Name: Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Odkryj metodę równoległego przesiewowego badania rekrutacji β-Arrestin2 do GPCR przy użyciu platformy PRESTO-Tango. To otwarte źródło umożliwia farmakologiczne profilowanie ligandów i identyfikację związków aktywnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (grant CIHR #MOP142219).

1. Przesiewanie pierwotne: hodowla komórek i wysiew na płytki
<ol>
	<li>Aby przygotować płytki pokryte poli-L-lizyną (PLL), nanieść 20 μL/dołek roztworu stokowego PLL o stężeniu 25 μg/mL do białych lub czarnych płytek optycznych 384-dołkowych z przezroczystym dnem, używając elektronicznej pipety wielokanałowej lub dozownika odczynników. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 0,5–2 h. 
	UWAGA: W przypadku stosowania czarnych płytek 384-dołkowych należy spodziewać się niższego sygnału tła w porównaniu z płytkami białymi. Płytki czarne są zalecane w celu ograniczenia przenikania luminescencji między sąsiednimi dołkami.</li>
	<li>Aby zakonserwować pokryte płytki i wypłukać nadmiar PLL, usunąć PLL poprzez szybkie opróżnienie płytki nad zlewem, osuszyć ją, uderzając o ręcznik papierowy, a następnie dodać 40 μL/dołek rozcieńczonego 1x roztworu antybiotyku-antymykotyki za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej lub dozownika odczynników. Przechowywać płytki pokryte PLL w temperaturze 4 °C do momentu wysiania komórek.</li>
	<li>Hodować komórki HTLA (uprzejmie udostępnione przez dr. Richarda Axela) – linię komórkową ludzkiej embrionalnej nerki (HEK293T) stabilnie ekspresującą β-arrestin2-TEV oraz lucyferazę sterowaną przez tTA – w pełnej pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5% surowicy z cielęcej krwi, 2,5 μg/mL puromycyny, 50 μg/mL hygromycyny, 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO2.</li>
	<li>Hodować komórki HTLA w szalkach 150 mm i pasażować komórki dwa razy w tygodniu przy współczynniku rozcieńczenia 1:10, przy optymalnej liczbie pasaży od 5 do 25. Należy zapewnić, aby w dniu wysiewania na płytki 384-dołkowe odpowiednia liczba szalek 150 mm osiągnęła konfluencję, zależnie od skali przesiewu pierwotnego. 
	UWAGA: Stosowanie komórek HTLA powyżej 25. pasażu może skutkować obniżoną żywotnością, co prowadzi do uzyskania suboptymalnych wyników.</li>
	<li>Aby wysiać komórki HTLA do przesiewu pierwotnego, delikatnie wypłukać konfluentne szalki 150 mm 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), pH 7,4. Odłączyć komórki za pomocą około 6 mL 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA i przenieść do probówki do wirowania zawierającej co najmniej równą ilość pełnej pożywki DMEM w celu neutralizacji trypsyny.</li>
	<li>Wirować komórki HTLA z prędkością 500 x g przez 3 min i resuspendować pellet komórkowy do gęstości 0,22 x 106 komórek/mL w pełnej pożywce DMEM, pomijając dodatek 2,5 μg/mL puromycyny i 50 μg/mL hygromycyny, ponieważ mogą one obniżyć wydajność transfekcji.</li>
	<li>Inkubować niezbędne płytki 384-dołkowe pokryte PLL w temperaturze 37 °C, aby je ogrzać przed wysianiem komórek. Usunąć roztwór przechowujący 1x antybiotyku-antymykotyki z płytek 384-dołkowych pokrytych PLL poprzez szybkie opróżnienie płytki nad zlewem i osuszenie jej o ręcznik papierowy.</li>
	<li>Wysiać komórki na płytki 384-dołkowe pokryte PLL do końcowej gęstości 10 000 komórek/dołek, nanosząc 45 μL zawiesiny HTLA o gęstości 0,22 x 106 komórek/mL za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Jeśli preferowana jest transfekcja w tym samym dniu, wysiać komórki z gęstością 16 000 komórek/dołek i przeprowadzić transfekcję po 4 h. 
	UWAGA: Dla wysokiej wydajności transfekcji optymalna jest konfluencja komórek na poziomie 50–70%.</li>
</ol>
2. Przesiewanie wstępne: przygotowanie płytek DNA i transfekcje
<ol>
	<li>Aby przygotować 384-dołkową płytkę źródłową z DNA do transfekcji, jak pokazano na Ryc. 2, rozdziel plazmidowe cDNA kodujące interesujące konstrukty GPCR-Tango w płytce 96-dołkowej, umieszczając inny GPCR w każdym dołku. DNA plazmidowe powinno być zawieszone w buforze 0,1x Tris-EDTA (TE) w stężeniu 50 ng/μL. 
