Name: Produkcja autologicznego osocza bogatopłytkowego w celu zwiększenia ekspansji ludzkich fibroblastów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę ekspansji ludzkich fibroblastów wykorzystującą autologiczne osocze bogatopłytkowe jako bezpieczny suplement komórkowy. Standardizowany protokół zapewnia skuteczną proliferację bez ksenogenicznych dodatków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu Grégory Schneiter za pomoc techniczną przy danych cytometrii przepływowej; prof. Muriel Cuendet (Laboratorium Farmakognozji, Szkoła Nauk Farmaceutycznych i Uniwersytet Genewski) za umożliwienie korzystania z cytometru przepływowego Attune i mikroskopu wysokoprzepustowego Cytation 3; Profesor Brigitte Pittet za porady naukowe.

Protokół badania był zgodny z Deklaracją Helsińską, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę przed udziałem w badaniu. Próbki skóry pobierane są od zdrowych kobiet poddawanych plastyce brzucha na Oddziale Chirurgii Plastycznej, Rekonstrukcyjnej i Estetycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie (Genewa, Szwajcaria). Procedura jest zgodna z zasadami Deklaracji Helsińskiej i została zatwierdzona przez lokalną instytucjonalną komisję etyki (protokół #3126).
1. Przygotowanie PRP
UWAGA: Probówki CuteCell-PRP (Tabela Materiałów) są przeznaczone do szybkiego przygotowania PRP z małej objętości krwi pacjenta w systemie zamkniętym.
<ol>
	<li>Pobieranie krwi pełnej 
	UWAGA: Krew autologiczną należy pobrać z żyły obwodowej ramienia za pomocą igły motylkowej bezpośrednio podłączonej do rurki PRP, zgodnie z protokołem pobrania instytutu medycznego. Krew może być pobierana bezpośrednio przez kaniulę żylną, jeśli pacjent jest pod narkozą.
	<ol>
		<li>Otworzyć blister z tubką. Wykonaj nakłucie żylne i napełnij żądaną liczbę probówek PRP krwią pełną. Podciśnienie w probówkach umożliwi automatyczne pobranie niezbędnej objętości krwi (~10 ml).</li>
		<li>Ostrożnie odwróć kilkakrotnie probówki do góry nogami, aby wymieszać krew z antykoagulantem.</li>
		<li>Z wnętrza komory bezpieczeństwa biologicznego (klasa 2) pobrać 100 μl całkowitej ilości krwi pełnej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml w celu dalszego zliczenia liczby krwinek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirowanie 
	UWAGA: Upewnij się, że wirówka jest prawidłowo wyważona przed jej uruchomieniem.
	<ol>
		<li>Po zebraniu krwi w probówkach PRP, jeśli to konieczne, przygotuj probówkę przeciwwagi (dostarczaną oddzielnie) z wodą do tego samego poziomu, co krew w probówce PRP. Umieść napełnione probówki w wirówce naprzeciwko siebie, upewniając się, że maszyna jest wyważona.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 1 500 x g przez 5 min. 
		UWAGA: Ustaw odpowiednią prędkość obrotową zgodnie z instrukcjami producenta wirówki. Po odwirowaniu krew ulegnie frakcjonowaniu. Czerwone i białe krwinki są uwięzione pod żelem, a płytki krwi osadzają się na powierzchni żelu (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie odwrócić probówkę PRP 20x, aby ponownie zawiesić osad płytek krwi w supernatantze osocza. 
	UWAGA: Upewnij się, że płytki krwi są całkowicie odłączone od żelu. Osocze powinno zmienić się z klarownego i przezroczystego na mętne. Jeśli obecne są agregaty płytek krwi, należy je pobrać wraz z osoczem.</li>
	<li>Aby pobrać PRP, należy pobrać roztwór osocza z probówki za pomocą urządzenia do przenoszenia strzykawki podłączonej do strzykawki o pojemności 10 ml. 
	UWAGA: Z każdej probówki uzyska się około 5 ml PRP. Roztwór PRP jest teraz gotowy do zmieszania z końcowym preparatem pożywki. Roztwór może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) w komorze bezpieczeństwa do czasu przyszłych kroków związanych z analizatorem hematologicznym i użytkowaniem.</li>
	<li>Przed użyciem PRP należy określić stężenie płytek krwi, średnią objętość płytek krwi oraz liczbę czerwonych i białych krwinek za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego (tabela materiałów). W tym celu należy ostrożnie pobrać 100 μl roztworu i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Osocze bogatopłytkowe (PRP) stosuje się jako autologiczny suplement do hodowli w stężeniu 5–20% v/v. Optymalne stężenie PRP należy określić dla każdej linii komórkowej. Aby zapobiec tworzeniu się skrzepów fibryny, końcową pożywkę hodowlaną należy uzupełnić heparyną o stężeniu 2 j./ml.</li>
</ol>
2. Izolacja autologicznych fibroblastów i hodowla w pożywkach uzupełnionych FBS lub PRP
<ol>
	<li>Umyj próbki skóry w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), delikatnie wstrząsając w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Jeżeli próbka skóry jest stosunkowo duża (>10cm2), należy umieścić próbkę na pokrywie naczynia do hodowli tkankowej o powierzchni 150cm2 (naskórkiem do dołu). Usuń podskórną tkankę tłuszczową za pomocą kleszczy i nożyczek. Aby zapobiec wysuszeniu chusteczki, należy ją płukać co kilka minut w PBS. 
	UWAGA: Do mniejszych próbek należy używać mniejszego naczynia do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Po zakończeniu przycinania tłuszczu pokrój tkankę na paski o wymiarach około 0,5 cm x 1,5 cm za pomocą sterylnego skalpela.</li>
	<li>Dodać 5 ml mieszaniny kolagenazy i dypazy (tabela materiałów; 14 jednostek Wünscha/ml) do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przenieś przeciętą tkankę do probówki, upewniając się, że kawałki tkanki są zanurzone w roztworze. Szczelnie zakręć rurkę.</li>
	<li>Umieścić probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym przez 150 minut. Po inkubacji umieścić probówkę zawierającą tkankę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Umieść pokrywkę sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm do góry nogami w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść strawiony roztwór tkankowy na dno naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm, nie rozpryskując się. Jeśli w probówce pozostaną jakiekolwiek kawałki tkanki, użyj sterylnej pipety o pojemności 1 ml lub sterylnych kleszczyków, aby przenieść kawałki tkanki na dno naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Trzymając pasek naskórka skierowany do góry, oddziel nienaruszony arkusz naskórka od skóry właściwej za pomocą dwóch par kleszczy. Przytrzymaj skórę właściwą paska tkanki za pomocą kleszczy, a krawędź naskórka za pomocą innej pary kleszczy. Rozerwij skórę właściwą i naskórek na dwie części, trzymając oddzielone kawałki na tej samej pokrywie. Spróbuj szybko wykonać ten krok i powtórz manipulację dla każdego kawałka tkanki.</li>
	<li>Przenieść kawałki skóry do nowej płytki hodowlanej o średnicy 100 mm zawierającej PBS.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy laboratoryjnych umieść kawałki skóry w 15 ml probówce polipropylenowej z 3 ml 0,3% trypsyny/PBS. Inkubować przez 10-20 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i odwracać probówkę kilka razy co 2-3 minuty.</li>
	<li>Aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodaj 3-5 ml lodowatej kompletnej pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle [DMEM] firmy Dulbecco lub RPMI zawierająca 10% FBS). Kilkakrotnie energicznie wymieszaj rurkę. Przefiltruj zawiesinę fibroblastów przez nylonową siatkę o grubości 85 μm (umieszczoną na górze probówki o pojemności 50 ml), aby usunąć zanieczyszczenia skórne.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 150 x g, w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100−1.000 μl kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Używając błękitu trypanowego (współczynnik rozcieńczenia x2) zmieszanego z zawiesiną komórek, policz liczbę komórek całkowitych i żywotnych, wypełniając komorę hemocytometru. 
	UWAGA: Żywotność komórek zależy od warunków stosowanych do trawienia enzymatycznego. Aby zwiększyć regenerację komórek i ich żywotność, próbkę skóry można pokroić na mniejsze kawałki.</li>
	<li>Płytka 3−10 x 104 komórki w 5 ml kompletnej pożywki wzrostowej FBS (DMEM, 10% FBS inaktywowane termicznie przez 60 min w 56 °C, 1% 1 M roztwór buforowy HEPES, 1% 100x mieszanina aminokwasów endogennych, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicylina/streptomycyna, 1% 100x pirogronian sodu) w kolbie do hodowli tkankowych o średnicy 25 cm2. Inkubować w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Żywotne fibroblasty przyczepią się do kolby w ciągu 24 godzin i zaczną wykazywać kształt wrzeciona w ciągu 2-3 dni.</li>
	<li>W dniu 2 odessać pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki i dodać świeżą pożywkę. 
	UWAGA: Ponieważ martwe komórki w pożywce hodowlanej wpływają na wzrost żywotnych fibroblastów, nieprzylegające, martwe komórki muszą zostać usunięte z hodowli.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 3-4 dni, aż kultura osiągnie 70-80% zbieżności.</li>
	<li>Aby pobrać fibroblasty, przemyć PBS i inkubować w roztworze trypsyny/EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Aby zatrzymać reakcję, dodaj 3-5 ml ciepłej kompletnej pożywki wzrostowej (DMEM lub RPMI zawierającej 10% FBS). Pobrać porcję zawiesiny komórek, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut przy 200 x g i usunąć pożywkę przez aspirację.</li>
	<li>Hodowla fibroblastów w pożywce PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M roztwór buforowy HEPES, 1% 100x mieszanina aminokwasów endogennych, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicylina/streptomycyna, 1% 100x pirogronian sodu, 2 U/ml heparyny) w inkubatorze w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Minimalna zalecana gęstość komórek to 4,000 żywotnych komórek/cm2.</li>
