Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

Platforma Presto-Tango została opracowana w celu przeprowadzenia równoległego i jednoczesnego przesłuchania wszystkich niewęchowych GPCR w ludzkim genomie, w tym sierocych celów w celu profilowania indukowanej przez ligand rekrutacji beta-arrestiny 2. Platforma Presto-Tango jest jedynym zasobem open source do profilowania całego genomu GPCR w podejściu równoległym, przy użyciu niezależnego od białka G testu rekrutacji beta-aresztiny. Demonstracją procesora zajęliby się Genevieve Laroche, pracownik naukowy w moim laboratorium, oraz Manel Zighal, doktorant w moim laboratorium.

Przed rozpoczęciem procedury dodać 20 mikrolitrów roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 25 mikrogramów na mililitr do każdej studzienki o odpowiedniej liczbie doświadczalnej 384 optycznych płytek dennych i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut do dwóch godzin. Pod koniec inkubacji przetrząśnij płytki zlewem, aby usunąć nadmiar poli-L-lizyny i dodaj 40 mikrolitrów antybiotykowego roztworu przeciwgrzybiczego do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytki potrzebne do wysiewu komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a resztę płytek umieść w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.

Aby wysadzić komórki HTLA do wstępnego badania przesiewowego, delikatnie przepłucz zlewające się 150-milimetrowe kultury komórkowe 10 mililitrami PBS, a następnie potraktuj kultury sześcioma mililitrami 0,05% trypsyny EDTA na naczynie. Gdy komórki się odłączą, zawiesiny komórek umieszcza się w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, zawierającej równą objętość DMEM. I zbierz komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w stężeniu 2,2 razy 10 do piątej komórki na mililitr DMEM i przesunąć płytki nad zlewem, aby usunąć antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy. Postukaj w płytki, aby wyschły i zasiej 45 mikrolitrów komórek do każdej studzienki. Następnie umieść płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 45% dwutlenku węgla na noc.

Aby przygotować 384-dołkową płytkę źródłową DNA do transfekcji, rozprowadź 50 nanogramów na mililitr każdego plazmidowego komplementarnego DNA kodującego interesujący nas konstrukt GPRC Tango w 0,1 Tris-EDTA na studzienkę do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Użyj pipety wielokanałowej, aby ręcznie przenieść 10 mikrolitrów roztworu DNA z każdej studzienki płytki 96-dołkowej do indywidualnych dołków jednej 384-dołkowej płytki źródłowej DNA czterokrotnie dla każdego stanu, jak pokazano na ilustracji. Następnie przenieś 40 mikrolitrów 0,313 molowego roztworu chlorku wapnia do każdej studzienki płytki źródłowej DNA i delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki.

Dodaj 50 mikrolitrów buforu 2x HEPES do każdej studzienki 384-dołkowej płytki źródłowej DNA, delikatnie mieszając. Po jednej minucie przenieś 10 mikrolitrów mieszaniny transfekcji DNA z 384-dołkowej płytki źródłowej DNA do każdej studzienki z wysianymi komórkami HTLA i inkubuj komórki w inkubatorze hodowli komórkowych przez noc. Następnego dnia zdekantuj transfekowaną pożywkę komórkową i powoli dodaj 40 mikrolitrów głodującej pożywki do każdej studzienki, uważając, aby nie dotykać komórek bezpośrednio.

Następnie dodać 20 mikrolitrów bufora nośnika dla naprzemiennych rzędów bez związku w 20 mikrolitrach interesującego związku o trzykrotnym stężeniu do naprzemiennych rzędów, przed powrotem płytki do inkubatora do hodowli komórkowych. 16 do 24 godzin po stymulacji zdekantować transfekowaną pożywkę komórkową i dodać 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego odczynnika żarowego do każdej studzienki na pięć do 20 minut inkubacji w temperaturze pokojowej chronionej od światła. Następnie odczytaj płytki na liczniku luminescencji mikropłytki z czasem całkowania wynoszącym jedną sekundę na studzienkę.

