Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego
5 lutego 2020
W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.
Nasz protokół zapewnia jasny proces badania neurobehawioralnych skutków substancji i zanieczyszczeń będących przedmiotem zainteresowania dla larw danio pręgowanego oraz ujawniania potencjalnej neurotoksyczności tych czynników. Technikę tę można przeprowadzić przy użyciu wysokoprzepustowych testów neurozachowań w modelu danio pręgowanego. Metoda ta może być stosowana do oceny allelowo-neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń w celu wykazania potencjalnej neurotoksyczności dla nas, ludzi, ponieważ genom danio pręgowanego ma wysoką homologię z ludźmi, więc może dostarczyć wskazówek do zarządzania chemicznego i problemów zdrowia publicznego spowodowanych przez zanieczyszczenia.
Ponieważ danio pręgowany ma tę zaletę, że przeprowadza się wysokoprzepustowe badania przesiewowe, metoda ta zapewnia wgląd zarówno w rozwój leków psychotropowych, jak i badania toksykologiczne w środowisku. Nie daj się zastraszyć studiowaniem pierwszego eksperymentu. Jeśli zastosujesz się do protokołu, osiągniesz pomyślny wynik.
Co najmniej dwie godziny przed wykonaniem eksperymentu ustaw temperaturę pokojową na 28 stopni Celsjusza i dodaj 800 mikrolitrów roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki 48-dołkowej mikropłytki. Następnie użyj jednomililitrowej pipety ze zmodyfikowaną końcówką, aby przenieść jedną larwę w 200 mikrolitrach roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki mikropłytki w ramach przygotowań do eksperymentu z lokomocją, kątem toru. Aby przygotować sześciodołkową mikropłytkę do eksperymentów z zachowaniami społecznymi, dodaj cztery mililitry roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki z sześciodołkowej mikropłytki i przenieś dwie larwy w 200 mikrolitrach roztworu ekspozycyjnego do każdej studzienki.
Przed rozpoczęciem testu otwórz oprogramowanie do monitorowania wysokiej przepustowości i wybierz moduł kątów ścieżki śledzenia obrotów. Przenieś 48-dołkową mikropłytkę na platformę nagrywającą i pociągnij pokrywę w dół. Kliknij Plik i generuj protokół, aby rozpocząć generowanie nowego protokołu i wprowadź liczbę 48 w polu Liczba lokalizacji.
Kliknij Parametry, Parametry protokołu i Czas, ustaw Czas trwania eksperymentu na jedną godzinę i 10 minut, a Okres integracji na 60 sekund. Za pomocą narzędzia do kształtu eliptycznego narysuj okrąg wokół lewego górnego rogu. Zaznacz okrąg i kliknij Kopiuj, Prawy górny znacznik, Wklej i Wybierz.
Użyj myszy, aby przeciągnąć skopiowane kółko do prawego górnego pola i kliknij Kopiuj, Prawy górny znacznik, Wklej i ponownie wybierz. Następnie przeciągnij skopiowane kółko do prawego dolnego rogu i kliknij Buduj i wyczyść znaki. System automatycznie narysuje okrąg nad każdym innym dołkiem płytki.
Następnie kliknij Rysuj skalę i narysuj linię kalibracji na ekranie. Wprowadź długość linii, ustaw jednostkę i kliknij przycisk Zastosuj do grupy. Ustaw kolor zwierzęcia na i ustaw próg wykrywania na 16 do 18, aby umożliwić wykrywanie zwierząt, ustaw nieaktywną na małą prędkość na 0,5 centymetra na sekundę, a małą na dużą prędkość na 2,5 centymetra na sekundę.
Ustaw klasy kąta ścieżki od minus 180 do plus 180, jak pokazano. Aby ustawić warunki oświetleniowe, kliknij Parametry, Lekka jazda, Używa jednej z 3 poniższych metod wyzwalania i Ulepszone bodźce, aby ustawić warunki oświetlenia. Kliknij Krawędź i ustaw ciemny okres na 10 minut, a następnie trzy cykle naprzemiennych 10-minutowych okresów światła i ciemności.
Następnie zapisz protokół. Po ustawieniu wszystkich parametrów należy ściszyć oświetlenie w pomieszczeniu testowym i pozwolić larwom zaaklimatyzować się w systemie przez 10 minut. Pod koniec okresu aklimatyzacji kliknij przycisk Eksperymentuj i Wykonaj, a następnie utwórz folder, w którym mają zostać zapisane pliki eksperymentalne.
Następnie wprowadź nazwę wyniku i kliknij Tło i Start. Po zakończeniu eksperymentu kliknij Eksperymentuj i zatrzymaj. Następnie należy zwrócić 48-dołkową mikropłytkę z powrotem do inkubatora światła w celu przeprowadzenia kolejnych eksperymentów.
Ponieważ każda grupa może składać się z 16 zwierząt, system może być używany do wykonywania wysokoprzepustowych testów lokomocji i kąta toru w różnych warunkach leczenia na jednej 48-dołkowej mikropłytce. Aktywność społeczną larw można badać za pomocą płytek sześciodołkowych. W tym reprezentatywnym eksperymencie grupa o najwyższym stężeniu BDE-47 wykazała wyraźną hipoaktywność w okresie ciemnym, podczas gdy w okresach światła nie zaobserwowano żadnych zmian spowodowanych ekspozycją na BDE-47.
Co więcej, grupa o wysokim stężeniu 6-hydroksy-BDE-47 wykonywała mniej rutynowych i średnich zwrotów po pięciu dniach od zapłodnienia. Jednak bardziej wrażliwe zwroty zostały wywołane w grupach ekspozycji na 6-metoksy-BDE47. Aktywność społeczna danio pręgowanego była stymulowana przez chlorowaną parafinę-70 i krótkołańcuchową chlorowaną parafinę-52b, podczas gdy długołańcuchowa chlorowana parafina-52a skracała czas kontaktu larw.
Ważne jest, aby upewnić się, że larwy przeniesione do testu powinny mieć normalną zdolność pływania i brak wad rozwojowych. Inne zmienne, takie jak preferencja kolorów, preferencja jasno-ciemna, cała ciemność, ruchy ogona danio pręgowanego, mogą być uwzględnione, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska. Roztwory BDE-47 są neurotoksyczne i mogą powodować zaburzenia endokrynologiczne, dlatego należy unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiskowych z wykorzystaniem modelu larw zebrafish. Szczegółowo opisano proces ekspozycji oraz testy neurobehawioralne służące do oceny potencjalnej neurotoksyczności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurotoksykologia
- Nauki o środowisku
- Analiza behawioralna
Wprowadzenie
- Larwy danio przebrzękłego stanowią cenny model do badania efektów neurobehawioralnych.
- Genom danio przebrzękłego wykazuje wysoką homologię z ludzkim genomem.
- Przesiewy wysokoprzepustowe umożliwiają efektywne testowanie zachowań neurologicznych.
- Zrozumienie neurotoksyczności jest kluczowe dla zdrowia publicznego i zarządzania substancjami chemicznymi.
Cel badania
- Ocena efektów neurobehawioralnych zanieczyszczeń środowiskowych.
- Wykazanie potencjalnej neurotoksyczności substancji u ludzi.
- Dostarczenie informacji przydatnych w opracowywaniu leków psychotropowych oraz w toksykologii środowiskowej.
Zastosowane metody
- Badania wysokoprzepustowe larw zebrafish.
- Ocena wskaźników neurobehawioralnych.
- Ekspozycja na różne zanieczyszczenia środowiskowe.
- Analiza reakcji behawioralnych w celu określenia toksyczności.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie identyfikuje toksyczność neurobehawioralną u rybek zebrafish.
- Metody wysokoprzepustowe dostarczają wiarygodnych danych na temat efektów neurobehawioralnych.
- Wyniki mogą stanowić podstawę do opracowania strategii zarządzania substancjami chemicznymi.
- Wyniki wskazują na potencjalne implikacje dla zdrowia ludzi w odniesieniu do zanieczyszczeń.
Wnioski
- Model rybki zebrafish jest skuteczny w badaniu neurotoksyczności.
- Przestrzeganie protokołu pozwala na uzyskanie pomyślnych wyników w testach neurobehawioralnych.
- Niniejsze badanie przyczynia się do zrozumienia wpływu zanieczyszczeń na zdrowie.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowe testy neurobehawioralne u larw rybek danio umożliwiają wczesne wykrywanie efektów neurotoksycznych wywołanych przez zanieczyszczenia środowiska, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w toksykologii i procesach odkrywania leków. Ten system modelowy łączy mechanistyczną redukcję ryzyka z istotnością translacyjną dzięki homologii genetycznej z ludźmi. Integracja tych testów z procesami badawczo-rozwojowymi usprawnia selekcję portfolio i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju związków neuroaktywnych oraz oceny bezpieczeństwa środowiskowego w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechaniczną analizę szlaków neurotoksycznych z wykorzystaniem genetycznie modyfikowalnego modelu kręgowców.
- Pozwala na funkcjonalną walidację celów dla związków neuroaktywnych i neurotoksycznych.
- Ułatwia zwiększenie pewności prognostycznej podczas wczesnej selekcji i priorytetyzacji związków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia wysokoprzepustowe, ilościowe odczyty behawioralne do skalowalnego przesiewania neurotoksyczności.
- Standaryzuje warunki testu w celu zapewnienia powtarzalności w obrębie bibliotek związków i paneli zanieczyszczeń.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych przepływów pracy w zakresie przesiewania mechanistycznego lub fenotypowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje punkty końcowe neurobehawioralne z biomarkerami translacyjnymi istotnymi dla neurotoksyczności u ludzi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po przedkliniczną ocenę bezpieczeństwa w przypadku substancji środowiskowych i farmaceutycznych.
- Zmniejsza ryzyko rozwoju kandydatów poprzez wczesne wykrywanie efektów poza celowych lub niepożądanych skutków neurobehawioralnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test neurobehawioralny oparty na rybkach danio mieści się w kontinuum od wczesnej fazy odkrywania leków po badania bezpieczeństwa przedklinicznego, umożliwiając szybką weryfikację hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego przed optymalizacją wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotezy zerowej w zakresie efektów neurotoksycznych i zaangażowania konkretnych szlaków w systemie kręgowców.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych parametrów lokomocji i zachowań społecznych do porównywania związków.
- Analityka: Generuje statystycznie istotne pomiary zmiennych zależnych do analizy porównawczej różnych warunków.
- Badania translacyjne: Oferuje istotne dla przebiegu chorób punkty końcowe behawioralne o znaczeniu dla zdrowia ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, wielokrotnego użytku platformę do prowadzenia ciągłych badań nad neurotoksycznością i bezpieczeństwem leków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie neurotoksyczności.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, wydajność i powtarzalność w zespołach B&R.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez wczesne identyfikowanie ryzyk.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój bezpieczniejszych i bardziej skutecznych kandydatów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze danio przeznaczonego do badań, konfiguracji testów behawioralnych oraz analizy danych.
- Wymaga infrastruktury do wysokoprzepustowego obrazowania i śledzenia zachowań.
- Wymaga standaryzacji protokołów ekspozycji i parametrów odczytu pomiędzy zespołami.
- Możliwość dostosowania do różnych punktów końcowych neurobehawioralnych i klas zanieczyszczeń poprzez optymalizację protokołu.
- Wymaga rygorystycznej kontroli zmiennych środowiskowych i eksperymentalnych w celu zapewnienia integralności danych.