	UWAGA: 96-dołkowe płytki z DNA można uszczelnić i przechowywać w temperaturze -20 °C oraz ponownie wykorzystać w wielu eksperymentach przesiewowych. Wszystkie cDNA kodujące konstrukty GPCR-Tango są dostępne komercyjnie (patrz Tabela materiałów) i są sklonowane w plazmidzie pcDNA3.1 neomycyna. Zestaw PRESTO-Tango GPCR składa się z czterech płytek 96-dołkowych, z których każda zawiera 80 GPCR-ów, kilka dołków z pustym wektorem jako kontrolami negatywnymi, dołki z kontrolą pozytywną zawierającą receptor dopaminowy D2 (DRD2) oraz dołki z plazmidem kodującym białko fluorescencyjne (YFP) do monitorowania wydajności transfekcji.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej ręcznie przenieś roztwór DNA z płytki 96-dołkowej do 384-dołkowej płytki źródłowej z DNA, dodając 10 μL do każdego dołka. Aby zapewnić analizę każdego wariantu eksperymentu w czterech powtórzeniach, połowa 96-dołkowej płytki z DNA (rzędy A-D lub E-H) wypełni całą płytkę 384-dołkową poprzez rozdzielenie każdego GPCR w dwóch kwadrantach (pierwszy kwadrant = bez związku, drugi kwadrant = z związkiem), tak aby ten sam GPCR został transfekowany w 8 dołkach płytki 384-dołkowej (jako pomoc posłuż się Ryc. 2).</li>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki do transfekcji niezbędne dla metody wytrącania fosforanu wapnia, opisanej przez Jordana i współpracowników20: bufor 0,1x TE (1 mM Tris-HCl i 0,1 mM EDTA); roztwór 2,5 M CaCl2; bufor 2x Hepes, pH 7,05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4). Wszystkie roztwory wysterylizuj przez filtrację i przechowuj w temperaturze 4 °C. W dniu transfekcji doprowadź odczynniki do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
	<li>Rozcieńcz roztwór zapasowy 2,5 M CaCl2 w 0,1x TE (rozcieńczenie 1:8) do stężenia końcowego 0,313 M CaCl2 i wymieszaj na wirówce typu vortex. Przenieś 40 μL 0,313 M CaCl2 do 384-dołkowej płytki źródłowej z DNA i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół za pomocą ręcznej pipety wielokanałowej lub zautomatyzowanego stacjonarnego pipetora 384-kanałowego.</li>
	<li>Dodaj 50 μL buforu 2x Hepes do 384-dołkowej płytki źródłowej z DNA, ponownie wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół i pozostaw na 1 min; każdy 384-dołek będzie zawierał odpowiednią ilość mieszaniny DNA/transfekcyjnej do transfekcji dziewięciu płytek 384-dołkowych, w zależności od liczby związków, które muszą zostać przetestowane. Przenieś 10 μL mieszaniny DNA/transfekcyjnej z 384-dołkowej płytki źródłowej z DNA do wysianych komórek HTLA i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Przesiewanie wstępne: Stymulacja komórek
<ol>
	<li>Po dwudziestu czterech godzinach odlać pożywkę z transfekowanych komórek, delikatnie odwracając płytkę 384-dołkową nad zlewem i osuszając ją ręcznikiem papierowym lub używając końcówki aspiratora. Powoli dodać 40 μL pożywki głodzeniowej (DMEM uzupełniony o 1% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej (dFBS) i 1x antybiotyk/antymykotyk), uważając, aby nie dotykać bezpośrednio komórek.</li>
	<li>Do naprzemiennych rzędów ze stymulacją (+) pipetować 20 μL badanego związku w stężeniu 3x (końcowe stężenie leku na płytce z komórkami wyniesie 1x), a do naprzemiennych rzędów bez związku (-) 20 μL buforu nośnika. Umieścić płytkę z komórkami w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 i inkubować przez co najmniej 16 h.</li>
</ol>
4. Przesiewanie pierwotne: Pomiar luminescencji
<ol>
	<li>Przygotować odczynnik Glo, zmodyfikowany według Baker i Boyce21: 108 mM Tris–HCl; 42 mM Tris-Base, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol (DTT), 0.2 mM koenzym A, 0.14 mg/ml D-lucyferyny, 1.1 mM ATP, 0.25% v/v Triton X-100, 2 mM hydrosiarczyn sodu. 
	UWAGA: Roztwory zapasowe odczynników można przygotować wcześniej, z wyjątkiem D-lucyferyny, którą zawsze dodaje się do odczynnika Glo w formie proszku bezpośrednio przed użyciem. W przypadku zastosowania czarnych płytek ilość D-lucyferyny można zwiększyć do 0.25 mg/mL.</li>
	<li>Po 16–24 h od stymulacji odlać pożywkę z transfected cells, delikatnie potrząsając płytką 384-dołkową nad zlewem i osuszając ją na ręczniku papierowym. Dodać 20 μL/well odczynnika Glo i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5–20 min. Odczytać wyniki za pomocą luminometru do mikropłytek, stosując czas całkowania 1 s/well.</li>
</ol>
5. Przesiewanie pierwotne: Analiza danych
<ol>
	<li>Wyeksportuj zapisane pliki z licznika luminescencji do arkusza kalkulacyjnego; wyniki zostaną zapisane w relatywnych jednostkach luminescencji (RLU). Na podstawie układu płytki 384-dołkowej oblicz aktywację (krotność zmiany) każdego receptora, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/60823/60823eq1.jpg" /> 
	UWAGA: W tym przypadku Sample RLU odnosi się do wartości każdego z czterech powtórzeń w kwadrancie stymulowanym (+ związek), Mean background RLU to średnia z kontroli negatywnych na płytce, a Mean basal RLU odnosi się do średniej z kwadranta niepoddanego działaniu związku dla tego samego receptora (- związek). Dodatkowo oblicz odchylenie standardowe z 4 punktów danych, aby zweryfikować jakość wyników. Zaleca się przeprowadzenie transformacji log2 średniej z krotności zmian w celu skorygowania ewentualnej heteroskedastyczności; podstawa log2 jest praktycznym wyborem ułatwiającym identyfikację pozytywnych wyników (hits). Empirycznie określ progi dla pozytywnych wyników; należy zauważyć, że w przypadku pełnego agonisty niektóre receptory mogą wykazywać wzrost już 2-krotny, a inne nawet do 40-krotnego.</li>
	<li>Na podstawie wyników wybierz receptory GPCR, które stanowią potencjalne pozytywne wyniki do przesiewu wtórnego.</li>
</ol>
6. Przesiewanie wtórne: wysiew komórek i transfekcje
<ol>
	<li>Przesiej komórki HTLA do szalek 100 mm przy całkowitym zagęszczeniu 5 x 106 komórek w 11 mL pożywki kompletnej (4.55 x 105/mL) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 h. Jeśli preferowana jest transfekcja w tym samym dniu, wysiej komórki w zagęszczeniu 7.5 x 106 komórek i przeprowadź transfekcję 4 h później.</li>
	<li>Podgrzej w temperaturze pokojowej odczynniki niezbędne do wytrącania fosforanu wapnia. Połącz 450 μL buforu TE 0.1x z 50 μL 2.5 M CaCl2 i szybko wymieszaj na wortexie; ilości te są dostosowane do jednej szalki 100 mm, w zależności od objętości zawieranej przez nią pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Do probówki dodaj 500 μL roztworu TE/CaCl2 do 10 μg cDNA GPCR i wymieszaj na wortexie. Do probówki dodaj 500 µL 2x roztworu buforu Hepes, energicznie potrząśnij (nie używaj wortexa) i inkubuj przez 1 min. 
	UWAGA: 1 µg dowolnego plazmidu kodującego białko fluorescencyjne (np. YFP, mCherry itd.) można przetransfekować wspólnie z 9 µg cDNA GPCR, aby uzyskać łącznie 10 μg. Białko fluorescencyjne służy do śledzenia wydajności transfekcji, a ta minimalna ilość nie będzie zakłócać analizy.</li>
	<li>Bezpośrednio po krótkiej inkubacji nanieś 1 mL roztworu kroplami na komórki. Delikatnie kołysz płytką w przód i w tył, aby równomiernie rozprowadzić osad, uważając, aby nie wirować płytki, i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 h.</li>
	<li>Następnego dnia oceń wydajność transfekcji, obserwując ekspresję białka fluorescencyjnego pod fluorescencyjnym obrazownikiem komórek; idealna jest transfekcja obejmująca ponad 50% powierzchni.</li>
	<li>Inkubuj niezbędną płytkę(i) 384-dołkową powleczoną PLL w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby ją ogrzać przed wysianiem komórek. Usuń roztwór do przechowywania (1x antybiotyk-antymykotyk) z płytki(ek) 384-dołkowej powleczonej PLL, energicznie potrząsając płytką nad zlewem, a następnie osusz ją, przykładając do ręcznika papierowego.</li>
	<li>Delikatnie wypłucz przetransfekowane komórki roztworem Versene (1X PBS, pH 7.4; 0.53 mM EDTA) i ododerwij je, dodając do szalki 3 mL 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA. Przenieś zawartość do probówki wirówkowej zawierającej co najmniej taką samą ilość kompletnego DMEM w celu zneutralizowania trypsyny.</li>
	<li>Wiruj komórki przy 500 x g przez 3 min i resuspenduj komórki w pożywce głodzeniowej do zagęszczenia 0.4 x 106 komórek/mL. Wysiej komórki na płytkę(i) 384-dołkową powleczoną PLL do końcowego zagęszczenia 25 000 komórek/dołek, nanieząc 45 μL zawiesiny komórkowej za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej. Wróć z płytkami do temperatury 37 °C na minimum 4 h, aby umożliwić komórkom prawidłowe przytwierdzenie się do dołków przed przystąpieniem do stymulacji.</li>
</ol>
7. Przesiewanie wtórne: Przygotowanie płytek z lekami dla 16-punktowej krzywej dawka-odpowiedź (półlogarytmicznej)
<ol>
	<li>Do płytki 96-dołkowej dodać 270 μL buforu do leków 1X HBSS (1x Hank's Balanced Salt Solution [HBSS], 20 mM HEPES pH 7.4, 1x antibiotic-antimycotic), z wyłączeniem ostatniego rzędu (rzęd H) płytki, zgodnie z ryciną 4. 
	UWAGA: W przypadku peptydów, cząsteczek koloidalnych i związków słabo rozpuszczalnych w wodzie zaleca się dodanie 0,1–1% BSA. Aby zapobiec utlenianiu leku, można dodać do 0,01% kwasu askorbinowego.</li>
	<li>Z roztworu zapasowego przygotować roztwór leku (oznaczony jako stężenie „Wysokie”), obliczając końcowe stężenie 3x (końcowe stężenie leku w płytce z komórkami wyniesie 1x). Na przykład dla krzywej dawka-odpowiedź z najwyższym stężeniem 10 μM, przygotować stężenie „Wysokie” o wartości 30 μM. Pipetować 300 μL stężenia „Wysokie” do dołków w rzędzie H.</li>
	<li>W oddzielnej probówce przygotować stężenie „Niskie”, które stanowi stężenie „Wysokie” podzielone przez 3,16 (pół logarytmu). Na podstawie poprzedniego przykładu stężenie „Niskie” wyniosłoby 9,49 μM. Pipetować 300 μL stężenia „Niskie” do dołków w rzędzie H, sąsiadujących z dołkami „Wysokie”. 
	UWAGA: Całkowita liczba dołków 96-dołkowych potrzebnych w rzędzie H będzie zależeć od liczby komórek i warunków stymulacji. Cztery dołki (dwa „Wysokie” i dwa „Niskie”) zapewnią wystarczającą ilość roztworu leku do stymulacji całej płytki 384-dołkowej.</li>
	<li>Wykonać rozcieńczenia seryjne, pipetując 30 μL roztworu leku z dołków „Wysokie” i „Niskie” rzędu H do rzędu poprzedniego (rzęd G) i wymieszać poprzez ręczne pipetowanie w górę i w dół lub, zgodnie z zaleceniami, za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej z funkcją „Pipette and Mix”. Powtarzać ten krok aż do pierwszego i najbardziej rozcieńczonego rzędu (rzęd A), wymieniając końcówki między rozcieńczeniami. 
	UWAGA: Jeśli jest to pożądane, rozcieńczenia seryjne można przerwać przed rzędem A, który będzie stanowił kontrolę wewnętrzną bez leku, czyli tzw. „prawdziwe zero”.</li>
	<li>Kierując się ryciną 4, wystymulować transfekowane komórki, pipetując 20 μL rozcieńczeń z kolumny „Niskie” z płytki 96-dołkowej do rzędów A–O wcześniej wysianej płytki 384-dołkowej, a także 20 μL rozcieńczeń z kolumny „Wysokie” do dołków B–P. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez minimum 16 h.</li>
</ol>
8. Przesiewanie wtórne: Odczyt luminescencji i analiza danych
<ol>
	<li>W 16–24 h po stymulacji zlać medium z transfektowanych komórek, delikatnie potrząsając płytką 384-dołkową nad zlewem i odkładając ją na ręcznik papierowy. Dodać 20 μL/well odczynnika Glo i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5–20 min. Odczytać płytki za pomocą luminometru do mikro płytek, stosując czas całkowania 1 s/well.</li>
	<li>Wyeksportować zapisane pliki z luminometru do arkusza kalkulacyjnego; wyniki zostaną zarejestrowane w relatywnych jednostkach luminescencji (RLU). Przenieść dane z płytki 384-dołkowej do oprogramowania statystycznego, aby przeanalizować wyniki za pomocą wbudowanej analizy XY dla dopasowania nieliniowej krzywej regresji. Wybrać wbudowaną 3-parametrową funkcję stymulacji odpowiedź-dawka „Log(agonist) vs. response (three parameters)”, 
	<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/60823/60823eq2.jpg" /> 
	UWAGA: W tym modelu Top i Bottom to plateau w jednostkach osi Y, odpowiednio odpowiedź maksymalna i poziom bazalny, EC50 to stężenie agonisty generujące 50% odpowiedzi między Top a Bottom, a X odnosi się do logarytmu stężenia agonisty. Model ten zakłada, że krzywa odpowiedź-dawka ma standardowe nachylenie Hill równą 1.</li>
</ol>

<ol><li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G-protein+coupled+receptor+family%3A+actors+with+many+faces%5BTitle%5D)+AND+%22Current+pharmaceutical+design%22%5BJournal%5D)">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li>
<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li>
<li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein-coupled+receptors+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, Pt 24 4867-4869 (2003).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs%3A+current+status+using+structure-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li>
<li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+GPCR+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li>
<li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates%3A+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li>
<li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li>
<li>Denis, C., Saulière, A., Galandrin, S., Sénard, J. -M., Galés, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+heterotrimeric+G+protein+activation%3A+applications+to+biased+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Chemical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li>
<li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li>
<li>Jean-Charles, P. -Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+%CE%B2-Arrestin-Dependent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through β-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li>
<li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2-Arrestins%3A+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The β-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li>
<li>Böhme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+life+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16(2009).</li>
<li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Receptor+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. Measurement of β-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+T+%22Eli+Lilly+%26+Company+and+the+National+Center+for+Advancing+Translational+Sciences%22">Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences</a>. , (2004).</li>
<li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li>
<li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+Mammalian+Cells%3A+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li>
<li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282(2014).</li>
<li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018(2016).</li>
<li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), Baltimore, Md. 814-830 (2015).</li>
<li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li>
<li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques+JBT%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li>
<li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+B+or+not+tet+B%3A+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li>
<li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+%22Frequent+Hitters%22+in+Compound+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Konformacyjnie dynamiczne GPCR są potęgami transdukcji sygnału. Właściwości fizykochemiczne kieszeni wiążących te receptory heptaheliczne, a także ich znaczenie fizjologiczne podkreślają potrzebę stosowania narzędzi do badań przesiewowych ligandów GPCR. Jak przedstawiono powyżej, test PRESTO-Tango jest szybki, czuły i przyjazny dla użytkownika, dzięki czemu nadaje się do opracowywania leków. Test ten nie tylko mierzy aktywację indukowaną przez agonistę, ale może być również wykorzystany do ilościowego określenia aktywnoś...

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) stanowią największą i najbardziej zróżnicowaną rodzinę białek transbłonowych, działających jako interfejsy komunikacyjne między komórką a jej środowiskiem1. Wszechstronność GPCR podkreśla ich zdolność do wykrywania różnorodnych ligandów - od neuroprzekaźników po nukleotydy, peptydy po fotony i wiele innych - a także ich zdolność do regulowania licznych kaskad sygnałowych związanych ze wzrostem komórek, migracją, różnicowaniem, apoptozą, wypalaniem komórek itp.2,3. Biorąc pod uwagę ich wszechobecność i udział w wielu procesach fizjologicznych, ta rodzina receptorów ma ogromne znaczenie terapeutyczne, o czym świadczy fakt, że ponad jedna trzecia obecnie dostępnych leków na receptę celuje w GPCRs4. Jednak te istniejące terapie są ukierunkowane tylko na niewielką podgrupę nadrodziny (około 10%), a farmakologia wielu GPCR pozostaje niewyjaśniona. Co więcej, ponad 100 GPCR istnieje jako receptory sieroce, ponieważ nie zostały one dopasowane do endogennego ligandu5. W związku z tym badania przesiewowe ligandów GPCR mają kluczowe znaczenie w desierotyzacji i opracowywaniu leków, ponieważ torują drogę do odkrycia i optymalizacji wiodących, a być może do fazy badań klinicznych.
Metody badań przesiewowych ligandów GPCR tradycyjnie zaliczane są do jednej z dwóch kategorii, testów funkcjonalnych zależnych od białka G lub niezależnych od białka G6. Sygnalizacja GPCR jest regulowana przez heterotrimeryczne białka G (Gαβγ), które są aktywowane przez wymianę GTP na GDP związane z podjednostką Gα7. Sygnały z aktywowanego receptora są transdukowane przez białka G za pośrednictwem wtórnych przekaźników, takich jak cAMP, Wapń, DAG i IP3, aby pośredniczyć w dalszej sygnalizacji w dalszych efektorach8. Charakter funkcjonalnych konsekwencji sygnalizacji białka G został wykorzystany do stworzenia testów komórkowych, które odzwierciedlają aktywację receptora. Metody te, które mierzą zdarzenia proksymalne (bezpośrednie) lub dystalne (pośrednie) w sygnalizacji białka G, są najczęściej stosowane do badań przesiewowych ligandów GPCR i są głównie stosowane w badaniach nad desierotyzacją6. Przykłady testów, które bezpośrednio mierzą aktywację białka G za pośrednictwem GPCR, obejmują test wiązania [35S]GTPγS, który mierzy wiązanie znakowanego radioaktywnie i niehydrolizowalnego analogu GTP z podjednostką Gα, oraz sondy Förster/bioluminescencji rezonansu rezonansowego (odpowiednio FRET/BRET) do monitorowania interakcji GPCR-Gα i Gα/Gγ, które z biegiem lat zyskują coraz większą popularność9, 10. Testy monitorujące zdarzenia dystalne są najczęściej stosowanymi narzędziami do profilowania GPCR; na przykład testy cAMP i IP1/3 mierzą wewnątrzkomórkową akumulację wtórnych przekaźników zależnych od białka G, podczas gdy testy strumienia [Ca2 +] i reportera obejmujące specyficzne elementy odpowiedzi zaangażowane w aktywację białka G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) badają zdarzenia dalej po kaskadzie sygnalizacyjnej11. Podczas gdy większość z wyżej wymienionych testów można przeprowadzić na poziomie wysokiej przepustowości, są one dość czułe i mają pewne zalety specyficzne dla testu (np. rozróżnienie między pełnymi/częściowymi agonistami, neutralnymi antagonistami i odwrotnymi agonistami w przypadku wiązania GTPγS lub funkcjonalność testu na żywych komórkach, takich jak [Ca2+] i IP1/3)6, niestety nie istnieją żadne metody zależne od białka G, które pasowałyby do badania całego GPCR-omu leku. Wynika to w dużej mierze z natywnego sprzężenia wielu podrodzin białka G z GPCR, co skutkuje sygnalizacją w kilku kaskadach i nieznanym sprzężeniem białka G w sierocych GPCR. Aby złagodzić ten problem, opracowano testy, aby wymusić rozwiązłe sprzężenie białka G za pomocą jednego wspólnego odczytu sygnalizacji, takiego jak cAMP i Ca2+, chociaż większość z nich ma niską przepustowość12.
Ważnym aspektem cyklu życia GPCR jest zakończenie sygnalizacji zależnej od białka G, co następuje w dużej mierze poprzez rekrutację β-aresztin, co indukuje dysocjację białka G, a ostatecznie odczulanie receptora, który jest celem internalizacji pokrytej klatryną13. Najbardziej rozpowszechnionymi izoformami β-arrestin są niewizualne β-arrestin1 i β-arrestin2, oznaczane również odpowiednio jako arrestin-2 i arrestin-314. Wprowadź testy komórkowe niezależne od białka G, które nadają nowy wymiar badaniom przesiewowym ligandów GPCR; Transportem receptorów, testami rekrutacji całych komórek bez znaczników i β-aresztiną są godnymi uwagi przykładami. Testy transportu GPCR wykorzystują ligandy znakowane fluoroforem lub współinternalizowane przeciwciała skierowane do receptora15, podczas gdy testy całych komórek bez znaczników wykorzystują bioczujniki, które tłumaczą zmiany komórkowe wywołane wiązaniem liganda na wymierne wyniki, takie jak sygnały elektryczne lub optyczne16. Warto zauważyć, że kwintesencją interakcji GPCR-β-arrestin jest to, że test rekrutacyjny β-arrestin jest atrakcyjnym narzędziem w repertuarze testów funkcjonalnych17. System tango, po raz pierwszy opracowany przez Barnea i wsp. zaledwie dziesięć lat temu, obejmuje wprowadzenie trzech egzogennych elementów genetycznych: fuzji białek składającej się z β-aresztyny2 z proteazą wirusa wytrawiania tytoniu (TEVp), transaktywatora tetracykliny (tTA), który jest przywiązany do GPCR za pośrednictwem miejsca cięcia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEVcs) i jest poprzedzony sekwencją z C-końca receptora wazopresyny V2 (ogon V2) w celu promowania rekrutacji aresztyny, oraz gen lucyferazy reporterowej, którego transkrypcja jest wyzwalana przez translokację czynnika transkrypcyjnego tTA do jądra, które jest uwalniane od zakotwiczenia błony po rekrutacji β-arrestin2 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) < klasa sup = "xref">18. Ilościowe odczyty aktywacji GPCR i rekrutacji β-arrestin2 można następnie określić poprzez odczyt luminescencji. Godnym uwagi rozróżnieniem jest to, że podczas gdy transport receptorów i metody bez znaczników całych komórek są stosunkowo niskoprzepustowe, Tango ma kilka zalet, w tym selektywny odczyt, który jest specyficzny dla docelowego receptora i czułość dzięki integracji sygnału, co czyni go odpowiednim kandydatem do badań przesiewowych ligandów na większą skalę18.
Mając na uwadze te strategiczne cechy, Kroeze i in. opracowali PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), wysokoprzepustową platformę open-source, która wykorzystuje podejście Tango do profilowania GPCR-omu w sposób równoległy i jednoczesny19. Wykorzystując "rozwiązłą" rekrutację β-aresztyny2 do prawie wszystkich GPCR, PRESTO-Tango jest pierwszym w swoim rodzaju testem funkcjonalnym opartym na komórkach, umożliwiającym szybkie "pierwsze" badania przesiewowe związków małocząsteczkowych w prawie wszystkich niewęchowych GPCR, w tym sierocych, niezależnie od sprzężenia podrodziny białka G.

<table><tbody><tr><td>384 Well Optyczne płytki dolne, baza polimerowa polistyrenu, poddana obróbce kultur komórkowych,, z pokrywką, sterylna</td><td>NUNC</td><td>12-566 384</td><td></td></tr><tr><td>Well Optical Bottom Plates, baza polimerowa polistyrenu, poddana hodowli komórkowej, biała, z pokrywką, sterylna</td><td>NUNC</td><td>12-566-1</td><td></td></tr><tr><td>384 Well Round Bottom, polipropylen, niepoddany obróbce, niebieski, niesterylny, bez pokrywki</td><td>ThermoFisher</td><td>12-565-390</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td><td></td><td>Żubr 450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, sól sodowa</td><td>GoldBio</td><td>LUCNA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z L-Glutaminą, 4,5g/L Glukoza i Pirogronian Sodu</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Xplorer, 12-kanałowy, zmienny, 15&ndash; 300 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>4861000155</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Xplorer, 12-kanałowy, zmienny, 5&ndash; 100 &mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>4861000139</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Platemate 2x3</td><td>ThermoFisher</td><td>801-10001</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta 1450 Wallac</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Żubr</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P2636-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Addgene</td><td></td><td>Zestaw #1000000068</td><td></td></tr></tbody></table>

równoległe przesłuchanie rekrutacji β-arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali gpcr przy użyciu testu presto-tango

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Jako największa i najbardziej wszechstronna nadrodzina genów i mediatory całej gamy komórkowych szlaków sygnałowych, receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią jeden z najbardziej obiecujących celów dla przemysłu farmaceutycznego. Ergo, projektowanie, wdrażanie i optymalizacja testów przesiewowych ligandów GPCR ma kluczowe znaczenie, ponieważ stanowią one narzędzia zdalnego sterowania do odkrywania leków oraz manipulowania farmakologią i wynikami GPCR. W przeszłości testy zależne od białka G stanowiły typowy obszar badań, wykrywając zdarzenia wywołane ligandem i określając ilościowo generowanie wtórnych przekaźników. Jednak od czasu pojawienia się selektywności funkcjonalnej, a także zwiększonej świadomości na temat kilku innych szlaków niezależnych od białka G i ograniczeń związanych z testami zależnymi od białka G, istnieje większy nacisk na tworzenie alternatywnych testów przesiewowych ligandów GPCR. W tym celu opisujemy zastosowanie jednego z takich zasobów, platformy PRESTO-Tango, systemu opartego na reporterze lucyferazy, który umożliwia równoległe i jednoczesne badanie ludzkiego GPCR-omu, wyczyn, który wcześniej uważano za technicznie i ekonomicznie niewykonalny. Opierając się na niezależnym od białka G teście rekrutacji β-arrestin2, uniwersalność transportu i sygnalizacji za pośrednictwem β-arrestin2 w GPCR sprawia, że PRESTO-TANGO jest odpowiednim narzędziem do badania około 300 niewęchowych ludzkich GPCR, w tym około 100 receptorów sierocych. Czułość i wytrzymałość PRESTO-Tango sprawiają, że nadaje się on do pierwotnych badań przesiewowych o wysokiej przepustowości z wykorzystaniem bibliotek złożonych, wykorzystywanych do odkrywania nowych celów GPCR dla znanych leków lub do odkrywania nowych ligandów dla receptorów sierocych.

Wykorzystując przedstawiony tutaj protokół PRESTO-Tango, ekstrakt z ziarnistości chromafinnych (CG) przesiewano przeciwko 168 nieolfaktorycznym receptorom GPCR, z których większość stanowiły receptory osierocone. Profilowanie wspomnianego ekstraktu przeprowadzono poprzez badanie mobilizacji β-arrestyny 2 przy wybranych receptorach, w oparciu o zasadę opracowaną przez Barnea i współpracowników18 (Rycina 1). Plazmidowe cDNA interesujących receptorów GPCR pobrano z zesta...

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Platforma Presto-Tango została opracowana w celu przeprowadzenia równoległego i jednoczesnego przesłuchania wszystkich niewęchowych GPCR w ludzkim genomie, w tym sierocych celów w celu profilowania indukowanej przez ligand rekrutacji beta-arrestiny 2. Platforma Presto-Tango jest jedynym zasobem open source do profilowania całego genomu GPCR w podejściu równoległym, przy użyciu niezależnego od białka G testu rekrutacji beta-aresztiny. Demonstracją procesora zajęliby się Genevieve Laroche, pracownik naukowy w moim laboratorium, oraz Manel Zighal, doktorant w moim laboratorium.Przed rozpoczęciem procedury dodać 20 mikrolitrów roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 25 mikrogramów na mililitr do każdej studzienki o odpowiedniej liczbie doświadczalnej 384 optycznych płytek dennych i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut do dwóch godzin. Pod koniec inkubacji przetrząśnij płytki zlewem, aby usunąć nadmiar poli-L-lizyny i dodaj 40 mikrolitrów antybiotykowego roztworu przeciwgrzybiczego do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytki potrzebne do wysiewu komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a resztę płytek umieść w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.Aby wysadzić komórki HTLA do wstępnego badania przesiewowego, delikatnie przepłucz zlewające się 150-milimetrowe kultury komórkowe 10 mililitrami PBS, a następnie potraktuj kultury sześcioma mililitrami 0,05% trypsyny EDTA na naczynie. Gdy komórki się odłączą, zawiesiny komórek umieszcza się w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, zawierającej równą objętość DMEM. I zbierz komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić osad w stężeniu 2,2 razy 10 do piątej komórki na mililitr DMEM i przesunąć płytki nad zlewem, aby usunąć antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy. Postukaj w płytki, aby wyschły i zasiej 45 mikrolitrów komórek do każdej studzienki. Następnie umieść płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 45% dwutlenku węgla na noc.Aby przygotować 384-dołkową płytkę źródłową DNA do transfekcji, rozprowadź 50 nanogramów na mililitr każdego plazmidowego komplementarnego DNA kodującego interesujący nas konstrukt GPRC Tango w 0,1 Tris-EDTA na studzienkę do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Użyj pipety wielokanałowej, aby ręcznie przenieść 10 mikrolitrów roztworu DNA z każdej studzienki płytki 96-dołkowej do indywidualnych dołków jednej 384-dołkowej płytki źródłowej DNA czterokrotnie dla każdego stanu, jak pokazano na ilustracji. Następnie przenieś 40 mikrolitrów 0,313 molowego roztworu chlorku wapnia do każdej studzienki płytki źródłowej DNA i delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki.Dodaj 50 mikrolitrów buforu 2x HEPES do każdej studzienki 384-dołkowej płytki źródłowej DNA, delikatnie mieszając. Po jednej minucie przenieś 10 mikrolitrów mieszaniny transfekcji DNA z 384-dołkowej płytki źródłowej DNA do każdej studzienki z wysianymi komórkami HTLA i inkubuj komórki w inkubatorze hodowli komórkowych przez noc. Następnego dnia zdekantuj transfekowaną pożywkę komórkową i powoli dodaj 40 mikrolitrów głodującej pożywki do każdej studzienki, uważając, aby nie dotykać komórek bezpośrednio.Następnie dodać 20 mikrolitrów bufora nośnika dla naprzemiennych rzędów bez związku w 20 mikrolitrach interesującego związku o trzykrotnym stężeniu do naprzemiennych rzędów, przed powrotem płytki do inkubatora do hodowli komórkowych. 16 do 24 godzin po stymulacji zdekantować transfekowaną pożywkę komórkową i dodać 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego odczynnika żarowego do każdej studzienki na pięć do 20 minut inkubacji w temperaturze pokojowej chronionej od światła. Następnie odczytaj płytki na liczniku luminescencji mikropłytki z czasem całkowania wynoszącym jedną sekundę na studzienkę.W przypadku wtórnego badania przesiewowego subkulturuj komórki HTLA w 100-milimetrowych szalkach w proporcji od pięciu razy 10 do sześciu komórek o całkowitej gęstości komórek w 11 milimetrach kompletnej pożywki na szalkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zmieszano 10 mikrogramów uzupełniającego DNA GPCR z 500 mikrolitrami roztworu chlorku wapnia Tris-EDTA z wirowaniem, a następnie dodano 500 mikrolitrów buforu HEPES. Po energicznym wstrząśnięciu inkubować roztwór przez minutę w temperaturze pokojowej i natychmiast dodać jeden mililitr roztworu kroplami na komórki.Delikatnie rozkołysz, aby równomiernie rozprowadzić osad i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. Następnego dnia sprawdź skuteczność transfekcji pod fluorescencyjnym imagerem komórek. Transakcje większe niż 50% pokrycia są idealne.Delikatnie przepłucz transfekowane komórki roztworem versenu przed odłączeniem komórek trzema mililitrami 0,05% trypsyny EDTA. Zbierz zdysocjowane komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w stężeniu cztery razy 10 do piątych komórek na mililitr głodującego stężenia. Następnie wysiewaj 45 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 384-dołkowej płytki kodowanej poli-L-lizyną i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej cztery godziny.Aby przygotować półlogarytmiczną płytkę odpowiedzi dawka-krzywa, dodać 270 mikrolitrów HBSS uzupełnionego HEPES i antybiotykiem przeciwgrzybiczym do wszystkich z wyjątkiem ostatniego rzędu płytki 96-dołkowej i dodać 30 mikrolitrów każdego roztworu leku o wysokiej i niskiej zawartości do studzienek rzędu H. Przenieść roztwór z każdej studzienki w rzędzie H do odpowiedniego dołka w rzędzie G, mieszając i kontynuować seryjne rozcieńczanie związków leku, aż do Osiągnięto ostatni rząd płyty. Korzystając ze schematu jako odniesienia, wymieszaj 20 mikrolitrów rozcieńczeń z dolnej kolumny z rzędów od A do G płytki 96-dołkowej i 20 mikrolitrów rozcieńczeń z wysokiej kolumny do studzienek od B do H płytki 96-dołkowej z poprzednio osadzoną płytką 384-dołkową. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez minimum 16 godzin.16 do 24 godzin po stymulacji zdekantować transfekowaną pożywkę komórkową i dodać 20 mikrolitrów odczynnika jarzeniowego do każdej studzienki na pięć do 20 minut inkubacji przed odczytaniem płytek na liczniku luminescencji mikropłytki z czasem integracji wynoszącym jedną sekundę na studzienkę. W tym reprezentatywnym eksperymencie, spośród 168 GPCR, które zostały przesłuchane w pierwotnym badaniu przesiewowym, tylko receptor dopaminy D3 i opsyna 5 były pretendentami jako potencjalne aktywne cele. Receptor dopaminy D3 powodował znaczącą zmianę log2-krotną wynoszącą 4,7, podczas gdy opsyna 5 powodowała nieco niższą odpowiedź wynoszącą 2,39.Dla porównania, receptor dopaminy D2, pozytywna kontrola dla pierwotnego badania przesiewowego, spowodowała log2-krotną zmianę 4,58. Te krzywe odpowiedzi z wtórnego badania przesiewowego wykazały, że ekstrakt granulek chromatyny wytwarza podobne okna sygnałowe w połowie maksymalnych skutecznych wartości stężenia do chinpirolu, co potwierdza jego ważność jako aktywnego uderzenia w receptor dopaminy D3. Płaska krzywa dawkowania podobna do kontroli ujemnej została wytworzona dla opsyny 5, jednak wykluczając ten receptor jako możliwy cel dla ekstraktu z granulek chromatyny. Presto-Tango wymaga szczególnej ostrożności, ponieważ różnice w rozmieszczeniu komórek, wydajności transfekcji i seryjnych rozcieńczeniach leków mogą powodować złożony błąd, który może wpływać na dokładność danych.Metody ortogonalne, takie jak podejścia wiążące radioligandy, rezonans bioluminescencji, transfer energii i cykliczne testy funkcjonalne wapnia i internalizacji AMP, mogą być stosowane do dalszego potwierdzania i charakteryzowania interakcji receptorów ligandowych.

parallel-interrogation-arrestin2-recruitment-for-ligand-screening-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Odkryj metodę równoległego przesiewowego badania rekrutacji β-Arrestin2 do GPCR przy użyciu platformy PRESTO-Tango. To otwarte źródło umożliwia farmakologiczne profilowanie ligandów i identyfikację związków aktywnych.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

Przeglądaj więcej filmów