Wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie

Celem tego protokołu jest ocena w modelu in vitro, czy preparaty sztucznych łez mogą chronić ludzkie komórki nabłonka rogówki przed wysuszeniem. Ta metoda może być wykorzystana do identyfikacji preparatów suchego oka, które mogą pomóc w ochronie oczu u osób z objawami suchego oka. Test ten wykorzystuje bardzo czułą miarę wykrywania aktywności metabolicznej komórek nabłonka rogówki.

W rezultacie można wykryć niewielkie zmiany w zdrowiu komórek rogówki spowodowane wysuszeniem. Dzisiejszą procedurę zademonstrują Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran i Adeline Suko. Zacznij od wyhodowania unieśmiertelnionych ludzkich komórek nabłonka rogówki w kolbach pokrytych kolagenem z 20 mililitrami DMEM / F12 zawierającymi 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny / streptomycyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni.

Gdy komórki prawie się zlewają, usuń pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj od czterech do sześciu mililitrów pożywki do dysocjacji komórek do każdej kolby. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż się oderwą, okresowo sprawdzając je pod mikroskopem. Dodaj od dwóch do sześciu mililitrów DMEM/F12 z 10% FBS do każdej kolby i przenieś zawartość do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Odwirować komórki w temperaturze od 450 do 500 razy g przez pięć minut. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym podłożu. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru i oblicz objętość zawierającą 100 000 komórek.

Dodaj pożywkę do każdej studzienki 48-dołkowej, pokrytej kolagenem I płytki hodowlanej wraz z obliczoną objętością komórek, upewniając się, że końcowa objętość w każdym dołku wynosi 0,5 mililitra. Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny. W celu przeprowadzenia procedury kontrolnej należy usunąć pożywkę hodowlaną z dołków i natychmiast potraktować komórki 150 mikrolitrami preparatu testowego lub roztworu kontrolnego pożywki.

Następnie inkubuj komórki przez 30 minut. Usuń roztwór testowy z komórek i dodaj 0,5 mililitra 10% metabolicznego roztworu barwnika. Inkubuj komórki przez kolejne cztery godziny.

Po inkubacji usuń 100 mikrolitrów roztworu barwnika z każdej studzienki i przenieś go na 96-dołkową płytkę. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć fluorescencję każdej studzienki, ustawiając wzbudzenie na 540 nanometrów i emisję na 590 nanometrów. W celu przeprowadzenia procedury odzysku, należy inkubować komórki z roztworami testowymi lub kontrolami, jak opisano wcześniej.

Następnie dodaj 0,5 mililitra pożywki DMEM/F12 do każdego dołka. Inkubuj komórki przez 18 godzin. Następnie usuń pożywkę i przetestuj aktywność metaboliczną.

Aby przeprowadzić procedurę kontrolną, należy usunąć pożywkę hodowlaną z komórek na płytce 48-dołkowej i natychmiast poddać je działaniu preparatu testowego lub roztworu kontrolnego pożywki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Po inkubacji usuń roztwory testowe z komórek i umieść je w komorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności 45% na pięć minut w celu wysuszenia.

Następnie dodaj 0,5 mililitra 10% metabolicznego roztworu barwnika i inkubuj komórki przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji przenieś 100 mikrolitrów metabolicznego roztworu barwnika z każdej studzienki na 96-dołkową płytkę i zmierz fluorescencję. Aby przeprowadzić procedurę odzyskiwania, powtórzyć poprzednio opisany protokół i dołączyć 18-godzinną inkubację z pożywką DMEM/F12 po etapie suszenia.

Następnie przeprowadź analizę statystyczną danych zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Porównano trzy preparaty suchego oka pod kątem ich wpływu na żywotność ludzkich komórek nabłonka rogówki. Roztwory pierwszy i drugi miały znaczący wpływ na aktywność metaboliczną komórek przed wysuszeniem.

Komórki wystawione na działanie roztworu pierwszego wykazywały dodatkowy spadek aktywności metabolicznej komórek po 18-godzinnej rekonwalescencji, co oznacza, że początkowo zostały uszkodzone, a uraz nie został naprawiony. Dla porównania, roztwór trzeci miał tylko łagodny wpływ na aktywność metaboliczną komórek nabłonka. Porównując zdolność tych preparatów zawierających lipidy do ochrony komórek, stwierdzono, że roztwory pierwszy i drugi nie chroniły komórek przed stresem związanym z wysuszeniem.

Rozwiązanie trzecie zapewniało jednak pewną ochronę. Podczas wysiewania komórek na płytki pokryte kolagenem upewnij się, że zawiesina komórek zawiera komórki, które są równomiernie wymieszane, tak aby każda studzienka była wysiana z równą liczbą komórek. Roztwór trzeci wykazał statystycznie istotną poprawę żywotności komórek i ochrony przed stresem związanym z wysuszeniem w porównaniu z pozostałymi dwoma produktami zawierającymi lipidy.

Możliwe, że olej mineralny z fosfolipidami, wraz z HP-guar i glikolem propylenowym, pozwala roztworowi trzeciemu zapewnić ochronę komórek rogówki przed nawodnieniem i zmniejszyć parowanie pod wpływem wysuszenia.