym okiem z dołków hodowlanych, chemia pozostałych cząsteczek, które mają kontakt z komórkami, będzie miała wpływ na wysuszenie komórek. Niektóre produkty zawierają mikroemulsje olejów, które minimalizują parowanie komórek20. Badanie, w którym oceniano analizę tarcia po płukaniu, wykazało utrzymanie niskiego tarcia w przypadku niektórych preparatów suchego oka, co może być wskaźnikiem wydłużonego czasu przebywania preparatów suchego oka21. Jednym z ograniczeń tego testu jest to, że chociaż ochronę przed wysuszeniem można ocenić w porównaniu z innymi preparatami kropli do oczu, nie można określić czasu trwania tej ochrony ze względu na oceniany krótki czas schnięcia. Dłuższe czasy schnięcia w tym teście in vitro mogą wymagać użycia kultur wielowarstwowych, które mają ogólnie większą zawartość wilgoci niż monowarstwa komórkowa.
W przypadku zmiany wartości temperatury i wilgotności może być konieczne dostosowanie określonych czasów inkubacji preparatów na komórkach oraz czasu trwania suszenia. Wybór temperatury, wilgotności względnej i przepływu powietrza do symulacji warunków stresu środowiskowego, które mogą przyczyniać się do suchego oka, może być trudny, ponieważ sezonowe i lokalne warunki środowiskowe są dość zmienne21. Nowoczesne komory środowiskowe do badań na ludziach mogą zmieniać temperaturę w zakresie od 5 °C do 35 °C, a wilgotność względną od 5% do 95%22. Za pomocą parownika i szczelnie dopasowanych okularów stwierdzono, że przy wilgotności względnej 40−45% szybkość parowania z rogówki wynosiła 0,037 μl/cm2/min, a przy wilgotności względnej 20−25% szybkość parowania wynosiła 0,065 μl/cm2/min23. Jeśli model in vitro analizuje ochronne działanie preparatów w warunkach ekstremalnie niskiej wilgotności względnej, takich jak samoloty15, pustynie lub suche środowiska wewnętrzne16, może być konieczne skrócenie czasu inkubacji, aby dostosować się do zwiększonej szybkości parowania z komórek. W ludzkim płynie łzowym obecne są różne lipidy pochodzące z meiboma i innych gruczołów, które chronią łzy przed parowaniem. Te lipidy mają różne temperatury topnienia24. Zmiany temperatury mogą mieć wpływ na płynność płynu łzowego, dlatego testy przeprowadzone w temperaturze otoczenia mogą charakteryzować się znacznie innymi szybkościami parowania niż testy przeprowadzone w temperaturze 37 °C. Ponieważ średni zakres temperatur powierzchni oka wynosi od 32,9 do 36 °C25, zaleca się wykonanie badania w pobliżu tego zakresu temperatur.
Oprócz barwnika metabolicznego (alamarBlue) stosowanego w tym protokole istnieją inne odczynniki chemiczne, które można wykorzystać do oceny wpływu preparatów produktów na aktywność metaboliczną komórek. Sole tetrazolowe (MTT, XTT, MTS, WST) są alternatywnymi substancjami chemicznymi, które można stosować. Różnica w solach tetrazolowych polega na tym, że MTT jest dodatnio naładowaną cząsteczką, więc może dostać się do cytoplazmy żywych komórek26. MTT staje się nierozpuszczalny po jego zmniejszeniu przez NAD(P)H27. Musi być rozpuszczony przed odczytaniem absorbancji na czytniku płytkowym. Pozostałe sole tetrazolium są naładowane ujemnie28. Muszą być redukowane przez cząsteczki wtórne na zewnątrz żywej komórki, ponieważ nie mogą dostać się do komórki i bezpośrednio oddziaływać z cząsteczkami wewnątrzkomórkowymi29. W przypadku testów XTT, MTS i WST-1 dodanie środka sprzęgającego elektrony 1-metoksy-metasiarczanu fenazyny (PMS) może poprawić wydajność testów30. W przeciwieństwie do testów metabolicznych, które wykorzystują sole tetrazoliowe, alamarBlue nie wymaga dodatkowych środków rozpuszczających lub sprzęgających elektrony. Ponadto, w przeciwieństwie do XTT, MTS lub WST-1, alamarBlue przenika przez błony komórkowe i może być redukowany bezpośrednio przez enzymy komórkowe27,29. Bezpośrednie porównanie alamarBlue z solami tetrazolium wykazało, że alamarBlue jest bardziej czuły na ocenę aktywności metabolicznej różnych linii komórkowych, w tym HCEC 3,27,31,32.
Inne biochemiczne punkty końcowe mogą być również brane pod uwagę przy ocenie ochrony ludzkich komórek nabłonka rogówki przez wysuszenie. Barwniki fluorescencyjne mogą być stosowane do wykrywania przepuszczalności błony komórkowej i aktywności esterazy komórkowej1. Apoptozę można również wykryć poprzez barwienie markerów apoptotycznych na powierzchni komórki lub pomiar aktywności kaspazy 1,33. Inne testy określiły wpływ produktów okulistycznych na połączenia ścisłe HCEC34. Testy te mogą zostać włączone do przyszłych ocen z wykorzystaniem procedur osuszania opisanych w tym artykule.
Istnieje wiele przyczyn suchego oka. Suche oko może być spowodowane zmniejszonym wydzielaniem łez, zwiększonym stanem zapalnym powierzchni oka lub zwiększonym odwodnieniem na powierzchni oka. W przypadku osób, które mają suche oko parujące, stosowanie kropli do suchego oka, która zapobiega wysuszeniu komórek w warunkach wysuszenia, może złagodzić objawy suchego oka. Jednym z problemów w niektórych preparatach suchego oka jest obecność konserwantów, które mogą uszkodzić powierzchnię oka. Uszkodzenie komórek nie jest pomocne dla pacjentów z zespołem suchego oka, ponieważ może spowodować śmierć większej liczby komórek, ponieważ uszkodzone komórki są bardziej podatne na stres związany z wysuszeniem35.
Niedawny artykuł przeglądowy Garrigue i wsp.36 zawiera ocenę aktualnej wiedzy na temat działania produktów na bazie lipidów w celu złagodzenia suchego oka spowodowanego parowaniem. Dodanie lipidów do łez z niedoborem lipidów może zapobiec parowaniu, chroniąc w ten sposób komórki przed wysuszeniem. Ponadto humektanty to cząsteczki, które przyciągają i zatrzymują wodę na powierzchni oka37. Zarówno gliceryna w roztworze #1, jak i glikol propylenowy w roztworze #3 są humektantami. Roztwór #3 wykazał silniejsze działanie ochronne HCEC, które mogło wynikać z właściwości lipidowych i humektantowych składników preparatu.
Protokół ten ma na celu ocenę aktywności metabolicznej HCEC po ekspozycji na preparaty suchego oka i na stres związany z wysuszaniem. Stosując metody opisane w tym artykule, można opracować nowe, niedrażniące i ochronne krople do oczu dla osób cierpiących na suche oko wyparne.

