Name: Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę oceny neurotoksyczności zanieczyszczeń środowiskowych na larwach Danio rerio. Protokół wykorzystuje testowanie wysokoprzepustowe do analizy zachowań i zarządzania chemikaliami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (21876135 i 21876136), Narodowego Głównego Projektu Naukowo-Technologicznego Chin (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), Fundacji MOE-Shanghai Key Laboratory of Children's Environmental Health (CEH201807-5) oraz Szwedzkiej Rady ds. Badań (nr 639-2013-6913).

Protokół jest zgodny z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Tongji.
1. Kolekcja zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Umieść dwie pary zdrowych, dorosłych zebry z Tybingi w tarlisku w noc poprzedzającą ekspozycję, utrzymując stosunek płci na poziomie 1:1.</li>
	<li>Wyjmij dorosłe ryby z powrotem do systemu 30-60 minut po świetle dziennym następnego ranka.</li>
	<li>Wyjmij zarodki z tarła.</li>
	<li>Opłucz zarodki wodą systemową.</li>
	<li>Przenieś zarodki na szklaną szalkę Petriego (o średnicy 9 cm) z wystarczającą ilością wody systemowej.</li>
	<li>Obserwuj zarodki pod mikroskopem i wybierz zdrowe zarodki do późniejszej ekspozycji. 
	UWAGA: Zdrowe zarodki są zwykle przezroczyste z jasnozłotym kolorem pod mikroskopem. Niezdrowe zarodki są zwykle blade i zbite razem, jak obserwuje się pod mikroskopem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie przed ekspozycją
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór Hanksa zgodnie z wytycznymi książki danio pręgowanego31. 
	UWAGA: Rozwiązanie Hanksa obejmuje 0,137 M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4 i 4,2 mM NaHCO3.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór Hanksa do 10% roztworu Hanksa, używając sterylnej wody.</li>
	<li>Dodaj 1 ml DMSO do 999 ml 10% roztworu Hanksa, aby uzyskać roztwór kontrolny 10% roztworu Hanksa, w tym 0,1% DMSO. 
	UWAGA: W następnych krokach wykorzystano BDE-47 jako przykład roztworu do ekspozycji.</li>
	<li>Rozpuścić 5 mg czystego BDE-47 w 1 ml 100% DMSO, aby uzyskać roztwór o standardowej ekspozycji 5 mg / ml.</li>
	<li>Wirować roztwór 5 mg/ml przez 1 minutę, aby całkowicie rozpuścić BDE-47 w DMSO.</li>
	<li>Przenieść 10 μl roztworu o stężeniu 5 mg/ml do butelki z brązowego szkła o pojemności 12 ml.</li>
	<li>Dodaj wysterylizowaną wodę do końcowej objętości 10 ml, aby stężenie roztworu ekspozycyjnego BDE-47 wynosiło 5 mg/l i stosunek DMSO wynosił 0,1%, a następnie wiruj przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieść 10 μl i 100 μl roztworu o stężeniu 5 mg/l do dwóch kolb miarowych o pojemności 100 ml.</li>
	<li>Dodaj 10% roztwór Hanksa, w tym 0,1% DMSO (przygotowany w kroku 2.3) do 100 ml, aby uzyskać końcowe stężenia roztworów ekspozycyjnych BDE-47 odpowiednio 5 μg/l i 50 μg/l.</li>
	<li>Przenieść roztwory do butelek z brązowego szkła o pojemności 100 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Ekspozycja zarodków
<ol>
	<li>Przenieś ~50 zarodków do każdej z trzech szklanych szalek Petriego (średnica 6 cm) 3-5 godzin po zapłodnieniu (hpf).</li>
	<li>Użyj końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby osuszyć wodę z systemu wokół zarodków.</li>
	<li>Za pomocą pipety przenieś kontrolę i dwa roztwory ekspozycyjne BDE-47 (kontrola, 5 μg/l, 50 μg/l) odpowiednio do trzech szklanych szalek Petriego.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij szklanymi szalkami Petriego jeden po drugim, aby zarodki rozproszyły się na dnie płytki.</li>
	<li>Umieścić szklane szalki Petriego w inkubatorze światła w temperaturze poniżej 28,5 °C.</li>
	<li>Odnawiać połowę roztworów ekspozycyjnych co 24 godziny do 5 dpf.</li>
	<li>Sprawdź martwe zarodki każdej grupy na 1 dpf i 2 dpf i oblicz śmiertelność.</li>
	<li>Sprawdzić inkubowane zarodki każdej grupy na 2 dpf i 3 dpf i obliczyć wylęgowość.</li>
	<li>Sprawdzaj deformację larw każdego dnia po wyjściu z kosmówki i obliczaj wskaźnik deformacji każdej grupy. 
	UWAGA: Wskaźniki deformacji obejmują między innymi torbiel osierdzia, krzywiznę kręgosłupa, krzywiznę ogona32.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do testu zachowania
<ol>
	<li>Przygotuj 48-dołkową mikropłytkę do testu lokomocji i kąta toru oraz trzy mikropłytki 6-dołkowe do testu aktywności społecznej rano o 5 dpf.</li>
	<li>Przenieś 800 μl roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki 48-dołkowej mikropłytki. 
	UWAGA: Użyj 16 dołków dla każdej grupy (tj. roztwór kontrolny, grupa 5 μg/L i grupa 50 μg/L).</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml przenieś 200 μl roztworu ekspozycyjnego z jedną larwą ze szklanej szalki Petriego do jednego dołka z 48-dołkową mikropłytką.</li>
	<li>Przenieś 4 ml roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki mikropłytki 6-dołkowej. 
	UWAGA: Użyj jednej mikropłytki 6-dołkowej dla każdej grupy.</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml przenieś 200 μl roztworu ekspozycyjnego z dwiema larwami do każdej studzienki mikropłytki 6-dołkowej. 
	UWAGA: Każda grupa składa się z sześciu powtarzających się grup.</li>
	<li>Upewnij się, że temperatura w pomieszczeniu testowym wynosi 28 °C na 2 godziny przed badaniem. 
	UWAGA: Testy behawioralne są zwykle wykonywane w godzinach popołudniowych.</li>
</ol>
5. Test behawioralny
<ol>
	<li>Badanie lokomocji i kąta toru
	<ol>
		<li>Kliknij ikonę uruchamiania na biurku komputerowym, aby otworzyć oprogramowanie (patrz Spis materiałów), które steruje obudową monitorującą o wysokiej przepustowości w celu uruchomienia programu.</li>
		<li>Wybierz moduł "Śledzenie, obroty, kąty ścieżki", aby przejść do interfejsu operacyjnego.</li>
		<li>Przenieść 48-dołkową mikropłytkę przygotowaną w kroku 4.3 na platformę rejestrującą i pociągnąć pokrywę w dół.</li>
		<li>Kliknij kolejno przycisk "Plik" "Generuj protokół" w oprogramowaniu, aby rozpocząć generowanie nowego protokołu.</li>
		<li>Wprowadź "48" w pozycji "Liczba lokalizacji" i kliknij przycisk "OK".</li>
