Name: Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę analizy strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy. Protokół umożliwia badanie metabolizmu energetycznego w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony dr Lavoisiera Ramosa-Espiritu z Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.

Plemniki pobierane są od 8-16-tygodniowych samców myszy CD-1. Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Weill Cornell Medicine.
1. Dzień przed testem
<ol>
	<li>Przygotowanie wkładu czujnika i kalibru analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego
	<ol>
		<li>Aby nawodnić wkład czujnika, wyjmij wkład czujnika z zestawu XFe96 Extracellular Flux Assay Kit i umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej.</li>
		<li>Napełnij zbiornik roztworu 25 ml podwójnie destylowanegoH2Oza pomocą pipety wielokanałowej, dodaj 200 μLH2Odo każdej studzienki płytki użytkowej. Umieść wkład czujnika z powrotem w płytce użytkowej i inkubuj przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez zawartościCO2. 
		UWAGA: Wkład musi być nawodniony przez co najmniej 4 godziny.</li>
		<li>Porcję 25 ml analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez zawartościCO2 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mikropłytek pokrytych ConA
	<ol>
		<li>Rozpuścić 2,5 mg ConA w 5 ml podwójnie destylowanegoH2O, aby przygotować bulion 0,5 mg/ml (w/v).</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej napełnij każdą studzienkę 96-dołkowej płytki analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego 50 μl roztworu Con A o stężeniu 0,5 mg/mL. Pozostaw pokrywkę otwartą i pozostaw talerz do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Wiele płytek może być powlekanych jednocześnie i przechowywanych w temperaturze 4 °C przez okres do czterech tygodni, aż będą gotowe do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu nasienia
	<ol>
		<li>Przygotuj 250 ml buforu TYH analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego o niskim poziomie HEPES, zawierającego 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mMMgSO4, 5,6 mM glukozy i 1 mM HEPES. Podgrzać bufor do temperatury 37 °C i dostosować pH do 7,4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dzień testu
<ol>
	<li>Przygotowanie do kalibracji wkładu
	<ol>
		<li>ZastąpH2Ow tabliczce użytkowej 200 μl kalibru XF na studzienkę i inkubuj przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze bez emisji CO2 37 °C. 
		UWAGA: Zamiast kalibrowego, sterylnie filtrowanego PBS można użyć pH 7,4.</li>
		<li>Podgrzać 50 ml buforu TYH w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie szablonu falowego dla analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego
	<ol>
		<li>Włączyć analizator strumienia zewnątrzkomórkowego i pozwolić, aby temperatura ustabilizowała się do 37 °C.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie grupy czynności i zaprojektuj nowy szablon, otwierając pusty szablon (zobacz Plik uzupełniający 1, szablon grupy czynności).</li>
		<li>Otwórz kartę Definicje grup. Zdefiniuj pożywkę testową jako TYH; pH 7,4 i typ komórki jako plemniki myszy, pozostaw puste strategie iniekcji i zabiegi wstępne. Tworzenie różnych grup dla każdego warunku testu; w tym przykładzie istnieje 6 różnych grup (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) i 3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX) do indukcji kapacytacji, 2-deoksyglukoza (2-DG) jako inhibitor glikolizy, antymycyna A (antA) i rotenon (rot) jako inhibitor kompleksu III i kompleksu I łańcucha transportu elektronów. 
		UWAGA: Aby uwzględnić zmienność między studzienkami, należy mierzyć równolegle co najmniej 7-8 dołków na warunek.</li>
		<li>Otwórz zakładkę Mapa płyt i zdefiniuj mapę płyt, przypisując grupy do określonych studni. 
		UWAGA: Cztery studzienki narożne (A1, A12, H1, H12) zostaną wypełnione buforem TYH (bez plemników), a następnie zostaną wykorzystane do odejmowania tła.</li>
		<li>Otwórz zakładkę Protokół, dodaj 4 różne cykle pomiarowe, wybierz odpowiedni port i edytuj szczegóły pomiaru (Rysunek 2, Tabela 1). Zaznacz miarę po wstrzyknięciu i nie podkreślaj równowagi.</li>
		<li>Zapisz szablon testu, wypełnij podsumowanie projektu i zdefiniuj miejsce zapisu pliku z wynikami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie związków do załadowania do wkładu czujnika
	<ol>
		<li>Przygotować 2 ml 50 mM db-cAMP, rozpuszczając 9,8 mg związku w buforze TYH i dodać IBMX do końcowego stężenia 5 mM. 
		UWAGA: IBMX ma tendencję do wytrącania się po rozcieńczeniu w buforze TYH. Osady można rozpuścić przez wirowanie i inkubację roztworu TYH/db-cAMP/IBMX w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Przygotować 1 ml 500 mM 2-DG, rozpuszczając 82,1 mg związku w buforze TYH.</li>
		<li>Przygotować 1 ml 5 μM AntA/Rot, rozcieńczając oba leki w buforze TYH. 
		UWAGA: Związki rozcieńcza się 10-krotnie przez wstrzyknięcie do wkładu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego; Dlatego należy upewnić się, że roztwory iniekcyjne są 10 razy bardziej skoncentrowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja nasienia myszy
	<ol>
		<li>Znieczulić 3 samce myszy między 8 a 16 tygodniem za pomocą izofluranu i poświęcić myszy przez zwichnięcie szyjki macicy po wykryciu braku reakcji na szczypanie palców u stóp. Usuń najądrza ogona i nasieniowód.</li>
		<li>Umieścić każdą ogon w 500 μl wstępnie podgrzanego buforu TYH w 24-dołkowej płytce, unieruchomić ogon do dna płytki za pomocą kleszczy i otworzyć tkankę, wykonując 5-7 małych nacięć nożyczkami do piór</li>.
		<li>Natychmiast przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C niezawierającejCO2 i pozostawić plemniki do rozproszenia przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie wkładu czujnika