Wiele różnych składników w wielodawkowych roztworach okulistycznych jest potrzebnych do utrzymania stabilności, pH, osmolarności i skuteczności. Jednak niektóre substancje chemiczne, takie jak konserwanty lub środki powierzchniowo czynne w roztworach do oczu, mogą powodować uszkodzenie nabłonka rogówki1,2. Testy żywotności komórek z wykorzystaniem ludzkich komórek nabłonka rogówki (HCEC) można przeprowadzić w celu oceny potencjalnych uszkodzeń spowodowanych przez te różne składniki w preparatach okulistycznych. Jednym z testów in vitro, który jest szczególnie przydatny do oceny uszkodzeń komórek, jest test alamarBlue3. W tym teście barwnik metaboliczny (tj. alamarBlue) zawiera rezazurynę, która działa jako wskaźnik żywotności komórek. Podczas oddychania komórkowego rezazuryna jest redukowana do rezorufiny poprzez akceptację elektronów4. Zmniejszenie stężenia rezorufiny powoduje zmianę cząsteczki z niefluorescencyjnej na cząsteczkę fluorescencyjną, którą można wykryć za pomocą spektrofluorometru5.
To badanie wykorzystuje dwie różne metody leczenia komórek nabłonka rogówki, aby określić, jak produkty suchego oka mogą działać w modelu in vitro. W pierwszej ocenie komórki są traktowane tymi produktami przez 30 minut. Po leczeniu komórki są następnie oceniane pod kątem aktywności metabolicznej natychmiast po ekspozycji na produkty z suchym okiem i po okresie rekonwalescencji. Ocena ta określa wpływ tych produktów na komórki przed wysuszeniem w komorze wilgotnościowej. Konserwanty w roztworach, środki powierzchniowo czynne lub w tych roztworach mogą mieć pewne działanie cytotoksyczne na komórki, które można wykryć za pomocą barwnika metabolicznego.
Druga ocena określa aktywność metaboliczną komórek po ekspozycji na produkty suchego oka i wysuszeniu. W tej ocenie, jeśli obróbka produktem zapewnia ochronę komórek przed uszkodzeniem spowodowanym wysuszeniem, aktywność metaboliczna komórek zostanie utrzymana. Ochrona komórek przed szkodliwymi skutkami wysuszenia może wystąpić, jeśli produkt suchego oka może pokryć komórki lipidami lub produkt może wchłonąć płyn z otoczenia, dodając wilgoci do komórek.
Ten protokół jest przeznaczony do symulacji ciężkich warunków stresu środowiskowego na komórkach. W innych badaniach wykorzystano różne modele do stworzenia tego zewnętrznego stresu. Niektóre badania suszyły komórki w okapach z przepływem laminarnym6,7,8, podczas gdy inne używały temperatury pokojowej i różnych wartości wilgotności względnej (RH)9,10,11. Metodą symulacji stanu suchego oka jest zwiększenie osmolarności roztworu inkubacyjnego12,13. Inną metodą in vitro do symulacji niekorzystnych warunków środowiskowych jest dodanie cytokin do pożywki komórkowej w celu symulacji płynu łzowego u pacjentów z zespołem suchego oka14. Chociaż testy te są interesującymi modelami, które mogą ocenić, w jaki sposób substancje chemiczne zmniejszają stres osmotyczny lub stymulują układ odpornościowy, modele te nie pokazują bezpośrednio, w jaki sposób preparaty chemiczne mogą chronić komórki przed stresem wysuszenia.
Model suszenia wykorzystuje komorę temperaturowo-wilgotnościową 37 °C i 45% wilgotności względnej. Symuluje warunki środowiskowe, które mogą powodować parowanie z powierzchni oka. Symulacje innych ekstremalnych warunków środowiskowych, takich jak niska wilgotność występująca w kabinach samolotów15 lub w pomieszczeniach w miesiącach zimowych16 mogą być również wykonywane przy użyciu tej metody.
Modelowanie hodowli komórkowych służy do symulacji wpływu stresu związanego z suszeniem na ludzką rogówkę. W celu wykrycia stresu komórkowego przeprowadza się testy żywotności komórek w celu określenia wpływu na zdrowie komórek. Na komórkach można przeprowadzić kilka różnych testów fizjologicznych, aby określić, czy są zestresowane17. W analizie przeprowadzonej w tej procedurze badawczej wykorzystuje się dostępny w handlu barwnik metaboliczny (tabela materiałów). Ma tę przewagę nad wieloma innymi testami stresu komórkowego, że jest nietoksyczny, rozpuszczalny w pożywkach wzrostowych i może oceniać komórki bez fiksacji komórek18. W tej procedurze