		<li>Kliknij kolejno przycisk "Parametry", "Parametry protokołu", "Czas" w oprogramowaniu. Ustaw czas trwania eksperymentu na 1 godzinę i 10 minut i ustaw okres integracji na 60 s33.</li>
		<li>Narysuj wykryte obszary.
		<ol>
			<li>Wybierz kształt eliptyczny i narysuj pierwszy okrąg wokół pierwszego lewego górnego dołka.</li>
			<li>Zaznacz okrąg, kliknij kolejno przycisk "Kopiuj", "Znak w prawym górnym rogu", "Wklej", "Wybierz" i użyj myszy, aby przeciągnąć skopiowane kółko do prawego górnego rogu.</li>
			<li>Zaznacz okrąg, kliknij kolejno przycisk "Kopiuj", "Dolny znak", "Wklej", "Wybierz" i użyj myszy, aby przeciągnąć skopiowane kółko do prawego dolnego rogu.</li>
			<li>Kliknij kolejno przycisk "Buduj" "Wyczyść znaki". 
			UWAGA: System automatycznie narysuje co drugą studzienkę płytki. Nowo powstałe obszary powinny idealnie pasować do każdej studni pomiędzy rzeczywistą rybą a jej odbiciem z boku studni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kliknij przycisk "Narysuj skalę", narysuj na ekranie linię kalibracyjną (ścieżkę ukośną lub równoległą do boku mikropłytki), wprowadź jej długość i ustaw "Jednostkę". Następnie kliknij przycisk "Zastosuj do grupy".</li>
		<li>Ustaw kolor zwierzęcia na "" w oprogramowaniu.</li>
		<li>Ustaw próg wykrywania na 16-18, aby umożliwić wykrycie zwierząt.</li>
		<li>Wejście nieaktywne/małe i małe/duże prędkość odpowiednio 0,5 cm/s i 2,5 cm/s.</li>
		<li>Ustaw klasy kąta ścieżki. Wprowadź "-90, -30, -10, 0, 10, 30 i 90", aby utworzyć klasy kąta ścieżki od -180° do +180°.</li>
		<li>Ustawianie warunków oświetlenia
		<ol>
			<li>Kliknij kolejno przycisk "Parametry", "Lekka jazda", "Wykorzystuje jedną z 3 poniższych metod wyzwalania", "Wzmocnione bodźce", aby ustawić warunki oświetleniowe.</li>
			<li>Wybierz przycisk "Krawędź", a następnie ustaw ciemny okres 10 minut, a następnie trzy cykle naprzemiennych 10-minutowych okresów światła i ciemności.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisz protokół i zgaś światło w pomieszczeniu testowym.</li>
		<li>Zaaklimatyzuj larwy w systemie przez 10 minut i kliknij kolejno przycisk "Eksperyment" "Wykonaj", a następnie wybierz folder, w którym zapisywane są pliki eksperymentu i wprowadź nazwę wyniku.</li>
		<li>Kliknij kolejno przycisk "Tło" "Start", aby rozpocząć test.</li>
		<li>Kliknij kolejno przycisk "Eksperyment" "Zatrzymaj", aby zatrzymać eksperyment po jego zakończeniu. 
		UWAGA: System wyświetla przetestowane dane po zatrzymaniu systemu. Dane obejmują śledzoną odległość w trzech klasach prędkości i liczby kątów ścieżki w ośmiu klasach kątów na minutę. Dla badania lokomocji w przedstawionym przykładzie oblicza się całkowitą odległość w każdym okresie świetlnym (10 min) i porównuje różnicę między grupą kontrolną a grupami leczonymi.</li>
		<li>Przenieś 48-dołkową mikropłytkę z powrotem do inkubatora światła w celu przeprowadzenia innych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test aktywności społecznej
	<ol>
		<li>Kliknij ikonę programu uruchamiającego na biurku komputerowym, aby otworzyć oprogramowanie sterujące obudową monitorującą o wysokiej przepustowości w celu uruchomienia programu.</li>
		<li>Wybierz moduł "Interakcje społecznościowe", aby przejść do interfejsu operacyjnego.</li>
		<li>Przenieś przygotowaną 6-dołkową mikropłytkę (grupę kontrolną) w kroku 4.4 na platformę rejestrującą i pociągnij pokrywę w dół.</li>
		<li>Kliknij kolejno przycisk "Plik" "Generuj protokół" w oprogramowaniu, aby rozpocząć generowanie nowego protokołu.</li>
		<li>Wprowadź "6" w pozycji "Liczba lokalizacji" i kliknij przycisk "OK".</li>
		<li>Kliknij kolejno przycisk "Parametry", "Parametry protokołu", "Czas" w oprogramowaniu. Ustaw czas trwania eksperymentu na 1 godzinę i 10 minut i ustaw okres integracji na 60 s.</li>
		<li>Narysuj wykryte obszary.
		<ol>
			<li>Wybierz kształt eliptyczny i narysuj pierwszy okrąg wokół pierwszego lewego górnego dołka.</li>
			<li>Zaznacz okrąg, kliknij kolejno przycisk "Kopiuj", "Znak w prawym górnym rogu", "Wklej", "Wybierz" i użyj myszy, aby przeciągnąć skopiowane kółko do prawej górnej studni.</li>
			<li>Zaznacz okrąg, kliknij kolejno przycisk "Kopiuj", "Dolny znak", "Wklej", "Wybierz" i użyj myszy, aby przeciągnąć skopiowane kółko do prawego dolnego rogu.</li>
			<li>Kliknij kolejno przycisk "Buduj" "Wyczyść znaki". 
			UWAGA: Nowo utworzone obszary powinny idealnie pasować do każdej studzienki i pomiędzy rzeczywistymi larwami a ich odbiciem z boku studni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kliknij przycisk "Narysuj skalę", narysuj linię kalibracyjną na ekranie (ścieżkę ukośną lub równoległą do boku mikropłytki), wprowadź jej długość i ustaw "Jednostkę". Następnie kliknij przycisk "Zastosuj do grupy".</li>
		<li>Ustaw próg wykrywania na 16-18, aby umożliwić wykrycie zwierząt.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Czarne zwierzę" w oprogramowaniu.</li>
		<li>Wybierz przycisk "Próg odległości" i wprowadź "5" w oprogramowaniu.</li>
		<li>Ustaw warunki oświetleniowe.
		<ol>
			<li>Kliknij kolejno przycisk "Parametry", "Lekka jazda", "Wykorzystuje jedną z 3 poniższych metod wyzwalania", "Wzmocnione bodźce", aby ustawić warunki oświetleniowe.</li>
			<li>Wybierz przycisk "Krawędź", a następnie ustaw ciemny okres 10 minut, a następnie trzy cykle naprzemiennych 10-minutowych okresów światła i ciemności.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisz protokół i zgaś światło w pokoju.</li>
		<li>Zaaklimatyzuj larwy w systemie przez 10 minut i kliknij kolejno przycisk "Eksperyment" "Wykonaj", a następnie wybierz folder, w którym zapisywane są pliki eksperymentu i wprowadź nazwę wyniku.</li>
		<li>Kliknij kolejno przycisk "Tło" "Start", aby rozpocząć test.</li>
		<li>Kliknij kolejno przycisk "Eksperyment" "Zatrzymaj", aby zatrzymać eksperyment w oprogramowaniu po zakończeniu testu. 
		UWAGA: System wyświetla przetestowane dane po zatrzymaniu systemu.</li>
		<li>Przenieś 6-dołkową mikropłytkę (grupa kontrolna) z powrotem do inkubatora światła w celu przeprowadzenia innych eksperymentów.</li>