	<li>Aby ocenić wpływ PRP na proliferację fibroblastów, fibroblasty nasienne (pasaż 2) w 24-dołkowych płytkach o gęstości 8 x 103 komórki na dołek w pożywce PRP o różnych stężeniach PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% i 50%) oraz z heparyną 2 U/ml lub w klasycznych warunkach hodowlanych (10% FBS). Po 7 dniach hodowli dodaj do komórek ważny barwnik (fioletowy barwnik proliferacji komórek) i oceń proliferację za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Aby zbadać przegrupowania cytoszkieletu, komórki nasienne w 96 dołkach czarnych/przezroczystych płaskich płytkach o płaskim dnie w stężeniu 1 x 105 komórek/ml w pełnym wzroście FBS DMEM (patrz krok 2.14) uzupełnione 0,5% FBS przez 24 godziny. Traktuj komórki 10% FBS lub różnymi stężeniami PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% i 50%) przez 7 dni.
	<ol>
		<li>Utrwalić fibroblasty 4% paraformaldehydem przez 10 minut i przepuszczalnie 0,1% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wybarwić fibroblasty 50 ml 5 U/ml falloidyny, przemyć 2x PBS i oznaczyć 50 ml 1 mg / ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 5 min. Do wizualizacji barwienia falloidyny użyto czytnika wielomodowego obrazowania komórek Cytation 3 (BioTek).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+therapies+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+and+Aesthetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li>
<li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li>
<li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li>
<li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li>
<li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li>
<li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+cell+therapy%3A+will+it+replace+dermal+fillers%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+Plastic+Surgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li>
<li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212(2018).</li>
<li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum%3A+serum-free+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li>
<li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li>
<li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Bovine+Serum+%28FBS%29%3A+Past+-+Present+-+Future%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li>
<li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma%3A+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717(2016).</li>
<li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation%3A+Facts%2C+Fiction%2C+and+Pearls+for+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+Plastic+Surgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li>
<li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+%28PRP%29+systems%3A+a+call+for+PRP+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Regional+Anesthesia+and+Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li>
<li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Platelet-Rich+Plasma+%28CuteCell+PRP%29+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li>
<li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects%3A+A+Clinical+Replication+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetics%2C+Dermatological+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li>
<li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li>
<li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Dermatology%2C+Venereology+and+Leprology%22%5BJournal%5D)">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li>
<li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal%2FStem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724(2019).</li>
<li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet-rich+plasma%3A+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li>
<li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li>
<li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Skin+%26+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li>
<li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li>
<li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery%3A+clinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Craniofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li>
<li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+%28PRP%29+in+Infrabony+Regenerative+Treatment%3A+A+Systematic+Review+and+RCT%27s+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235(2018).</li>
<li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation%3A+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li>
<li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li>
<li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting%3A+What+Is+the+Best+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406(2015).</li>
<li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platlet+Rich+Plasma+%28PRP%29+Improves+Fat+Grafting+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma%3A+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66(2017).</li>
<li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li>
<li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypersensitivity+reactions+to+heparins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li>
<li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).</li>
</ol>