komórki są testowane pod kątem aktywności metabolicznej natychmiast po każdym zabiegu, a drugi zestaw komórek umieszcza się z powrotem w pożywce wzrostowej i ocenia po 18 godzinach rekonwalescencji. Powodem natychmiastowego testowania, a następnie po okresie rekonwalescencji jest zidentyfikowanie uszkodzeń komórek, które powodują natychmiastowy wpływ na aktywność metaboliczną oraz uszkodzeń komórek, które powodują opóźnione efekty. Daje również możliwość oceny wpływu tych preparatów na krótkotrwałe i długoterminowe uszkodzenia oraz zdolności preparatów do powrotu do zdrowia/braku rekonwalescencji po początkowej zniewadze.
To badanie służy do porównywania różnych produktów suchego oka zawierających lipidy pod kątem ich wpływu na aktywność metaboliczną HCEC z wysuszeniem i bez wysuszenia. Składniki badanych produktów z zespołem suchego oka są opisane w Tabeli Materiałów. Składnikami w roztworze #1 są sól sodowa karboksymetylocelulozy (0,5%), gliceryna (1%) i polisorbat 80 (0,5%), w roztworze #2 są to lekki olej mineralny (1,0%) i olej mineralny (4,5%), a w roztworze #3 lipid to olej mineralny, a glikol propylenowy jest środkiem łagodzącym. Lipidy te są składnikami preparatu, od których oczekuje się, że zapewnią ochronę HCEC przed wysuszeniem.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 Kolba wentylowana</td><td>Corning</td><td>354485</td><td>Jest to 96-dołkowa płytka powlekana kolagenem marki BioCoat</td></tr><tr><td></td><td>costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Corning 48 Płytki dołkowe</td><td>Corning</td><td>354505</td><td>Jest to pokryta kolagenem marki BioCoat</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>Może odczytywać fluorescencję od 280 - 700 nm (do testu 540/590)</td></tr><tr><td>DMEM/F12 z L-glutaminą i 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>W tym podłożu nie ma czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Hycone</td><td>w surowicy bydlęcej płodu</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki nabłonka rogówki</td><td>University of Ottawa</td><td>N/A</td><td>Unieśmiertelnione SV40 ludzkie komórki nabłonka rogówki od dr M. Griffitha (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Kanada) i zostały scharakteryzowane przez Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Funkcjonalne odpowiedniki ludzkiej rogówki zbudowane z linii komórkowych. Nauka. 1999; 286:2169&ndash;72.</td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowo-temperaturowa</td><td>Powiązane systemy środowiskowe</td><td>LH-1.5</td><td>Linia ekonomiczna Komora wilgotnościowa</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100X stężenie więc dodaj 1 ml do każdych 99 ml podłoża</td></tr><tr><td>Refresh Optive Advanced (roztwór #1)</td><td>Allergan, Inc</td><td></td><td>Karboksymetyloceluloza Sód (0,5%),Gliceryna (1%),Polisorbat 80 (0,5%),-Smary- Składniki nieaktywne-Kwas borowy; kopolimer karbomeru typu A; olej rycynowy; Erytrytol; lewokarnityna; woda oczyszczona; Puryt (stabilizowany kompleks oksychlorowy) i może zawierać wodorotlenek sodu w celu dostosowania pH.</td></tr><tr><td>Ukojenie XP (roztwór #2)</td> <td>Bausch & Olej</td> mineralny Lomb <td></td><td>Light (1,0%), Olej mineralny (4,5%)-emolienty-Składniki nieaktywne-kwas borowy, wersenian disodowy, oktoksynol-40, polyquaternium-1 (konserwant), polisorbat 80, woda oczyszczona, dekahydrat boranu sodu. Może zawierać kwas solny i/lub wodorotlenek sodu (w celu dostosowania pH).</td></tr><tr><td>Systane Complete (rozwiązanie #3)</td><td>Alcon Inc.</td><td></td><td>Glikol propylenowy 0,6% Smar Składniki nieaktywne - kwas borowy, dimyrystoyl fosfatydyloglicerol, edatete disodium, hydroksypropyl guar, olej mineralny, stearynian polioxlu 40, POLYQUAD&reg; (polyquaternium-1) 0,001% konserwantu, tristearynian sorbitanu, sorbitol i woda oczyszczona. Może zawierać kwas solny i/lub wodorotlenek sodu w celu dostosowania pH.</td></tr><tr><td>TrypLE Express (roztwór do dysocjacji komórek)</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12605036" target="_blank">12605036</a></td><td></td></tr></tbody></table>

wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Sztuczne preparaty łez zawierające lipidy są opracowywane w celu zmniejszenia parowania łez poprzez przywrócenie wadliwej warstwy lipidowej łez. Preparaty zapobiegające wysuszaniu komórek, które zapobiegają wysuszaniu komórek, spowodują ochronę powierzchni oka i utrzymanie aktywności metabolicznej komórek. Podczas odwodnienia komórki przechodzą proces utraty aktywności metabolicznej, a następnie śmierci komórki. W pracy opisano metodę oceny skuteczności preparatów na sztuczne łzy. Barwnik metaboliczny (tj. alamarBlue) zmienia się z cząsteczki rezazuryny o niskiej fluorescencji w cząsteczkę fluorescencyjną rezorufinę w żywych komórkach. Wydajność biologiczna preparatu ze sztucznymi łzami jest mierzona jako zdolność preparatu do (a) utrzymania żywotności komórek oraz (b) zapewnienia im ochrony przed wysuszeniem. Pożywki wzrostowe i sól fizjologiczna są używane jako kontrole w testach żywotności/wysuszania komórek. Komórki inkubuje się z roztworami testowymi przez 30 minut, a następnie suszy się przez 0 lub 5 minut w temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 45%. Następnie określa się aktywność metaboliczną komórek po początkowej ekspozycji i po wysuszeniu komórek. Wyniki pokazują porównawczy wpływ preparatów kropli do oczu na aktywność metaboliczną komórek i ochronę przed wysuszeniem. Metodę tę można zastosować do testowania preparatów z suchym okiem, które są przeznaczone do leczenia osób z suchym okiem wyparnym.