		<li>Przenieść kolejno 6 mikropłytek dołkowych (grupy 5 μg/l i 50 μg/l) na platformę rejestrującą i powtórzyć kroki od 5.2.4 do 5.2.17 porządkowo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego w wynikach lokomocji i kąta ścieżki.</li>
	<li>Zaznacz trzy kolumny odległości (inadist, smldist, lardist) i zsumuj je. 
	UWAGA: Dane inadist, smldist i lardist oznaczają różne odległości rejestrowane przez system w różnych klasach prędkości (odpowiednio nieaktywna/mała/duża).</li>
	<li>Dla każdego 10-minutowego okresu świetlnego zsumuj odległość każdej studni, oblicz średnią odległość 16 studni i porównaj dane z trzech grup pod wpływem bodźców świetlnych.</li>
	<li>Dla każdego 10-minutowego okresu świetlnego zsumuj liczbę kątów każdej studzienki w każdym czasie trwania światła od cl01 do cl08 po kolei i porównaj dane z trzech grup pod wpływem bodźców świetlnych. 
	UWAGA: Dane kolumn od cl01 do cl08 oznaczają różne numery kątów ścieżki rejestrowane przez system odpowiednio pod różnymi kątami ścieżki.</li>
	<li>Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego w wynikach aktywności społecznościowej.</li>
	<li>Wybierz kolumny contct i contdur i dla każdych 10 minut okresu światła zsumuj czasy społeczne i czas ich trwania dla każdej studni.</li>
	<li>Oblicz średni czas trwania spotkań towarzyskich i czas trwania jednej grupy w każdym czasie trwania światła i porównaj dane z trzech grup pod wpływem bodźców świetlnych.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+of+organophosphate+flame+retardants+in+early+life+stages+of+Japanese+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxicity+induced+by+zinc+oxide+nanoparticles%3A+age-related+differences+and+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction.</a> Scientific Reports. 5, 16117(2015).</li>
<li>Rauh, V. A., Margolis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+review%3A+environmental+exposures%2C+neurodevelopment%2C+and+child+mental+health-new+paradigms+for+the+study+of+brain+and+behavioral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Child+Psychology+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects.</a> Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).</li>
<li>Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+environmental+toxicants+and+autism+spectrum+disorders+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children.</a> Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).</li>
<li>Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchwarzenbach%2C+RP+%22Environmental+Organic+Chemistry%22">Environmental Organic Chemistry</a>. , John Wiley & Sons. (2016).</li>
<li>Akortia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+sources%2C+levels%2C+and+toxicity+of+polybrominated+diphenyl+ethers+%28PBDEs%29+and+their+transformation+and+transport+in+various+environmental+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Reviews%22%5BJournal%5D)">A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments.</a> Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).</li>
<li>Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+the+fish+early-life+stage+toxicity+test+for+engineered+nanomaterials%3A+experimental+modifications+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations.</a> Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).</li>
<li>Landrigan, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+environmental+origins+of+neurodegenerative+disease+in+later+life%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).</li>
<li>Xu, T., Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unlocking+neurobehavioral+effects+of+environmental+endocrine+disrupting+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrine+and+Metabolic+Research%22%5BJournal%5D)">The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals.</a> Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).</li>
<li>Panula, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+neurotransmitter+systems+and+behavior%3A+towards+zebrafish+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases.</a> Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).</li>
<li>Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+alterations+of+zebrafish+larvae+after+early+embryonic+exposure+to+ketamine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine.</a> Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).</li>
<li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+behavioral+effects+following+early+life+exposure+to+retinoic+acid+or+valproic+acid+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish.</a> Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).</li>
<li>Richendrfer, H., Créton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+High-throughput+Behavioral+Analyses+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50622(2013).</li>
<li>Best, J. D., Alderton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+in+vivo+model+for+the+study+of+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+%26+Treatment%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases.</a> Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).</li>
<li>Yuhei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+systems+toxicology+model+for+developmental+neurotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing.</a> Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBBPA+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress%2C+and+apoptosis+in+embryos+and+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).</li>
<li>Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+complete+animal+model+to+enumerate+the+nanoparticle+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65(2016).</li>
<li>Wehmas, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metal+oxide+nanoparticle+toxicity+using+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish.</a> Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).</li>
