Name: Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj izolację i ekspansję neurosfer z nisz neurogennych myszy postnatalnych. Ta metoda umożliwia badanie właściwości komórek macierzystych oraz ich różnicowanie w neurony, oligodendrocyty i astrocyty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez IF/01227/2015 i UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) i R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) otrzymali stypendium FCT. Autorzy pragną podziękować członkom ośrodka bioobrazowania w Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes za pomoc w mikroskopii.

<ol><li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393(2010).</li>
<li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+%28neuronal%29+and+bipotent+%28neuronal%2Fastroglial%29+EGF-generated+CNS+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li>
<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li>
<li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+Mouse%2C+Two+Cultures%3A+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225(2014).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+%28CB1R%29+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529(2013).</li>
<li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li>
<li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li>
<li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457(2011).</li>
<li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural-Colony+Forming+Cell+Assay%3A+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639(2011).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li>
<li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li>
<li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+systems%3A+physiological+players+or+in+vitro+entities%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li>
<li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer%27s+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg%28APPswe%2CPSEN1dE9%2985Dbo%2FJ+embryonic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161(2014).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li>
<li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978(2017).</li>
<li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li>
<li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis%2C+Neural+Stem+Cell+Pool%2C+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li>
<li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516(2017).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis%3A+a+role+for+hemopressin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Systemy NSPC in vitro pozwalają na lepsze zrozumienie mechanizmów komórkowych i molekularnych, które można dalej walidować in vivo. NSA jest bardzo potężną metodą naśladowania warunków fizjologicznych ze względu na ich trójwymiarową strukturę. Co więcej, ten system hodowli jest również technicznie łatwiejszy do hodowli10 w porównaniu z innymi systemami in vitro, takimi jak system hodowli jednowarstwowej. Rzeczywiście, dzięki NSA łatwo jest kontrolować eksponowane sygnały zewnętrzne podczas rozwoju komórki, zarówno w fazie ekspansji, jak i różnicowania, poprzez dodawanie precyzyjnych i zmiennych ilości czynników będących przedmiotem zainteresowania pożywki, a także poprzez hodowlę neurosfer z innymi typamikomórek6. Ponadto, w porównaniu z hodowlami jednowarstwowymi, w NSA możliwe jest uzyskanie większej gęstości komórek z niewielkiej ilości tkanki lub z niewielką liczbą komórek, co pozwala na prowadzenie równoległych badań, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt1.
NSA jest najpowszechniejszą metodą izolacji i namnażania NSC 11,12,13, może być stosowana do szacowania liczby komórek prekursorowych obecnych w danej próbce tkanki 5 oraz częstości występowania komórek prekursorowych w różnych warunkach. Jednak zarówno neurosfery, jak i kultury jednowarstwowe nie odpowiadają za NSC w stanie spoczynku14. Co więcej, NSA ma pewne ograniczenia 11,12,13, a wynikająca z tego częstotliwość neurosfery zależy od wielu czynników, w tym składników pożywki, procedury rozbioru 11,12,13 i agregacji neurosfery 5 . Rzeczywiście, w kulturze o dużej gęstości neurosfery mają tendencję do agregacji. W związku z tym należy zachować ostrożność przy szacowaniu liczby komórek prekursorowych w próbce. Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, izolowane NSPC mogą być również rozszerzane i pasażowane w monowarstwie 5,15. Co ważne, wykorzystanie NSA do porównania częstości występowania komórek prekursorowych w różnych warunkach jest bardzo przydatne i dokładne, ponieważ wszystkie te ograniczenia są ukryte i podobne we wszystkich warunkach przeprowadzonych w tym samym eksperymencie.