Wyniki badania porównującego trzy formulacje na zespół suchego oka przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek ten wykazuje różnice w wpływie trzech produktów: roztworu nr 1, roztworu nr 2 oraz roztworu nr 3 (Tabela materiałów) na żywotność HCEC. Roztwór nr 1 i roztwór nr 2 miały istotny wpływ na aktywność metaboliczną HCEC przed wysuszeniem. Oznacza to, że w produktach tych znajdują się składniki formulacji, które mogą zaburzać aktywność metaboliczną HCEC. Dodatkowy spadek aktywności metabolicznej komórek, który wystąpił po 18 h regeneracji komórek eksponowanych na roztwór nr 1, wskazuje, że HCEC zostały początkowo uszkodzone i po 18 h uszkodzenie to nie zostało naprawione. W porównaniu do nich, roztwór nr 3 miał jedynie łagodny wpływ na aktywność metaboliczną HCEC.
Rysunek 2 przedstawia wpływ tych lipidowych preparatów na zespół suchego oka na ochronę komórek. Przy aktywności metabolicznej HCEC bliskiej 0% w 18 h odstępie czasu regeneracji, roztwór #1 oraz roztwór #2 nie chroniły komórek przed stresem wysuszeniowym. Roztwór #3 zapewnił jednak pewną ochronę przed stresem wysuszeniowym.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający wpływ produktów na suchość oka na żywotność komórek w czasie, porównanie roztworów 1-3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wpływ produktów wzbogaconych w lipidy na suchość oka na żywotność komórek. Względna żywotność mierzona aktywnością metaboliczną HCEC po zastosowaniu produktów na suchość oka zawierających lipidy. * = istotność statystyczna (p &lt; 0.05) w stosunku do roztworu nr 3, Δ = istotność statystyczna (p &lt; 0.05) w stosunku do kontroli z medium dla odpowiedniego okresu rekonwalescencji. Wysokość słupka reprezentuje wartość średnią, a słupki błędów oznaczają SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy ochrony przed wysychaniem, żywotność komórek, porównanie roztworów, analiza regeneracji po 18 godzinach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wpływ produktów wzbogaconych lipidami na ochronę przed wysychaniem w przebiegu zespołu suchego oka. Wpływ formulacji na zespół suchego oka zawierających lipidy na ochronę komórek. Roztwór nr 1 i roztwór nr 2 nie chroniły komórek przed stresem wywołanym wysychaniem i nie odnotowano w ich przypadku regeneracji po efektach wysychania w czasie. W przeciwieństwie do nich, roztwór nr 3 zapewnił pewną ochronę przed stresem wywołanym wysychaniem. * = p &lt; 0.05 w stosunku do roztworu nr 3, a Δ = p &lt; 0.05 w stosunku do nieleczonego medium (kontrolnego) dla odpowiedniego czasu regeneracji. Wysokość słupka reprezentuje wartość średnią, a słupki błędów to SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Celem tego protokołu jest ocena, czy różne preparaty sztucznych łez mogą chronić ludzkie komórki nabłonka rogówki przed wysuszeniem za pomocą modelu in vitro. Po wystawieniu na działanie preparatów sztucznych łez i wysuszeniu, ludzkie komórki nabłonka rogówki są oceniane pod kątem aktywności metabolicznej.

Wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Celem tego protokołu jest ocena w modelu in vitro, czy preparaty sztucznych łez mogą chronić ludzkie komórki nabłonka rogówki przed wysuszeniem. Ta metoda może być wykorzystana do identyfikacji preparatów suchego oka, które mogą pomóc w ochronie oczu u osób z objawami suchego oka. Test ten wykorzystuje bardzo czułą miarę wykrywania aktywności metabolicznej komórek nabłonka rogówki.W rezultacie można wykryć niewielkie zmiany w zdrowiu komórek rogówki spowodowane wysuszeniem. Dzisiejszą procedurę zademonstrują Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran i Adeline Suko. Zacznij od wyhodowania unieśmiertelnionych ludzkich komórek nabłonka rogówki w kolbach pokrytych kolagenem z 20 mililitrami DMEM / F12 zawierającymi 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny / streptomycyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni.Gdy komórki prawie się zlewają, usuń pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj od czterech do sześciu mililitrów pożywki do dysocjacji komórek do każdej kolby. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż się oderwą, okresowo sprawdzając je pod mikroskopem. Dodaj od dwóch do sześciu mililitrów DMEM/F12 z 10% FBS do każdej kolby i przenieś zawartość do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować komórki w temperaturze od 450 do 500 razy g przez pięć minut. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym podłożu. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru i oblicz objętość zawierającą 100 000 komórek.Dodaj pożywkę do każdej studzienki 48-dołkowej, pokrytej kolagenem I płytki hodowlanej wraz z obliczoną objętością komórek, upewniając się, że końcowa objętość w każdym dołku wynosi 0,5 mililitra. Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny. W celu przeprowadzenia procedury kontrolnej należy usunąć pożywkę hodowlaną z dołków i natychmiast potraktować komórki 150 mikrolitrami preparatu testowego lub roztworu kontrolnego pożywki.Następnie inkubuj komórki przez 30 minut. Usuń roztwór testowy z komórek i dodaj 0,5 mililitra 10% metabolicznego roztworu barwnika. Inkubuj komórki przez kolejne cztery godziny.Po inkubacji usuń 100 mikrolitrów roztworu barwnika z każdej studzienki i przenieś go na 96-dołkową płytkę. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć fluorescencję każdej studzienki, ustawiając wzbudzenie na 540 nanometrów i emisję na 590 nanometrów. W celu przeprowadzenia procedury odzysku, należy inkubować komórki z roztworami testowymi lub kontrolami, jak opisano wcześniej.Następnie dodaj 0,5 mililitra pożywki DMEM/F12 do każdego dołka. Inkubuj komórki przez 18 godzin. Następnie usuń pożywkę i przetestuj aktywność metaboliczną.Aby przeprowadzić procedurę kontrolną, należy usunąć pożywkę hodowlaną z komórek na płytce 48-dołkowej i natychmiast poddać je działaniu preparatu testowego lub roztworu kontrolnego pożywki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Po inkubacji usuń roztwory testowe z komórek i umieść je w komorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności 45% na pięć minut w celu wysuszenia.Następnie dodaj 0,5 mililitra 10% metabolicznego roztworu barwnika i inkubuj komórki przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji przenieś 100 mikrolitrów metabolicznego roztworu barwnika z każdej studzienki na 96-dołkową płytkę i zmierz fluorescencję. Aby przeprowadzić procedurę odzyskiwania, powtórzyć poprzednio opisany protokół i dołączyć 18-godzinną inkubację z pożywką DMEM/F12 po etapie suszenia.Następnie przeprowadź analizę statystyczną danych zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Porównano trzy preparaty suchego oka pod kątem ich wpływu na żywotność ludzkich komórek nabłonka rogówki. Roztwory pierwszy i drugi miały znaczący wpływ na aktywność metaboliczną komórek przed wysuszeniem.Komórki wystawione na działanie roztworu pierwszego wykazywały dodatkowy spadek aktywności metabolicznej komórek po 18-godzinnej rekonwalescencji, co oznacza, że początkowo zostały uszkodzone, a uraz nie został naprawiony. Dla porównania, roztwór trzeci miał tylko łagodny wpływ na aktywność metaboliczną komórek nabłonka. Porównując zdolność tych preparatów zawierających lipidy do ochrony komórek, stwierdzono, że roztwory pierwszy i drugi nie chroniły komórek przed stresem związanym z wysuszeniem.Rozwiązanie trzecie zapewniało jednak pewną ochronę. Podczas wysiewania komórek na płytki pokryte kolagenem upewnij się, że zawiesina komórek zawiera komórki, które są równomiernie wymieszane, tak aby każda studzienka była wysiana z równą liczbą komórek. Roztwór trzeci wykazał statystycznie istotną poprawę żywotności komórek i ochrony przed stresem związanym z wysuszeniem w porównaniu z pozostałymi dwoma produktami zawierającymi lipidy.Możliwe, że olej mineralny z fosfolipidami, wraz z HP-guar i glikolem propylenowym, pozwala roztworowi trzeciemu zapewnić ochronę komórek rogówki przed nawodnieniem i zmniejszyć parowanie pod wpływem wysuszenia.

effect-artificial-tear-formulations-on-metabolic-activity-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje test fluorometryczny in vitro, który ma na celu ocenę wpływu preparatów sztucznych łez na komórkową aktywność metaboliczną komórek nabłonka rogówki przy użyciu roztworu niebieskiego Alamar na bazie resazuryny. Nietoksyczny preparat utrzymuje komórki w zdrowym, metabolicznie aktywnym stanie, ułatwiając redukcję rezazuryny do wysoce fluorescencyjnej rezorufiny.

Test alamarBlue: czuła metoda fluorometryczna do badania cytotoksycznego wpływu preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki

Ten film demonstruje metodę oceny gładkości rogówki i stabilności filmu łzowego w autoimmunologicznym modelu szczura. Podkreśla wpływ dysfunkcji gruczołów na stabilność filmu łzowego, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia choroby suchego oka.

Ocena gładkości rogówki i łez w autoimmunologicznym modelu szczurzym z suchym okiem

Obecne modele in vitro do oceny soczewek kontaktowych (CL) i innych zastosowań związanych z oczami są poważnie ograniczone. Prezentowana platforma okularowa symuluje fizjologiczny przepływ łez, objętość łez, ekspozycję na powietrze oraz zużycie mechaniczne. System ten jest bardzo wszechstronny i może być stosowany do różnych analiz in vitro z CL.

Opracowanie platformy ocznej in vitro do badania soczewek kontaktowych

Ten artykuł opisuje rozwój metody wywoływania ostrej lub przewlekłej choroby suchego oka u królików poprzez wstrzykiwanie konkanawaliny A do wszystkich części układu gruczołu łzowego oczodołu. Ta metoda, lepsza od już opisanych, generuje powtarzalny, stabilny model suchego oka, odpowiedni do badania środków farmakologicznych.

Króliczy model zespołu suchego oka z niedoborem wody wywołanej wstrzyknięciem konkanawaliny A do gruczołów łzowych: zastosowanie do badań skuteczności leków

Przedstawiono nowatorskie podejście do wywoływania przewlekłej choroby suchego oka u królików poprzez chirurgiczne usunięcie wszystkich gruczołów łzowych oczodołu. Ta metoda, odmienna od wcześniej opisanych, daje stabilny, powtarzalny model suchego oka z niedoborem wody wodnistej, dobrze nadający się do badania fizjologii i patofizjologii łez oraz terapii okulistycznej.

Opracowanie modelu ciężkiego zespołu suchego oka za pomocą całkowitej dacryoadenektomii u królików

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia mysiego modelu suchego oka z niedoborem wody wodnej poprzez wycięcie gruczołów łzowych zewnątrzoczodołowych i podoczodołowych oraz ocenę zmian na powierzchni oka w suchym oku z niedoborem wodnistości.

Opracowanie mysiego modelu suchego oka z niedoborem wody wodnistej

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

OSTSS prowadzi do gromadzenia się mediatorów stanu zapalnego w filmie łzowym, powodując objawy takie jak epiforia i dyskomfort. W tym miejscu przedstawiamy przypadek, w którym terapeutyczne płukanie nosowo-łzowe co 2 miesiące rozwiązało epiforę i swędzenie, co sugeruje jego skuteczność jako interwencji terapeutycznej w przypadku OSTSS. Dodatkowo zgłaszamy subiektywną poprawę objawów u 3 dodatkowych pacjentów.

Płukanie nosowo-łzowe w leczeniu zespołu toksycznej zupy na powierzchni oka

Poznaj metodę oceny ochrony komórek nabłonka rogówki przed wysuszeniem za pomocą preparatów sztucznych łez. Badanie wykorzystuje pomiar aktywności metabolicznej komórek w modelu in vitro.

Wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie

Przeglądaj więcej filmów