W przypadku wtórnego badania przesiewowego subkulturuj komórki HTLA w 100-milimetrowych szalkach w proporcji od pięciu razy 10 do sześciu komórek o całkowitej gęstości komórek w 11 milimetrach kompletnej pożywki na szalkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zmieszano 10 mikrogramów uzupełniającego DNA GPCR z 500 mikrolitrami roztworu chlorku wapnia Tris-EDTA z wirowaniem, a następnie dodano 500 mikrolitrów buforu HEPES. Po energicznym wstrząśnięciu inkubować roztwór przez minutę w temperaturze pokojowej i natychmiast dodać jeden mililitr roztworu kroplami na komórki.

Delikatnie rozkołysz, aby równomiernie rozprowadzić osad i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. Następnego dnia sprawdź skuteczność transfekcji pod fluorescencyjnym imagerem komórek. Transakcje większe niż 50% pokrycia są idealne.

Delikatnie przepłucz transfekowane komórki roztworem versenu przed odłączeniem komórek trzema mililitrami 0,05% trypsyny EDTA. Zbierz zdysocjowane komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w stężeniu cztery razy 10 do piątych komórek na mililitr głodującego stężenia. Następnie wysiewaj 45 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 384-dołkowej płytki kodowanej poli-L-lizyną i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej cztery godziny.

Aby przygotować półlogarytmiczną płytkę odpowiedzi dawka-krzywa, dodać 270 mikrolitrów HBSS uzupełnionego HEPES i antybiotykiem przeciwgrzybiczym do wszystkich z wyjątkiem ostatniego rzędu płytki 96-dołkowej i dodać 30 mikrolitrów każdego roztworu leku o wysokiej i niskiej zawartości do studzienek rzędu H. Przenieść roztwór z każdej studzienki w rzędzie H do odpowiedniego dołka w rzędzie G, mieszając i kontynuować seryjne rozcieńczanie związków leku, aż do Osiągnięto ostatni rząd płyty. Korzystając ze schematu jako odniesienia, wymieszaj 20 mikrolitrów rozcieńczeń z dolnej kolumny z rzędów od A do G płytki 96-dołkowej i 20 mikrolitrów rozcieńczeń z wysokiej kolumny do studzienek od B do H płytki 96-dołkowej z poprzednio osadzoną płytką 384-dołkową. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez minimum 16 godzin.

16 do 24 godzin po stymulacji zdekantować transfekowaną pożywkę komórkową i dodać 20 mikrolitrów odczynnika jarzeniowego do każdej studzienki na pięć do 20 minut inkubacji przed odczytaniem płytek na liczniku luminescencji mikropłytki z czasem integracji wynoszącym jedną sekundę na studzienkę. W tym reprezentatywnym eksperymencie, spośród 168 GPCR, które zostały przesłuchane w pierwotnym badaniu przesiewowym, tylko receptor dopaminy D3 i opsyna 5 były pretendentami jako potencjalne aktywne cele. Receptor dopaminy D3 powodował znaczącą zmianę log2-krotną wynoszącą 4,7, podczas gdy opsyna 5 powodowała nieco niższą odpowiedź wynoszącą 2,39.

Dla porównania, receptor dopaminy D2, pozytywna kontrola dla pierwotnego badania przesiewowego, spowodowała log2-krotną zmianę 4,58. Te krzywe odpowiedzi z wtórnego badania przesiewowego wykazały, że ekstrakt granulek chromatyny wytwarza podobne okna sygnałowe w połowie maksymalnych skutecznych wartości stężenia do chinpirolu, co potwierdza jego ważność jako aktywnego uderzenia w receptor dopaminy D3. Płaska krzywa dawkowania podobna do kontroli ujemnej została wytworzona dla opsyny 5, jednak wykluczając ten receptor jako możliwy cel dla ekstraktu z granulek chromatyny. Presto-Tango wymaga szczególnej ostrożności, ponieważ różnice w rozmieszczeniu komórek, wydajności transfekcji i seryjnych rozcieńczeniach leków mogą powodować złożony błąd, który może wpływać na dokładność danych.

Metody ortogonalne, takie jak podejścia wiążące radioligandy, rezonans bioluminescencji, transfer energii i cykliczne testy funkcjonalne wapnia i internalizacji AMP, mogą być stosowane do dalszego potwierdzania i charakteryzowania interakcji receptorów ligandowych.