Name: Eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę eksploracji genomu pod kontrolą spektrometrii mas w połączeniu z sieciowaniem molekularnym. Protokół umożliwia szybką identyfikację nowych związków bioaktywnych z ekstraktów mikroorganizmów i roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla tego badania zostało zapewnione przez São Paulo Research Foundation - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 i 2014/50249-8 dla L.G.O; 2013/12598-8 i 2015/01013-4 dla R.S.; oraz 2019/08853-9 dla C.F.F.A.). B.S.P, C.F.F.A. i L.G.O. otrzymali stypendia Narodowej Rady Rozwoju Naukowego i Technologicznego - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 i 313492/2017-4). L.G.O. jest również wdzięczna za wsparcie grantowe udzielone przez program For Women in Science (2008, edycja brazylijska). Wszyscy autorzy wyrażają uznanie dla CAPES (Koordynacja na rzecz Doskonalenia Kadr Szkolnictwa Wyższego) za wspieranie programów podyplomowych w Brazylii.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Największą zaletą tego protokołu jest jego zdolność do szybkiej dereplikacji profili metabolicznych i łączenia informacji genomicznej z danymi MS w celu wyjaśnienia struktur nowych cząsteczek, zwłaszcza analogów strukturalnych2. Na podstawie informacji genomicznych można badać różne chemotypy produktów naturalnych, takie jak poliketydy (PK), peptydy nierybosomalne (NRP) i glikozylowane produkty naturalne (GNP), a także tajemnicze BGC. Badania przesiewowe metabolomiczne dostarczają dowodów na aktyw...

Badania nad metabolizmem wtórnym często polegają na przesiewaniu surowych ekstraktów pod kątem specyficznych aktywności biologicznych, a następnie na oczyszczaniu, identyfikacji i charakterystyce składników należących do aktywnych frakcji. Proces ten okazał się efektywny, umożliwiając izolację wielu związków chemicznych. Obecnie uznaje się go jednak za nieefektywny, głównie ze względu na wysoki odsetek ponownych odkryć tych samych substancji. Ponieważ przemysł farmaceutyczny rozwijał się bez pełnej wiedzy na temat ról i funkcji wyspecjalizowanych metabolitów, ich identyfikacja była przeprowadzana w warunkach laboratoryjnych, które nie odzwierciedlały wiernie natury1. Obecnie istnieje lepsze zrozumienie naturalnych wpływów sygnałowych, wydzielania oraz obecności większości celów w niewykrywalnie niskich stężeniach. Ponadto regulacja tego procesu pomoże środowisku akademickiemu i przemysłowi farmaceutycznemu w wykorzystaniu tej wiedzy. Przyniesie to również korzyści badaniom obejmującym bezpośrednią izolację metabolitów związanych z milczącymi klastrami genów biosyntezy (BGCs)2.
W tym kontekście postępy w sekwencjonowaniu genomicznym odnowiły zainteresowanie badaniami przesiewowymi metabolitów mikroorganizmów. Wynika to z faktu, że analiza informacji genomicznych odkrytych klastrów biosyntetycznych może ujawnić geny kodujące nowe związki, których nie zaobserwowano lub których nie wytworzono w warunkach laboratoryjnych. Obecnie dostępnych jest wiele projektów lub szkiców pełnych genomów drobnoustrojów, a ich liczba rośnie z każdym rokiem, co stwarza ogromne perspektywy odkrywania nowych cząsteczek biologicznie czynnych poprzez eksplorację genomów (genome mining)3,4.
Atlas Biosyntetycznych Klastrów Genów (Atlas of Biosynthetic Gene Clusters) jest obecnie największym zbiorem automatycznie zidentyfikowanych klastrów genów, stanowiącym element Zintegrowanej Platformy Genomów Mikrobialnych (Integrated Microbial Genomes Platform) Joint Genome Institute (JGI IMG-ABC)2. Niedawno inicjatywa standaryzacyjna Minimum Information for Biosynthetic Gene Clusters (MIBiG) promowała ręczną reanotację BGC, dostarczając wysoko wykuratorowany zestaw danych referencyjnych5. Obecnie dostępnych jest wiele narzędzi umożliwiających obliczeniowe przeszukiwanie danych genetycznych i powiązanie ich ze znanymi metabolitami wtórnymi. Opracowano również różne strategie pozyskiwania nowych bioaktywnych produktów naturalnych (np. ekspresję heterologiczną, delecję genów docelowych, rekonstrukcję in vitro, analizę sekwencji genomowej, screening z wykorzystaniem izotopów [podejście genomizotopowe], manipulację regulatorami lokalnymi i globalnymi, przeszukiwanie oparte na celach oporności, przeszukiwanie niezależne od hodowli, a ostatnio podejścia sterowane spektrometrią mas lub kodem2,6,7,8,9,10,1,12,13,14,15).
Przeszukiwanie genomu (genome mining) jako strategia pojedyncza wymaga wysiłków w celu adnotacji jednej lub małej grupy cząsteczek; w związku z tym w procesie tym wciąż istnieją luki w zakresie ustalania priorytetów dla nowych związków do izolacji i wyznaczania struktury. W teorii podejścia te celują w tylko jedną ścieżkę biosyntetyczną na eksperyment, co skutkuje powolnym tempem odkryć. W tym sensie stosowanie GM wraz z podejściem sieci molekularnych stanowi istotny postęp w badaniach nad produktami naturalnymi14,15.
Wszechstronność, dokładność i wysoka czułość chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS) sprawiają, że jest to doskonała metoda do identyfikacji związków. Obecnie wiele platform udostępnia algorytmy i pakiety oprogramowania do niezorientowanej metabolomiki16,17,18,19,20. Rdzeniem tych programów jest detekcja cech (wykrywanie pików)21 oraz wyrównywanie pików, co umożliwia dopasowanie identycznych cech w serii próbek oraz poszukiwanie wzorców. Algorytmy oparte na wzorcach MS2,23 porównują charakterystyczne wzorce fragmentacji i dopasowują podobieństwa MS2, generując rodziny molekularne o wspólnych cechach strukturalnych. Cechy te mogą być następnie wyróżnione i pogrupowane, co pozwala na szybkie odkrywanie znanych i nieznanych cząsteczek w złożonym ekstrakcie biologicznym za pomocą tandemowej spektrometrii mas MS2,24,25. Zatem tandemowa spektrometria mas jest wszechstronną metodą pozyskiwania informacji strukturalnych o wielu chemotypach zawartych w dużym zbiorze danych jednocześnie.
Algorytm Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)26 wykorzystuje znormalizowaną intensywność jonów fragmentowych do konstruowania wektorów wielowymiarowych, w których podobieństwa są porównywane przy użyciu funkcji cosinusowej. Relacje między różnymi jonami prekursorowymi są przedstawione na schemacie, w którym każda fragmentacja jest wizualizowana jako węzeł (okręgi), a stopień powiązania poszczególnych węzłów jest definiowany przez krawędź (linie). Globalna wizualizacja cząsteczek pochodzących z jednego źródła jest definiowana jako sieć molekularna. Cząsteczki rozbieżne strukturalnie, które ulegają unikalnej fragmentacji, tworzą własne, specyficzne klastry lub konstelacje, podczas gdy cząsteczki spokrewnione grupują się razem. Klastrowanie chemotypów umożliwia hipotetyczne powiązanie podobnych cech strukturalnych z ich pochodzeniem biosyntetycznym.