	<ol>
		<li>W zestawie Extracellular Flux znajdują się dwie prowadnice ładowania portów dla portów A i D oraz portów B i C. Aby załadować określony port, zdejmij pokrywę z wkładu czujnika i wyrównaj literę odpowiedniego przewodnika ładowania portu z lewym górnym rogiem wkładu. Podczas wstrzykiwania należy przytrzymać prowadnicę ładowania portu opuszkami palców ręki niewykonującej iniekcji i włożyć końcówki pipet pionowo do otworów prowadnicy ładowania portu.</li>
		<li>Port A: Za pomocą pipety wielokanałowej wstrzyknąć 20 μl buforu TYH do każdej kolumny.</li>
		<li>Port B: Wstrzyknąć 22 μl buforu TYH do kolumny 1-4, wstrzyknąć 22 μl 500 mM 2-DG do kolumny 5-8 i 25 μL 5 μM AntA/Rot do kolumny 9-12.</li>
		<li>Port C: Wstrzyknij 25 μl buforu TYH do każdej kolumny o numerach nieparzystych, wstrzyknij 25 μL 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX do każdej kolumny z numerami parzystymi.</li>
		<li>Umieść wkład czujnika z płytką kalibracyjną w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego i rozpocznij test. Kalibracja trwa 10 - 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie nasienia
	<ol>
		<li>Rozpuścić 45 mg BSA w 15 ml buforu TYH (3 mg/ml w/v) i przygotować trzy podwielokrotności 3 ml roztworu BSA/TYH każdy w probówkach wirówkowych o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Połączyć dwie studzienki nasienia w jednej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, policzyć plemniki za pomocą hematocytometru i rozcieńczyć plemniki do stężenia 2 x 107 plemników/ml. 
		UWAGA: Do pipetowania nasienia należy używać przeciętych końcówek pipet, aby uniknąć uszkodzenia komórek.</li>
		<li>Wirować plemniki przez 3 minuty przy 700 x g, usunąć supernatant i dodać 1 ml buforu TYH. Powtórzyć etap wirowania, usunąć supernatant i przenieść każdą porcję zawiesiny nasienia do jednej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml z 3 ml BSA/TYH.</li>
		<li>Umieścić 180 μl buforu TYH w każdym dołku narożnym (A1, A12, H1, H12) płytki pokrytej ConA. Umieścić 180 μl zawiesiny nasienia w każdym pustym dołku płytki pokrytej ConA (1,2 x 106 plemników/basenik).</li>
		<li>Odwirować płytkę nasienia przy 250 x g przez 1 minutę, obrócić płytkę o 180° i ponownie odwirować przy 250 x g przez 1 minutę (najniższa szybkość hamowania 1).</li>
		<li>Wyjmij płytkę kalibracyjną z analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego i dodaj płytkę nasienia. Kontynuuj badanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja i analiza danych
	<ol>
		<li>Po zakończeniu testu wyjmij kasetę, otwórz plik z wynikami, kliknij kartę Eksport i wyeksportuj zakończony przebieg jako plik GraphPad Prism (Plik uzupełniający 2: Podstawowe przykładowe dane używane dla Rysunek 3).</li>
		<li>Zduplikuj plik ECAR i OCR, klikając zakładkę Nowy, a następnie zakładkę Duplicate Family... (Rysunek 3A).</li>
		<li>Usuń pierwsze 7 wierszy danych (Rysunek 3B).</li>
		<li>Znormalizuj do punktu danych przed wstrzyknięciem cAMP/IBMX przez linię bazową odejmując wiersz 1. Kliknij kartę Analiza, a następnie kartę Usuń plan bazowy i matematykę kolumn. Wyróżnij wybrane wiersze: Pierwszy wiersz, Obliczanie: Stosunek:Wartość/Linia bazowa i Podkolumny: Ignoruj podkolumnę. Kliknij przycisk OK (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li>
<li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li>
<li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12%2FE1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54(2009).</li>
<li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li>
<li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li>
<li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li>
<li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li>
<li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hyperactivation+in+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li>
<li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75(2012).</li>
<li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li>
<li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse%3A+the+influence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li>
<li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoglycerate+kinase+2+%28PGK2%29+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li>
<li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S%2C+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme%2C+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li>
<li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+%28mHk1-s%29+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li>
<li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li>
<li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li>
<li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li>
<li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li>
<li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection%3A+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li>
<li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li>
<li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li>
<li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li>
<li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Utrata kapacytacji plemników przy braku pewnych substratów metabolicznych lub krytycznych enzymów metabolicznych ujawniła, że metabolizm energetyczny jest kluczowym czynnikiem wspierającym udane zapłodnienie. Przełącznik metaboliczny podczas aktywacji komórek jest dobrze ugruntowaną koncepcją w innych typach komórek, jednak dopiero zaczynamy rozumieć, w jaki sposób plemniki dostosowują swój metabolizm do rosnącego zapotrzebowania na energię podczas kapacytacji. Korzystając z analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, op...

