Name: Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj wizualizację receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji. Ta metoda pozwala badać rolę estrogenów w zapaleniu jelit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została opublikowana dzięki wsparciu finansowemu władz Uniwersytetu Łódzkiego: Prorektora ds. Badań Naukowych, Prorektora ds. Współpracy Krajowej i Międzynarodowej oraz Dziekana Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska. Damian Jacenik otrzymał wsparcie w postaci grantów (2017/24/T/NZ5/00045 i 2015/17/N/NZ5/00336) z Narodowego Centrum Nauki.

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Lokalnej Komisji Etycznej (28/ŁB29/2016) zgodnie z Dyrektywą 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 22 września 2010 r. oraz zaleceniami instytucjonalnymi.
1. Model choroby Leśniowskiego-Crohna u myszy indukowany TNBS
UWAGA: W tym protokole wykorzystano samce myszy BALB/C o masie 25-28 g. Zwierzęta są utrzymywane w stałej temperaturze (22-24 °C) i wilgotności względnej 55 ± 5%, w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, z nieograniczonym dostępem do standardowej karmy peletowanej oraz wody z kranu ad libitum.
<ol>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i szczelnie zamknij pokrywę. Krótko znieczul mysz izofluranem (25% O2 przy przepływie O2 na poziomie 1,5-2 L/min). 
	UWAGA: Częstość oddechów powinna pozostać rytmiczna, być wolniejsza niż zwykle i nie powinna zmieniać się w odpowiedzi na bodziec drażniący.</li>
	<li>Podaj do końcowego odcinka jelita grubego za pomocą cewnika 4 mg TNBS w 0,1 mL 30% etanolu w 0,9% NaCl lub 0,1 mL 30% etanolu w 0,9% NaCl jako kontrolę nośnika. 
	UWAGA: Cewnik należy ostrożnie wprowadzić na głębokość około 3 cm do odbytu.</li>
	<li>Monitoruj mysz codziennie od drugiego do ósmego dnia pod kątem parametrów klinicznych, w tym masy ciała, krwawienia z odbytu, konsystencji stolca oraz śmiertelności.</li>
	<li>Ósmego dnia uśmierć mysz poprzez zwichnięcie stawów szyjnych.</li>
</ol>
<img alt="Schemat osi czasu przedstawiający podanie TNBS w 1. dniu i eutanazję w 8. dniu badania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Oś czasu dla mysiego modelu choroby Crohna indukowanego TNBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60813/60813fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
2. Separacja i ocena makroskopowa jelita grubego
UWAGA: Na jeden dzień przed separacją okrężnicy należy rozcieńczyć 100 µL antybiotyku w 1 mL soli fizjologicznej z fosforanem (PBS) i pozostawić w temperaturze 4 °C przez noc.
<ol>
	<li>Oczyścić skórę w okolicy brzucha, używając 75% etanolu i sterylnej gazy.</li>
	<li>Rozciąć ścianę brzucha od mostka do odbytu za pomocą sterylnych nożyczek i pęsety.</li>
	<li>Odciąć okrężnicę jak najbliżej odbytu oraz kątnicy.</li>
	<li>Umieścić okrężnicę na szalce Petriego. Rozciąć okrężnicę wzdłuż od strony odbytu do końca kątnicy. Oczyścić i wypłukać okrężnicę 2-4 razy w zimnym roztworze PBS z antybiotykiem.</li>
	<li>Przeprowadzić ocenę makroskopową przy użyciu suwmiarki zgodnie z Tabelą 1. 
	UWAGA: Zrosty tkankowe* oraz rumień/krwawienie#, krew w kale# i biegunka# podlegają ocenie wizualnej. *Zrosty tkankowe ocenia się w skali trzystopniowej (0: okrężnica bez zrostów tkankowych, 1: okrężnica z umiarkowanymi zrostami tkankowymi, 2: okrężnica z rozległymi zrostami tkankowymi); #na podstawie braku (0) lub obecności (1) rumienia/krwawienia, krwi w kale oraz biegunki.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhezja*</td>
			<td>Rumień/wybroczyny#</td>
			<td>Krew w kale#</td>
			<td>Biegunka#</td>
			<td>Długość wrzodu</td>
			<td>Grubość jelita grubego</td>
			<td>Długość okrężnicy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>punkty (0 – 2)</td>
			<td>punkty (0 – 1)</td>
			<td>punkty (0 – 1)</td>
			<td>punkty (0 – 1)</td>
			<td>cm/punkty</td>
			<td>mm/punkty</td>
			<td>cm/punkty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 – brak</td>
			<td>0 – brak</td>
			<td>0 – brak</td>
			<td>0 – brak</td>
			<td rowspan="3">0,5 cm = 0,5 punktu</td>
			<td rowspan="3">n mm = n punkty</td>
			<td>0 – &lt;o 10% krótsze od kontroli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 – umiarkowany</td>
			<td>1 – obecnie</td>
			<td>1 – obecnie</td>
			<td>0,5 – stolek lekko luźny/rzadki</td>
			<td>1 – o 10 do 20% krótsze od kontroli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 – obecnie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 – obecnie</td>
			<td>2 – o ponad 20% krótsze niż w grupie kontrolnej</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Makroskopowa ocena jelit myszy w modelu choroby Crohna indukowanej TNBS.
<ol start="6">
	<li>Przelicz długość owrzodzenia w centymetrach na skalę punktową, przyjmując, że każde 0,5 cm owrzodzenia odpowiada 0,5 punktu. Przelicz grubość okrężnicy w milimetrach na skalę punktową, przyjmując, że każde n odpowiada mm n punkty</li>
	<li>Przelicz długość okrężnicy w centymetrach na skalę trzystopniową. Długość okrężnicy uzyskaną od każdej myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna indukowaną TNBS ocenia się w stosunku do średniej długości okrężnicy w grupie kontrolnej (0: &lt;o 10% krótsze od kontroli, 1: od 10 do 20% krótsze od kontroli, 2: o ponad 20% krótsze od kontroli).</li>
	<li>Oblicz całkowity wynik makroskopowy zgodnie z równaniem: Całkowity wynik makroskopowy = zrosty (punkty) + rumień/krwawienie (punkty) + krew w kale (punkty) + biegunka (punkty) + długość owrzodzenia (punkty) + grubość jelita grubego (punkty) + długość jelita grubego (punkty).</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek okrężnicy
<ol>
	<li>Pokrój okrężnicę na fragmenty o długości 1-2 cm i umieść każdy z nich na gąbce w odpowiednio oznakowanej kasecie histologicznej. 
	UWAGA: Gąbki w kasetach histologicznych zapobiegają składaniu się okrężnicy podczas odwodnienia i inkubacji w parafinie ciekłej.</li>
	<li>Umieść fragment okrężnicy w 4% formaldehydzie i inkubuj przez co najmniej 24 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj i zaprogramuj procesor tkankowy na 1 h inkubacji w etanolu 50%, 70%, 90%, 95%, 100%, ksylenie/etanolu 100% (1:1; v/v) oraz samym ksylenie, a także na co najmniej 3 h inkubacji w parafinie ciekłej. 
	UWAGA: Odwodnienie musi być przeprowadzone w rosnących stężeniach etanolu i ksylenu, jednak stężenie etanolu może zostać zmodyfikowane. Mieszanina ksylenu z etanolem jest zalecana, ale nie wymagana.</li>
	<li>Przenieś fragment okrężnicy do pojemnika histologicznego i umieść go w zaprogramowanym procesorze tkankowym.</li>
	<li>Uruchom procesor tkankowy.</li>
	<li>Po etapach inkubacji umieść fragment okrężnicy w metalowej formie w taki sposób, aby dwa końce okrężnicy znajdowały się w pozycji pionowej, a następnie wypełnij jedną trzecią formy parafiną ciekłą.</li>
	<li>Umieść formę w strefie chłodzenia (-5 °C) na kilka sekund, a następnie przenieś ją do strefy ogrzewania (70 °C). Umieść formę w dolnej części pojemnika histologicznego i całkowicie przykryj fragment okrężnicy parafiną ciekłą.</li>
	<li>Pozostaw metalową formę z fragmentem okrężnicy w parafinie na kilka minut w strefie chłodzenia. Wyjmij metalową formę z bloku parafiny i inkubuj przez co najmniej 24 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń nadmiar parafiny z bloku i włóż go do w pełni automatycznego mikrotomu obrotowego. 
	UWAGA: Blok parafiny można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka minut przed tym etapem.</li>
	<li>Wykonaj skrawki fragmentu okrężnicy o grubości 5 µm.</li>
	<li>Przenieś skrawek okrężnicy do kąpieli wodnej podgrzanej do 40 °C.</li>
	<li>Użyj oznakowanego szkiełka przedmiotowego, aby wyjąć skrawek okrężnicy z kąpieli wodnej. 
	UWAGA: Skrawki okrężnicy pływają na powierzchni wody. Wsuń oznakowane szkiełko przedmiotowe do wody pod skrawkiem okrężnicy i ostrożnie je wycofaj.</li>
	<li>Pozostaw szkiełko przedmiotowe na 24 h w temperaturze pokojowej. W przypadku długoterminowego przechowywania, po 24 h inkubacji w temperaturze pokojowej przechowuj szkiełko w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Immunohistochemia z barwieniem immunofluorescencyjnym
UWAGA: Na żadnym etapie procedury nie wolno dopuścić do wyschnięcia sekcji okrężnicy.
<ol>
	<li>Usuń parafinę, inkubując szkiełko w ksylenie przez 5 min. Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Umieść szkiełko w mieszaninie ksylen/100% etanol (1:1; v/v) na 5 min. Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Rehydratyzuj przekrój okrężnicy w serii malejących stężeń etanolu, tj. 70%, 50%, 30% i 10% etanolu przez 5 min. Powtórz każdy krok trzy razy.</li>
	<li>Płucz szkiełko pod bieżącą wodą przez 5 min.</li>
	<li>Podgrzej bufor do odmaskowania antygenu (10 mM cytrynian sodu; 0,05% Tween 20, pH 6,0) do 95-98 °C i podgrzewaj szkiełko w gotującym się roztworze do odmaskowania antygenu przez 10 min. 
	UWAGA: Etap odmaskowania antygenu jest opcjonalny, ale zalecany. Roztwór odmaskowujący należy zoptymalizować w zależności od przeciwciała użytego w eksperymencie.</li>
	<li>Obrysuj przekrój okrężnicy okręgiem za pomocą pisaka hydrofobowego. 
	UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale zalecany. Pisak hydrofobowy zapobiega marnowaniu odczynników, utrzymując ciecz w małej objętości wewnątrz zaznaczonego okręgu.</li>
	<li>Inkubuj przekrój w 3% wodnym roztworze nadtlenku wodoru przez 10 min.</li>
	<li>Przemyj w roztworze piorącym (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) przez 5 min.</li>
	<li>Inkubuj w roztworze blokującym (5% normalne surowica kozia; 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) przez 1 h w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W roztworze blokującym normalna surowica musi pochodzić od tego samego gatunku, co przeciwciało wtórne. Na etapach wymagających inkubacji umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec nadmiernemu odparowaniu.</li>
	<li>Usuń roztwór blokujący i dodaj 20-50 µL przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko ERα, ERβ lub GPER rozcieńczonego w 1% albuminie surowiczej wołowej z 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. 
	UWAGA: Zalecane rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych przedstawiono w Tabeli 2.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typ przeciwciała</td>
			<td>Przeciwciało przeciwko</td>
			<td>Klonowatość</td>
			<td>Gatunki gospodarzy</td>
			<td>Reaktywność gatunkowa</td>
			<td>Rozcieńczanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="13">Pierwotny</td>
			<td rowspan="4">ERα</td>
			<td rowspan="4">Poliklonalne</td>
			<td rowspan="4">Królik</td>
			<td>Człowiek</td>
			<td rowspan="13">1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mysz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Żółw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapybara</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">ERβ</td>
			<td rowspan="6">Poliklonalne</td>
			<td rowspan="6">Królik</td>
			<td>Człowiek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Małpa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szczur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mysz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Świnia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">GPER</td>
			<td rowspan="3">Poliklonalne</td>
			<td rowspan="3">Królik</td>
			<td>Człowiek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szczur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mysz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wtórny</td>
			<td>DyLight 650</td>
			<td>Poliklonalne</td>
			<td>Koza</td>
			<td>Królik</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Charakterystyka przeciwciał.
<ol start="11">
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć roztworem piorącym (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20) przez 5 min. Powtórzyć ten krok trzy razy.</li>
	<li>Dodać 20-50 µL przeciwciała wtórnego DyLight 650 rozcieńczonego w 1% albuminie surowicy bydlęcej (zawierającej 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Triton X-100). Inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z barwnikiem przez 1 h w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	UWAGA: Zalecane rozcieńczenie przeciwciała wtórnego przedstawiono w Tabeli 2.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć roztworem piorącym (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) przez 5 min. Powtórzyć ten krok trzy razy.</li>
	<li>Dodać 2% DiOC6(3) rozcieńczonego w 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Usunąć roztwór i przemyć roztworem piorącym (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) przez 5 min. Powtórzyć ten krok trzy razy.</li>
	<li>Nanieść kilka kropel medium na bazie glicerolu z DAPI bezpośrednio na przekrój okrężnicy i ostrożnie przykryć szkiełkiem podstawowym. Inkubować przekrój okrężnicy przez co najmniej 24 h w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Należy unikać pęcherzyków powietrza podczas przykrywania tkanki szkiełkiem podstawowym.</li>
	<li>Przeanalizować przekrój okrężnicy pod mikroskopem konfokalnym z obiektywami 20x lub 63x i imersją olejową, używając dedykowanego oprogramowania. 
	UWAGA: Tabela 3 zawiera charakterystykę fluorochromów użytych w tym badaniu.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Typ fluorochromu</td>
			<td colspan="2">Długość fali (nm)</td>
			<td rowspan="2">Barwnik</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wzbudzenie</td>
			<td>Emisja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>405</td>
			<td>460 – 480</td>
			<td>Niebieski</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>485</td>
			<td>538 – 595</td>
			<td>Zielony</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650</td>
			<td>654</td>
			<td>660 – 680</td>
			<td>Czerwony</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Charakterystyka fluorochromów.

<ol><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li>
<li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone+colitis%3A+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li>
<li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li>
<li>Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li>
<li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous%2C+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H%2FHeJ+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li>
<li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li>
<li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+estrogen+receptor+%CE%B2+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li>
<li>Włodarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+30+%28GPR30%29+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li>
<li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415(2018).</li>
<li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749(2019).</li>
<li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li>
<li>Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li>
<li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li>
<li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li>
<li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis%2C+but+not+oxazalone-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje wiele modeli zwierzęcych do badania patofizjologii IBD, w tym modele genetyczne, immunologiczne lub spontaniczne, a także modele indukowane chemicznie15. Spośród kilku rodzajów zwierzęcych modeli zapalenia jelita grubego, modele indukowane chemicznie, takie jak model indukowany TNBS opisany w tym protokole, są stosunkowo niedrogie i łatwe do uzyskania. Mysi model zapalenia jelita grubego indukowany przez TNBS ma kilka objawów klinicznych związanych z patologicznymi podstawami CD. Zwierzęt...

choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) to nieswoiste zapalenie jelit (IBD) objawiające się przewlekłym zapaleniem jelit. Etiologia ChLC jest słabo poznana, ale istnieje kilka głównych czynników, które wydają się być odpowiedzialne za rozwój CD, w tym mikrobiota jelitowa oraz czynniki genetyczne i środowiskowe, takie jak dieta lub stres1. Aby lepiej zrozumieć patogenezę choroby Leśniowskiego-Crohna, wykorzystano kilka modeli zapalenia jelit2,3,4,5,6,7. W artykule przedstawiono wyniki uzyskane z mysiego modelu CD indukowanego kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS).
Udokumentowano, że estrogeny są zdolne do modulowania przewlekłego zapalenia jelit8,9,10,11,12. W aktywności biologicznej estrogenów pośredniczą receptory pokrewne, wśród których znajdują się jądrowe receptory estrogenowe (ER), tj. ERα (gen ESR1) i ERβ (gen ESR2), a także receptor estrogenowy sprzężony z białkiem G, tj. GPER (gen GPER1), określany jako ER13,14. Istnieje kilka metod określania poziomu receptorów estrogenowych, ale tylko kilka z nich można wykorzystać do ich wizualizacji w jelicie.
Immunohistochemia (IHC) jest szeroko stosowaną metodą w badaniach klinicznych i podstawowych do wykrywania pewnych antygenów w komórkach lub tkankach z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem. IHC wydaje się być ważną metodą w wizualizacji struktury tkanki, a także w identyfikacji i lokalizacji określonych białek, co może być kluczowe dla zrozumienia rozwoju zapalenia jelita grubego. W tym miejscu przedstawiamy kompletny i zwalidowany protokół immunohistochemicznej wizualizacji receptorów estrogenowych w jelicie za pomocą immunofluorescencji.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C</td><td>myszy Uniwersytet Łódzki</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>VWR</td><td>62379-531</td><td></td></tr><tr><td>Blok kartonowy</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny - TCS SP8</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>W pełni zautomatyzowany mikrotom rotacyjny - RM2255</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800BMNT</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewany moduł zatapiania parafiny - EG1150 H</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka histologiczna</td><td>Marfour</td><td>LN.138747</td><td></td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Waga laboratoryjna</td><td>Radwag</td><td>WL-104-0048</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie LAS X</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Forma metalowa</td><td>Marfour</td><td>CP.5105</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td>NA</td><td>NA</td> Sterylna pęseta NA NA <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Procesor tkanek - TP1020</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2, 4, 6-trinitrobenzenosulfonowy kwas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92822</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6 (3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 650 przeciwciało wtórne</td><td>Abcam ab96886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ER&alfa; przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Abcam</td><td>ab75635</td><td></td></tr><tr><td>ER&beta; przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Abcam</td><td>ab3576</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Avantor Performance Materials Polska</td><td>396480111</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>432173111</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe GPER</td><td>Abcam</td><td>ab39742</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>575283421</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza wodorowa</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>885193111</td><td></td></tr><tr><td>izofluran (foran)</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Nest Scientific 705001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (antybiotyk)</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifage Mountant z DAPI (płyn na bazie glicerolu z DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Chempur</td><td>WE/231-598-3</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Avantor Performance Materials Polska</td><td>795780429</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Avantor Performance Materials Polska</td><td>853470115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Avantor Performance Materiały Polska</td><td>BA0860119</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą leśniowskiego-crohna wywołaną tnbs przy użyciu immunofluorescencji

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Choroba Leśniowskiego-Crohna jest najczęściej diagnozowanym typem nieswoistego zapalenia jelit. Przewlekły stan zapalny rozwijający się w jelicie prowadzi do zaburzeń perystaltyki jelit i uszkodzenia błony śluzowej jelit i wydaje się być związany ze zwiększonym ryzykiem transformacji nowotworowej jelita grubego. Coraz więcej dowodów wskazuje, że estrogeny i receptory estrogenowe wpływają nie tylko na tkanki wrażliwe na hormony, ale także na inne tkanki, które nie są bezpośrednio związane z estrogenami, takie jak płuca czy okrężnica. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego barwienia immunofluorescencyjnego receptorów estrogenowych w okrężnicy uzyskany z mysiego modelu choroby Leśniowskiego-Crohna wywołanej TNBS. Przedstawiono szczegółowy protokół indukcji choroby Leśniowskiego-Crohna u myszy i preparatu jelitowego, a także procedurę immunohistochemiczną krok po kroku z wykorzystaniem skrawków jelita zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie. Opisane metody są przydatne nie tylko do wykrywania receptorów estrogenowych i badania sygnalizacji estrogenowej in vivo, ale mogą być również stosowane do innych białek, które mogą być zaangażowane w rozwój zapalenia jelita grubego.

Charakterystyka makroskopowa jelit grubych u myszy z indukowaną TNBS chorobą Crohna 
Reprezentatywne obrazy jelit grubych pobranych od myszy z grupy kontrolnej oraz myszy traktowanych TNBS przedstawiono na Rysunku 2. U myszy w modelu choroby Crohna indukowanej TNBS długość jelita grubego jest zmniejszona, natomiast jego szerokość jest zwiększona.
<img alt="Porównanie tkanki kontr...

Protokół przedstawia kompletny, potwierdzony, indukowany przez TNBS mysi model choroby Leśniowskiego-Crohna oraz metody wizualizacji receptorów estrogenowych za pomocą immunohistochemii przy użyciu immunofluorescencji utrwalonych formaliną odcinków jelita grubego zanurzonych w parafinie.