<li>Cavalieri, V., Spinelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+epigenetics+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Environmental epigenetics in zebrafish.</a> Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46(2017).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+three+different+embryonic+exposure+modes+of+2%2C+2%3F%2C+4%2C+4%3F-tetrabromodiphenyl+ether+on+the+path+angle+and+social+activity+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae.</a> Chemosphere. 169, 542-549 (2017).</li>
<li>Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotor+activity+changes+on+zebrafish+larvae+with+different+2%2C+2%3F%2C+4%2C+4%3F-tetrabromodiphenyl+ether+%28PBDE-47%29+embryonic+exposure+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes.</a> Chemosphere. 94, 53-61 (2014).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioral+effects+of+two+metabolites+of+BDE-47+%286-OH-BDE-47+and+6-MeO-BDE-47%29+on+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae.</a> Chemosphere. 200, 30-35 (2018).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chlorine+contents+and+chain+lengths+influence+the+neurobehavioral+effects+of+commercial+chlorinated+paraffins+on+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae.</a> Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).</li>
<li>Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+of+the+neurobehavioral%2C+molecular%2C+and+enzymatic+effects+of+organophosphates+on+embryo-larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio).</a> Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).</li>
<li>Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+behavioral+phenomics+applied+for+phenotyping+aquatic+neurotoxicity+induced+by+lead+contaminants+of+environmentally+relevant+level%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level.</a> Chemosphere. 224, 445-454 (2019).</li>
<li>Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+environmentally+relevant+neuroactive+chemicals+specifically+be+detected+with+the+locomotor+response+test+in+zebrafish+embryos%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?</a> Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).</li>
<li>Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+exposure+to+bisphenol+A+and+replacement+bisphenol+S+induces+precocious+hypothalamic+neurogenesis+in+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).</li>
<li>Javed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+amyloid+beta+toxicity+in+zebrafish+with+a+chaperone-gold+nanoparticle+dual+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Green, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+neurophenotyping+of+zebrafish+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior.</a> Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).</li>
<li>Tytell, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydrodynamics+of+eel+swimming+II.+Effect+of+swimming+speed%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed.</a> Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Zebrafish+Book%22%5BJournal%5D)">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. 4, (2000).</li>
<li>Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogenic+effects+of+embryonic+exposure+to+pretilachlor+on+the+larvae+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agro-Environment+Science%22%5BJournal%5D)">Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish.</a> Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).</li>
<li>Macphail, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+in+larval+zebrafish%3A+Influence+of+time+of+day%2C+lighting+and+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol.</a> Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).</li>
<li>Kais, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+modifies+the+permeability+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+chorion-implications+for+the+fish+embryo+test+%28FET%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET).</a> Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).</li>
<li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTruong%2C+L+%22Drug+Safety+Evaluation%22">Drug Safety Evaluation</a>. , Springer. 271-279 (2011).</li>
<li>Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+preference+in+Danio+rerio%3A+effects+of+age+and+anxiolytic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments.</a> Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).</li>
<li>Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+social+preferences+of+lone+zebrafish+in+a+novel+environment%3A+strain+and+anxiolytic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects.</a> Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).</li>
<li>Blaser, R., Penalosa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli+affecting+zebrafish+%28Danio+rerio%29+behavior+in+the+light%2Fdark+preference+test%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test.</a> Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).</li>
<li>Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+anxiety+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+dissociation+of+black%2Fwhite+preference+and+novel+tank+test%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test.</a> PloS One. 7 (5), e36931(2012).</li>
<li>Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+ecotoxicity+of+potentially+neurotoxic+substances-Evaluation+of+a+behavioural+parameter+in+the+embryogenesis+of+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio.</a> Chemosphere. 186, 43-50 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Praca ta dostarcza szczegółowego protokołu eksperymentalnego do oceny neurotoksyczności zanieczyszczeń środowiska z wykorzystaniem larw danio pręgowanego. Danio pręgowany przechodzi przez proces od zarodków do larw w okresie ekspozycji, co oznacza, że niezbędna jest dobra pielęgnacja zarodków i larw. Wszystko, co wpływa na rozwój zarodków i larw, może wpłynąć na efekt końcowy. Tutaj omówiono środowisko hodowli, proces ekspozycji i warunki eksperymentalne, aby zapewnić powodzenie całego testu.
...

W ostatnich latach udowodniono, że coraz więcej zanieczyszczeń środowiska jest neurotoksycznych1,2,3,4. Jednak ocena neurotoksyczności in vivo po narażeniu na zanieczyszczenia środowiska nie jest tak łatwa, jak w przypadku zaburzeń endokrynologicznych lub toksyczności rozwojowej. Ponadto wczesne narażenie na zanieczyszczenia, zwłaszcza w dawkach istotnych dla środowiska, przyciąga coraz większą uwagę w badaniach toksyczności5,6,7,8.
Danio pręgowany jest tworzony jako model zwierzęcy nadający się do badań neurotoksyczności we wczesnym okresie rozwoju, po ekspozycji na zanieczyszczenia środowiska. Danio pręgowany to kręgowce, które po zapłodnieniu rozwijają się szybciej niż inne gatunki. Larwy nie muszą być karmione, ponieważ składniki odżywcze w kosmówce wystarczają do utrzymania ich przez 7 dni po zapłodnieniu (dpf)9. Larwy wychodzą z kosmówki przy ~2 dpf i rozwijają zachowania, takie jak pływanie i obracanie się, które można obserwować, śledzić, określać ilościowo i analizować automatycznie za pomocą instrumentów behawioralnych10,11,12,13 począwszy od 3-4 DPF14,15,16,17,18. Ponadto testy o wysokiej przepustowości mogą być również realizowane za pomocą instrumentów behawioralnych. Tak więc larwy danio pręgowanego są znakomitym modelem do neurobehawioralnych badań zanieczyszczeń środowiska19. W tym przypadku zaproponowano protokół wykorzystujący wysokoprzepustowe monitorowanie w celu zbadania neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiskowych na larwy danio pręgowanego pod wpływem bodźców świetlnych.
Nasze laboratorium zbadało neurobehawioralną toksyczność eteru 2,2',4'-tetrabromodifenylu (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/Methoxy-2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether (6-OH/MeO-BDE-47)22, deka-bromowany eter difenylowy (BDE-209), ołów i komercyjne chlorowane parafiny23 z wykorzystaniem przedstawionego protokołu. Wiele laboratoriów korzysta również z tego protokołu do badania neurobehawioralnych skutków innych zanieczyszczeń na larwy lub dorosłe ryby24,25,26,27. Ten protokół neurobehawioralny został wykorzystany w celu zapewnienia mechanistycznego wsparcia, pokazując, że narażenie na niskie dawki bisfenolu A i zastępczego bisfenolu S wywołało przedwczesną neurogenezę podwzgórza u embrionalnego danio pręgowanego27. Ponadto niektórzy badacze zoptymalizowali protokół, aby przeprowadzić odpowiednie badania. Niedawne badanie wyeliminowało toksyczność beta-amyloidu (Aβ) w łatwym, wysokowydajnym modelu danio pręgowanego wykorzystującym nanocząstki złota pokryte kazeiną (βCas AuNPs). Wykazano, że βCas AuNP w krążeniu ogólnoustrojowym przemieszczały się przez barierę krew-mózg larw danio pręgowanego i sekwestrowały śródmózgowe Aβ42, wywołując toksyczność w niespecyficzny, podobny do chaperonu sposób, co było wspierane przez patologię behawioralną28.
Lokomocja, kąt ścieżki i aktywność społeczna to trzy wskaźniki neurobehawioralne używane do badania efektów neurotoksyczności larw danio pręgowanego po ekspozycji na zanieczyszczenia w przedstawionym protokole. Lokomocja jest mierzona odległością pływania larw i może ulec uszkodzeniu po narażeniu na zanieczyszczenia. Kąt ścieżki i aktywność społeczna są ściślej związane z funkcjonowaniem mózgu i ośrodkowego układu nerwowego29. Kąt ścieżki odnosi się do kąta ścieżki ruchu zwierzęcia w stosunku do kierunku pływania30. W systemie ustawianych jest osiem klas kątowych od ~-180° do ~+180°. Aby uprościć porównanie, sześć klas w końcowym wyniku zdefiniowano jako rutynowe skręty (-10° ~0°, 0° ~+10°), średnie skręty (-10° ~-90°, +10° ~+90°) i skręty responsywne (-180° ~-90°, +90° ~+180°) zgodnie z naszymi wcześniejszymi badaniami21,22. Aktywność społeczna dwóch ryb jest podstawą grupowego zachowania ławicowego; W tym przypadku odległość < 0,5 cm między dwiema larwami jest definiowana jako kontakt społeczny.
Przedstawiony tutaj protokół demonstruje jasny proces badania neurobehawioralnych efektów na larwy danio pręgowanego i umożliwia ujawnienie efektów neurotoksyczności różnych substancji lub zanieczyszczeń. Protokół przyniesie korzyści naukowcom zainteresowanym badaniem neurotoksyczności zanieczyszczeń środowiska.