Łączenie podejść chemotyp-genotyp oraz genotyp-chemotyp jest niezwykle skuteczne podczas tworzenia powiązań bioinformatycznych między BGC a ich małocząsteczkowymi produktami27. W związku z tym poszukiwanie genomowe sterowane przez MS jest szybką metodą i strategią wymagającą niewielkiej ilości materiału, co pomaga powiązać jony rodzime ze szlakami biosyntezy ujawnionymi przez WGS jednego lub wielu szczepów w różnych warunkach metabolicznych i środowiskowych.
Przebieg tego protokołu (Rycina 1) polega na wprowadzeniu danych WGS do platformy adnotacji biosyntetycznych klastrów genów, takiej jak antiSMASH28,29,30. Pomaga to oszacować różnorodność i klasę związków zakodowanych w genomie. Należy przyjąć strategię nakierowaną na biosyntetyczny klaster genów kodujący interesującą jednostkę chemiczną, a następnie przeanalizować ekstrakty hodowlane szczepu dzikiego i/lub szczepu heterologicznego zawierającego BGC, aby wygenerować klastry jonów na podstawie podobieństw przy użyciu GNPS26,31. W konsekwencji możliwe jest zidentyfikowanie nowych cząsteczek powiązanych z docelowym BGC, których nie ma w bazie danych (głównie nieznane analogi, czasami produkowane w niskich mianach). Warto zauważyć, że użytkownicy mogą współtworzyć te platformy, a dostępność danych bioinformatycznych i MS/MS szybko rośnie, co prowadzi do ciągłego rozwoju i aktualizacji skutecznych narzędzi obliczeniowych oraz algorytmów umożliwiających efektywne łączenie złożonych ekstraktów z cząsteczkami.
<img alt="Proces poszukiwania genomowego prowadzonego za pomocą spektrometrii mas (MS), przedstawiający sekwencjonowanie całego genomu, analizę in silico oraz dane LC-MS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60825/60825fig1b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Przegląd całego schematu postępowania. Przedstawiono ilustrację etapów bioinformatycznych, klonowania oraz sieciowania molekularnego, które wchodzą w skład opisanego podejścia do przeszukiwania genomu z wykorzystaniem spektrometrii mas (MS) w celu identyfikacji nowych metabolitów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60825/60825fig1blarge.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Niniejszy protokół opisuje szybki i efektywny schemat pracy łączący analizę genomu (genome mining) z sieciowaniem molekularnym (molecular networking) jako punkt wyjścia dla procesu odkrywania produktów naturalnych. Choć wiele aplikacji pozwala na wizualizację składu i pokrewieństwa cząsteczek wykrywanych metodą MS w ramach jednej sieci, w niniejszej pracy zastosowano kilka z nich w celu wizualizacji strukturalnie podobnych, zgrupowanych cząsteczek. Dzięki zastosowaniu tej strategii pomyślnie zidentyfikowano nowe cyklodepsypeptydy zaobserwowane w ekstraktach metabolicznych Streptomyces sp. CBMAI 2042. Na podstawie analizy genomu rozpoznano cały biosyntetyczny klaster genowy (BGC) kodujący walinomycyny i sklonowano go do szczepu produkcyjnego Streptomyces coelicolor M146. Ostatecznie, po przeprowadzeniu sieciowania molekularnego opartego na wzorcach MS, cząsteczki wykryte metodą MS skorelowano z BGC odpowiedzialnymi za ich biogenezę32.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Tedia</td><td>AA1120-048</td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Oxoid</td><td>LP0011</td><td>NA</td></tr><tr><td>Apramycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2024</td><td>NA</td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9231</td><td>NA</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>5804</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3175</td><td>NA</td></tr><tr><td>Kolumna C18</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>ZORBAX RRHD Extend-C18, 80&Aring;, 2.1 x 50 mm, 1.8 &micro; m, 1200 bar limit ciśnienia P/N 757700-902</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K1377</td><td>NA</td></tr><tr><td>Manitol P.A.- A.C.S.</td><td>Synth</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>5418</td></tr><tr><td>Kwas nalidyksowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4382</td><td>NA</td></tr><tr><td>Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix</td> Spektrometr masowy <td>ThermoFisher Scientific</td><td>F548S</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q-TOF</td><td>Agilent technologies</td><td>NA</td><td>6550 iFunnel Q-TOF LC/MS</td></tr><tr><td>Sacarose P.A.- A.C.S.</td><td>Synth</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA Shaker/Inkubator</td><td>Marconi</td><td>MA420</td><td>NA</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Synth</td><td>NA</td><td>P. A. - ACS</td></tr><tr><td>Ekstrakt sojowy</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA</td><td>Sacharoza</td><td>Synth NA</td><td>P. A. - ACS</td></tr><tr><td>Thermal Cycles</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Mastercycler Nexus Gradient</td></tr><tr><td>Thiostrepton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8902</td><td>NA</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tryptonowy bulion sojowy</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td>NA</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>1290 Infinity LC System</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

Przestrzeń chemiczna pokryta naturalnymi produktami jest ogromna i powszechnie nierozpoznana. W związku z tym pożądane są wygodne metodologie do przeprowadzania szeroko zakrojonej oceny ich funkcji w przyrodzie i potencjalnych korzyści dla człowieka (np. w przypadku zastosowań związanych z odkrywaniem leków). Protokół ten opisuje połączenie eksploracji genomu (GM) i sieci molekularnej (MN), dwóch współczesnych podejść, które dopasowują adnotacje kodowane przez klastry genów w sekwencjonowaniu całego genomu do sygnatur struktury chemicznej z surowych ekstraktów metabolicznych. Jest to pierwszy krok w kierunku odkrycia nowych organizmów naturalnych. Pojęcia te, zastosowane razem, są tutaj zdefiniowane jako eksploracja genomu kierowana przez MS. W tej metodzie główne składniki są wcześniej oznaczane (przy użyciu MN), a strukturalnie spokrewnieni nowi kandydaci są powiązani z adnotacjami sekwencji genomu (przy użyciu GM). Połączenie GMO i MN jest opłacalną strategią ukierunkowaną na nowe szkielety molekuł lub zbieranie profili metabolicznych w celu identyfikacji analogów z już znanych związków.

Protokół został pomyślnie zademonstrowany z wykorzystaniem kombinacji eksploracji genomu (genome mining), ekspresji heterologicznej oraz podejść sterowanych spektrometrią mas (MS) i kodem, w celu uzyskania nowych cząsteczek będących wyspecjalizowanymi analogami walinomycyny. Przepływ pracy od genomu do cząsteczki dla celu, jakim jest walinomycyna (VLM), przedstawiono w Rysunek 8. Streptomyces Analizowano in silico projekt genomu szczepu CBMAI 2042, w wyniku czego zidentyfikowano kla...

Protokół eksploracji genomu sterowany spektrometrią mas jest ustanowiony i opisany tutaj. Opiera się na informacjach o sekwencjach genomu i analizie LC-MS/MS i ma na celu ułatwienie identyfikacji cząsteczek ze złożonych ekstraktów mikrobiologicznych i roślinnych.

Eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Sekwencjonowanie całego genomu, eksploracja genomu i sieci molekularne stanowią podstawę przewodnika po spektrometrii mas, który opisujemy tutaj. I są najbardziej nowoczesnym podejściem do odkrywania produktów naturalnych. Eksploracja genomu i sieci molekularne pasują do siebie w klastrze, w zakodowanych adnotacjach w sekwencjonowaniu całego genomu z sygnaturami chemicznej restrukturyzacji z surowych ekstraktów, zapewniając ogromne perspektywy odkrycia pępka przez aktywne cząsteczki.Zasadniczo eksploracja genomu jest ukierunkowana na pojedynczą lub małą grupę cząsteczek w eksperymencie. Powoduje to powolny wskaźnik wykrywania. W tym sensie wykorzystanie eksploracji genomu wraz z sieciami molekularnymi stanowi ważny postęp w badaniach nad produktami naturalnymi.Przewodnik po spektrometrii mas - eksploracja genomu jest wszechstronną metodą, która może jednocześnie strukturyzować informacje o kilku chemotypach zawartych w dużej ilości danych z surowego ekstraktu. Obecnie jest to metodologia o wysokim zasięgu, która umożliwia badanie sekwencji bakterii, grzybów lub roślin. Chemotyp do genotypu i genotyp do chemotypu bioinformatyczne powiązania między klastrami biosyntetycznymi i są produktami małocząsteczkowymi.Słysząc, wykazano, że protokół charakteryzuje głębokość cyklu pępka Produkty peptydowe obserwowane w ekstraktach metabolicznych gatunków Streptomyces. Ale ma również zastosowanie do sekwencji i ekstraktów grzybów i roślin. Bardzo ważne jest, aby mieć dobrze wyselekcjonowany zestaw danych genomu, a w dzisiejszych czasach fragmentaryczne sekwencje robocze są coraz częściej zastępowane przez prawie gotowe dane sekwencyjne.Opracowano również różne strategie dostępu do nowych bioaktywnych produktów naturalnych i z pewnością połączenie ich z podejściem MS-Guide. Doprowadzimy do poprawy izolacji produktów naturalnych i wyjaśnienia ich struktury. Ponieważ tutaj łączymy podejście genotypu z chemotypem, kluczowe znaczenie mają bioinformatyczne powiązania między klastrami biosyntetycznymi i produktami małocząsteczkowymi.w celu oszacowania różnorodności i klasy związków oraz kodowania przez genom. Co oznacza replikację. Później grupowanie oparte na podobieństwach jonów można przeprowadzić za pomocą GNPS.Procedurę zademonstrują dr Renata Sigrist i profesor Angolini, moi współpracownicy w tym badaniu. Uzyskanie informacji in silico o wtórnym metabolizmie genów klastrów z całego genomu sekwencji. Prześlij plik sekwencji, bank genów E-M-B-L lub szybszy format, na platformę anty-smash.Podobnie jak klastry genów będące przedmiotem zainteresowania na podstawie danych wyjściowych opartych na najbardziej podobnym znanym klastrze. Opierając się na informacjach o sekwencji DNA BGC, zaprojektuj podstawowe od 20 do 25 nukleotydów flankujących klaster genów dla paciorkowców ecoli. Badania przesiewowe biblioteki chromosomów sztucznych.Po uzyskaniu rekombinowanego organizmu heterologicznego zgodnie z manuskryptem, należy zaszczepić jedną setną szczepów przed kulturą w odpowiednich pożywkach fermentacyjnych. Takich jak płynne nośniki ISP2. Umieść kulturę w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 220 obr./min na siedem dni.Po zaszczepieniu odwirować kultury w temperaturze 2200 razy G przez 10 minut. Odrzucić komórki i przenieść supernatant do rozdzielacza. Dodać jedną do jednej objętości octanu etylu i wstrząsnąć.Odczekaj od jednej do trzech minut, aż warstwy organiczne i przyzwolone się oddzielą. I zbierz warstwę organiczną w kolbie Erlenmeyera. Aby uzyskać dane MS/MS.Zaprogramować odpowiednie metody HPLC i spektrometrii mas za pomocą oprogramowania sterującego. Należy zauważyć, że sieć MS / MS jest wykrywalną siecią molekularną w danych warunkach spektrometrii mas. Konwertuj widma masowe do formatu mzXML za pomocą MS Convert z kreatora protea.Dostosuj parametry wejściowe do konwersji. Prześlij przekonwertowane pliki LC-MS/MS do bazy danych GNPS. Dostępne są dwie opcje.Za pomocą protokołu przesyłania plików lub bezpośrednio w przeglądarce za pośrednictwem platformy internetowej. Po założeniu konta w GNPS zaloguj się do utworzonego konta i wybierz opcję utwórz sieć molekularną. Dodaj nazwę stanowiska.Aby wykonać podstawowe opcje. Wybierz pliki mzXML, aby wykonać sieć molekularną. Podziel je na maksymalnie sześć grup.Podobnie jak biblioteki dla procedury dereplikacji. Wybierz tolerancję masy jonu prekursora i fragment Da na tolerancję masy odpowiednio 0,02 daltona i 0,05 daltona. Aby wykonać zaawansowane opcje sieciowe, należy wybrać parametry, które bezpośrednio wpływają na wielkość i formę klastra sieciowego.Zaawansowane parametry znajdują się w dokumentacji GNPS. Wybierz adres e-mail, na który chcesz otrzymać powiadomienie o zakończeniu pracy, i prześlij zadanie. Do analizowania wyników GNPS.Zaloguj się do GNPS. Wybierz pozycję Zadania, Opublikowane zadanie, Gotowe, aby otworzyć zadanie. Otworzy się strona internetowa z wyświetlonymi wszystkimi wynikami uzyskanymi za pomocą sieci molekularnych.Wybierz opcję wyświetl rodziny widmowe w wizualizatorze sieci przeglądarki, aby wyświetlić wszystkie klastry sieciowe. Wyświetlana jest lista ze wszystkimi wygenerowanymi klastrami sieci molekularnych. Wstępna identyfikacja molekularna jest wyświetlana we wszystkich identyfikatorach.Wybierz pozycję pokaż, aby je zwizualizować. Aby przeanalizować klaster sieci molekularnej, wybierz opcję Wizualizuj sieć. W polu etykiety węzłów wybierz masę nadrzędną.W polu etykiety krawędzi wybierz opcję Podpis wspólny lub Delta Emz. Aby zaobserwować odpowiednio podobieństwo węzłów lub różnicę masy między węzłami. W przypadku analizy wielogrupowej kliknij przycisk Rysuj wycinki w polu kolorowania węzłów.Aby obserwować częstotliwość, z jaką każdy węzeł pojawia się w każdej grupie. Aby wyświetlić wszystkie biblioteki, wybierz widok, całą bibliotekę, trafienia. Otwórz widma fragmentacji bezpośrednio na platformie GNPS.Lub w oryginalnych plikach surowych, aby ręcznie potwierdzić związki dereplikacji i wyjaśnić strukturę powiązanych związków. Protokół został z powodzeniem zilustrowany przy użyciu kombinacji eksploracji genomu, ekspresji heterologicznej i podejścia do kodu sterowanego przez MS. Aby uzyskać dostęp do nowych wyspecjalizowanych Walinomycyny i cząsteczek analogowych.Przepływ pracy genomu do cząsteczki dla docelowej walinomycyny przedstawiono tutaj. Chromatogram wykazał, że walinomycyna, montanastatyna i pięć analogów były wytwarzane przez walinomycynę, biosyntetyczną ekspresję klastrów genów w heterologicznym gospodarzu. Molekularne jony sieciowe odpowiadające walinomycynie, znanemu już związkowi z odpowiadającymi mu biosyntetycznymi klastrami genów opisanymi w gatunkach Streptomyces, CBM AI dwa zero cztery dwa genomy.Są zgrupowane z jonami związanymi z analogami, po raz pierwszy opisanymi dla klastra genów biosyntezy walinomycyny. Widma MS i struktury chemiczne walinomycyny i pokrewnych analogów są pokazane tutaj. Przeprowadzenie sekwencjonowania całego genomu i odpowiednie selekcjonowanie zbiorów danych jest pierwszym krokiem do wyboru klastra biosyntetycznego do prowadzenia eksploracji genomu przez MS.Całą procedurę można wykonać za pomocą surowego ekstraktu z dzikich typów, ale możesz zdecydować się na wybór interesującego Cię klastra genów i promować ekspresję heterologiczną. Opisano różne metody przechwytywania całego klastra genów biosyntetycznych z próbki DNA. Największą zaletą tego protokołu jest jego zdolność do szybkiej replikacji profili metabolicznych i kojarzenia informacji genomowych z danymi dotyczącymi stwardnienia rozsianego.W celu wyjaśnienia tych takich jak nowe cząsteczki. Masowe eksploracje genomu przewodnika zostało po raz pierwszy opisane w dziedzinie genomiki peptydowej i glikogenomiki przez Doris Chime i współpracowników. A po wprowadzeniu NPS, zintegrowana metabolomika i podejście do eksploracji genomu stały się najbardziej wszechstronną drogą łączenia sieci molekularnych o możliwościach biosyntezy.

mass-spectrometry-guided-genome-mining-as-tool-to-uncover-novel

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół (A) identyfikacji naturalnego produktu o aktywności antybiotykowej, (B) oczyszczania związku, (C) pierwszego modelu jego biosyntezy, (D) sekwencjonowania/-eksploracji genomu oraz (E) weryfikacji klastra genów biosyntetycznych.

Od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Diagnostyczne filtrowanie fragmentacji, zaimplementowane w MZmine, to eleganckie, post-akwizycyjne podejście do przesiewania zbiorów danych LC-MS/MS dla całych klas zarówno znanych, jak i nieznanych produktów naturalnych. To narzędzie przeszukuje widma MS/MS pod kątem jonów produktowych i/lub strat neutralnych, które analityk zdefiniował jako diagnostyczne dla całej klasy związków.

Naturalne odkrywanie produktu z diagnostycznym filtrowaniem fragmentacji LC-MS/MS: zastosowanie do analizy mikrocystyny

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Szybka multidyscyplinarna strategia wczesnego wykrywania zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn jest opisana tutaj. Pozwala na wykrycie cyjanobakterii i pokrewnych sinic w próbkach wody oraz w matrycach organicznych, takich jak próbki małży, w ciągu 24 godzin.

Wczesne wykrywanie zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn przy użyciu strategii szybkiego wykrywania

Charakterystyka spektrometryczna mas neuropeptydów dostarcza informacji o sekwencji, kwantyfikacji i lokalizacji. Ten zoptymalizowany przepływ pracy jest przydatny nie tylko w badaniach neuropeptydów, ale także innych endogennych peptydów. Przedstawione tutaj protokoły opisują przygotowanie próbki, akwizycję MS, analizę MS i generowanie bazy danych neuropeptydów za pomocą LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting i obrazowania MALDI-MS.

Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus

Skonstruowaliśmy nieukierunkowany przepływ metabolomiczny, który zintegrował XY-Meta i metaX razem. W tym protokole pokazaliśmy, jak używać XY-Meta do generowania wabikowej biblioteki spektralnej na podstawie odniesienia do widm w otwartym dostępie, a następnie przeprowadziliśmy kontrolę FDR i użyliśmy metaX do ilościowego określenia metabolitów po zidentyfikowaniu widm metabolomicznych.

Zintegrowany proces identyfikacji i kwantyfikacji nieukierunkowanego metabolomu opartego na kontroli FDR

Prezentujemy metodę szybkiej spektrometrii mas (MS)/spektrometrii mas (MS) opartej na adnotacji i klasyfikacji alkaloidów tropanowych, przydatną zarówno do wstępnej dereplikacji próbek zawierających tropan jak i odkrywania nowych alkaloidów do izolacji.

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Poznaj metodę eksploracji genomu pod kontrolą spektrometrii mas w połączeniu z sieciowaniem molekularnym. Protokół umożliwia szybką identyfikację nowych związków bioaktywnych z ekstraktów mikroorganizmów i roślin.

Eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych

Przeglądaj więcej filmów