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Coraz więcej dowodów sugeruje wpływ sygnalizacji estrogenowej na część fizjologii okrężnicy, immunohistochemia jest obiecującą techniką identyfikacji receptorów estrogenowych w okrężnicy i ewoluują one w zapalenie jelita grubego. Przedstawiamy kompletny i zwalidowany protokół immunohistochemicznej wizualizacji receptorów estrogenowych w jelicie grubym z wykorzystaniem immunofluorescencji. Wspólnie z dr Sylwią Michlewską z Pracowni Obrazowania Mikroskopowego Uniwersytetu Łódzkiego zademonstrujemy przebieg zabiegu.Umieść dwukropek na szalce Petriego. Pokrój okrężnicę na kawałki o długości od jednego do dwóch centymetrów. Umieść każdy fragment na gąbce w odpowiednio oznakowanej kasecie histologicznej.Umieść kasetę zawierającą fragment jelita grubego w 4% paraformaldehydzie. Inkubować przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj i zaprogramuj procesor tkanek na jedną godzinę inkubacji w samych 50%70%90%95% i 100%etanolu, ksylenie, 100% etanolu i ksylenie, a także na co najmniej trzy godziny inkubacji w ciekłej parafinie.Przenieś fragment jelita grubego do pudełka histologicznego. Umieść pudełko we wstępnie zaprogramowanym procesorze tkanek i uruchom

visualization-estrogen-receptors-colons-mice-with-tnbs-induced-crohn

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film pokazuje ocenę chemicznie wywołanego zapalenia jelita grubego poprzez immunohistochemiczne barwienie tkanki okrężnicy myszy. W wycinku wybarwionej tkanki obecność dużej liczby komórek reagujących immunologicznie w uszkodzonej tkance reprezentuje infiltrację komórek odpornościowych podczas zapalenia jelita grubego.

Ocena chemicznie wywołanego zapalenia jelita grubego za pomocą analizy immunohistochemicznej skrawków tkanki jelita grubego

Ten film demonstruje technikę oceny infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego za pomocą tomografii fluorescencyjnej (FMT). Po wywołaniu zapalenia jelita grubego u myszy za pomocą siarczanu sodu dekstranu (DSS), zwierzęciu wstrzykuje się przeciwciała, które rozpoznają marker glikoproteiny F4 / 80 na infiltrowanych makrofagach w okrężnicy. Mysz jest następnie obrazowana w urządzeniu FMT, w którym sygnały fluorescencji i odbicia są rekonstruowane w trójwymiarowy...

Wykorzystanie tomografii fluorescencyjnej do oceny zapalenia jelit myszy

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Dokładna identyfikacja i lokalizacja komórek nabłonkowych wzdłuż błony śluzowej jelit są niezbędne do zdefiniowania różnych linii komórkowych. Prawidłowe obrazowanie tkanek jelitowych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji wzorców ekspresji białek z maksymalną rozdzielczością. Badanie to ma na celu nakreślenie optymalnych metod i warunków przetwarzania tkanek jelitowych myszy.

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

W tym modelu zapalenia jelita grubego napędzanego antygenem, limfocyty T OT-II CD4+ wyrażające białko czerwonej fluorescencji zostały adoptywnie przeniesione do myszy RAG-/-, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne w fagocytach jednojądrzastych (MP). Gospodarzom poddano prowokację Escherichia coli (E. coli) wykazującej ekspresję białka albuminy jaja kurzego (OVA) połączonego z cyjanowym białkiem fluorescencyjnym (CFP).

Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

W tym badaniu szczegółowo opisujemy procedurę zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS, które wykazuje porównywalną patofizjologię do zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Omawiamy również to podejście w świetle hamującego działania rapamycyny na zwłóknienie jelit.

Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

Obecny protokół opisuje rozwój podobnego do choroby Leśniowskiego-Crohna modelu zapalenia jelita grubego u gryzoni. Zapalenie przezścienne prowadzi do zwężenia w miejscu wkroplenia TNBS, a powiększenie mechaniczne obserwuje się w segmencie bliższym zwężeniu. Zmiany te pozwalają na badanie naprężeń mechanicznych w zapaleniu jelita grubego.

Model gryzoni indukowany przez TNBS do badania patogennej roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Poznaj wizualizację receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji. Ta metoda pozwala badać rolę estrogenów w zapaleniu jelit.

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów