Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

Coraz więcej dowodów sugeruje wpływ sygnalizacji estrogenowej na część fizjologii okrężnicy, immunohistochemia jest obiecującą techniką identyfikacji receptorów estrogenowych w okrężnicy i ewoluują one w zapalenie jelita grubego. Przedstawiamy kompletny i zwalidowany protokół immunohistochemicznej wizualizacji receptorów estrogenowych w jelicie grubym z wykorzystaniem immunofluorescencji. Wspólnie z dr Sylwią Michlewską z Pracowni Obrazowania Mikroskopowego Uniwersytetu Łódzkiego zademonstrujemy przebieg zabiegu.

Umieść dwukropek na szalce Petriego. Pokrój okrężnicę na kawałki o długości od jednego do dwóch centymetrów. Umieść każdy fragment na gąbce w odpowiednio oznakowanej kasecie histologicznej.

Umieść kasetę zawierającą fragment jelita grubego w 4% paraformaldehydzie. Inkubować przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj i zaprogramuj procesor tkanek na jedną godzinę inkubacji w samych 50%70%90%95% i 100%etanolu, ksylenie, 100% etanolu i ksylenie, a także na co najmniej trzy godziny inkubacji w ciekłej parafinie.

Przenieś fragment jelita grubego do pudełka histologicznego. Umieść pudełko we wstępnie zaprogramowanym procesorze tkanek i uruchom procesor. Po inkubacji w procesorze tkankowym wyjmij okrężnicę z pudełka histologicznego i umieść fragment okrężnicy w metalowej formie, tak aby dwa końce okrężnicy były w pozycji pionowej.

Napełnij jedną trzecią formy płynną parafiną. Umieść formę w obszarze chłodzenia w temperaturze minus pięciu stopni Celsjusza na kilka sekund, a następnie przenieś formę do obszaru podgrzewania w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Następnie umieść formę w dolnej części pudełka histologicznego i przykryj cały fragment jelita grubego płynną parafiną.

Umieść metalową formę zawierającą fragment okrężnicy i parafinę w obszarze chłodzenia na kilka minut. Następnie wyjmij metalową formę z okrężnicy i bloku parafiny. Inkubuj okrężnicę i blok parafiny przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji usuń nadmiar parafiny z bloku. Umieść okrężnicę i blok parafinowy w pełni zautomatyzowanym mikrotomie obrotowym. Pokrój fragment jelita grubego na pięć mikrometrowych odcinków

Przenieś jeden wycinek jelita grubego do łaźni wodnej podgrzanej do 40 stopni Celsjusza. Użyj oznakowanego szkiełka, aby usunąć fragment jelita grubego z łaźni wodnej i inkubować szklane szkiełko w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Najpierw usuń parafinę, inkubując szklane szkiełko w ksylenie przez pięć minut.

Powtórz ten krok trzy razy. Następnie umieść szkiełko w mieszaninie ksylenu i 100% etanolu jeden do jednego na pięć minut. Powtórz ten krok trzy razy.

Użyj serii zmniejszających się stężeń etanolu, aby nawodnić odcinek okrężnicy. Zanurz szkiełko w etanolu na pięć minut. Powtórz trzy razy dla każdego stężenia przed przejściem do następnego stężenia.

Opłucz szkiełko szklane pod bieżącą wodą przez pięć minut. Podgrzej bufor do pobierania antygenu do 95 do 98 stopni Celsjusza. Następnie podgrzewać szkiełko podstawowe we wrzącym roztworze do pobierania antygenu przez 10 minut.

Aby zapobiec marnowaniu odczynników, użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować okrąg wokół odcinka okrężnicy. Następnie inkubować szkiełko przez 10 minut w 3% roztworze peroksydazy wodorowej i wody. Myj szkiełko w roztworze myjącym przez pięć minut.

Następnie inkubować szkiełko w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór blokujący i dodaj 20 do 50 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko rozcieńczonym E-R alfa, E-R beta lub G-P-E-R. Inkubuj pierwotne przeciwciało przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Usunąć roztwór przeciwciał. Umyj szkiełko trzy razy w roztworze myjącym przez pięć minut za każdym razem. Następnie dodaj rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe.

Inkubować szkiełko z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z barwnikiem przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała ze szkiełka. Umyj szkiełko trzy razy w roztworze myjącym przez pięć minut za każdym razem.

Dodaj rozcieńczony fluorochrom do wizualizacji błony i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Usunąć roztwór i umyć szkiełko trzy razy w roztworze myjącym przez pięć minut za każdym razem. Dodaj kilka kropli płynnego DAPI na bazie glicerolu, fluorochromu do wizualizacji jąder komórkowych, bezpośrednio w sekcji okrężnicy.

Przykryj go ostrożnie szkiełkiem pokrywy. Inkubuj sekcję jelita grubego przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przeanalizuj wycinek jelita grubego pod mikroskopem konfokalnym z obiektywami 20x lub 63x i zanurzeniem w olejku.

Swoistość przeciwciał użytych w badaniu została zwalidowana przy użyciu komórek MCF-7. Przeciwciała przeciwko receptorowi estrogenowemu umożliwiły wykrycie jądrowych receptorów estrogenowych E-R alfa i E-R beta, a także błonowego receptora estrogenowego G-P-E-R. Przeprowadzono również kontrolę ujemną, w której komórki MCF-7 wybarwiono jedynie drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem i płynem na bazie glicerolu z DAPI.

Silny sygnał cytoplazmatyczny E-R alfa stwierdzono w odcinkach okrężnicy uzyskanych od myszy kontrolnych oraz od myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS. Jednak tylko okrężnice uzyskane od myszy kontrolnych miały E-R alfa zlokalizowane w cytoplazmie komórki kubkowej. Mikroskopia konfokalna ujawniła również cytoplazmatyczną lokalizację E-R beta w odcinkach okrężnicy zarówno myszy kontrolnych, jak i leczonych TNBS.

Podobnie, cytoplazmatyczna lokalizacja G-P-E-R została udokumentowana w odcinkach okrężnicy uzyskanych od myszy kontrolnych i myszy leczonych TNBS. Prawidłowe ustawienie okrężnicy w formie jest niezbędne do wygenerowania prawidłowego przekroju poprzecznego. Fluorochrom powinien być wybierany według własnego widma wzbudzenia i emisji.

Metodę tę można również zastosować do innych białek, które mogą być zaangażowane w rozwój zapalenia jelita grubego. Detekcja immunohistochemiczna za pomocą immunofluorescencji może być rozszerzona o barwienie innych białek w stanie kierunku białko-białko.