W kulturze neurosfery istnieją krytyczne etapy, które wymagają uwagi. Na etapie pobierania mózgu, całkowite usunięcie opon mózgowych i dobra izolacja nisz neurogennych są niezbędne, aby zmaksymalizować czystość i wydajność NSPC. Podczas dysocjacji tkanek, ze względu na proteolityczną aktywność trypsyny, nadmierne stosowanie trypsyny lub dłuższy czas inkubacji może prowadzić do lizy komórek. Co więcej, dzień przejścia ma kluczowe znaczenie dla uzyskania zdrowej populacji neurosfer. Pasażujące neurosfery o średnicy większej niż 200 μm mają ogromny wpływ na żywotność, zdolność proliferacyjną i różnicującą NSPC. Co ważne, dłuższe cykle pasaży, więcej niż 10, mogą zwiększać niestabilność genetyczną6. Co więcej, powlekanie PDL i PLD/lamininą odpowiednio dla komórek SVZ i DG jest niezbędne do zapewnienia dobrej migracji komórek z neurosfer bez uszczerbku dla procesu różnicowania. Jeśli chodzi o analizę immunocytochemiczną, dłuższe czasy inkubacji z PFA mogą zagrozić barwieniu poprzez maskowanie antygenów i zwiększanie tła.
NSA jest potężnym narzędziem zapewniającym spójne i nieograniczone źródło NSPC do badań in vitro nad rozwojem i różnicowaniem neuronalnym, a także do celów terapeutycznych16,17. Rzeczywiście, test ten można zastosować do modeli genetycznych i behawioralnych w celu lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych i komórkowych zaangażowanych w proliferację i różnicowanie NSPC18,19. Test ten jest również przydatny do testowania różnych leków i związków 20,21,22, a także do wykonywania manipulacji genetycznych19,23 w celu modulowania właściwości NSC. Oprócz immunocytochemii można przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją i analizę Western blot w celu uzyskania dostępu do ekspresji RNA i białka, podczas gdy badania elektrofizjologiczne i obrazowanie wapnia można wykorzystać do oceny funkcji nowo narodzonych neuronów21.

Test neurosfery (NSA) został po raz pierwszy opisany w 1992 roku1,2 i nadal pozostaje unikalnym i potężnym narzędziem w badaniach nad neuronalnymi komórkami macierzystymi (NSC). Izolacja NSC od głównych regionów neurogennych wiąże się z trudnymi problemami, ponieważ wymagania dotyczące utrzymania tych komórek w warunkach fizjologicznych pozostają słabo poznane. W NSA komórki są hodowane w chemicznie zdefiniowanym podłożu wolnym od surowicy z obecnością czynników wzrostu, w tym naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF)1,2,3. Neuronalne komórki prekursorowe (macierzyste i progenitorowe) są wybierane przy użyciu tych mitogenów, ponieważ komórki te reagują na EGF i FGF, wchodząc w okres aktywnej proliferacji, podczas gdy inne komórki, a mianowicie komórki zróżnicowane, umierają4. Neuronalne komórki prekursorowe rosną jako neurosfery, które mogą być następnie pasażowane, aby jeszcze bardziej rozszerzyć pulę tych komórek5. Co ważne, ponieważ te progenitorowe komórki macierzyste (NSPC) są multipotencjalne, są w stanie różnicować się w trzy główne typy komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN): neurony, oligodendrocyty i astrocyty5.
NSA dostarcza odnawialnego źródła niezróżnicowanych prekursorów OUN, które mogą być wykorzystane do badania kilku procesów, w tym proliferacji i samoodnawiania się NSC oraz różnicowania neuronów i gleju, zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i chorobowym. Co więcej, badania in vitro mogą być wykorzystane do oceny stopnia wewnętrznej specyfikacji obecnej w prekursorach neuronalnych podczas rozwoju, a także do zbadania pełnego potencjału komórek, poprzez usunięcie zewnętrznych sygnałów związanych z ich normalnym środowiskiem6. Model neurosfery jest cenny dla oceny przypuszczalnych regulatorów, ponieważ utrzymując komórki w pożywce pozbawionej surowicy, sygnały środowiskowe są dostarczane tylko przez otaczające komórki6. Co więcej, w NSA NSPC łatwo się namnażają w hodowli, gęstość komórek na obszar jest wysoka, a niejednorodny skład neurosfer ma pewne podobieństwo do nisz in vivo6. Te dobrze ugruntowane zalety są powodem, dla którego metodologia ta jest szeroko stosowana przez wielu badaczy.
Poniższy protokół szczegółowo opisuje wszystkie procesy od izolacji populacji postnatalnej NSPC od dwóch głównych regionów neurogennych, strefy podkomorowej (SVZ) i zakrętu zębatego hipokampa (DG), aż do ekspansji tych komórek jako neurosfer, a także do różnicowania się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Na koniec opisano również różne testy w celu uzyskania dostępu do właściwości pnia i multipotencji NSPC pochodzących z SVZ i DG.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>0,4% roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>12mm Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>VWR</td><td>631-1577</td><td></td></tr><tr><td>15mL Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-2'-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285-1G</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Manuel Vieira & C&ordf; (Irm&atilde; o) Sucrs, Lda</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka adhezyjne, Menzel Gl&auml; ser, SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-kurczak IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-królik IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-szczurzy IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 osioł anty-mysz IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 osioł anty-królik IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kozia anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Anty-5-bromo-2-deoksyurydyna</td><td>Dako</td><td>M0744</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD140a (PDGFR&alfa;) (szczur)</td><td>BD Biosciences</td><td>558774</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:500.</td></tr><tr><td>Siarczan anty-chondroityny Proteoglikan NG2 (królik)</td><td>Merck Milipore</td><td>AB5320</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:200.</td></tr><tr><td>Anty-Doublecortin (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:200.</td></tr><tr><td>Systemy synaptyczne</td> <td>anty-Doublecortin (kurczak)</td> <td>326006</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:500.</td></tr><tr><td>Kwaśne białko fibrylarne przeciwglejowe (królik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9269-.2ML</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:1000.</td></tr><tr><td>Antymielinowe białko podstawowe (królik)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>78896S</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:200.</td></tr><tr><td>Anti-Nestin (mysz)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB353</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:200.</td></tr><tr><td>Jądra antyneuronalne (myszy)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB377</td><td>Użyj 6% BSA w PBS 1X. Rozcieńczyć w stosunku 1:400.</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:500.</td></tr><tr><td>Anty-tubulina &beta; 3 (królik)</td><td>BioLegend</td><td>802001</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:200.</td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny Axiovert 200</td><td>Suplement ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 (50X), bez surowicy</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500g</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>NZYTech</td><td>MB04602</td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek, Neubauer</td><td>Hirschmann</td><td>8100104</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa CO Inkubator 2</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated 24 Płytka wielodołkowa</td><td>Corning</td><td>CLS3524-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodowy wodorofosforan dwuwodny</td><td>Merck Milipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, Suplement GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Kleszcze drobnoziarniste</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do #5S Dumont</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Kleszcze</td><td>FST</td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>ThermoFisher</td><td>53003018</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>ThermoFisher</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>Bibuły filtracyjne</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr> - <tr><td>Sharp</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Gillete Platinum 5 ostrzy</td><td>Gillette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>1399</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck Milipore</td><td>1.09057.1000 (1L)</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego Labculture klasy II</td><td>ESCO</td><td>2012-65727</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz do tkanek McILWAIN</td><td>Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td><td>MTC/2</td><td>Ustaw na 450 &mu; </td></tr><tr><td>m Mikro szpatułka - 12 cm</td><td>FST</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 0,5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.699</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 2,0 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji chemicznej NeuroCult (mysz)</td><td>Komórka macierzysta</td><td>5707</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus SZ51</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, proszek</td><td>VWR</td><td>28794.295</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 60 mm</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Roztwory wzorcowe fosforanów, PO43 - w wodzie</td><td>BDH ARISTAR</td><td>452232C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna 100mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-ornityny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>27800.360.5K</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck Milipore</td><td>535C549998</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>14630</td><td></td></tr><tr><td>VWR INCU-Line IL10</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (p1−3) mysich nisz neurogennych

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Test neurosfery jest niezwykle przydatną techniką in vitro do badania naturalnych właściwości nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych (NSPC), w tym proliferacji, samoodnowy i multipotencji. W mózgu po urodzeniu i w wieku dorosłym NSPC są obecne głównie w dwóch niszach neurogennych: strefie podkomorowej (SVZ) wyściełającej komory boczne i strefie podziarnistej zakrętu zębatego hipokampa (DG). Izolacja nisz neurogennych od mózgu postnatalnego pozwala na uzyskanie większej ilości NSPC w hodowli, a w konsekwencji na korzyść wyższych plonów. Bliski kontakt między komórkami w każdej neurosferze tworzy mikrośrodowisko, które może przypominać nisze neurogenne. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak generować kultury neurosfery pochodzące z SVZ i DG od myszy w wieku 1-3 dni (P1-3), a także pasażowanie w celu ekspansji neurosfery. Jest to korzystne podejście, ponieważ test neurosfery pozwala na szybkie generowanie klonów NSPC (6-12 dni) i przyczynia się do znacznego zmniejszenia liczby wykorzystania przez zwierzęta. Poprzez posiew neurosfer w warunkach różnicowania możemy uzyskać pseudomonowarstwę komórek złożoną z NSPC i zróżnicowanych komórek o różnych liniach nerwowych (neuronów, astrocytów i oligodendrocytów), co pozwala na badanie działania czynników wewnętrznych lub zewnętrznych na proliferację, różnicowanie, przeżycie komórek i neurytogenezę.

Neurosfery z SVZ i DG, otrzymane przy użyciu NSA, składają się z niezróżnicowanych komórek wykazujących pozytywny wynik dla Sox2, czynnika transkrypcyjnego zaangażowanego w zdolność do samoodnawiania, oraz dla nestyny, białka filamentów pośrednich ekspresowanego w NSPCs (Rysunek 1A). Ponadto neurosfery pochodzące z SVZ mają większe rozmiary niż ich odpowiedniki z DG (Rysunek 1A). Co istotne, w warunkach różnicowania NSPCs pochodzące z SVZ i DG migrują poza neurosfery, tworząc pseudomonowarstwę komórek (Rysunek 1B).
W celu oceny zdolności do samoodnowy przeprowadzono test par komórkowych w oparciu o ekspresję Sox2 i nestyny, która wygasza się w dzielących się komórkach rozpoczynających proces różnicowania, w połączeniu z markerem linii neuronalnej, mianowicie DCX. W obu obszarach neurogennych można zaobserwować podziały symetryczne (samoodnowa) Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- (Rycina 2A1,B1), podziały asymetryczne Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- (Rycina 2A1,B2) oraz podziały symetryczne (różnicowanie) Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ (Rycina 2A2,B1).
Pasażowanie neurosfer zwiększa wydajność NSPC; jednakże śmierć komórek w DIV2 zmienia się wraz z pasażowaniem. W rzeczywistości procent komórek dodatnich dla PI wzrasta wraz z pasażowaniem komórek w SVZ (P0: 15,6% ± 1,2% vs P1: 19,2% ± 2,7% vs P2: 32,35% ± 0,14% vs P3: 39,6% ± 4,0%) oraz w DG (P0: 16,31% ± 0,95% vs P1: 32,1% ± 1,7% vs P2: 27,42% vs P3: 32,2% ± 3,1%) (Rysunek 3).
Neurytogenezę można ocenić w neuronach uzyskanych z różnicowania NSPC z obszarów SVZ i DG na początku różnicowania: DIV1 (Rycina 4A,D), DIV2 (Rycina 4B,E) oraz DIV3 (Rycina 4C,F). W rzeczywistości, jak zaobserwowano na Rycynie 4, długość i stopień rozgałęzienia neurytów zwiększają się wraz z postępem różnicowania.
Proliferację komórek można ocenić w neurosferach pochodzących z SVZ i DG. Porównując pierwotne zróżnicowane neurosfery w DIV1 z SVZ (Rysunek 5A1) i DG (Rysunek 5A2), odsetek komórek BrdU-dodatnich jest wyższy w SVZ niż w DG (SVZ: 6,15% ± 0,64% vs DG: 3,27% ± 0,13%; p &lt; 0,05; n = 4; Rysunek 5A3). Ponadto zróżnicowanie komórek można ocenić, łącząc barwienie BrdU z markerem dojrzałości, takim jak jądra neuronalne (NeuN), który identyfikuje dojrzałe neurony (Rysunek 5B1,B2). Rysunek 5B3 pokazuje, że odsetek proliferujących progenitorów, które różnicują się w dojrzałe neurony, jest podobny w SVZ i DG (SVZ: 12,04% ± 1,58% vs DG: 13,56% ± 0,48%; p &gt; 0,05; n = 4).
Właściwości macierzystości i wielopotencjalności NSPC pochodzących z SVZ i DG można ocenić za pomocą NSA, analizując ekspresję różnych markerów w różnych dniach różnicowania (DIV2 i DIV7). Rzeczywiście, NSCs (komórki podwójnie dodatnie dla nestyny oraz gliałego białka włóknistego kwaśnego [GFAP]) występują w obu regionach neurogennych (Rysunek 6A,G). Komórki te są zdolne do różnicowania się w niedojrzałe neurony (komórki DCX-dodatnie) (Rysunek 6B,H), dojrzałe neurony (komórki NeuN-dodatnie) (Rysunek 6F,L), komórki prekursorowe oligodendrocytów (komórki dodatnie dla antygenu neuronowo-gialnego 2 [NG2] i receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego α [PDGFRα]) (Rysunek 6C,I), dojrzałe oligodendrocyty (komórki MBP-dodatnie, gdzie MBP to podstawowe białko mieliny) (Rysunek 6E,K) oraz astrocyty (komórki GFAP-dodatnie) (Rysunek 6D,J).
Do pokrywania szkiełek podstawowych w celu utworzenia pseudomonowarstwy komórek w warunkach różnicowania można zastosować różne podłoża. Jak pokazano na Rycynie uzupełniającej 1, komórki DG wykazują większą migrację, gdy szkiełka podstawowe są dodatkowo pokryte lamininą w połączeniu z PLO lub PDL niż w przypadku zastosowania samego PDL (Rycina uzupełniająca 1B−H). W rzeczywistości, gdy jako podłoża stosuje się wspólnie PDL i lamininę (Rycina uzupełniająca 1C,G), komórki DG tworzą bardziej zbitą pseudomonowarstwę niż komórki SVZ, dla których zastosowano wyłącznie PDL (Rycina uzupełniająca 1A,E).
Co istotne, wyniki te wykazują potencjał NSA w ocenie właściwości pluripotencji i wielopotencjalności NSCs pochodzących z dwóch głównych nisz neurogennych.
<img alt="Kultury komórek SVZ i DG z barwieniem Hoechst/SOX2/Nestin; mikroskopia, badanie neurogenezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: NSPC pochodzące z strefy podkomorowej i zakrętu zębatego hodowane jako neurosfery lub pseudomonowarstwy. (A) Reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym (A1,A3) i fluorescencyjne (A2,A4) neurosfer pochodzących z SVZ i DG, gdzie jądra barwiono Hoechst 33342 (niebieski), a NSC pod kątem Sox2 (zielony) i nestyny (czerwony). (B) Reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym pseudomonowarstw wytworzonych z neurosfer pochodzących z SVZ i DG w warunkach różnicowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, różnicowanie neuronalne, Sox2 DCX, analiza immunofluorescencyjna, komórki SVZ i DG." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Test par komórek. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne par komórek pochodzących z podziału komórki progenitorowej. Jądra komórek SVZ i DG zostały zabarwione Hoechst 33342 (niebieski), komórki macierzystopodobne na Sox2 (czerwony) i nestynę (biały), a niedojrzałe neurony na DCX (zielony). Groty strzałek na panelach A1 i B1 wskazują symetryczne podziały samoodnawiające Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/-, strzałki na panelach A1 i B2 wskazują podziały asymetryczne Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+, a strzałki przerywane na panelach A2 i B1 pokazują symetryczne podziały różnicujące Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający procent komórek wykazujących pozytywność na PI w strefie podkomorowej (SVZ) i zakręcie zębatym (DG) w stadiach P0-P3, wskazujący na żywotność komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Analiza przeżywalności komórek wraz z pasażowaniem komórek. Analiza ilościowa komórek PI-dodatnich w 2. dniu in vitro (DIV2) w kulturach zróżnicowanych neurosfer pochodzących z strefy podkomorowej (SVZ) i zakrętu zębatego (DG), po 0, 1, 2 i 3 pasażach (P0–P3). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n = 1–8. PI = jodek propidyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia rozwoju neuronalnego, barwienie Hoechst Tuj1, DIV1-3, regiony SVZ DG, fluorescencja komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza neuritogenezy w dniach DIV 1, 2 i 3. Reprezentatywne obrazy fluorescencji konfokalnej neurytów, zidentyfikowanych za pomocą sygnału βIII-tubuliny, w neuronach SVZ i DG w dniach (A,D) DIV1, (B,E) DIV2 oraz (C,F) DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek; marker BrdU; SVZ vs DG; analiza komórek neuronalnych; wyniki na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza proliferacji komórek. Reprezentatywne obrazy konfokalne komórek BrdU-dodatnich w DIV1 w (A1) SVZ i (A2) DG. (A3) Analiza ilościowa komórek BrdU-dodatnich w DIV1 w zróżnicowanych kulturach neurosfer pochodzących z DG i SVZ. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n = 4. *p &lt; 0,05 w teście t. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne komórek BrdU- i NeuN-dodatnich w DIV7 w (B1) SVZ i (B2) DG. Grotowid szykują komórki BrdU-/NeuN-dodatnie. (B3) Analiza ilościowa komórek BrdU-/NeuN-dodatnich w DIV7 w obu niszach. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoksyurydyna, syntetyczny analog tymidyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja komórek neuronalnych, DIV2 vs DIV7, barwienie Hoechst, markery GFAP, Nestin, DCX, mikroskopia konfokalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Typy komórek neuronalnych obecne w hodowli zróżnicowanych neurosfer pochodzących z SVZ i DG. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne typów komórek pochodzących z SVZ i DG po 2 i 7 dniach różnicowania neurosfer (DIV2 i DIV7), gdzie jądra komórkowe zabarwiono Hoechst 33342 (niebieski) oraz: (A,G) NSCs na GFAP (zielony) i nestin (czerwony), (B,H) niedojrzałe neurony na DCX (zielony), (C,I) komórki prekursorowe oligodendrocytów na PDGFRα (zielony) i NG2 (czerwony), (D,J) astrocyty na GFAP (zielony), (E,K) dojrzałe oligodendrocyty na MBP (zielony) oraz (F,L) dojrzałe neurony na NeuN (czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa wykazująca komórki barwione Hoechst; powiększenie 10x/40x; efekt podłoży." src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina uzupełniająca 1"> 
Rycina uzupełniająca 1: Testowanie różnych podłoży pod kątem adhezji i migracji neurosfer w celu utworzenia pseudomonowarstwy. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne dla (A,E) pseudomonowarstwy pochodzącej z SVZ z zastosowaniem poli-D-lizyny jako podłoża, (B,F) pseudomonowarstwy pochodzącej z DG z zastosowaniem poli-D-lizyny jako podłoża, (C,G) pseudomonowarstwy pochodzącej z DG z zastosowaniem poli-D-lizyny z lamininą jako podłoża oraz (D,H) pseudomonowarstwy pochodzącej z DG z zastosowaniem poli-D-lizyny z poli-L-ornityną jako podłoża. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Test neurosfery jest przydatną techniką in vitro do badania nieodłącznych właściwości nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, w tym proliferacji, samoodnowy i multipotencji zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym. Ze względu na swoją trójwymiarową strukturę, technika ta jest potężnym narzędziem do badania neurogenezy dorosłych. Jest również przydatny do hodowli i uzyskiwania wyższych plonów nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych.Ten test neurosfery może być stosowany do badania zaburzeń mózgu, takich jak choroby Alzheimera i Parkinsona lub stwardnienie rozsiane. Neurosfery można również uzyskać z innych obszarów lub układów mózgu, takich jak tkanka tłuszczowa lub jelita. Procedurę z Filipą Ribeiro zademonstruje Rita Soares, doktorantka w mojej grupie.Aby zebrać mózgi myszy od pierwszego do trzech dni po urodzeniu, przytrzymaj brzuszną część ciała u podstawy głowy i użyj małych spiczastych nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry na całej długości głowy, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj podłużne nacięcie u podstawy czaszki i kontynuuj cięcie wzdłuż szwu strzałkowego pod jak najmniejszym, aby uniknąć uszkodzenia struktur mózgu. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby oderwać czaszkę na boki, aby odsłonić mózg i wsuń małą szpatułkę pod mózg, aby przeciąć nerwy czaszkowe i naczynia krwionośne połączone z podstawą mózgu.Umieść mózg na szalce Petriego z zimnym HBSS uzupełnionym antybiotykami i umieść szalkę pod mikroskopem preparacyjnym w małym powiększeniu. Ustaw mózg na jego grzbietowej powierzchni. Trzymając mózg za móżdżek, użyj cienkich kleszczy, aby usunąć opony mózgowe z brzusznej strony mózgu i opuszki węchowe.Obróć mózg na brzuszną część i oderwij resztę opon mózgowych. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć móżdżek i użyj zakrzywionych, spiczastych kleszczy, aby przenieść mózg na kawałek bibuły filtracyjnej z porem 11 mikrometrów na wierzchu rozdrabniacza tkanek. W przypadku mikrodysekcji SVZ i DG zacznij od pokrojenia mózgu na 450-mikrometrowe odcinki koronalne.Użyj mokrej blaszki, aby zebrać pocięty mózg na nową szalkę Petriego wypełnioną zimnym antybiotykiem uzupełnionym HBSS pod mikroskopem preparacyjnym i użyj kleszczy, aby oddzielić plasterki koronalne w sposób przedni od tylnego, aż do osiągnięcia wycinków z bocznymi komorami. Za pomocą cienkich kleszczyków przeciąć cienką warstwę tkanek otaczających boczną ścianę komór, z wyłączeniem miąższu prążkowia i ciała modzelowatego, a następnie umieścić jedną końcówkę kleszczy bezpośrednio pod ciałem modzelowatym, a drugą w tkance bezpośrednio przylegającej do brzusznej części komory bocznej, aby wyizolować SVZ. Przeciąć niewielką linię tkanek otaczających komorę boczną i zebrać wypreparowaną tkankę do probówki z próbką zawierającą uzupełniony roztwór HBSS.Kiedy wszystkie plastry zostaną podcięte kleszczami i zostanie osiągnięta formacja hipokampa, wyrzuć pierwszy plasterek z hipokampem, w którym DG jest nadal nierozpoznawalny. Aby usunąć DG, najpierw odizoluj hipokamp od plasterków i ponownie ustaw ostrość mikroskop, aby uwidocznić granice wokół DG.To zbierz DG, użyj kleszczy, aby wykonać cięcie między regionem DG a CA1, a następnie pionowe cięcie między regionem DG i CA3. Następnie usuń fimbrię i wszelkie przyległe tkanki i umieść pobraną tkankę w oddzielnej probówce z roztworem HBSS uzupełnionym antybiotykiem.Aby oddzielić próbki SVZ i DG, dodaj Trypsinę-EDTA 0,05% do końcowego stężenia 5-10% Trypsyny-EDTA 0,05% w HBSS do każdej probówki na około 50-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Całkowite stosowanie trypsyny lub zbyt długi czas inkubacji może prowadzić do zwiększonej śmierci komórek, negatywnie wpływając na wzrost komórek. Gdy tkanka zlepia się ze sobą, zastąp roztwór enzymu przez cztery kolejne płukania jednym mililitrem świeżo uzupełnionego HBSS na pranie.Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś strawione tkanki w jednym mililitrze pożywki bez surowicy uzupełnionej 10 nanogramami na mililitr naskórkowego czynnika wzrostu i pięcioma nanogramami na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów na probówkę. Następnie mechanicznie rozdzielić tkanki za pomocą delikatnego pipetowania siedem do 10 razy pipetą P1000, aż do uzyskania jednorodnego roztworu komórek. Aby określić gęstość zdysocjowanej komórki DG lub SVG, policz komórki w każdej zawiesinie na hematocytometrze.Aby rozszerzyć komórki w neurosfery, rozcieńczyć poszczególne populacje komórek w gęstości dwa razy dziesięć do czwartej komórek na mililitr w pożywce bez surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu i zasiać pięć mililitrów zawiesiny komórkowej na niepowlekanych szalkach Petriego o średnicy 60 milimetrów. Następnie inkubuj komórki SVZ przez sześć do ośmiu dni, a komórki DG przez 10 do 12 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu utworzenia pierwotnej neurosfery. Gdy większość neurosfer ma średnicę od 150 do 200 mikrometrów, zbierz zawiesinę komórkową z kultur i zbierz neurosfery przez odwirowanie.Ponownie zawiesić paletę neurosfery za pomocą mysiego zestawu do dysocjacji chemicznej zgodnie z instrukcjami producenta przed zebraniem komórek za pomocą kolejnego wirowania. Zastąp supernatant jednym mililitrem pożywki bez surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu i delikatnie spróbuj ocenić osad około 10 razy. Policz zdysocjowane komórki nerwowe, jak pokazano, i ponownie zasiaj komórki w gęstości dwa razy od 10 do czwartej na mililitr w pożywce bez surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu na nowe 60-mililitrowe szalki Petriego.Następnie należy zwrócić komórkę do inkubatora hodowli komórkowej na dodatkowe sześć do ośmiu lub 10 do 12 dni, w zależności od potrzeb, aby uzyskać wtórne neurosfery. Neurosfery SVG i DG uzyskane za pomocą testu neurosfery składają się z niezróżnicowanych komórek Sox2-dodatnich, gniazdowo-dodatnich. Warto zauważyć, że neurosfery pochodzące z SVG mają większe wymiary niż ich odpowiedniki DG.Co ważne, w warunkach różnicowania SVG i neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe pochodzące z DG migrują z neurosfer, tworząc pseudomonowarstwę komórek. W obu regionach neurogennych można zaobserwować obecność podwójnie dodatnich par komórek Sox2, podwójnie dodatnich gniazdowych, podwójnie ujemnych par komórek podwójnie ujemnych z podwójną kortyną odpowiadających symetrycznym podziałom wskazującym na samoodnowę. Pary komórek, w których jedna komórka Sox2 dodatnia, gniazdyna dodatnia i podwójnie ujemna kortyna, a druga komórka Sox2 ujemna, gniazdyna ujemna i podwójnie dodatnia kortyna wykazująca asymetryczne podziały.I podwójnie ujemne pary komórek Sox2, podwójnie ujemne gniazdowe i podwójnie dodatnie pary komórek podwójnie dodatnie kortyny odpowiadające symetrycznym podziałom wskazującym na różnicowanie. Ogólnie rzecz biorąc, pasażowanie zmienia wskaźnik śmierci komórek w drugim dniu in vitro. Neuretogenezę można ocenić w neuronach uzyskanych z różnicowania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych SVG i DG na początku różnicowania.Jak zaobserwowano, długość i rozgałęzienie neurytów wzrasta wraz z różnicowaniem. W SVG obserwuje się wysoki odsetek komórek proliferacyjnych w porównaniu z DG. Chociaż odsetek proliferujących komórek progenitorowych, które różnicują się w dojrzałe neurony, jest podobny w obu niszach neurogennych. Oba typy komórek są również zdolne do różnicowania się w niedojrzałe neurony, dojrzałe neutrony, oligodendrocyty, komórki prekursorowe, dojrzałe oligodendrocyty i astrocyty.Po uzyskaniu neurosfer można wykonać kilka metod, w tym immunocytochemię, obrazowanie wapnia, Western blot i RT-PCR, w celu zbadania macierzystej i wielomocy nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych. Test neurosfery można zastosować do modeli genetycznych i chorobowych w celu dalszej oceny procesów molekularnych i komórkowych zaangażowanych zarówno w proliferację, jak i różnicowanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych.

isolation-expansion-neurospheres-from-postnatal-p13-mouse-neurogenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Ten film pokazuje proces powstawania neurosfery i jej ekspansji z tkanki hipokampa. Nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe z postnatalnej tkanki zakrętu zębatego myszy proliferują i tworzą pierwotne neurosfery, które są następnie ponownie zasiewane, tworząc neurosfery wtórne.

Tworzenie i rozszerzanie neurosfer z tkanki hipokampa

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

Stworzyliśmy warunki do hodowli nerwowych komórek progenitorowych ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego dorosłego mózgu norników preriowych, jako uzupełniające badanie in vitro, w celu analizy zależnych od płci różnic między niszami neurogennymi, które mogą być częścią funkcjonalnych zmian plastycznych związanych z zachowaniami społecznymi.

Kultura neurosfer wywodzących się z nisz neurogennych u dorosłych norników preriowych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Poznaj izolację i ekspansję neurosfer z nisz neurogennych myszy postnatalnych. Ta metoda umożliwia badanie właściwości komórek macierzystych oraz ich różnicowanie w neurony, oligodendrocyty i astrocyty.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Przeglądaj więcej filmów