Projekt został sfinansowany przez Regen Lab SA. Sarah Berndt jest kierownikiem projektu terapii komórkowej w Regen Lab i jest zatrudniona w Regen Lab SA. Antoine Turzi jest dyrektorem generalnym RegenLab.

Zalety stosowania autologicznych fibroblastów jako naturalnej alternatywy w porównaniu z innymi materiałami wypełniającymi w terapii komórek ran obejmują dobrą biokompatybilność, minimalne skutki uboczne oraz łatwość pobierania i stosowania. Jednak przed zastosowaniem tych środków terapeutycznych w codziennych warunkach klinicznych konieczne są odpowiednie badania przedkliniczne w celu zidentyfikowania cech wzrostu oraz oceny funkcji biologicznej i bezpieczeństwa izolowanych fibroblastów zarówno przed, jak i po przeszcze...

Medycyna regeneracyjna ma na celu leczenie lub wymianę tkanek i organów uszkodzonych przez wiek, chorobę lub uraz, a także korygowanie wad wrodzonych. W terapii autologicznej komórki lub tkanki są pobierane od pacjenta, namnażane lub modyfikowane, a następnie ponownie wprowadzane do dawcy. Ta forma terapii ma szeroki potencjał w dziedzinie dermatologii1. W autologicznej terapii fibroblastami fibroblasty pacjenta są hodowane i ponownie wstrzykiwane w celu leczenia zmarszczek, rytów lub blizn potrądzikowych. Ponieważ fibroblasty są głównymi funkcjonalnymi komórkami w skórze właściwej, wstrzykiwanie autologicznych fibroblastów może być bardziej korzystne niż inne terapie w odmładzaniu twarzy2.
W skórze, fibroblasty są odpowiedzialne za syntezę i wydzielanie białek zewnątrzkomórkowych (tj. kolagenu, elastyny, kwasu hialuronowego i glikozaminoglikanów). Uwalniają również czynniki wzrostu, które regulują funkcję komórki, migrację i interakcje komórka-macierz/komórka-komórka w prawidłowej homeostazie skóry i gojeniu się ran3. Fibroblasty skórne zostały już wprowadzone jako potencjalna kliniczna terapia komórkowa do gojenia ran skóry4, regeneracja tkanek5, lub wypełniacze skórne w zabiegach chirurgii estetycznej i plastycznej6. Niektóre badania sugerują nawet, że w kontekście medycyny regeneracyjnej fibroblasty mogą być bardziej praktyczną i skuteczną terapią komórkową niż mezenchymalne komórki macierzyste7.
Aby uzyskać wystarczającą ilość fibroblastów do zastosowań klinicznych, ekspansja komórek jest zazwyczaj obowiązkowa. Hodowla komórkowa ex vivo/in vitro wymaga podłoża podstawowego uzupełnionego czynnikami wzrostu, białkami i enzymami w celu wsparcia adhezji i proliferacji komórek. Surowica bydlęca płodu (FBS) jest powszechnym suplementem do hodowli komórkowych, ponieważ krew płodu 1) jest bogata w czynniki wzrostu w porównaniu z krwią osoby dorosłej i 2) ma niską zawartość przeciwciał8. Wraz z postępem terapii komórkowej pojawiają się obawy co do bezpieczeństwa klasycznych warunków hodowli komórkowych, w których FBS jest dodawany do pożywki hodowlanej. Co więcej, obecnie istnieje tendencja do zastępowania FBS alternatywami9. Kilka substytutów FBS wykazało obiecujące wyniki10.
Alternatywa dla osocza bogatopłytkowego (PRP) została tutaj wybrana, a my opracowaliśmy urządzenie medyczne do produkcji standaryzowanego preparatu PRP, o nazwie CuteCell-PRP. Przeznaczeniem tego urządzenia jest przygotowanie autologicznego PRP do stosowania jako suplement pożywki hodowlanej do ekspansji in vitro komórek autologicznych w warunkach GMP.
PRP jest zdefiniowany jako skoncentrowana zawiesina płytek krwi w osoczu. Ponieważ istnieje wiele protokołów przygotowania, które różnią się 1) ilością potrzebnej krwi, 2) rodzajami używanych urządzeń i 3) protokołem wirowania, wynikowe stężenia płytek krwi wahają się od nieco powyżej do ponad 10-krotności wartości wyjściowej krwi. Ponadto preparaty PRP zawierają różne poziomy zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi i białymi. Terminologia "PRP" jest zatem używana do opisania produktów, które znacznie różnią się składem biologicznym i potencjalnymi efektami terapeutycznymi.
W większości badań, substytucja FBS jest osiągana przy użyciu różnych stężeń PRP, które są aktywowane (przez trombinę lub wapń). Ta sztuczna aktywacja powoduje natychmiastowe i ważne uwalnianie czynników wzrostu płytek krwi od 15 minut do 24 h11. Dlatego uważa się, że aktywacja płytek krwi jest niepożądana w przypadku zastosowań w hodowlach komórkowych, w których wymagane jest powolne uwalnianie czynników wzrostu ze stopniowej degranulacji płytek krwi.
terapia PRP polega na przygotowaniu autologicznych płytek krwi w skoncentrowanym osoczu12. Optymalne stężenie płytek krwi jest niejasne, a dostępna jest szeroka gama komercyjnych urządzeń do przygotowania PRP13. Ten brak standaryzacji wynika z niespójności między badaniami i doprowadził do powstania czarnej skrzynki dotyczącej dawkowania i czasu wstrzykiwania. Protokół ten opisuje procedurę uzyskiwania autologicznego PRP przy użyciu tego dedykowanego urządzenia PRP w celu ekspansji fibroblastów skóry w 100% autologicznym modelu hodowli ex vivo.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowy przezroczysty płaskie dno</td><td>BD Falcon</td><td>353219</td><td>32 / skrzynka</td></tr><tr><td>Ślad komórkowy Fioletowy barwnik</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C34557</td><td>180 testów</td></tr><tr><td>CuteCell PRP</td><td>Regen Lab SA</td><td>CC-PRP-3T</td><td>3 probówki w opakowaniu</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>52400-025</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>glutaminy 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>licznik hematologiczny</td><td>Sysmex</td><td>KK-21N</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna 5000E Skroplona</td><td>Drossapharm AG</td><td></td><td>0,5 ml</td></tr> roztworu <tr><td>buforowego HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>2x 5 mg w opakowaniu</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Na pirogronian 1 mg / ml</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Phalloidin alexa Fluor 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A12379</td><td>300 jednostek</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Trypsyna 1x 0,25%</td> <td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 0,25%</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td>100 ml</td></tr></tbody></table>

produkcja autologicznego osocza bogatopłytkowego w celu zwiększenia ekspansji ludzkich fibroblastów in vitro

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Obecnie istnieje duże kliniczne zainteresowanie wykorzystaniem autologicznych fibroblastów do naprawy skóry. W większości przypadków wymagana jest hodowla komórek skóry in vitro. Jednak hodowla komórkowa przy użyciu ksenogenicznych lub allogenicznych pożywek hodowlanych ma pewne wady (tj. ryzyko przeniesienia czynnika zakaźnego lub powolną ekspansję komórek). W tym przypadku opracowywany jest system hodowli autologicznej do namnażania ludzkich komórek fibroblastów skóry in vitro przy użyciu własnego osocza bogatopłytkowego (PRP) pacjenta. Ludzkie fibroblasty skóry są izolowane od pacjenta podczas wykonywania abdominoplastyki. Hodowle są obserwowane przez okres do 7 dni przy użyciu pożywki uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS) lub PRP. Ocenia się zawartość komórek krwi w preparatach PRP, proliferację i różnicowanie fibroblastów. Protokół ten opisuje sposób otrzymywania standaryzowanego, nieaktywowanego preparatu PRP za pomocą dedykowanego wyrobu medycznego. Do przygotowania potrzebne jest jedynie urządzenie medyczne (CuteCell-PRP) i wirówka. To urządzenie nadaje się do odpowiednich warunków praktyki medycznej i jest jednoetapowym, apirogenicznym i sterylnym systemem zamkniętym, który wymaga pojedynczego, miękkiego wirowania 1,500 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu składniki krwi są oddzielane, a osocze bogatopłytkowe jest łatwo zbierane. Urządzenie to pozwala na szybkie, spójne i standaryzowane przygotowanie PRP, które może być stosowane jako suplement do hodowli komórkowych do ekspansji in vitro komórek ludzkich. Uzyskany w ten sposób PRP zawiera 1,5-krotne stężenie płytek krwi w porównaniu z krwią pełną razem, z preferencyjnym usunięciem czerwonych i białych krwinek. Wykazano, że PRP wykazuje efekt zwiększający proliferację komórek w porównaniu z FBS (7,7x) i że fibroblasty są aktywowane po leczeniu PRP.

Ta opatentowana technologia stanowi prostym, szybkim i powtarzalnym wyrobem medycznym służącym do otrzymywania standaryzowanych preparatów PRP. Jest to jednowypadowy, w pełni zamknięty system, który umożliwia przygotowanie PRP z pełnej krwi żylnej po 5 min wirowania przy 1,50 x g (dzięki zastosowaniu technologii żelu separującego). PRP otrzymane po wirowaniu jest oczyszczone z erytrocytów i leukocytów, które osadzają się poniżej żelu. Po kilkukrotnym odwróceniu probówki płytki krwi znajdujące się nad żelem zosta...

Ten protokół przedstawia urządzenie, które wytwarza PRP, aby przyspieszyć ekspansję in vitro komórek w 100% autologicznym systemie hodowli fibroblastów.

Produkcja autologicznego osocza bogatopłytkowego w celu zwiększenia ekspansji ludzkich fibroblastów in vitro

