Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy

Protokół ten może być wykorzystany do zastosowania analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do monitorowania zmian w metabolizmie energetycznym podczas kapacytacji plemników. Opracowaliśmy ten protokół, aby porównać zmiany w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym między plemnikami myszy bez pojemności i z pojemnością. W dniu poprzedzającym test wyjmij wkład czujnika z zestawu do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego i umieść wkład do góry nogami obok płytki użytkowej.

Napełnij zbiornik roztworu 25 mililitrami podwójnie destylowanej wody i dodaj 200 mikrolitrów wody do każdej studzienki płytki użytkowej, a następnie umieść wkład czujnika z powrotem w płytce użytkowej. Umieść płytkę w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie podajcie 25 mililitrów analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do 50-mililitrowej stożkowej rurki i umieść probówkę w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby przygotować mikropłytki pokryte ConA, rozpuść 2,5 miligrama ConA w pięciu mililitrach podwójnie destylowanej wody i użyj wielokanałowej pipety, aby napełnić każdą studzienkę 96-dołkowej płytki analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego 50 mikrolitrami roztworu ConA, a następnie pozostaw pokrywkę otwartą, aby płytka wyschła przez noc. Aby przygotować bufor nasienia, podgrzej 250 mililitrów buforu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego TYH do 37 stopni Celsjusza i dostosuj pH do 7,4. W dniu testu należy zastąpić wodę w każdej studzience płytki użytkowej 200 mikrolitrami kalibru XF na studzienkę i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze bez dwutlenku węgla na co najmniej jedną godzinę.

Aby wygenerować szablon fali, włącz analizator strumienia zewnątrzkomórkowego. Gdy temperatura stabilizuje się do 37 stopni Celsjusza, otwórz oprogramowanie wave i otwórz pusty szablon. Na karcie definicje grup zdefiniuj pożywkę testową jako TYH, a typ komórki jako plemniki myszy, pozostawiając puste strategie wstrzykiwania i obróbki wstępne.

Utwórz różne grupy dla każdego warunku testu i otwórz mapę płyty, aby przypisać każdą grupę do określonych studzienek. Na karcie protokołu odznacz równowagę, dodaj każdy z czterech różnych cykli pomiarowych, wybierz odpowiedni port i edytuj szczegóły pomiaru, aby pomiar po wstrzyknięciu był podświetlony, a następnie zapisz szablon testu, wypełnij podsumowanie projektu i zapisz wyniki. Przed pobraniem nasienia podgrzej 50 mililitrów buforu TYH w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po zebraniu ogonów od dorosłych samców myszy, umieść każdą ogon w 500 mikrolitrach wstępnie podgrzanego buforu TYH w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki. Użyj kleszczy, aby unieruchomić każdą ogon indywidualnie na dnie każdej studzienki i szybko wykonaj od pięciu do siedmiu małych nacięć w każdej tkance za pomocą nożyczek do piór. Po nacięciu wszystkich ogonów należy natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze bez dwutlenku węgla, aby plemniki mogły się rozproszyć przez 15 minut.

Aby załadować wkład czujnika, zdejmij pokrywę z wkładu czujnika i wyrównaj literę odpowiedniej prowadnicy ładowania portu z lewym górnym rogiem wkładu. Trzymając prowadnicę ładowania portu na miejscu, włóż końcówki pipet pionowo do otworów prowadnicy ładowania portu w porcie A i wstrzyknij 20 mikrolitrów buforu TYH do każdej kolumny. W przypadku portu B wstrzyknąć 22 mikrolitry buforu TYH do kolumn od pierwszej do czwartej, 22 mikrolitry 500 milimolowej 2-deoksyglukozy do kolumn od piątej do ósmej i 25 mikrolitrów pięciomilimolowego rotenonu antymycyny A do kolumn od dziewiątej do dwunastej.

W przypadku portu C wstrzyknąć 25 mikrolitrów buforu TYH do każdej kolumny o liczbach nieparzystych i 25 mikrolitrów 10 milimolowych dibutyrylowo-cyklicznych AMP 500 mikromolowych IBMX do każdej kolumny o numerach parzystych, a następnie umieścić wkład czujnika z płytką kalibracyjną w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego i rozpocząć test. Kalibracja potrwa od 10 do 15 minut. Aby przygotować płytki nasienne, dodaj trzy mililitry po trzy miligramy na mililitr albuminy surowicy bydlęcej w buforze TYH do każdej z trzech pięciomililitrowych probówek wirówkowych.

Następnie zbierz dwie studzienki nasienia do każdej z trzech 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Po zliczeniu rozcieńczyć plemniki do stężenia dwa razy od 10 do siedmiu plemników na mililitr na próbkę w świeżym TYH uzupełnionym albuminą surowicy bydlęcej. Osadź plemniki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki nasienia w jednym mililitrze buforu TYH.

Ponownie odwirować plemniki i usunąć supernatanty, uważając, aby nie naruszyć osadów. Przenieś każdą zawiesinę nasienia do jednej z przygotowanych pięciomililitrowych probówek wirówkowych i dodaj 180 mikrolitrów buforu TYH do każdego narożnego dołka płytki pokrytej ConA. Dodaj 180 mikrolitrów plemników do każdej pustej studzienki płytki pokrytej ConA i odwiruj płytkę dwa razy, obracając płytkę o 180 stopni między wirowaniami, a następnie umieść płytkę kalibracyjną z płytką nasienia i kontynuuj test.

W tym reprezentatywnym eksperymencie plemniki zostały zpojemnościone w obecności glukozy jako jedynego substratu energetycznego oraz 2-deoksyglukozy oraz antymycyny i rotenonu jako modulatorów farmakologicznych. Strzałka wskazuje indukcję pojemności. W obecności glukozy kapacytacji towarzyszył siedmiokrotny wzrost szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, które jest hamowane przez blokowanie glikolizy za pomocą 2-deoksyglukozy.

Plemniki zpojemnościowe wykazały 20-krotny wzrost wskaźnika zużycia tlenu w porównaniu z plemnikami niezpojemnościowymi, co pokazuje, że plemniki myszy zwiększają zarówno glikolizę, jak i fosforylację oksydacyjną, aby zaspokoić rosnące zapotrzebowanie na energię podczas kapacytacji. Na wzrost szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego podczas kapacytacji plemników nie mają wpływu inhibitory fosforylacji oksydacyjnej, antymycyna A i rotenon, co wskazuje, że zmiana tego tempa jest napędzana głównie przez uwalnianie wodoru z glikolizy. Wzrost tempa zużycia tlenu jest jednak blokowany przez antymycynę A i rotenon, a także przez 2-deoksyglukozę, co pokazuje, że wzrost OXPHOS podczas kapacytacji plemników zależy od aktywności glikolitycznej.

Źródło energii oraz farmakologiczne aktywatory i inhibitory mogą być zmieniane w zależności od celu eksperymentu, a równolegle można mierzyć do 12 różnych warunków. Protokół można łatwo dostosować do innych gatunków, takich jak człowiek czy bydło, gdzie zmiany w metabolizmie energetycznym podczas kapacytacji są równie enigmatyczne.