Zastosowanie spektrometrii mas zrewolucjonizowało badania nad metabolizmem. Ukierunkowane profilowanie metaboliczne i śledzenie metabolomiczne umożliwiają precyzyjne monitorowanie zmian w metabolizmie energetycznym. Jednak skuteczne przeprowadzanie metabolomiki wymaga intensywnego szkolenia, doświadczonego personelu oraz drogich, bardzo czułych spektrometrów masowych, które nie są łatwo dostępne w każdym laboratorium. W ostatnich latach korzystanie z analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, takiego jak Seahorse XFe96, stało się popularne jako zastępcza metoda pomiaru zmian w metabolizmie energetycznym w różnych typach komórek1,2,3,4,5.
Plemniki to wysoce wyspecjalizowane komórki ruchliwe, których zadaniem jest dostarczenie ojcowskiego genomu do oocytu. Plemniki opuszczające męski układ rozrodczy po wytrysku są nadal funkcjonalnie niedojrzałe i nie mogą zapłodnić oocytu, ponieważ nie są w stanie przeniknąć przez szaty oocytów. Plemniki nabywają zdolność zapłodnienia, gdy przechodzą przez żeński układ rozrodczy w procesie dojrzewania znanym jako capacitation6,7. Świeżo wytryskujące plemniki lub plemniki wypreparowane z najądrza ogona mogą być kapacystowane in vitro przez inkubację w określonych pożywkach pojemnościowych zawierających Ca2+, wodorowęglan (HCO3-) lub przepuszczalny dla komórek analog cAMP (np. dibutyryl-cAMP), akceptor cholesterolu (np. albumina surowicy bydlęcej, BSA) i źródło energii (np. glukoza). Podczas kapacytacji plemniki modyfikują swój wzorzec ruchliwości w asymetryczne uderzenie wici, reprezentujące tryb pływania zwany hiperaktywacją8,9, i stają się kompetentne do przejścia reakcji akrosomowej7, w której uwalniane są enzymy proteolityczne, które trawią szaty oocytów. Procesy te wymagają energii i podobnie jak komórki somatyczne, plemniki wytwarzają ATP i inne związki wysokoenergetyczne poprzez glikolizę, a także mitochondrialny cykl TCA i fosforylację oksydacyjną (oxphos)10. Podczas gdy liczne badania wykazują, że glikoliza jest konieczna i wystarczająca do wspierania kapacytacji plemników11,12,13,14, wkład oxphos jest mniej oczywisty. W przeciwieństwie do innych typów komórek, w których glikoliza jest fizycznie sprzężona z cyklem TCA, plemniki są wysoce podzielone na przedziały i uważa się, że utrzymują te procesy w oddzielnych przedziałach wiciowych: część środkowa koncentruje maszynerię mitochondrialną, podczas gdy kluczowe enzymy glikolizy wydają się być ograniczone do głównej części15,16. To podział na przedziały powoduje ciągłą debatę na temat tego, czy pirogronian wytwarzany w głównej części przez glikolizę może wspierać mitochondrialny okfos w części środkowej i czy ATP wytwarzany przez oksfos w części środkowej byłby w stanie dyfundować wystarczająco szybko wzdłuż wici, aby zaspokoić zapotrzebowanie na energię w dystalnych częściach części głównej17, 18,19. Istnieje również poparcie dla roli oxphos w kapacytacji plemników. Oksfos jest nie tylko bardziej korzystny energetycznie niż glikoliza, generując 16 razy więcej ATP niż glikoliza, ale objętość części środkowej i zawartość mitochondriów są bezpośrednio skorelowane ze sprawnością reprodukcyjną u gatunków ssaków, które wykazują większy stopień konkurencji między samcami o partnerów20. Odpowiedź na te pytania wymaga metod badania względnego udziału glikolizy i oksfosu podczas kapacytacji plemników.
Tourmente et al. zastosowali 24-dołkowy analizator strumienia zewnątrzkomórkowego do porównania metabolizmu energetycznego blisko spokrewnionych gatunków myszy o znacząco różniących się parametrach wydajności plemników21. Zamiast raportować podstawowe wartości ECAR i OCR plemników nieuzdolnionych, tutaj dostosowujemy ich metodę za pomocą 96-dołkowego analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do monitorowania zmian w metabolizmie energetycznym podczas kapacytacji plemników myszy w czasie rzeczywistym. Opracowaliśmy metodę, która pozwala na jednoczesne monitorowanie glikolizy i oksfosu w czasie rzeczywistym w plemnikach z biciem wici w maksymalnie dwunastu różnych warunkach eksperymentalnych poprzez pomiar strumienia tlenu (O2) i protonów (H+) (ryc. 1A). Ze względu na rozkład pirogronianu do mleczanu podczas glikolizy i wytwarzanie CO2 w cyklu TCA, nieusprawiedliwione i pojemnościowe plemniki wytłaczają H+ do pożywki testowej, która jest wykrywana przez zewnątrzkomórkowy analizator strumienia za pomocą wrażliwych na H+ fluoroforów unieruchomionych na końcówce sondy wkładu czujnika. Równolegle zużycieO2 przez fosforylację oksydacyjną jest wykrywane za pomocą wrażliwych na O2 fluoroforów unieruchomionych na tej samej końcówce sondy (rysunek 1B). Skuteczne wykrywanie uwolnionego H+ i zużytegoO2 wymaga zmodyfikowanego bufora plemników o niskiej zdolności buforowej bez wodorowęglanu lub czerwieni fenolowej. Tak więc, aby wywołać kapacytację przy braku wodorowęglanu, przyjęliśmy użycie przepuszczalnego dla komórek analogu cAMP wstrzykniętego razem z inhibitorem PDE o szerokim zakresie IBMX22. Trzy dodatkowe niezależne porty iniekcyjne umożliwiają wstrzykiwanie aktywatorów farmakologicznych i/lub inhibitorów, co ułatwia wykrywanie w czasie rzeczywistym zmian w oddychaniu komórkowym i szybkości glikolizy spowodowanych manipulacją eksperymentalną.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>2-DG</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>IBMX; przygotować 500 mM roztwór podstawowy w DMSO (111,1 mg/ml) i przechowywać w małych porcjach</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Anta; przygotować 5 mM roztwór podstawowy w DMSO (2,7 mg/ml) i przechowywać w małych porcjach</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1470</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Konkanakalina A, lektyna z Arachis hypogaea (orzeszki ziemne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7381</td><td>ConA Glukoza</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>1169567761</td><td>Izofluran</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>N6,2'-O-dibutyryloadenozyna 3',5'-cykliczna sól sodowa monofosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>db-cAMP</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13995</td><td>Rot; przygotować 5 mM roztwór podstawowy w DMSO (2 mg/ml) i przechowywać w małych podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3-Chlorek</td></tr> <tr><td>sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Equipment i materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pipeta 12-kanałowa 10-100 &mu; L</td><td>eppendorf</td><td>ES-12-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 12-kanałowa 50-300 &mu; L</td><td>vwr</td><td>613-5257</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, inkubator bez CO2</td><td>vwr</td><td>1545</td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL probówki do cetrifuge</td><td>eppendorf</td><td>30119380</td><td></td></tr><tr><td>50 mL stożkowe probówki wirówkowe</td><td>vwr</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z adapterem płytkowym</td><td>Thermo Scientific</td><td>IEC FL40R</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw preparacyjny</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem odwróconych faz z obiektywem 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, dzielone</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X93</td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, dzielone</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X95</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analizator</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Sprzedawany również jako XFe96 FluxPak mini (102601-100) z 6 zamiast 18 wózków.</td></tr></tbody></table>

używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Plemniki ssaków nabywają zdolność do zapłodnienia w żeńskim układzie rozrodczym w procesie znanym jako capacitation. Procesy związane z pojemnością wymagają energii. Trwa debata na temat źródeł generujących ATP, który napędza ruchliwość postępową plemników, kapacytację, hiperaktywację i reakcję akrosomalną. W tym miejscu opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego jako narzędzia do analizy zmian w metabolizmie energetycznym podczas kapacytacji plemników myszy. Wykorzystując fluorofory wrażliwe na H+ iO2-, metoda ta umożliwia monitorowanie glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym w plemnikach niepojemnościowych i pojemnościowych. Zastosowanie tego testu w obecności różnych substratów energetycznych i/lub aktywatorów farmakologicznych i/lub inhibitorów może dostarczyć ważnych informacji na temat udziału różnych szlaków metabolicznych i przecięcia między kaskadami sygnałowymi a metabolizmem podczas kapacytacji plemników.

Metoda ta wykorzystuje analizator przepływu zewnątrzkomórkowego do monitorowania w czasie rzeczywistym zmian szybkości glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej (oxphos) podczas kapacytacji plemników myszy. Rysunek 4 przedstawia przykładowy eksperyment, w którym kapacytacja plemników odbywała się w obecności glukozy jako jedynego substratu energetycznego oraz 2-DG, antymycyny i rotenonu jako modulatorów farmakologicznych. Substrat energetyczny w buforze TYH anali...

Opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do monitorowania zmian w czasie rzeczywistym w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji nasienia myszy.

Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Protokół ten może być wykorzystany do zastosowania analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do monitorowania zmian w metabolizmie energetycznym podczas kapacytacji plemników. Opracowaliśmy ten protokół, aby porównać zmiany w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym między plemnikami myszy bez pojemności i z pojemnością. W dniu poprzedzającym test wyjmij wkład czujnika z zestawu do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego i umieść wkład do góry nogami obok płytki użytkowej.Napełnij zbiornik roztworu 25 mililitrami podwójnie destylowanej wody i dodaj 200 mikrolitrów wody do każdej studzienki płytki użytkowej, a następnie umieść wkład czujnika z powrotem w płytce użytkowej. Umieść płytkę w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie podajcie 25 mililitrów analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do 50-mililitrowej stożkowej rurki i umieść probówkę w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Aby przygotować mikropłytki pokryte ConA, rozpuść 2,5 miligrama ConA w pięciu mililitrach podwójnie destylowanej wody i użyj wielokanałowej pipety, aby napełnić każdą studzienkę 96-dołkowej płytki analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego 50 mikrolitrami roztworu ConA, a następnie pozostaw pokrywkę otwartą, aby płytka wyschła przez noc. Aby przygotować bufor nasienia, podgrzej 250 mililitrów buforu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego TYH do 37 stopni Celsjusza i dostosuj pH do 7,4. W dniu testu należy zastąpić wodę w każdej studzience płytki użytkowej 200 mikrolitrami kalibru XF na studzienkę i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze bez dwutlenku węgla na co najmniej jedną godzinę.Aby wygenerować szablon fali, włącz analizator strumienia zewnątrzkomórkowego. Gdy temperatura stabilizuje się do 37 stopni Celsjusza, otwórz oprogramowanie wave i otwórz pusty szablon. Na karcie definicje grup zdefiniuj pożywkę testową jako TYH, a typ komórki jako plemniki myszy, pozostawiając puste strategie wstrzykiwania i obróbki wstępne.Utwórz różne grupy dla każdego warunku testu i otwórz mapę płyty, aby przypisać każdą grupę do określonych studzienek. Na karcie protokołu odznacz równowagę, dodaj każdy z czterech różnych cykli pomiarowych, wybierz odpowiedni port i edytuj szczegóły pomiaru, aby pomiar po wstrzyknięciu był podświetlony, a następnie zapisz szablon testu, wypełnij podsumowanie projektu i zapisz wyniki. Przed pobraniem nasienia podgrzej 50 mililitrów buforu TYH w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po zebraniu ogonów od dorosłych samców myszy, umieść każdą ogon w 500 mikrolitrach wstępnie podgrzanego buforu TYH w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki. Użyj kleszczy, aby unieruchomić każdą ogon indywidualnie na dnie każdej studzienki i szybko wykonaj od pięciu do siedmiu małych nacięć w każdej tkance za pomocą nożyczek do piór. Po nacięciu wszystkich ogonów należy natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze bez dwutlenku węgla, aby plemniki mogły się rozproszyć przez 15 minut.Aby załadować wkład czujnika, zdejmij pokrywę z wkładu czujnika i wyrównaj literę odpowiedniej prowadnicy ładowania portu z lewym górnym rogiem wkładu. Trzymając prowadnicę ładowania portu na miejscu, włóż końcówki pipet pionowo do otworów prowadnicy ładowania portu w porcie A i wstrzyknij 20 mikrolitrów buforu TYH do każdej kolumny. W przypadku portu B wstrzyknąć 22 mikrolitry buforu TYH do kolumn od pierwszej do czwartej, 22 mikrolitry 500 milimolowej 2-deoksyglukozy do kolumn od piątej do ósmej i 25 mikrolitrów pięciomilimolowego rotenonu antymycyny A do kolumn od dziewiątej do dwunastej.W przypadku portu C wstrzyknąć 25 mikrolitrów buforu TYH do każdej kolumny o liczbach nieparzystych i 25 mikrolitrów 10 milimolowych dibutyrylowo-cyklicznych AMP 500 mikromolowych IBMX do każdej kolumny o numerach parzystych, a następnie umieścić wkład czujnika z płytką kalibracyjną w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego i rozpocząć test. Kalibracja potrwa od 10 do 15 minut. Aby przygotować płytki nasienne, dodaj trzy mililitry po trzy miligramy na mililitr albuminy surowicy bydlęcej w buforze TYH do każdej z trzech pięciomililitrowych probówek wirówkowych.Następnie zbierz dwie studzienki nasienia do każdej z trzech 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Po zliczeniu rozcieńczyć plemniki do stężenia dwa razy od 10 do siedmiu plemników na mililitr na próbkę w świeżym TYH uzupełnionym albuminą surowicy bydlęcej. Osadź plemniki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki nasienia w jednym mililitrze buforu TYH.Ponownie odwirować plemniki i usunąć supernatanty, uważając, aby nie naruszyć osadów. Przenieś każdą zawiesinę nasienia do jednej z przygotowanych pięciomililitrowych probówek wirówkowych i dodaj 180 mikrolitrów buforu TYH do każdego narożnego dołka płytki pokrytej ConA. Dodaj 180 mikrolitrów plemników do każdej pustej studzienki płytki pokrytej ConA i odwiruj płytkę dwa razy, obracając płytkę o 180 stopni między wirowaniami, a następnie umieść płytkę kalibracyjną z płytką nasienia i kontynuuj test.W tym reprezentatywnym eksperymencie plemniki zostały zpojemnościone w obecności glukozy jako jedynego substratu energetycznego oraz 2-deoksyglukozy oraz antymycyny i rotenonu jako modulatorów farmakologicznych. Strzałka wskazuje indukcję pojemności. W obecności glukozy kapacytacji towarzyszył siedmiokrotny wzrost szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, które jest hamowane przez blokowanie glikolizy za pomocą 2-deoksyglukozy.Plemniki zpojemnościowe wykazały 20-krotny wzrost wskaźnika zużycia tlenu w porównaniu z plemnikami niezpojemnościowymi, co pokazuje, że plemniki myszy zwiększają zarówno glikolizę, jak i fosforylację oksydacyjną, aby zaspokoić rosnące zapotrzebowanie na energię podczas kapacytacji. Na wzrost szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego podczas kapacytacji plemników nie mają wpływu inhibitory fosforylacji oksydacyjnej, antymycyna A i rotenon, co wskazuje, że zmiana tego tempa jest napędzana głównie przez uwalnianie wodoru z glikolizy. Wzrost tempa zużycia tlenu jest jednak blokowany przez antymycynę A i rotenon, a także przez 2-deoksyglukozę, co pokazuje, że wzrost OXPHOS podczas kapacytacji plemników zależy od aktywności glikolitycznej.Źródło energii oraz farmakologiczne aktywatory i inhibitory mogą być zmieniane w zależności od celu eksperymentu, a równolegle można mierzyć do 12 różnych warunków. Protokół można łatwo dostosować do innych gatunków, takich jak człowiek czy bydło, gdzie zmiany w metabolizmie energetycznym podczas kapacytacji są równie enigmatyczne.