<table><tbody><tr><td>48-dołkowa mikropłytka</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Obudowa Embyros</td></tr><tr><td>6-dołkowa mikropłytka</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Obudowa Embyros</td></tr><tr><td>BDE-47</td><td>AccuStandard</td><td>5436-43-1</td><td>Zanieczyszczenie</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td> Mikroskop <td>kosolowy</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX 16</td><td>Przyrząd obserwacyjny</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267</td><td>Rozwiązanie transferowe</td></tr><tr><td>Zebrabox</td><td>Viewpoint</td><td>ZebraBox</td><td>Instrument behawioralny</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>Shanghai FishBio Co., Ltd.</td><td>Dostawca danio pręgowanego</td> <td>z Tybingi</td></tr><tr><td>ZebraLab</td><td>Viewpoint</td><td>Oprogramowanie ZebraLab</td><td>Behavior</td></tr></tbody></table>

badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae

W ostatnich latach coraz więcej zanieczyszczeń środowiska okazało się neurotoksycznych, zwłaszcza we wczesnych stadiach rozwoju organizmów. Larwy danio pręgowanego są wybitnym modelem do neurobehawioralnych badań zanieczyszczeń środowiska. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurotoksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu larw danio pręgowanego, w tym pobierania zarodków, procesu ekspozycji, wskaźników neurobehawioralnych, procesu testowego i analizy danych. Omówiono również środowisko hodowli, proces ekspozycji i warunki eksperymentalne, aby zapewnić powodzenie testu. Protokół został wykorzystany w rozwoju leków psychopatycznych, badaniach nad neurotoksycznymi zanieczyszczeniami środowiskowymi i może być zoptymalizowany w celu przeprowadzenia odpowiednich badań lub być pomocny w badaniach mechanistycznych. Protokół przedstawia jasny proces operacyjny do badania skutków neurobehawioralnych na larwy danio pręgowanego i może ujawnić skutki różnych substancji neurotoksycznych lub zanieczyszczeń.

W niniejszym materiale opisujemy protokół badania efektów neurobehawioralnych zanieczyszczeń środowiskowych z wykorzystaniem larw rybek danio (*zebrafish*) poddanych stymulacji światłem. Testy lokomocji, kąta ścieżki oraz aktywności społecznej zostały zdefiniowane we wstępie. Poniżej przedstawiono konfigurację mikropłytek w testach lokomocji i kąta ścieżki oraz zrzuty ekranu z oprogramowania. Dodatkowo, jako przykłady, zaprezentowano wyniki naszych własnych badań. Dwie analizy przedstawia...

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae ...

Nasz protokół zapewnia jasny proces badania neurobehawioralnych skutków substancji i zanieczyszczeń będących przedmiotem zainteresowania dla larw danio pręgowanego oraz ujawniania potencjalnej neurotoksyczności tych czynników. Technikę tę można przeprowadzić przy użyciu wysokoprzepustowych testów neurozachowań w modelu danio pręgowanego. Metoda ta może być stosowana do oceny allelowo-neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń w celu wykazania potencjalnej neurotoksyczności dla nas, ludzi, ponieważ genom danio pręgowanego ma wysoką homologię z ludźmi, więc może dostarczyć wskazówek do zarządzania chemicznego i problemów zdrowia publicznego spowodowanych przez zanieczyszczenia.Ponieważ danio pręgowany ma tę zaletę, że przeprowadza się wysokoprzepustowe badania przesiewowe, metoda ta zapewnia wgląd zarówno w rozwój leków psychotropowych, jak i badania toksykologiczne w środowisku. Nie daj się zastraszyć studiowaniem pierwszego eksperymentu. Jeśli zastosujesz się do protokołu, osiągniesz pomyślny wynik.Co najmniej dwie godziny przed wykonaniem eksperymentu ustaw temperaturę pokojową na 28 stopni Celsjusza i dodaj 800 mikrolitrów roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki 48-dołkowej mikropłytki. Następnie użyj jednomililitrowej pipety ze zmodyfikowaną końcówką, aby przenieść jedną larwę w 200 mikrolitrach roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki mikropłytki w ramach przygotowań do eksperymentu z lokomocją, kątem toru. Aby przygotować sześciodołkową mikropłytkę do eksperymentów z zachowaniami społecznymi, dodaj cztery mililitry roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki z sześciodołkowej mikropłytki i przenieś dwie larwy w 200 mikrolitrach roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki.Przed rozpoczęciem testu otwórz oprogramowanie do monitorowania wysokiej przepustowości i wybierz moduł kątów ścieżki śledzenia obrotów. Przenieś 48-dołkową mikropłytkę na platformę nagrywającą i pociągnij pokrywę w dół. Kliknij Plik i generuj protokół, aby rozpocząć generowanie nowego protokołu i wprowadź liczbę 48 w polu Liczba lokalizacji.Kliknij Parametry, Parametry protokołu i Czas, ustaw Czas trwania eksperymentu na jedną godzinę i 10 minut, a Okres integracji na 60 sekund. Za pomocą narzędzia do kształtu eliptycznego narysuj okrąg wokół lewego górnego rogu. Zaznacz okrąg i kliknij Kopiuj, Prawy górny znacznik, Wklej i Wybierz.Użyj myszy, aby przeciągnąć skopiowane kółko do prawego górnego pola i kliknij Kopiuj, Prawy górny znacznik, Wklej i ponownie wybierz. Następnie przeciągnij skopiowane kółko do prawego dolnego rogu i kliknij Buduj i wyczyść znaki. System automatycznie narysuje okrąg nad każdym innym dołkiem płytki.Następnie kliknij Rysuj skalę i narysuj linię kalibracji na ekranie. Wprowadź długość linii, ustaw jednostkę i kliknij przycisk Zastosuj do grupy. Ustaw kolor zwierzęcia na i ustaw próg wykrywania na 16 do 18, aby umożliwić wykrywanie zwierząt, ustaw nieaktywną na małą prędkość na 0,5 centymetra na sekundę, a małą na dużą prędkość na 2,5 centymetra na sekundę.Ustaw klasy kąta ścieżki od minus 180 do plus 180, jak pokazano. Aby ustawić warunki oświetleniowe, kliknij Parametry, Lekka jazda, Używa jednej z 3 poniższych metod wyzwalania i Ulepszone bodźce, aby ustawić warunki oświetlenia. Kliknij Krawędź i ustaw ciemny okres na 10 minut, a następnie trzy cykle naprzemiennych 10-minutowych okresów światła i ciemności.Następnie zapisz protokół. Po ustawieniu wszystkich parametrów należy ściszyć oświetlenie w pomieszczeniu testowym i pozwolić larwom zaaklimatyzować się w systemie przez 10 minut. Pod koniec okresu aklimatyzacji kliknij przycisk Eksperymentuj i Wykonaj, a następnie utwórz folder, w którym mają zostać zapisane pliki eksperymentalne.Następnie wprowadź nazwę wyniku i kliknij Tło i Start. Po zakończeniu eksperymentu kliknij Eksperymentuj i zatrzymaj. Następnie należy zwrócić 48-dołkową mikropłytkę z powrotem do inkubatora światła w celu przeprowadzenia kolejnych eksperymentów.Ponieważ każda grupa może składać się z 16 zwierząt, system może być używany do wykonywania wysokoprzepustowych testów lokomocji i kąta toru w różnych warunkach leczenia na jednej 48-dołkowej mikropłytce. Aktywność społeczną larw można badać za pomocą płytek sześciodołkowych. W tym reprezentatywnym eksperymencie grupa o najwyższym stężeniu BDE-47 wykazała wyraźną hipoaktywność w okresie ciemnym, podczas gdy w okresach światła nie zaobserwowano żadnych zmian spowodowanych ekspozycją na BDE-47.Co więcej, grupa o wysokim stężeniu 6-hydroksy-BDE-47 wykonywała mniej rutynowych i średnich zwrotów po pięciu dniach od zapłodnienia. Jednak bardziej wrażliwe zwroty zostały wywołane w grupach ekspozycji na 6-metoksy-BDE47. Aktywność społeczna danio pręgowanego była stymulowana przez chlorowaną parafinę-70 i krótkołańcuchową chlorowaną parafinę-52b, podczas gdy długołańcuchowa chlorowana parafina-52a skracała czas kontaktu larw.Ważne jest, aby upewnić się, że larwy przeniesione do testu powinny mieć normalną zdolność pływania i brak wad rozwojowych. Inne zmienne, takie jak preferencja kolorów, preferencja jasno-ciemna, cała ciemność, ruchy ogona danio pręgowanego, mogą być uwzględnione, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska. Roztwory BDE-47 są neurotoksyczne i mogą powodować zaburzenia endokrynologiczne, dlatego należy unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą.