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Protokół ten jest autologicznym systemem do hodowli ludzkich fibroblastów z własnym osoczem bogatopłytkowym pacjenta i standaryzowanym preparatem przez pięć minut. PRP sprzyja masowej ekspansji komórkowej fibroblastów w hodowli. Polecam stosowanie tej metody przy użyciu PRP jako suplementu komórkowego, gdy potrzebujesz masywnego potoku i bezpiecznej ekspansji komórek do autologicznych terapii komórkowych.Podczas próby korzystania z tego protokołu zalecałbym sprawdzenie integralności PRP. Twoje osocze musi być bardzo czyste bez czerwonych krwinek. Kiedy go przenosisz, musisz to robić bardzo ostrożnie.A jeśli chodzi o trawienie twojej tkanki, musi być ona bardzo czysta przed kontynuowaniem. Na początek ostrożnie obróć wypełnione krwią probówki osocza bogatopłytkowego lub PRP trzy razy do góry nogami, aby wymieszać krew z antykoagulantem. Odwiruj próbki krwi o masie 1500 g przez pięć minut w stałym wirniku pod kątem 45 stopni i zrównoważ probówki.Po odwirowaniu frakcjonowana krew ma czerwone i białe krwinki uwięzione pod żelem separującym i płytki krwi na powierzchni żelu. Delikatnie odwrócić probówkę PRP 20 razy, aby ponownie zawiesić osad płytek krwi w supernatancie osocza. Upewnij się, że płytki krwi są całkowicie oderwane od żelu, a osocze powinno zmienić kolor z przezroczystego i przezroczystego na mętny.Pobrać roztwór osocza z probówki za pomocą urządzenia do przenoszenia podłączonego do 10-mililitrowej strzykawki. Umieść próbki skóry w 50-mililitrowej probówce polipropylenowej z PBS i delikatnie potrząśnij probówką. Jeśli próbka skóry jest stosunkowo duża, umieść ją na pokrywie naczynia do hodowli tkankowej o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych naskórkiem do dołu.Usuń podskórną tkankę tłuszczową za pomocą kleszczy i nożyczek. Aby zapobiec wysychaniu chusteczki, należy ją płukać co kilka minut w PBS. Po zakończeniu usuwania tłuszczu użyj skalpela, aby pociąć próbki skóry na paski o wymiarach około 0,5 na 1,5 centymetra.Następnie dodaj pięć mililitrów mieszanki kolagenazy / dispazy do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Przenieś przeciętą tkankę do probówki. Upewnij się, że kawałki tkanki są zanurzone w roztworze i szczelnie zamknij probówkę.Umieść probówki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym przez 150 minut. Po inkubacji przenieść probówkę zawierającą tkankę do komory bezpieczeństwa biologicznego. Umieść pokrywkę sterylnego 100-milimetrowego naczynia hodowlanego do góry nogami w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Przenieś zawiesinę tkankową na dno 100-milimetrowej płytki hodowlanej bez rozpryskiwania. Jeśli w probówce pozostaną jakiekolwiek kawałki tkanki, użyj sterylnej pipety o pojemności jednego mililitra lub sterylnych kleszczy, aby przenieść kawałki na dno naczynia hodowlanego. Trzymając naskórek skierowany do góry, przytrzymaj skórę właściwą za pomocą kleszczy.Chwyć krawędź naskórka kolejną parą kleszczy i oderwij skórę właściwą i naskórek. Trzymając oddzielone kawałki na tej samej pokrywie, umieść kawałki skóry w nowym 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym PBS. Następnie, za pomocą kleszczy laboratoryjnych, przenieś kawałki skóry do 15-mililitrowej probówki polipropylenowej zawierającej trzy mililitry 0,3% trypsyny PBS.Inkubuj probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i mieszaj zawartość co dwie do trzech minut, kilkakrotnie odwracając probówkę. Po 10 do 20 minutach zatrzymaj reakcję, dodając od trzech do pięciu mililitrów lodowatej pożywki do kompletnego wzrostu. Kilkakrotnie energicznie wymieszaj rurkę.Przefiltruj zawiesinę, która zawiera fibroblasty, przez 85-mikronową nylonową siatkę do 50-mililitrowej probówki. Odwirować roztwór fibroblastów o stężeniu 150 g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 do 200 mikrolitrach kompletnej pożywki wzrostowej w celu zliczenia komórek.Umieść komórki w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Następnie inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zmień pożywkę, która zawiera nieprzylegające komórki, następnego dnia i ponownie co trzy do czterech dni.Gdy fibroblasty osiągną 70 do 80% zbieżności, umyj je PBS i dodaj roztwór Trypsyny-EDTA. Po inkubacji kolby przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zatrzymaj reakcję, dodając od trzech do pięciu mililitrów ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o masie 200 g przez pięć minut.Usunąć supernatant przez aspirację. Hoduj fibroblasty w pożywce PRP i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Minimalna zalecana gęstość komórek to 4 000 żywotnych komórek na centymetr kwadratowy.Do produkcji PRP wykorzystano dedykowane urządzenie medyczne poprzez przetwarzanie krwi pełnej od 10 różnych pacjentów. Urządzenie usunęło większość czerwonych krwinek i białych krwinek. Średnie stężenie płytek krwi w PRP było o około 50% wyższe niż stężenie płytek krwi we krwi pełnej.Fibroblasty autologiczne hodowano w pożywce z 10% FBS lub w pożywce o stężeniach PRP od jednego do 50%Po siedmiu dniach hodowli, bez zmiany pożywki, kultury zagruntowane 20% PRP wykazywały większą liczbę żywotnych fibroblastów. PRP miał silne działanie jako wzmacniacz proliferacji do 7,7 razy w porównaniu z FBS. Barwienie falloidyną wykazało, że zmiana morfologiczna obserwowana po aktywacji PRP była związana z reorganizacją F-aktyny, która jest sygnaturą aktywacji fibroblastów.Głównym problemem związanym z szybką ekspansją komórek jest ryzyko modyfikacji genomu. Aby to ocenić, możesz wykonać porównawczy test hybrydyzacji genomowej, aby ocenić stabilność genomową swoich komórek. Główną zaletą tej techniki jest zastąpienie FBS przez PRP, który jest silniejszym autologicznym suplementem biologicznym.Dzięki temu badacz może szybciej wyhodować więcej komórek bez dodatku substancji ksenogenicznych. Możemy zastosować tę technikę do innych typów komórek, które wymagają ekspansji ex vivo przed zastosowaniem klinicznym, na przykład keratynocytów lub mezenchymalnych komórek macierzystych.

production-autologous-platelet-rich-plasma-for-boosting-vitro-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ludzki lizat płytek krwi jest bogatym źródłem czynników wzrostu i silnym suplementem w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli ludzkiego lizatu płytek krwi, rozpoczynając od osocza bogatopłytkowego, przeprowadzając kilka cykli zamrażania i rozmrażania oraz usuwając fragmenty płytek.

Przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (pHPL) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Ten film przedstawia przygotowanie wysokiej jakości osocza bogatopłytkowego (PRP) poprzez badanie przesiewowe liczby płytek krwi, pobieranie i odwirowywanie krwi oraz izolowanie płytek krwi. Ten PRP jest stosowany w zastosowaniach terapeutycznych do regeneracji i gojenia tkanek.

Przygotowanie osocza bogatopłytkowego z ludzkiej krwi obwodowej

Fibryna bogata w leukocyty-płytki krwi (L-PRF) reprezentuje zatwierdzony przez FDA preparat autologicznych koncentratów płytkowych, który posiada unikalną architekturę fibryny, wzbogacone płytki krwi i obfite czynniki wzrostu. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania L-PRF po stronie fotela, a także oceniamy jego właściwości mechaniczne, w tym testy jednoosiowe i testy wytrzymałości na utrzymanie szwów.

Charakterystyka fibryny bogatopłytkowej leukocytów, nowego biomateriału

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Osocze bogatopłytkowe (PRP) jest stosowane w leczeniu schorzeń układu mięśniowo-szkieletowego koni. Różne techniki dają PRP o różnych stężeniach płytek krwi i leukocytów. W artykule opisano metodę pozyskiwania PRP z krwi koni.

Prosta metoda podwójnej probówki wirującej do uzyskiwania osocza bogatopłytkowego z krwi koni

Do przyszłych zastosowań jako łatka do naprawy częściowych zerwań więzadła krzyżowego przedniego (ACL), ludzkie komórki pochodzące z ACL zostały wyizolowane z tkanki uzyskanej podczas procedur rekonstrukcyjnych, namnażone in vitro i wyhodowane na rusztowaniach inżynierii tkankowej. Następnie przeprowadzono adhezję komórkową i morfologię, aby potwierdzić biokompatybilność na powierzchni rusztowania.

Chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Poznaj metodę ekspansji ludzkich fibroblastów wykorzystującą autologiczne osocze bogatopłytkowe jako bezpieczny suplement komórkowy. Standardizowany protokół zapewnia skuteczną proliferację bez ksenogenicznych dodatków.

Produkcja autologicznego osocza bogatopłytkowego w celu zwiększenia ekspansji ludzkich fibroblastów in vitro

Przeglądaj więcej filmów