using-an-extracellular-flux-analyzer-to-measure-changes-glycolysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten protokół zapewnia biochemiczne podejście do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) pierwotnych komórek białaczkowych za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ocena profilu metabolicznego tych komórek pomaga scharakteryzować ich zapotrzebowanie, co prowadzi do spersonalizowanej terapii.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Analiza proteomiczna dowolnego typu komórek jest wysoce zależna zarówno od czystości, jak i wstępnego frakcjonowania materiału wyjściowego w celu de-kompleksizacji próbki przed chromatografią cieczową metodą spektrometrii mas (MS). Stosując techniki płukania wstecznego, można uzyskać czyste plemniki od gryzoni. Po trawieniu fosfopeptydy można wzbogacić za pomocą TiO2.

Analiza fosfopeptydowa plemników najądrzy gryzoni

Glikoliza jest definiującym markerem metabolicznym w wielu systemach biologicznych. Monitorowanie glikolizy poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego strumienia H+ jest powszechne, ale wymaga korekty, aby była ilościowa i jednoznaczna. W tym miejscu pokazujemy, jak zbierać i korygować dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego, aby odróżnić oddechowe i glikolityczne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Opisany tutaj model myszy AcroSensE i metody obrazowania żywych komórek dostarczają nowego podejścia do badania dynamiki wapnia w subkomórkowym przedziale akrosomu plemnika i jak regulują one etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

Protokół ten opisuje opłacalny sposób przeprowadzenia testu stresowego glikolizy w celu ilościowego przeprogramowania metabolizmu w pierwotnym mikrogleju myszy. Po izolacji i stymulacji zapalnej mierzy się tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) przy użyciu świeżo przygotowanych, pH-skorygowanych odczynników, a następnie następuje normalizacja białek, umożliwiająca dokładną i powtarzalną ocenę zmian glikolitycznych.

Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego

Poznaj metodę analizy strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy. Protokół umożliwia badanie metabolizmu energetycznego w czasie rzeczywistym.

Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy (Wideo) | JoVE Journal

Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy

Przeglądaj więcej filmów