studying-neurobehavioral-effects-environmental-pollutants-on

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten artykuł opisuje behawioralną reakcję danio pręgowanego na toksyczne związki poprzez monitorowanie lokomocji larw. W protokole przeanalizowano również przykład reakcji larw danio pręgowanego na zanieczyszczenie środowiska.

Test lokomocji larw: wysokoprzepustowa metoda badania neurobehawioralnej toksyczności związku w larwach danio pręgowanego

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje, jak dorosły danio pręgowany może zostać unieruchomiony, zaintubowany i wykorzystany do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo, aby umożliwić rejestrację i manipulację aktywnością neuronalną u nienaruszonego zwierzęcia.

Zapis elektrofizjologiczny w mózgu nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę behawioralnego pomiaru stresu u dorosłego gryba. Podejście to wykorzystuje wrodzoną tendencję do tego, że danio pręgowany preferuje dolną połowę zbiornika, gdy jest w stanie stresu. Opisano również metody sprzężenia testu z farmakologią.

Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego

Celem obecnego protokołu jest nakreślenie kroków niezbędnych do ustanowienia i użycia testu preferencji społecznych dla dorosłych ryb danio pręgowanego i pokazanie, że można go użyć do scharakteryzowania wad społecznych wywołanych etanolem.

Modelowanie płodowych zaburzeń alkoholowych u danio pręgowanego w celu scharakteryzowania wpływu niekorzystnego środowiska embrionalnego na zachowania społeczne dorosłych

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Przedstawiono protokół projektowania i budowy zbiornika gruntowego połączonego z małym tunelem aerodynamicznym z kontrolowanym klimatem w celu zbadania wpływu wymuszeń atmosferycznych na parowanie. Zarówno zbiornik glebowy, jak i tunel aerodynamiczny są wyposażone w technologie czujników do ciągłego pomiaru warunków środowiskowych in situ.

Badanie wpływu wymuszeń atmosferycznych na parowanie: eksperymentalna integracja atmosferycznej warstwy granicznej i płytkiej warstwy podpowierzchniowej

Poznaj metodę oceny neurotoksyczności zanieczyszczeń środowiskowych na larwach Danio rerio. Protokół wykorzystuje testowanie wysokoprzepustowe do analizy zachowań i zarządzania chemikaliami.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów