Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Test neurosfery jest przydatną techniką in vitro do badania nieodłącznych właściwości nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, w tym proliferacji, samoodnowy i multipotencji zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym. Ze względu na swoją trójwymiarową strukturę, technika ta jest potężnym narzędziem do badania neurogenezy dorosłych. Jest również przydatny do hodowli i uzyskiwania wyższych plonów nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych.

Ten test neurosfery może być stosowany do badania zaburzeń mózgu, takich jak choroby Alzheimera i Parkinsona lub stwardnienie rozsiane. Neurosfery można również uzyskać z innych obszarów lub układów mózgu, takich jak tkanka tłuszczowa lub jelita. Procedurę z Filipą Ribeiro zademonstruje Rita Soares, doktorantka w mojej grupie.

Aby zebrać mózgi myszy od pierwszego do trzech dni po urodzeniu, przytrzymaj brzuszną część ciała u podstawy głowy i użyj małych spiczastych nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry na całej długości głowy, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj podłużne nacięcie u podstawy czaszki i kontynuuj cięcie wzdłuż szwu strzałkowego pod jak najmniejszym, aby uniknąć uszkodzenia struktur mózgu. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby oderwać czaszkę na boki, aby odsłonić mózg i wsuń małą szpatułkę pod mózg, aby przeciąć nerwy czaszkowe i naczynia krwionośne połączone z podstawą mózgu.

Umieść mózg na szalce Petriego z zimnym HBSS uzupełnionym antybiotykami i umieść szalkę pod mikroskopem preparacyjnym w małym powiększeniu. Ustaw mózg na jego grzbietowej powierzchni. Trzymając mózg za móżdżek, użyj cienkich kleszczy, aby usunąć opony mózgowe z brzusznej strony mózgu i opuszki węchowe.

Obróć mózg na brzuszną część i oderwij resztę opon mózgowych. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć móżdżek i użyj zakrzywionych, spiczastych kleszczy, aby przenieść mózg na kawałek bibuły filtracyjnej z porem 11 mikrometrów na wierzchu rozdrabniacza tkanek. W przypadku mikrodysekcji SVZ i DG zacznij od pokrojenia mózgu na 450-mikrometrowe odcinki koronalne.

Użyj mokrej blaszki, aby zebrać pocięty mózg na nową szalkę Petriego wypełnioną zimnym antybiotykiem uzupełnionym HBSS pod mikroskopem preparacyjnym i użyj kleszczy, aby oddzielić plasterki koronalne w sposób przedni od tylnego, aż do osiągnięcia wycinków z bocznymi komorami. Za pomocą cienkich kleszczyków przeciąć cienką warstwę tkanek otaczających boczną ścianę komór, z wyłączeniem miąższu prążkowia i ciała modzelowatego, a następnie umieścić jedną końcówkę kleszczy bezpośrednio pod ciałem modzelowatym, a drugą w tkance bezpośrednio przylegającej do brzusznej części komory bocznej, aby wyizolować SVZ. Przeciąć niewielką linię tkanek otaczających komorę boczną i zebrać wypreparowaną tkankę do probówki z próbką zawierającą uzupełniony roztwór HBSS.

Kiedy wszystkie plastry zostaną podcięte kleszczami i zostanie osiągnięta formacja hipokampa, wyrzuć pierwszy plasterek z hipokampem, w którym DG jest nadal nierozpoznawalny. Aby usunąć DG, najpierw odizoluj hipokamp od plasterków i ponownie ustaw ostrość mikroskop, aby uwidocznić granice wokół DG.To zbierz DG, użyj kleszczy, aby wykonać cięcie między regionem DG a CA1, a następnie pionowe cięcie między regionem DG i CA3. Następnie usuń fimbrię i wszelkie przyległe tkanki i umieść pobraną tkankę w oddzielnej probówce z roztworem HBSS uzupełnionym antybiotykiem.

Aby oddzielić próbki SVZ i DG, dodaj Trypsinę-EDTA 0,05% do końcowego stężenia 5-10% Trypsyny-EDTA 0,05% w HBSS do każdej probówki na około 50-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Całkowite stosowanie trypsyny lub zbyt długi czas inkubacji może prowadzić do zwiększonej śmierci komórek, negatywnie wpływając na wzrost komórek. Gdy tkanka zlepia się ze sobą, zastąp roztwór enzymu przez cztery kolejne płukania jednym mililitrem świeżo uzupełnionego HBSS na pranie.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś strawione tkanki w jednym mililitrze pożywki bez surowicy uzupełnionej 10 nanogramami na mililitr naskórkowego czynnika wzrostu i pięcioma nanogramami na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów na probówkę. Następnie mechanicznie rozdzielić tkanki za pomocą delikatnego pipetowania siedem do 10 razy pipetą P1000, aż do uzyskania jednorodnego roztworu komórek. Aby określić gęstość zdysocjowanej komórki DG lub SVG, policz komórki w każdej zawiesinie na hematocytometrze.

Aby rozszerzyć komórki w neurosfery, rozcieńczyć poszczególne populacje komórek w gęstości dwa razy dziesięć do czwartej komórek na mililitr w pożywce bez surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu i zasiać pięć mililitrów zawiesiny komórkowej na niepowlekanych szalkach Petriego o średnicy 60 milimetrów. Następnie inkubuj komórki SVZ przez sześć do ośmiu dni, a komórki DG przez 10 do 12 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu utworzenia pierwotnej neurosfery. Gdy większość neurosfer ma średnicę od 150 do 200 mikrometrów, zbierz zawiesinę komórkową z kultur i zbierz neurosfery przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić paletę neurosfery za pomocą mysiego zestawu do dysocjacji chemicznej zgodnie z instrukcjami producenta przed zebraniem komórek za pomocą kolejnego wirowania. Zastąp supernatant jednym mililitrem pożywki bez surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu i delikatnie spróbuj ocenić osad około 10 razy. Policz zdysocjowane komórki nerwowe, jak pokazano, i ponownie zasiaj komórki w gęstości dwa razy od 10 do czwartej na mililitr w pożywce bez surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu na nowe 60-mililitrowe szalki Petriego.

Następnie należy zwrócić komórkę do inkubatora hodowli komórkowej na dodatkowe sześć do ośmiu lub 10 do 12 dni, w zależności od potrzeb, aby uzyskać wtórne neurosfery. Neurosfery SVG i DG uzyskane za pomocą testu neurosfery składają się z niezróżnicowanych komórek Sox2-dodatnich, gniazdowo-dodatnich. Warto zauważyć, że neurosfery pochodzące z SVG mają większe wymiary niż ich odpowiedniki DG.

Co ważne, w warunkach różnicowania SVG i neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe pochodzące z DG migrują z neurosfer, tworząc pseudomonowarstwę komórek. W obu regionach neurogennych można zaobserwować obecność podwójnie dodatnich par komórek Sox2, podwójnie dodatnich gniazdowych, podwójnie ujemnych par komórek podwójnie ujemnych z podwójną kortyną odpowiadających symetrycznym podziałom wskazującym na samoodnowę. Pary komórek, w których jedna komórka Sox2 dodatnia, gniazdyna dodatnia i podwójnie ujemna kortyna, a druga komórka Sox2 ujemna, gniazdyna ujemna i podwójnie dodatnia kortyna wykazująca asymetryczne podziały.

I podwójnie ujemne pary komórek Sox2, podwójnie ujemne gniazdowe i podwójnie dodatnie pary komórek podwójnie dodatnie kortyny odpowiadające symetrycznym podziałom wskazującym na różnicowanie. Ogólnie rzecz biorąc, pasażowanie zmienia wskaźnik śmierci komórek w drugim dniu in vitro. Neuretogenezę można ocenić w neuronach uzyskanych z różnicowania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych SVG i DG na początku różnicowania.

Jak zaobserwowano, długość i rozgałęzienie neurytów wzrasta wraz z różnicowaniem. W SVG obserwuje się wysoki odsetek komórek proliferacyjnych w porównaniu z DG. Chociaż odsetek proliferujących komórek progenitorowych, które różnicują się w dojrzałe neurony, jest podobny w obu niszach neurogennych. Oba typy komórek są również zdolne do różnicowania się w niedojrzałe neurony, dojrzałe neutrony, oligodendrocyty, komórki prekursorowe, dojrzałe oligodendrocyty i astrocyty.

Po uzyskaniu neurosfer można wykonać kilka metod, w tym immunocytochemię, obrazowanie wapnia, Western blot i RT-PCR, w celu zbadania macierzystej i wielomocy nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych. Test neurosfery można zastosować do modeli genetycznych i chorobowych w celu dalszej oceny procesów molekularnych i komórkowych zaangażowanych zarówno w proliferację, jak i różnicowanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych.